CN101434952A - 用于检测淋病奈瑟氏球菌的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的试剂和方法。该方法包括(a)将来自所述样品的核酸和/或其一种或多种扩增子与至少第一核酸引物对在至少一个核酸扩增反应中接触，所述的核酸引物包含至少一个选自下述的核酸：SEQ ID NOS：37－60；与SEQ ID NOS：37－60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37－60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37－60的互补序列及其变体。本发明还涉及与之相关的反应混合物，试剂盒，系统和计算机。

Description

用于检测淋病奈瑟氏球菌的试剂和方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和和核酸化学领域。本发明提供用于检测病原体，例如淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的方法和试剂，因此也涉及医学诊断和预防领域。

发明背景

奈瑟氏球菌属(Neisseria)是由革兰氏阴性需氧细菌组成，其包括作为淋病致病因素的人病原体——淋病奈瑟氏球菌。淋病奈瑟氏球菌感染具有高流行性和低致命性，通常是通过性接触获得，典型地，感染男性尿道黏膜和女性宫颈内膜。但这种感染也能散播到其他组织。例如，如果未经治疗，男性的生殖器感染可以上行尿道产生前列腺的症状，在女性中子宫颈淋病奈瑟氏球菌感染可以扩散至输卵管，最终导致不孕等病症。淋病奈瑟氏球菌的致病机理包括细菌通过菌毛附着于无纤毛的上皮细胞。所述机理还包括产生内毒素和IgA蛋白酶。

经常可以观察到淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)共感染。已知这两种感染是异位妊娠的两种已知病因，未经治疗可导致不育。它们也是急性粘液浓宫颈炎(mucopurulentcervicitis)的急性临床综合症和骨盆炎症疾病(pelvic inflammatorydisease)的已知病因。因此，对于特别是女性中可能是无症状的淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原体感染的检测对于有待进行治疗的个体，对于更广泛的处于获得并进一步传播所述感染的危险的人群而言是非常重要的。

对细菌感染的检测与鉴定通常是通过纯培养分离以及根据样品来源，必要生长条件，可见生长特性，显微形态学，染色反应，生化特性信息的测定方法进行的。例如，已存在的检测并鉴定淋病奈瑟氏球菌的方法包括革兰氏染色法，在选择琼脂培养基上进行培养的方法，以及利用细胞色素氧化酶和碳水化合物利用测试。也有记载利用包括凝集反应和荧光抗体染色的血清学实验对淋病奈瑟氏球菌进行检测。基于培养的方法，虽然相对灵敏，但通常进行得缓慢，经常需要过夜培养因此耗费人力。革兰氏染色和基于抗体实验的方法通常可以在1小时内获得结果，但灵敏性通常低于基于培养的方法。

相对有问题的免疫学方法和已存在的其他方法，利用特异性多核苷酸序列作为探针来识别感染介质是一种可选择的方法。例如，互补于靶核酸序列的核酸探针已应用于用来检测靶核酸序列的，例如Southern印迹、点印迹之类的杂交方法。许多杂交方法均依赖于样品的培养和/或富集因此不适用于快速诊断。聚合酶链式反应等特定核酸序列的快速扩增技术的出现，提供了一种直接将序列特异性探针应用于临床样品的途径，由此无需在进行杂交试验之前对病原体进行富集和体外培养。由此，基于扩增反应的杂交试验可以提供简单、快速地对临床样品中的病原体进行检测的技术。

目前所应用的许多探针相对于诸如，淋病奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)等具有高度核酸序列同源性的病原体之间的差异缺乏足够的特异性。这将导致包括假阳性在内的试验结果的偏差。误诊的结果可能造成对患者施以不当的治疗。

发明简述

本发明提供用于快速检测淋病奈瑟氏球菌的、种特异性的方法和试剂，所述的种特异性的是指无需对奈瑟氏球菌属的其他种或其他属的种进行实质性的检测。例如，本发明的核酸检测试剂(如，核酸探针，序列特异性抗体等)典型地与存在于淋病奈瑟氏球菌而不存在于其他种中的核苷酸序列结合。进一步地，由于感染了淋病奈瑟氏球菌的患者通常也感染有砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，本发明还提供一同检测样品中的淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原体的方法。该方法使患者所要接受的诊断程序最简化，同时也显著的使诊断所需总的花费最低化。除了组合物和反应混合物之外，本发明还涉及用于检测病原体的试剂盒和系统，还涉及相关的计算机和计算机可读介质。

