CN105008517A - 由骨移植物组成的微粉化组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了由结合有一种或多于一种骨移植物的微粉化颗粒组成的组合物，所述微粉化颗粒衍生自一种或多于一种存在于胎盘组织中的组分。所述组合物具有很多医学用途。本文还描述了制备和使用所述微粉化组合物的方法。

Description

由骨移植物组成的微粉化组合物及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年10月8日提交的美国专利申请第13/647,308号的优先权，该美国专利申请要求2011年10月6日提交的美国临时申请第61/543,934号的优先权。上述专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包括微粉化的胎盘组织的骨移植物，所述胎盘组织包括微粉化的羊膜和/或绒毛膜。将这种微粉化的组织包含在骨移植物中提供很多医学用途，包括用于改善这种骨移植物移植的治疗结果的方法。
背景技术
本文描述了由一种或多于一种存在于胎盘组织中的组分衍生得到的微粉化的颗粒结合一种或多于一种骨移植物而组成的组合物。所述组合物具有很多医学用途。本文还描述了用于制备和使用该微粉化组合物的方法。
本发明的优点一部分将在下文的描述中列出，一部分可从下文描述中凸显出来，或者可通过下文描述的各方面的实践得出。下文描述的优点可通过后附的权利要求中特别指出的元素和组合实现和得到。应当理解的是，上文的一般描述以及下文的详细描述仅仅是示例性地说明，无意于限制本发明。
发明内容
本发明提供包括衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒和一种或多于一种骨移植物的微粉化组合物。在各种不同实施方式中，所述胎盘组分包括羊膜膜(amniotic membrane)、羊膜(amnion)、绒毛膜、华通氏胶、胎盘或者它们的任意组合。
一方面，微粉化颗粒的粒径小于1,000μm。另一方面，微粉化颗粒的粒径为200μm至300μm。在其它方面，微粉化颗粒为100％微粉化的羊膜。在又一方面，微粉化颗粒为100％微粉化的绒毛膜。
在其它实施方式中，微粉化颗粒为具有华通氏胶的微粉化的羊膜和/或绒毛膜。在进一步的实施方式中，骨移植物为自体移植物、同种异体移植物、异种移植物、异质移植物或者它们的任意组合。在一种实施方式中，微粉化颗粒比骨移植物的量为1:99至99:1(按体积计)。
其它示例性的实施方式提供进一步包括药学上可接受的载体的所述微粉化组合物。在一些方面，药学上可接受的载体包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液、缓冲液或非水性载体。在一些方面，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液或Tris缓冲液。在其它实施方式中，所述药学上可接受的载体包括生物相容性填充物。在一些方面，所述填充物为羧甲基纤维素、纤维素、透明质酸或其盐、甘油或者它们的任意组合。在本发明的各种实施方式中，所述微粉化组合物是可注射的。在其它方面，所述组合物为泡沫状物、凝胶或油灰状物，或糊状物。
在又一实施方式中，本发明提供通过如下方法生产的组合物，所述方法包括(a)将一种或多于一种胎盘组分微粉化以生成微粉化颗粒；和(b)将所述微粉化颗粒与一种或多于一种骨移植物进行混合。在一些方面，步骤(a)通过机械研磨或者机械粉碎实施。在其它方面，步骤(a)通过低温研磨实施。
本发明的微粉化组合物可用于脊柱应用。在其它方面，所述微粉化组合物可用于治疗或预防受治者的关节中的炎症的方法，所述方法包括将所述微粉化组合物注射至所述关节中。
本发明的其它实施方式包括用于将两种或多于两种骨融合在一起的方法，所述方法包括(1)将所述微粉化组合物施用于所述骨中的一种或多于一种以及(2)使所述骨通过所述组合物相互接触。在另一实施方式中，本发明提供用于填充骨缝隙的方法，所述方法包括将所述微粉化组合物注射至所述缝隙中。在又一实施方式中，本发明提供用于治疗或预防受治者的关节中的炎症的方法，所述方法包括将包括衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒的微粉化组合物注射至所述关节中。在又一实施方式中，本发明提供用于将两种或多于两种骨融合在一起的方法，所述方法包括(1)将包括衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒的微粉化组合物施用于所述骨中的一种或多于一种以及(2)使所述骨通过所述组合物相互接触。在又一实施方式中，本发明提供用于填充骨缝隙的方法，所述方法包括将包括衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒的微粉化组合物注射至所述缝隙中。
在其它示例性实施方式中，本发明提供一种三维构建体，所述三维构建体包括(a)微粉化的羊膜和中间组织层，其中，用交联剂处理所述微粉化的羊膜和中间组织层，以及任选地，(b)一种或多于一种骨移植物。一方面，所述三维构建体包括(a)微粉化的羊膜膜和绒毛膜，其中，用交联剂处理所述微粉化的羊膜膜和绒毛膜，以及任选地，(b)一种或多于一种骨移植物。在一些方面，所述构建体可用于整形外科应用或脊柱应用。在其它方面，所述应用是用于缝隙填充或用于结构支撑。在其它方面，所述构建体可用作拔牙后的齿窝填充物。
在另一实施方式中，本发明提供适合在治疗骨质缺损中使用的微粉化组合物，所述组合物包括(a)衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒；(b)一种或多于一种骨移植物；(c)药学上可接受的载体；和(d)可生物降解的填充物。在本发明实施方式的一方面，应当理解的是所述组合物只包括不实质性改变所述组合物的基本特征的那些组分。在本发明实施方式的另一方面，所述组合物只包括本文具体记载的组分。
附图说明
说明书附图并入说明书并构成说明书的一部分，说明书附图举例说明下文所述的几个方面。
图1为制备本文所述的微粉化组合物的过程的总体流程图。
图2显示将填充有微粉化组合物的椎间融合装置用于融合两节椎骨。
图3显示将微粉化组合物用于融合两节椎骨。
图4显示将微粉化组合物用于牙骨缝隙中。
具体实施方式
在公开和描述本发明及本发明的方法之前，应当理解的是，下文所述的各方面并不限于具体的化合物、合成方法或用途，因为毫无疑问，这些具体的化合物、合成方法或用途可发生改变。还应当理解的是，本文使用的术语仅仅是为了描述特定方面，无意限制本发明。
在本发明的说明书和后附的权利要求书中，引用了大量术语，所述术语应当定义为具有以下含义：
必须注意，除非上下文另有清楚地说明，如在本发明的说明书和所附的权利要求中使用的不指明具体数目的形式(“a”、“an”和“the”)包括复数指代物。因此，例如，“生物活性剂”包括两种或多于两种该制剂的混合物等。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可发生或不可发生，还指该描述包括所述事件或情形发生的情况以及所述事件或情形未发生的情况。例如，短语“任选地清洗步骤”是指所述清洗步骤可进行或可不进行。
本文使用的术语“受治者”为任何脊椎动物体。
本文使用的术语“羊膜膜”包括其中中间组织层还未去除的羊膜组织。
本文使用的术语“羊膜”包括其中中间组织层已经去除的羊膜组织。
本文使用的术语“混合”定义为将两种组分混合在一起，从而不存在化学反应或物理相互作用。术语“混合”还包括化合物和药学上可接受的化合物之间的化学反应或物理相互作用。
本文使用的术语“胎盘组织”包括诸如存在于经过洗涤和去污的胎盘和脐带中的任何物质或组织之类的任何组分。一方面，胎盘组分包括，但不限于，羊膜膜、羊膜、绒毛膜、华通氏胶或者它们的任意组合。这样，“胎盘组织”和“胎盘组分”在本文中可互换使用。
本文使用的术语“微粉化的胎盘组织”包括通过使用任何本领域已知的技术进行微粉化的如上定义的胎盘组织，所述本领域已知的技术包括但不限于，机械研磨或机械粉碎、低温研磨、碾磨、球磨、湿磨、高压匀质、乳化和沉淀、通过压缩流体反溶剂沉淀、喷雾冷冻成液体、由液化的-气体溶液快速膨胀、蒸发沉淀成水溶液以及气流微粉化。
本文使用的术语“骨质缺损”是指任何骨质不足的部位，例如缝隙、间隙、缺口或骨中其它不连续情况。骨质缺损可人为形成或自然形成，并且例如可由于疾病或外伤产生。因此，所述骨质缺损可因病理学疾病、炎症性疾病或肿瘤疾病、外科手术、先天性缺陷或骨折等而产生。例如，在一些疾病(例如骨瘤)的情况下，所述骨质缺损由除去肿瘤组织而人为形成。因此，根据本发明的方法，例如，所述组合物可用于修复牙周骨缺损，用于颅面整形、关节重建、骨折修复，用于进行整形外科的手术操作，以及例如脊柱融合。
为了便于阅读，说明书中可使用标题或副标题，所述标题或副标题无意影响本发明的范围。此外，在下文中更加具体地定义了本发明说明书中使用的一些术语。
I.微粉化颗粒及其制备方法
本文描述了由微粉化的胎盘组织组成的组合物及其药物组合物。PCT申请PCT/US12/24798，以及美国临时申请第61/442,346号和第61/543,995号中描述了包括微粉化的胎盘组织的组合物。这些专利申请的全部内容通过引用明确并入本文。
本文描述了由(a)衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒，和(b)一种或多于一种骨移植物组成的微粉化组合物。
图1描述了收获、加工和准备用于制备本文描述的微粉化组合物的胎盘材料的步骤概况(100)和步骤的一些方面。下文更加详细地描述和讨论各单独的步骤。首先，收集胎盘组织(步骤110)。保存该材料并以常规组织保存方式将该材料运输至合适的加工地点或工厂以进行登记和评价(步骤120)。随后进行组织层的粗加工、处理和分离(步骤130)。随后对可接受的组织去污(步骤140)。去污之后，使胎盘组分(例如，羊膜膜、羊膜、绒毛膜、华通氏胶、胎盘)脱水(步骤145)，接下来，进行微粉化生成微粉化颗粒(步骤150)。最后，将微粉化颗粒与一种或多于一种骨移植物混合生成微粉化组合物(步骤160)。每一步骤在下文详细描述。
初始组织收集(步骤110)
用于生成微粉化颗粒的组分衍生自胎盘组织。胎盘组织的来源可不同。一方面，产自诸如人和其它动物之类的哺乳动物的胎盘组织可用于本文，所述其它动物包括，但不限于，牛、猪等。在胎盘组织产自人的情况下，胎盘组织的回收来自医院，在医院中，所述胎盘组织在剖腹产术生产过程中收集。供体(指将要生产的母亲)自愿进行全面的筛查过程，所述全面的筛查过程设计成提供对移植而言可能是最安全的组织。优选地，所述筛查过程使用常规血清学试验测试人免疫缺陷病毒1型和2型抗体(抗-HIV-1和抗-HIV-2)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、人T-嗜淋巴细胞病毒I型和II型抗体(抗HTLV-I和抗-HTLV-II)、CMV抗体和梅毒抗体。本领域技术人员应当理解的是，以上列举的测试仅仅是示例性的，因为更多测试、更少测试或不同测试随时间或基于移植物的预期使用可以是理想的或必要的。