本发明的一个方面提供由下述核酸组成的寡核苷酸，所述的核酸具有选自SEQ ID NOS：37-60或其互补序列的序列。另一方面，本发明提供具有50个或以下的核苷酸的寡核苷酸，所述的寡核苷酸包含下述的核酸，所述的核酸具有选自SEQ ID NOS：37-60或其互补序列的序列。又一方面本发明涉及包括下述核酸的寡核苷酸，所述的核酸与SEQ ID NOS：37-60之一或其互补序列具有至少90％(例如，至少95％，等等)的序列同一性。典型地，在这些实施方案中所述的寡核苷酸是核酸引物、核酸探针等。在这些具体的实施方案中，所述的寡核苷酸具有40个或以下的核苷酸(例如，35个或以下的核苷酸，30个或以下的核苷酸等)。在某些实施方案中，所述的寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。任选地，所述的寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂组成成份(quencher moiety)。在某些实施方案中，所述的寡核苷酸包括至少一个保守性修饰的变异。

本发明的再一方面提供检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的方法，该方法包括(a)将来自所述样品的核酸和/或其一种或多种扩增子与至少第一核酸引物对在至少一个核酸扩增反应中接触，所述的核酸引物包含至少一个选自下述的核酸：SEQ ID NOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。该方法还包括(b)在(a)期间或之后检测所述的核酸和/或来自所述核酸扩增反应的一个或多个其扩增子，由此检测样品中的淋病奈瑟氏球菌。在一些实施方案中，(a)包含将来自所述样品的核酸与与砂眼衣原体核酸至少部分互补的至少第二核酸引物对接触。在这些实施方案中(b)包含在(a)期间或之后检测来自所述核酸扩增反应的一个或多个附加的扩增子，由此检测样品中的砂眼衣原体。在具体的实施方案中，至少一个所述的核酸引物包含经修饰的核酸引物。在一些实施方案中，所述核酸引物中的至少一个包含至少一个标记。在这些实施方案中，(b)任选地包含检测由所述标记产生的可检测的信号，或扩增由所述标记产生的可检测的信号，由此产生经扩增的信号并检测经扩增的信号。在一些实施方案中，(b)包含检测所述的核酸扩增子与一个或多个以可检测的方式结合于下述核酸的核酸检测试剂的结合，所述的核酸为：SEQ ID NO：36组成的序列；与SEQ ID NO：36组成的序列基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：36具有至少90％序列同一性；SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。此处，在具体的实施方案中所述的核酸检测试剂中的至少一个包含寡核苷酸。在特定的实施方案中至少一个所述的核酸检测试剂包含具有下述序列的核酸，所述序列选自：SEQ ID NOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。

典型地，至少一个所述的核酸检测试剂包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂组成成分。在这些实施方案中，(b)任选地包含检测由所述标记产生的可检测的信号，或扩增由所述标记产生的可检测的信号，由此产生经扩增的信号并检测经扩增的信号。

本发明的另一方面提供确定样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌的方法，该方法包括(a)将来自所述样品的核酸与至少第一核酸引物对在至少一个核酸扩增反应中接触，所述的每个核酸引物均具有12-100个核苷酸，其中至少一个所述的核酸引物与SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列包含至少90％序列同一性。该方法还包括(b)在(a)期间或之后检测所述的核酸和/或来自所述核酸扩增反应的一个或多个扩增子，由此检测样品中的淋病奈瑟氏球菌。在一个具体的实施方案中该方法还包括(a)将来自所述样品的核酸与至少第二核酸引物对接触，所述的第二核酸引物对与砂眼衣原体核酸至少部分互补，(b)包含在(a)期间或之后检测来自所述核酸扩增反应的一个或多个附加的扩增子，由此检测样品中的砂眼衣原体。另一方面，所述的方法中，至少一个所述的核酸引物包含经修饰的核酸引物。另一方面其中的(b)包含监测所述的核酸扩增子与一个或多个核酸检测试剂的结合，所述的核酸检测试剂以可检测的方式结合于下述的核酸：SEQID NO：36组成的序列；与SEQ ID NO：36组成的序列基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：36具有至少90％序列同一性；SEQ IDNO：36的互补序列或其变体。又一方面，一个或多个所述的核酸引物具有下述的序列，所述序列选自：SEQ ID NOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。