基于对供体的信息和筛查测试结果的审核，将供体视为可接受的或不可接受的。此外，在运送时，进行培养以确定是否存在诸如梭菌或链球菌之类的细菌。如果供体的信息、筛查测试和运送培养均符合要求(即，未表现出任何风险或表现出可接受水平的风险)，则供体被医疗顾问批准且组织标本被指定为初步合格，用于进一步加工和评价。
优选地，将满足上述选择标准的人胎盘装入无菌装运包中的盐水溶液中并储存在装有湿冰的容器中以运至进一步加工的加工地点或实验室。
如果先收集胎盘组织，随后完成或获得筛查测试和运送培养的结果，则该组织被标记并隔离保存。所述组织只有在满足了所要求的声明该组织安全用于处理和使用的筛查评估和运送培养且获得来自医疗顾问的最终批准之后才被批准进行进一步加工。
材料登记和评价(步骤120)
在到达加工中心或实验室后，打开货物并证实：无菌装运包/容器仍然是密封的且在冷却剂中，有合适的供体文件，且供体文件上的供体编号与装有组织的无菌装运包上的编号匹配。随后将装有组织的无菌装运包储存于冰箱中，待用于进一步加工。
组织粗加工(步骤130)
当准备好对组织进一步加工时，在受控环境中，在预备区中装配进一步加工胎盘组织所必需的无菌用品并准备所述无菌用品以引入受控环境中。如果所述受控环境为生产罩，则使用常规无菌技术打开无菌用品并将其放置于所述罩内。如果所述受控环境为洁净室，则打开无菌用品并将无菌用品放置于由无菌布遮盖的推车(cart)上。所有工作面均通过使用常规无菌技术由一块无菌布遮盖，并且无菌用品和加工设备同样通过使用常规无菌技术放置于所述无菌布上。
根据常规且工业批准的去污过程对加工设备进行去污，随后将加工设备引入受控环境中。所述设备策略性地放置于受控环境中以使设备接近被组织标本污染或不小心被组织标本污染的机会最小化。
然后，在受控环境中从无菌装运包中取出胎盘并将胎盘无菌转移至无菌加工盆中。该无菌盆含有室温或接近室温下的高渗盐水溶液(例如，18％NaCl)。轻揉胎盘以有助于分离血凝块并使胎盘组织达到室温，如下文所述，这将使羊膜和绒毛膜膜彼此更容易分离。随后在升温至环境温度之后(大约10至30分钟之后)，将胎盘从无菌加工盆中移出并将胎盘平放于加工盘上，使羊膜膜层面朝下以进行观察。
检查胎盘组织中的变色、碎片或其它污染、气味和损坏迹象。并注意组织的大小。此时，进行去污(就组织是否为进一步加工可接受的而言)。
接着，如果胎盘组织被认为是进一步加工可接受的，则随后小心地分离胎盘组织的羊膜膜和绒毛膜膜(chorion membrane)。一方面，该操作中使用的材料和设备包括加工盘、18％盐水溶液、无菌4×4海绵和两个无菌Nalgene瓶。仔细检查胎盘组织以找出可将羊膜膜与绒毛膜膜分离的区域(通常为角落)。羊膜膜表现为绒毛膜上薄的不透明层。
通过用一块无菌纱布或棉签轻轻接触羊膜膜的每一侧识别成纤维细胞层。成纤维细胞层会粘附于检测材料上。将羊膜膜放置于加工盘中，基底膜层在下。使用钝的器械(细胞刮板或无菌纱布)除去任何残血。同样，该步骤必须足够谨慎地进行，以免撕破羊膜膜。一旦羊膜膜外观上看起来光滑且为不透明白色，则完成羊膜膜的清洁。如果羊膜膜清洁过度，则可除去胶状成纤维细胞层。任何过分清洁且显得透明的羊膜膜区域可能为不可接受的并且最后会被丢弃。
在一些方面，从羊膜膜中除去中间组织层。这可通过从羊膜膜中剥离中间组织层实施。可选地，可通过用纱布擦去中间组织层或其它合适的擦拭从羊膜膜中除去中间组织层。随后可使用下文描述的步骤对得到的羊膜去污。中间组织层不需要任何额外处理，可照原样使用。
在一些方面，任选地，可通过使用以下步骤分离华通氏胶。使用手术刀或剪刀，从绒毛膜盘中解剖出脐带。一旦识别出静脉和动脉，就沿着静脉或动脉中的一条向下纵向解剖脐带。一旦脐带被解剖，则可使用手术剪刀和镊子从华通氏胶中解剖静脉和动脉壁。接着，通过切割羊膜从华通氏胶中除去羊膜的外层。从华通氏胶中除去羊膜之后，可将华通氏胶切成条状。一方面，所述条状大约1至4cm乘10至30cm，厚度大约1.25cm；然而，根据应用其它厚度也是可能的。
化学去污(步骤140)
一方面，随后将步骤130中制备的羊膜放置于无菌Nalgene瓶中以在下一步进行额外清洗。一方面，以下方法可用于清洗羊膜。每一Nalgene瓶以无菌的方式装有18％盐水高渗溶液并被密封(或用盖密封)。随后将该瓶放置于摇床平台上并摇动30分钟至90分钟，进一步清洗组织污染物。如果摇床平台未处于关键的环境中(例如，生产罩)，则将Nalgene瓶放回至受控环境/无菌环境并打开。使用无菌镊子或通过以无菌的方式倾析内容物，从装有18％高渗盐水溶液的Nalgene瓶中轻轻地移出组织并将组织放置于空Nalgene瓶中。随后以无菌的方式将预混合的抗生素溶液装入含有组织的空Nalgene瓶。优选地，预混合的抗生素溶液由诸如硫酸链霉素和硫酸庆大霉素之类的抗生素的混合物组成。其它抗生素也是合适的，所述其它抗生素例如多粘菌素B硫酸盐和杆菌肽，或目前可用的或将来可用的类似的抗生素。此外，抗生素溶液在添加时最好处于室温，这样其不会改变组织的温度或破坏组织。随后密封或封闭这个装有组织和抗生素的瓶子或容器并将其放置于摇床平台上摇动，优选地，摇动60分钟至90分钟。在抗生素溶液中这样摇动或搅动组织进一步清洗组织污染物和细菌。任选地，可将羊膜放置于200ml.5％Triton-X洗涤液中。
同样，如果摇床平台未处于关键的环境中(例如，生产罩)，则随后将装有组织和抗生素的瓶子或容器放回至关键的环境/无菌环境中并打开。使用无菌镊子，从瓶子或容器中轻轻移出组织并将组织放置于装有无菌水或生理盐水(0.9％盐水溶液)的无菌盆中。将组织浸泡在无菌水/生理盐水溶液中持续至少10分钟至15分钟。可轻轻搅动组织以利于从组织中除去抗生素溶液和任何其它污染物。至少10分钟至15分钟后，组织准备好进行脱水和进一步加工。
另一方面，可使用上述步骤对羊膜膜去污，然后除去中间组织层。
在使用绒毛膜的情况下，可使用以下示例性步骤。在从羊膜中分离绒毛膜并从纤维层中除去凝血之后，在18％盐水溶液中漂洗绒毛膜持续30min。在第一漂洗循环中，使用实验室加热板在无菌容器中加热18％盐水，从而使溶液温度为约48℃。倾析溶液，将绒毛膜组织放置于无菌容器中，并将倾析出的盐水溶液倒入该容器中。密封容器并将容器放置于摇床板上并摇动1小时。1小时摇动浴之后，移出组织并将组织放置于第二加热摇动浴中再进行1小时漂洗循环。任选地，可将膜组织放入200ml.5％Triton-X洗涤液中。密封容器并在不加热的条件下摇动容器持续2小时。然后用去离子水(250ml DI水×4)洗涤组织，每次漂洗用力摆动。移出组织并将组织放入装有1xPBS w/EDTA溶液的容器中。密封容器并在持续8小时的控制温度下摇动容器1小时。移出组织并使用无菌水漂洗组织。进行外观检测以从膜中除去任何残余的变色纤维状血液物质。所述膜应当具有乳白色外表，没有变成褐色的迹象。去污之后，使绒毛膜脱水，然后进行微粉化。
就华通氏胶而言，可将华通氏胶转移至无菌Nalgene瓶中。然后，添加室温18％高渗盐水溶液以漂洗组织，密封该瓶。摇动瓶子30分钟至60分钟。孵育后，对该瓶去污并将该瓶放回无菌区。将组织转移至干净的无菌Nalgene瓶并添加预热的(约48℃)18％NaCl。密封容器并将容器放置于摇床板上，摇动60分钟至90分钟。
一方面，漂洗之后，对瓶子去污并将该瓶放回无菌区。移出组织并将组织放至抗生素溶液中。密封容器并在摇床平台上摇动60分钟至90分钟。孵育后，将瓶子冷藏在1至10℃下长达24小时。然后将华通氏胶转移至装有大约200mL无菌水的无菌盆中。漂洗组织1至2分钟并将组织转移至装有大约300ml无菌水的无菌Nalgene瓶中。密封瓶子并将该瓶放置于摇床上持续30分钟至60分钟。孵育之后，将瓶子放回无菌区。华通氏胶应当具有乳白色外表，没有变成褐色的迹象。该组织准备好进行进一步加工。
脱水(步骤145)
一方面，将胎盘组分(例如，羊膜膜或羊膜、中间组织层、绒毛膜、华通氏胶、胎盘)加工成随后被微粉化的组织移植物。一方面，将胎盘组分放在合适的干燥设备上。优选地，干燥设备的大小为足够完全接受展开、平放的方式的胎盘组分的大小。一方面，所述干燥设备由Teflon或Delrin制成，Teflon或Delrin是由DuPont发明和销售的缩醛树脂工程塑料的商标名称，且Teflon或Delrin也可从乔治亚州Marietta的Werner Machine公司购买得到。任何其它合适的、耐热且耐切割的、能够形成接收湿润组织的合适形状的材料也可用于干燥设备。
在另一实施方式中，可以如美国临时申请第61/683,700号、第61/683,699号、第61/683,698号和第61/683,697号中描述的适当方式使用干燥室或脱水设备。这些美国临时申请的全部内容通过引用明确并入本文。
一旦将胎盘组分放置于干燥设备上，则将干燥设备放于无菌Tyvex(或类似的、透气的、耐热的且可密封的材料)脱水包中并密封。这种透气的脱水包防止组织太快干燥。如果多个干燥设备同时进行加工，则将各干燥设备放入其自身的Tyvex包中或者，可选地，将各干燥设备放入合适的安装架中，所述安装架被设计成在其上容纳多个干燥架并且随后将整个安装架放至较大的单个无菌Tyvex脱水包中并密封。
随后，将装有一个或多于一个干燥设备的Tyvex脱水包放至已预热至大约35摄氏度至50摄氏度的非真空烘箱或培养箱中。Tyvex包在烘箱中保持30分钟至120分钟，尽管约45摄氏度的温度下大约45分钟看上去对于充分干燥组织而不过分干燥或灼伤组织而言是理想的。任何特定烘箱的特定温度和时间需要基于其它因素校准并调节，所述其它因素包括烘箱的高度、大小、烘箱温度的精确度、用于干燥设备的材料、同时干燥的干燥设备的数目、干燥单个干燥设备架还是同时干燥多个干燥设备架等。
微粉化组合物的制备(步骤150)
一旦胎盘组分(例如，羊膜膜或羊膜、中间组织层、绒毛膜、华通氏胶、胎盘)被分离、去污和脱水，则将胎盘组分微粉化以生成微粉化颗粒。用于生成微粉化颗粒的胎盘组分的选择可根据骨移植物的应用和选择而不同。一方面，微粉化颗粒由100％羊膜、绒毛膜或华通氏胶组成。另一方面，微粉化颗粒由羊膜和绒毛膜的混合物组成，其中，羊膜比绒毛膜的量按wt％计可为1:99至99:1、20:80至80:20、40:60至60:40或者约50:50。另一方面，微粉化颗粒由绒毛膜和华通氏胶的混合物组成，其中，绒毛膜比华通氏胶的量按wt％计可为1:99至99:1、20:80至80:20、40:60至60:40或者约50:50。又一方面，微粉化颗粒由羊膜、绒毛膜和华通氏胶的混合物组成，其中，羊膜的量按重量计为微粉化颗粒的10％至50％或者20％至40％，绒毛膜的量按重量计为微粉化颗粒的20％至60％或者30％至50％，华通氏胶的量按重量计为微粉化颗粒的20％至60％或者30％至50％。
微粉化组合物可使用本领域已知的设备生成。例如，Retsch OscillatingMill MM400可用于生成本文描述的微粉化组合物。微粉化组合物中的材料的粒径还可根据微粉化组合物的应用而不同。一方面，微粉化组合物的颗粒小于1,000μm、小于500μm、为25μm至500μm、为25μm至300μm、为25μm至200μm。另一方面，微粉化组合物的颗粒为100μm至300μm，或者200μm至300μm。一方面，微粉化组合物的颗粒的直径小于150μm、小于100μm或者小于50μm。在其它方面，具有较大直径(例如，150μm至350μm)的颗粒是理想的。在所有情况下，沿颗粒的最长轴测量颗粒的直径。