本发明的另一方面涉及一种试剂盒，其包括(a)至少一个具有50个或以下的核苷酸的寡核苷酸，所述的寡核苷酸包含与SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列至少90％的序列同一性；以及一个或多个：(b)通过监测来自所述样品的核酸和/或其扩增子与所述寡核苷酸的结合来确定样品中存在淋病奈瑟氏球菌的使用说明，其中，样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌是未知的或无确实根据的；(c)至少一个包装至少所述的寡核苷酸的容器。具体地，上述试剂盒中的本发明的寡核苷酸具有下述序列，所述序列选自：SEQ ID NOS：37-60；与SEQ IDNOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。所述的试剂盒还可以进一步包括一种或多种可检测地结合于砂眼衣原体核酸的核酸检测试剂。在一个具体的实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含至少一种酶。

再一方面，本发明涉及一种反应混合物，其包含一组扩增子，所述扩增子具有相应于：SEQ ID NO：36的一个或多个亚序列；与SEQ IDNO：36基本上同一的变体，其中，所述的变体与SEQ ID NO：36具有至少90％的序列同一性；或SEQ ID NO：36的互补序列或其变体，的序列，所述的扩增子缺少终止子核苷酸，其中，所述扩增子组的至少一种亚组是用至少一个下述的核酸引物制备的，所述的核酸引物具有下述序列，所述序列选自SEQ ID NOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。

本发明的核酸检测试剂包括多种实施方案。举例而言，至少一个所述的核酸检测试剂可以包含寡核苷酸(例如，核酸探针，核酸引物等)。典型地，所述的寡核苷酸与下述序列包含至少85％(例如，约90％，约95％等)的序列同一性，所述的序列指：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的亚序列；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：36之一具有至少90％的序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。任选地，所述的寡核苷酸具有约8到约100个核苷酸长度的序列。在具体的实施方案中，所述的寡核苷酸具有下述序列，所述序列选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。任选地，所述寡核苷酸中的至少一个核苷酸是经修饰的。在一些实施方案中，例如，相对于未经修饰的核苷酸，所述核苷酸的修饰是为了改变核酸杂交的稳定性。

进一步地，至少一个所述的核酸检测试剂任选地以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：1中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：1中的第：259，260，262，264，265，266，268，269，273，275，276，277，279，297，298，300，301，302，303，304，305，306，308，313，314，315，316，317，318，320，321，325，326，428，429，431，432，433，434，435，440，441，和447位。作为另外的选择，至少一个所述的核酸检测试剂以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：2中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：2中的第89，90，91，92，95，98，101，105，106，107，216，217，220，222，223，225，233，235，236，238，335，336，337，338，339，342，345，346，和351位。在另外的实施方案中，至少一个所述的核酸检测试剂包含，例如序列特异性抗体。

在具体的实施方案中，所述的核酸、其扩增子，和/或所述的核酸检测试剂包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂组成成分。例如，所述的标记任选地包含荧光染料，弱荧光标记，非荧光标记，显色标记，化学发光标记，生物发光标记，抗体，抗原，生物素，半抗原，质量修饰基团(a mass-modifying group)，放射性同位素，酶等。在这些实施方案中，(b)典型地包含，检测由所述的标记产生的可检测的信号。例如(b)任选地包含(i)扩增由所述的标记产生的可检测的信号以产生扩增的信号，和(ii)检测所扩增的信号。