在一种实施方式中，颗粒的大小可减小至纳米范围。如本领域技术人员所理解的，在施用于伤口后，胎盘组分的纳米颗粒就提高密度和/或增加释放率而言可以是理想的。优选地，微粉化颗粒的粒径为约0.05μm至约2μm、约0.1μm至约1.0μm、约0.2μm至约0.8μm、约0.3μm至约0.7μm、或者约0.4μm至约0.6μm。可选地，微粉化颗粒的粒径为至少0.05μm、至少0.1μm、至少0.2μm、至少0.3μm、至少0.4μm、至少0.5μm、至少0.6μm、至少0.7μm、至少0.8μm、至少0.9μm或者至少1μm。可选地，微粉化颗粒的粒径为小于1μm、小于0.9μm、小于0.8μm、小于0.7μm、小于0.6μm、小于0.5μm、小于0.4μm、小于0.3μm、小于0.2μm、小于0.1μm或者小于0.05μm。
在其它方面，具有一系列不同大小和体积的颗粒是优选的，因为这些颗粒会在伤口中产生不同的释放速率。在一种实施方式中，具有一系列不同的质量体积比的颗粒可通过将单层移植物与多层移植物(例如，2至10层)的混合物微粉化来制备，这样提供一系列不同的移植物大小和体积。在另一实施方式中，可通过将线性移植物压缩成不同大小的三维形状(圆形、椭圆形、长方形等)制备相同组织材料的具有不同表面积体积比的颗粒。随着表面积体积比增加，由于内源性酶等的暴露面积较大而使颗粒损耗也增加。这导致IV型、V型和VII型胶原蛋白、包括纤连蛋白和层粘连蛋白的细胞粘附生物活性因子和微粉化颗粒的其它组分的释放速率更快。另一方面，随着表面积体积比的减小，由于内源性酶等的暴露面积较小而使颗粒损耗降低。这导致IV型、V型和VII型胶原蛋白、包括纤连蛋白和层粘连蛋白的细胞粘附生物活性因子和微粉化颗粒的其它组分的释放速率更慢。总之，使用一层具有不同表面积体积比的微粉化颗粒提供“延时释放”机制，通过所述机制，微粉化移植物的益处既是即时的也是延长的。
在一种实施方式中，表面积体积比(基于如上所述的具有一系列不同直径的球形)为约0.06μm至约6×104μm、约0.06μm至约6×103μm、约0.06μm至约6×102μm或者约0.6μm至约6×102μm。
一方面，微粉化通过机械研磨或机械粉碎实施。另一方面，微粉化通过低温研磨实施。在这方面，在研磨步骤之前或在研磨步骤过程中，用来自集成式冷却系统的液氮连续冷却装有胎盘组分的研磨瓶。因此，使样本变脆并保存挥发组分。此外，最小化或防止羊膜或羊膜膜、中间组织层和绒毛膜中的蛋白变性。一方面，由Retsch生产的CryoMill可用于该方面。
另一方面，在微粉化之前和/或之后，可向胎盘组分的组合物中添加生物活性剂。生物活性剂的实例包括，但不限于，天然生成的生长因子，所述天然生成的生长因子来源于使用自体血收集和分离产物的血小板浓缩液，或来源于库存到期的血液的血小板浓缩液；骨髓穿刺液；来自浓缩的人胎盘脐血干细胞的干细胞，浓缩的羊水干细胞或在生物反应器中生长的干细胞；或抗生素。在将含有生物活性剂的微粉化组合物施用于目标部位后，生物活性剂随时间推移递送至所述部位。
一方面，可使羊膜膜或羊膜与中间组织层或绒毛膜交联。例如，在微粉化之前和/或之后，可向组合物中添加交联剂。一般而言，所述交联剂为无毒且无免疫原性的。当用交联剂处理羊膜膜或羊膜、中间组织层和绒毛膜时，交联剂可以相同或不同。一方面，可用交联剂分别处理羊膜膜或羊膜、中间组织层和绒毛膜，或者，可选地，可用相同的交联剂一同处理羊膜膜或羊膜、中间组织层和绒毛膜。在一些方面，可用两种或多于两种不同的交联剂处理羊膜膜或羊膜、中间组织层和绒毛膜。用于处理羊膜膜或羊膜、中间组织层和绒毛膜的条件可不同。在其它方面，羊膜膜或羊膜、中间组织层和/或绒毛膜可被微粉化，并且随后可用交联剂处理微粉化组合物。一方面，交联剂的浓度为0.1M至5M、0.1M至4M、0.1M至3M、0.1M至2M或0.1M至1M。
所述交联剂一般具有两种或多于两种能够与蛋白质反应生成共价键的官能团。一方面，所述交联剂具有可与存在于羊膜、中间组织层和绒毛膜中的蛋白质上的氨基反应的基团。这种官能团的实例包括，但不限于，羟基、取代氨基或未取代氨基、羧基和醛基。一方面，所述交联剂可为诸如戊二醛之类的二醛。另一方面，所述交联剂可为碳化二亚胺。
一方面，糖为所述交联剂，其中，所述糖可与存在于羊膜、中间组织层和绒毛膜中的蛋白质反应生成共价键。例如，所述糖可通过美拉德反应与蛋白质发生反应，所述美拉德反应通过由还原糖对蛋白质上的氨基的非酶糖基化作用开始，并导致随后生成共价键。可用作交联剂的糖的实例包括，但不限于，D-核糖、甘油糖、阿卓糖、塔罗糖、ertheose、葡萄糖、来苏糖、甘露糖、木糖、古洛糖、阿拉伯糖、艾杜糖、阿洛糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、龙胆二糖、蜜二糖、松二糖、海藻糖、异麦芽糖或者它们的任意组合。
含有骨移植物的微粉化组合物的制备(步骤160)
一旦微粉化颗粒生成，则将其与一种或多于一种骨移植物混合。骨移植物为用于修复骨组织中的缺损或缺陷的组织或材料。骨移植物一般分为四类：获自患者的自体移植物和同种异体移植物、异种移植物和异质移植物。骨移植物一般具有以下特征中的一种或多于一种：(1)成骨能力-存在活细胞；(2)骨诱导性-含有吸引细胞、诱导骨形成和/或加速细胞迁移的非胶原蛋白；和(3)骨引导性-作为细胞迁移的支架并提供磷酸钙。
从髂骨、肋骨、颏或来自上颌结节或拔牙部位的口内松质骨中获得的自体骨具有成骨性、骨诱导性和骨引导性。同种异体移植物材料是指衍生自人尸体的组织，包括髂骨松质骨和骨髓、冻干的皮质骨和松质骨以及去矿物质的冻干的皮质骨和松质骨。Caderivic同种异体移植物具有骨引导性和骨诱导性。异种移植物来自非人类物种。这些移植物材料只具有骨引导性，因为除去了所有或多数蛋白质材料，留下惰性的可吸收的羟磷灰石支架。异质移植物通过合成的方式制得，其包括无孔羟磷灰石、多孔羟磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、氟磷灰石、碳酸磷灰石、硫酸钙、碳酸钙以及它们的组合，并且异质移植物提供不同程度的骨引导性。
可使用本领域已知的技术将微粉化颗粒和骨移植物彼此混合。微粉化颗粒和骨移植物可在生物系统或生物体可耐受的任何赋形剂中配制以生成药物组合物。这种赋形剂的实例包括，但不限于，水、水性透明质酸、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液以及其它水性生理学平衡盐溶液。还可使用非水性载体，例如固定油、诸如橄榄油和芝麻油之类的植物油、甘油三酸酯、丙二醇、聚乙二醇和诸如油酸乙酯之类的可注射的有机酯。其它有用的制剂包括含有促粘剂的悬浮液，所述促粘剂例如羧甲基纤维素钠、纤维素、透明质酸或其盐、甘油、山梨醇、右旋糖酐或者它们的任意组合。赋形剂还可包含少量添加剂，所述添加剂例如提高等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，防腐剂的实例包括硫柳汞、甲酚、福尔马林和苄醇。在一些方面，pH可根据给药方式发生改变。此外，除了本文描述的化合物之外，药物组合物还可包括载体、增稠剂、稀释剂、防腐剂、表面活性剂等等。
可使用本领域已知的技术制备药物组合物。一方面，通过将微粉化颗粒和骨移植物与药学上可接受的化合物和/或载体混合制备所述组合物。
应当理解的是，指定情况下的微粉化颗粒和骨移植物的实际优选的量可根据所使用的具体化合物、配制的特定组合物、施用方式以及所治疗的特定部位和受治者而不同。一方面，微粉化颗粒比骨移植物的量按体积计为1:99至99:1、1:50至50:1、1:10至10:1、2:8至8:2、4:6至6:4或者约1:1。用于给定主体的剂量可使用常规考虑因素确定，例如通过对主题化合物与已知试剂的不同活性进行常规比较来确定，例如，通过合适的常规药理学方案来确定。医师和配方师(确定药物化合物的剂量的本领域技术人员)在根据标准建议(Physician’s Desk Reference，Barnhart出版(1999))确定剂量方面没有问题。
根据期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的部位，本文描述的药物组合物可以多种方式给药。一方面，可通过注射给药，其中，所述微粉化组合物配制成液体、凝胶、油灰状物、糊状物或海绵状物(即，冻干的)。其它方面，所述微粉化组合物可配制成内部施用于受治者。其它方面，所述微粉化组合物可局部施用(包括眼部施用、阴道施用、直肠施用、鼻内施用、经口施用或直接施用于皮肤)。用于局部给药的制剂可包括药膏、洗液、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可为必需的或理想的。
在一些方面，所述微粉化组合物可用于形成三维构建体。例如，可用上文描述的交联剂处理含有骨移植物的微粉化颗粒，然后将其放至具有特定尺寸的模子中。可选地，可将含有骨移植物的微粉化颗粒放至模子中，随后用交联剂进行处理。在其它方面，交联的颗粒可以手工的方式形成为任何期望的形状。不希望受理论的束缚，由较小的微粉化颗粒组成的三维构建体可生成较致密的能够承受机械载荷的产品。可选地，较大的微粉化颗粒可生成较不致密的具有压缩性的构建体。该特征可在非载荷缝隙填充中有用，尤其是可在期望具有可符合不规则形状的产品的非载荷缝隙填充中有用。所述三维构建体可包括一种或多于一种本文所描述的生物活性剂。
II.微粉化组合物的应用
本文描述的微粉化组合物(即，含有骨移植物和不含骨移植物的微粉化颗粒)具有很多医学用途。一方面，本文描述的微粉化组合物具有很多整形外科用途，例如，骨缝隙填充、骨软骨修复、骨移植，包括椎体间融合、横突间融合、新骨折、骨不连骨折、关节重建、胫骨干骺端、足和踝融合、初级和次级牙嵴增高、窦提升、齿窝扩增、位点保存以及牙周骨缺损。一方面，所述微粉化组合物可用于将两种或多于两种骨融合在一起。在图2和图3中描述了这种情况的实例，其中，通过椎体间融合设备将微粉化组合物注射至椎骨(图2)以融合两节椎骨(图3)。
所述微粉化组合物可用于许多伤口愈合应用。一方面，本文描述的微粉化组合物可用于处理或缓解手术后发生的脊柱和周围部位的并发症。一方面，本文描述的组合物可用于预防或减少脊柱或脊柱附近的疤痕生成。如上文所述，手术后在脊柱处或脊柱附近的疤痕形成可使人十分衰弱并可能需要随后进行手术来处理该症状。本领域还使用术语“抗粘附”来指对脊柱处或脊柱附近的疤痕组织的预防。其它方面，本文描述的微粉化组合物可用作保护性屏障，其中，所述组合物保护硬脊膜免受周围手术位点中的术后创伤的影响。例如，所述组合物可预防新切割的诸如椎骨之类的骨中的锐部对硬脊膜的破坏。
根据手术操作，微粉化组合物可直接施用于硬脊膜、脊柱的周围部位以包括神经根，或者它们的组合。由于椎骨的独特结构，所述微粉化组合物可配制成凝胶或糊状物以放置或粘附于受治者体内合适的部位。除了最小化横向移动，所述微粉化组合物还可提供近端和远端屏障覆盖，在所述屏障覆盖中，移动脊髓板层以暴露于受影响的部位。