在一些实施方案中，在(a)之前或期间用至少一种核酸扩增技术扩增至少一个所述的核酸节段以产生其扩增子，和(b)在所述扩增反应期间或之后监测所述的核酸和/或其扩增子与所述核酸检测试剂的结合。例如，所述的核酸扩增技术典型地包含聚合酶链式反应，连接酶链式反应等等。在这些实施方案中，任选地所述的节段是利用至少一个包含下述序列的核酸引物扩增的，所述的序列选自：SEQ IDNOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。在这些实施方案中，所述的核酸引物包含至少一个如上所述的或现有技术中已知的标记。任选地，所述的核酸引物包含经修饰的核酸引物(例如，用以改变核酸扩增特异性的修饰，限制性位点接头等等)。

另一方面，本发明涉及检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的方法。该方法包括(a)将来自所述样品的核酸与包含下述核酸的至少第一核酸引物对在至少一个核酸扩增反应中接触，所述的核酸选自：SEQ IDNOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。此外，所述的方法还包括(b)包含在(a)期间或之后检测所述的核酸和/或来自所述核酸扩增反应的一个或多个扩增子，由此检测样品中的淋病奈瑟氏球菌。在具体的实施方案中，例如，所述的核酸和/或其扩增子包含至少一个选自SEQ ID NOS：28-33的序列。所述的样品典型地来自受试的哺乳动物，例如人受试者。任选地，至少一个所述的核酸引物包含经修饰的核酸引物。在一些实施方案中，例如，所述经修饰的核酸引物包含用以改变核酸扩增特异性的修饰和/或限制性位点接头修饰。在具体的实施方案中(a)包含将来自所述样品的核酸与至少第二核酸引物对接触，所述的第二核酸引物对与砂眼衣原体核酸至少部分互补，(b)包含在(a)期间或之后检测来自所述核酸扩增反应的一个或多个附加的扩增子，由此检测样品中的砂眼衣原体。

在一些实施方案中，至少一个所述的核酸引物包含至少一个标记。所述的标记任选地包含，例如：荧光染料，弱荧光标记，非荧光标记，显色标记，化学发光标记，生物发光标记，抗体，抗原，生物素，半抗原，质量修饰基团，放射性同位素，酶等。在这些实施方案中，(b)典型地包含，检测由所述的标记产生的可检测的信号。例如(b)任选地包含(i)扩增由所述的标记产生的可检测的信号以产生扩增的信号，和(ii)检测所扩增的信号。在具体的实施方案中，(b)包含监测所述的扩增子与一个或多个结合于具有下述序列的核酸的核酸检测试剂的结合，所述的核酸为：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：36的互补序列或其变体。任选地，至少一个所述的核酸检测试剂包含寡核苷酸(例如核酸探针等)。在这些实施方案中，(b)包含检测所述的寡核苷酸与所述的扩增子之间的杂交。任选地，所述的寡核苷酸包含约8到约100个核苷酸长度的序列。在具体的实施方案中，所述的寡核苷酸中的至少一个核苷酸是经修饰的(例如，相对于未经修饰的核苷酸，所述核苷酸的修饰是为了改变核酸杂交的稳定性等)。例如，至少一个所述的核酸检测试剂包含含有下述序列的核酸，所述的序列选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。进一步地，至少一个所述的核酸检测试剂任选地以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：1中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：1中的第：259，260，262，264，265，266，268，269，273，275，276，277，279，297，298，300，301，302，303，304，305，306，308，313，314，315，316，317，318，320，321，325，326，428，429，431，432，433，434，435，440，441，和447位。作为另外的选择，至少一个所述的核酸检测试剂以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：2中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：2中的第89，90，91，92，95，98，101，105，106，107，216，217，220，222，223，225，233，235，236，238，335，336，337，338，339，342，345，346，和351位。在一些实施方案中，至少一个所述的核酸检测试剂包含至少一个序列特异性抗体等。任选地，至少一个所述的核酸检测试剂包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂组成成份。例如所述的标记任选地包含，例如：荧光染料，弱荧光标记，非荧光标记，显色标记，化学发光标记，生物发光标记，抗体，抗原，生物素，半抗原，质量修饰基团，放射性同位素，酶等。在这些实施方案中，(b)典型地包含，检测由所述的标记产生的可检测的信号。在一些实施方案中，(b)任选地包含(i)扩增由所述的标记产生的可检测的信号以产生扩增的信号，和(ii)检测所扩增的信号。