微粉化组合物可用于预防或减小疤痕形成，所述疤痕形成可由多种与脊柱相关的手术操作引起。可在颈部、中背部或下背部中的任何操作之后使用所述组合物。例如，可在诸如前路腰椎椎体间融合(ALIF)和椎间孔腰椎椎体间融合(TLIF)之类的前路手术或改良的前路手术之后使用所述组合物。在这些方面，所述组合物通过保持与腹膜、大血管和腹肌分离对脊椎手术位点提供额外的保护。所述组合物用作针对粘附和疤痕的减少摩擦的解剖学屏障。例如，所述组合物可预防疤痕组织使主要血管结合于脊柱。疤痕组织使主要血管结合于脊柱是脊柱术后的普遍问题，需要第二次手术操作来解决。
在预防或减小疤痕形成的另一种实施方式中，本文描述的微粉化组合物可与多层组织移植物联合使用，例如美国临时申请第61/683,698号中描述的组合物，该美国临时申请的全部内容通过引用明确并入本文。
在其它方面，所述微粉化组合物可用于牙齿再生操作，包括牙龈萎缩缺损的治疗、垂直和水平牙龈扩增、增加附着的牙龈组织的量、消除系带牵拉、牙种植体周围组织的扩增、牙乳头组织的再生、口腔前庭成形术、引导性组织再生、移植的拔牙窝上的引导性骨再生、骨内骨质缺损、开窗和开裂骨质缺损、初级和次级牙嵴增高、覆盖窦侧窗以及鼻粘膜中溢泪。在涉及口腔黏膜组织的应用中包括治疗口腔溃疡、口腔病损以及替换通过疾病或外伤丢失的较大量的黏膜组织。另一方面，所述微粉化组合物可用作拔牙后的齿窝填充物或者用于填充牙缝隙。图4中描述了该特征，其中，通过本文描述的微粉化组合物填充受治者颌中的缝隙(40)。
实施例
提供以下实施例以向本领域普通技术人员完整公开和描述如何制备和评价本文描述和要求保护的化合物、组合物以及方法，并且以下实施例纯粹是示例性的说明，无意限制发明人认定的发明范围。在数字(例如，数量、温度等)方面努力确保准确性，但是一些误差和偏差应当计算在内。除非另有说明，很多部分为按重量计的部分，温度的单位为℃或者温度为环境温度，压力为大气压或接近大气压。反应条件有大量变化和组合，所述反应条件例如，组分浓度、期望的溶剂、溶剂混合物、温度、压力和其它可用于优化获自上述加工过程中的产物的纯度和产量的反应范围和条件。只需要合理且常规的实验来优化这些加工条件。
实施例1-微粉化颗粒的制备
一方面，微粉化的人羊膜膜血管注射剂由获自胎盘组织的人羊膜和中间层组织组成，所述胎盘组织来源于医院，在医院中，所述胎盘组织在剖腹产术生产的过程中收集。组织的微粉化使用Retsch Oscillating Mill MM400实施。使用磷酸盐缓冲液作为载体。血管注射剂的比例为50mg/mL。浓度比例为在0.70mL磷酸盐缓冲液条件下，60％(21mg)羊膜和40％(14mg)中间组织层。
实施例2-微粉化组合物的制备
一方面，微粉化组合物可如下制备：(1)获得胎盘组织，(2)清洗组织，(3)使组织脱水，(4)磨碎、研磨和/或碾磨脱水组织，(5)滚压颗粒状胎盘组织生成微粉化颗粒，(6)筛选或过滤微粉化颗粒以得到250μm±50μm平均粒径，(7)将干燥微粉化颗粒装入小瓶中，(8)最终灭菌，以及(9)混合微粉化颗粒与骨移植物生成复合移植物，所述复合移植物按体积计为50％微粉化颗粒和50％骨移植物。
另一方面，由微粉化组合物组成的凝胶或油灰状物可通过以下步骤生成：(1)获得胎盘组织，(2)清洗组织，(3)使组织脱水，(4)磨碎、研磨和/或碾磨脱水组织，(5)滚压颗粒状胎盘组织生成微粉化颗粒，(6)筛选或过滤微粉化颗粒以得到250μm±50μm平均粒径，以及(7)使用溶胶-凝胶法将按体积计比例为1:1的微粉化颗粒和骨移植物与生物相容性填充物组合生成凝胶或糊状物，所述生物相容性填充物例如羧甲基纤维素、纤维素透明质酸盐或甘油，所述凝胶或糊状物按重量计为20-80％微粉化组合物和20-80％填充物。所述凝胶或油灰状物可装入注射器中并进一步灭菌。
又一方面，由微粉化组合物组成的泡沫状物可通过以下步骤生成：(1)获得胎盘组织，(2)清洗组织，(3)使组织脱水，(4)磨碎、研磨和/或碾磨脱水组织，(5)滚压颗粒状胎盘组织生成微粉化颗粒，(6)筛选或过滤微粉化颗粒以得到250μm±50μm平均粒径，(7)使用溶胶-凝胶法将按体积计比例为1:1的微粉化颗粒和骨移植物与生物相容性填充物组合生成凝胶或糊状物，所述生物相容性填充物例如羧甲基纤维素、纤维素透明质酸盐或甘油，所述凝胶或糊状物按重量计为20-80％微粉化组合物和20-80％填充物，以及(8)冷冻干燥浆状物生成复合的泡沫状物。
实施例3-含有生物活性剂的微粉化组合物的制备
根据实施例2中列举的步骤制备微粉化组合物。具体而言，以1:1的重量比混合5mg平均粒径为10μm的微粉化胎盘组织与骨移植物生成复合移植物，所述复合移植物按体积计为50％微粉化颗粒和50％骨移植物。然后，以1:1的重量比添加羧甲基纤维素和缓冲液生成适合在骨移植中使用的填充物组合物。随后将填充物组合物等分至单独的容器中，并向各分开的填充物组合物中添加各种不同的生物活性剂生成一系列其中合并有生物活性剂的微粉化组合物，所述各种不同的生物活性剂包括抗炎剂、抗生素和生长因子。
可对本文描述的化合物、组合物和方法做出各种改良和改变。考虑到本文公开的化合物、组合物和方法的说明和实施，本文描述的化合物、组合物和方法的其它方面会变得明显。应当理解的是，本文的说明和实施例是示例性的。

Claims (33)

1.一种微粉化组合物，所述微粉化组合物包括(a)衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒，和(b)一种或多于一种骨移植物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述胎盘组分包括羊膜膜、羊膜、绒毛膜、华通氏胶、胎盘或者它们的任意组合。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微粉化颗粒的粒径小于1,000μm。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微粉化颗粒的粒径为200μm至300μm。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微粉化颗粒为100％微粉化的羊膜。
6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微粉化颗粒为100％微粉化的绒毛膜。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述微粉化颗粒为具有华通氏胶的微粉化的羊膜和/或绒毛膜。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，所述骨移植物为自体移植物、同种异体移植物、异种移植物、异质移植物或者它们的任意组合。
9.如权利要求1所述的组合物，其中，微粉化颗粒比骨移植物的量按体积计为1:99至99:1。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1至9中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体。
11.如权利要求10所述的组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、Hank’s溶液、缓冲液或者非水性载体。
12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液或Tris缓冲液。
13.如权利要求10所述的组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括生物相容性填充物。
14.如权利要求13所述的组合物，其中，所述填充物为羧甲基纤维素、纤维素、透明质酸或其盐、甘油或者它们的任意组合。
15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为可注射的。
16.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中，所述组合物为泡沫状物、凝胶、油灰状物或糊状物。
17.一种由下述方法生成的组合物，所述方法包括：
a.将一种或多于一种胎盘组分微粉化生成微粉化颗粒；和
b.将所述微粉化颗粒与一种或多于一种骨移植物混合。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，步骤(a)通过机械研磨或机械粉碎实施。
19.如权利要求17所述的组合物，其中，步骤(a)通过低温研磨实施。
20.权利要求1至19中任一项所述的组合物在脊柱应用中的用途。
21.一种治疗或预防受治者的关节中的炎症的方法，所述方法包括将权利要求1至19中任一项所述的组合物注射至所述关节中。
22.一种将两种或多于两种骨融合在一起的方法，所述方法包括(1)将权利要求1至19中任一项所述的组合物施用于所述骨中的一种或多于一种以及(2)使所述骨通过所述组合物彼此接触。
23.一种填充骨缝隙的方法，所述方法包括将权利要求1至19中任一项所述的组合物注射至所述缝隙中。
24.一种治疗或预防受治者的关节中的炎症的方法，所述方法包括将微粉化组合物注射至所述关节中，所述微粉化组合物包括衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒。
25.一种将两种或多于两种骨融合在一起的方法，所述方法包括(1)将微粉化组合物施用于所述骨中的一种或多于一种，所述微粉化组合物包括衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒以及(2)使所述骨通过所述组合物彼此接触。
26.一种填充骨缝隙的方法，所述方法包括将微粉化组合物注射至所述缝隙中，所述微粉化组合物包括衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒。
27.一种三维构建体，所述三维构建体包括(a)微粉化的羊膜和中间组织层，其中，用交联剂处理所述微粉化羊膜和中间组织层，以及任选地，(b)一种或多于一种骨移植物。
28.一种三维构建体，所述三维构建体包括(a)微粉化的羊膜膜和绒毛膜，其中，用交联剂处理所述微粉化的羊膜膜和绒毛膜，以及任选地，(b)一种或多于一种骨移植物。
29.权利要求27或28所述的构建体在整形外科应用中的用途。
30.权利要求27或28所述的构建体在脊柱应用中的用途。
31.如权利要求30所述的用途，其中，所述应用为缝隙填充或用于结构支撑。
32.权利要求27或28所述的构建体作为拔牙后的齿窝填充物的用途。
33.一种适合在治疗骨质缺损中使用的微粉化组合物，所述组合物包括
(a)衍生自一种或多于一种胎盘组分的微粉化颗粒；
(b)一种或多于一种骨移植物；
(c)药学上可接受的载体；以及
(d)可生物降解的填充物。
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