另一方面，本发明涉及检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的方法，该方法包括(a)将来自所述样品的核酸与包含下述核酸的至少第一核酸引物对在至少一个核酸扩增反应中接触，每个核酸引物具有12到100个核苷酸，且其中至少一个所述的核酸引物与SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列包含与至少90％的序列同一性。所述的方法还包括(b)在(a)期间或之后检测所述的核酸和/或来自所述核酸扩增反应的一个或多个扩增子，由此检测样品中的淋病奈瑟氏球菌。典型地，在(a)之前，样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌是未知的或无确实根据的。在一些实施方案中，一个或多个所述的核酸引物具有下述序列，所述序列选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。

另一方面，本发明涉及检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的方法，该方法包括(a)将来自所述样品的核酸和/或其扩增子与至少一个具有12到100个核苷酸的寡核苷酸接触，所述的寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列至少90％的序列同一性。此外，所述的方法还包括(b)监测所述的核酸和/或其扩增子与所述寡核苷酸的结合，其中所述的所述的核酸和/或其扩增子与所述寡核苷酸之间可检测的结合确定所述样品中存在淋病奈瑟氏球菌。典型地，在(a)之前，样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌是未知的或无确实根据的。在具体的实施方案中，一个或多个所述的核酸引物具有下述序列，所述序列选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60；与SEQID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ IDNOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。

另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含来自受试者的样品，和一个或多个选择性结合与具有下述序列的核酸的核酸检测试剂，所述的序列为：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌通常是未知的或无确实根据的。典型地，所述的核酸检测试剂包含至少一个化学合成的核酸。在具体的实施方案中，至少一种所述的核酸检测试剂包含寡核苷酸(例如，核酸探针，核酸引物等等)。典型地，所述的寡核苷酸与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的亚序列，或其互补序列包含至少85％(例如，约90％，约95％等)的序列同一性。在这些实施方案中，所述的寡核苷酸具有约8到约100个核苷酸长度的序列(例如，约12到约50个核苷酸的长度)。在具体的实施方案中，所述的寡核苷酸中的至少一个核苷酸是经修饰的(例如，相对于未经修饰的核苷酸，经修饰的核苷酸改变了核酸杂交的稳定性)。例如，所述的核酸检测试剂可任选地包含至少一个具有下述序列的核酸，所述序列选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。进一步地，至少一个所述的核酸检测试剂任选地以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：1中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：1中的第：259，260，262，264，265，266，268，269，273，275，276，277，279，297，298，300，301，302，303，304，305，306，308，313，314，315，316，317，318，320，321，325，326，428，429，431，432，433，434，435，440，441，和447位。作为另外的选择，至少一个所述的核酸检测试剂以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：2中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：2中的第89，90，91，92，95，98，101，105，106，107，216，217，220，222，223，225，233，235，236，238，335，336，337，338，339，342，345，346，和351位。某些实施方案中，所述的核酸检测试剂包含至少一个序列特异性抗体。在具体的实施方案中，所述的组合物进一步包含至少一种以可检测的方式结合于砂眼衣原体核酸的核酸检测试剂。

典型地，至少一个所述的核酸检测试剂包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂组成成分。例如，所述的标记任选地包含荧光染料，弱荧光标记，非荧光标记，显色标记，化学发光标记，生物发光标记，抗体，抗原，生物素，半抗原，质量修饰基团，放射性同位素，酶等。

本发明的组合物中的核酸检测试剂可以多种形式提供。在一些实施方案中，例如，至少一个所述的核酸检测试剂在溶液中。在另外的实施方案中，为包含至少一个所述的核酸检测试剂的固体支持物。在这些实施方案中，所述的核酸检测试剂非共价或共价地附着于所述的固体支持物。这些实施方案中所述的固体支持物的例子，可任选地选自，例如，平板，微孔板，珠子，微珠(例如，磁性微珠等)，管子(例如，微管等)，纤维，须状物，梳状物，杂交芯片，膜，单晶，陶瓷层，自组装单层等。作为进一步的说明，所述的核酸检测试剂任选地与生物素或生物素衍生物偶联，所述的固体支持物任选地与抗生物素蛋白或其衍生物，或链霉抗生物素蛋白或其衍生物偶联。在一些实施方案中，核酸检测试剂通过一种接头附着于所述的固体支持物上。所述的接头典型地，选自，例如寡肽，寡核苷酸，低聚酰胺，低聚乙烯甘油(oligoethyleneglycerol)，低聚丙烯酰胺(oligoacrylamide)，烷基链等等。任选地，所述的核酸检测试剂由可切割的附加体附着于所述的固体支持物。所述的的可切割的附加体通常可由例如，加热、酶、化学试剂、电磁辐射等方式切割。

另一方面，本发明提供一种包括具有下述序列的一组扩增子的反应混合物，所述的序列相应于SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：36亚序列；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体，其中，所述的扩增子缺少终止子核苷酸。典型地，至少所述扩增子组的亚组是利用至少一个具有下述序列的核酸引物制备的，所述序列选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。在具体的实施方案中，所述的核酸引物包含经修饰的核酸引物，例如，所述经修饰的核酸引物，任选地包含用以改变核酸扩增特异性的修饰，限制性位点接头修饰等等。在某些实施方案中，所述的反应混合物进一步包括另外的一组包含下述序列的扩增子，所述的序列相应于砂眼衣原体核酸序列。

再一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括(a)至少一个具有12到100个或更少的核苷酸的寡核苷酸，所述的寡核苷酸与SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列包含至少90％的序列同一性；和一个或多个：(b)通过监测来自所述样品的核酸和/或其扩增子与所述寡核苷酸的结合来确定样品中存在淋病奈瑟氏球菌的使用说明，其中，样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌是未知的或无确实根据的，或(c)至少一个包装至少所述的寡核苷酸的容器。在这些实施方案中，所述的寡核苷酸包含约8到约100个核苷酸长度的序列。在具体的实施方案中，例如，所述的寡核苷酸具有下述序列，所述序列选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60；与SEQ ID NOS：3-27和37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：3-27和37-60之一具有至少90％序列同一性；SEQ ID NOS：3-27和37-60的互补序列及其变体。进一步地，至少一个所述的核酸检测试剂任选地以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：1中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：1中的第::259，260，262，264，265，266，268，269，273，275，276，277，279，297，298，300，301，302，303，304，305，306，308，313，314，315，316，317，318，320，321，325，326，428，429，431，432，433，434，435，440，441，和447位。作为另外的选择，所述的寡核苷酸以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：2中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：2中的第：89，90，91，92，95，98，101，105，106，107，216，217，220，222，223，225，233，235，236，238，335，336，337，338，339，342，345，346，和351位。在另外的实施方案中，所述的核酸检测试剂是序列特异性抗体。在具体的实施方案中，所述的试剂盒还进一步包括一个或多个与砂眼衣原体核酸特异结合的核酸检测试剂。在这些实施方案中，所述的试剂盒还进一步包括(b)通过监测来自所述样品的核酸和/或其扩增子与所述另外的核酸检测试剂的结合来确定样品中存在砂眼衣原体的使用说明，和/或一个或多个包装所述的另外的核酸检测试剂的容器。在一些实施方案中，所述的试剂盒典型地进一步包括至少一种酶(例如，聚合酶等)和/或一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，所述的核酸检测试剂在溶液中，在另外的实施方案中，为包含至少一个所述的核酸检测试剂的固体支持物。所述的固体支持物可任选地选自，例如，平板，微孔板，珠子，微珠，管子，纤维，须状物，梳状物，杂交芯片，膜，单晶，陶瓷层，自组装单层等。

典型地，所述的寡核苷酸包含至少一种标记和/或至少一种猝灭剂组成成份，标记的例子，例如任选地包含荧光染料，弱荧光标记，非荧光标记，显色标记，化学发光标记，生物发光标记，抗体，抗原，生物素，半抗原，质量修饰基团，放射性同位素，酶等。

再一方面，本发明提供一种用于检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的系统(例如，一种自动系统)，所述系统包括(a)至少一个具有12到100个或更少的核苷酸的寡核苷酸，所述的寡核苷酸与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列包含至少90％的序列同一性。所述系统还包括(b)至少一个检测器，用于检测样品中的核酸和/或其扩增子与所述寡核苷酸的结合，和(c)至少一个与所述检测器可操作连接的控制器，所述的控制器包含一个或多个指令组(instructions sets)，其用于将由检测器检测到的结合与样品中存在的淋病奈瑟氏球菌的存在相关联。所述的寡核苷酸典型地具有选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60或其互补序列的序列。进一步地，至少一个所述的核酸检测试剂任选地以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：1中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：1中的第::259，260，262，264，265，266，268，269，273，275，276，277，279，297，298，300，301，302，303，304，305，306，308，313，314，315，316，317，318，320，321，325，326，428，429，431，432，433，434，435，440，441，和447位。作为另外的选择，所述的寡核苷酸以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：2中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：2中的第：89，90，91，92，95，98，101，105，106，107，216，217，220，222，223，225，233，235，236，238，335，336，337，338，339，342，345，346，和351位。此外，所述的寡核苷酸典型地包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂组成成分。在具体的实施方案中，所述的系统进一步包括一个或多个特异结合于砂眼衣原体核酸的另外的核酸检测试剂，其中，所述的检测器检测样品中的所述核酸和/或其扩增子与上述另外的核酸检测试剂的结合，所述的控制器包含至少一个指令组，其用于将由检测器检测到的结合与样品中存在的砂眼衣原体的存在相关联。在一些实施方案中，至少一个容器或固体支持物包含所述的寡核苷酸。在这些实施方案中，所述的系统任选地进一步包括(d)在所述的容器或固体支持物中的至少一个与所述容器或固体支持物可操作连接的温度调节器，和/或(e)至少一个液体传输部件，其从和/或向所述容器或固体支持物传送液体，用以例如在所述容器内或所述固体支持物上实施一项或多项核酸扩增技术等。

另一方面，本发明提供一种系统，该系统包含(a)包含数据组(dataset)的计算机以及计算机可读介质，所述的数据组包含多个相应于下述多个序列的字符串，所述的多个序列相应于SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：36的亚序列；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。所述的系统还包括(b)与计算机或计算机可读介质的输出设备相连接的自动合成仪，所述的自动合成仪接受来自计算机或计算机可读介质的指令，所述指令指导合成相应于数据组中的一个或多个字符串的一个或多个核酸。典型地，至少一个所述的字符串相应于选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60或其互补序列的序列。

附图简述

图1为淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9(NGDR9)序列(SEQ IDNO：1)与来自多种淋病奈瑟氏球菌菌株(菌株1117，SEQ ID NO：29；菌株1120，SEQ ID NO：30；菌株6346，SEQ ID NO：31；菌株6359，SEQ IDNO：32；和菌株6364，SEQ ID NO：33)的基因组DNA的扩增子序列的序列比对结果。多数(共有)序列为SEQ ID NO：28。

图2表示用于检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的示例性系统的方框图

图3表示包括计算机和计算机可读介质的示例性系统的方框图，在其中涵盖了本发明的多个方面。

图4表示NGDR9序列(SEQ ID NO：1)与猪布鲁氏菌(Brucellasuis)1330染色体I区域(section)155(GenBank

登录号AE014469)的部分序列(SEQ ID NO：34)的ClustalW比对。

图5A和B是表示检测NGDR9的190bp节段的琼脂糖凝胶照片。

图6A和B是检测NGDR9的190bp节段的琼脂糖凝胶照片。

图7是检测NGDR9的416bp节段的琼脂糖凝胶照片。

图8表示淋病奈瑟氏球菌同向重复序列33(NGDR33)(SEQ IDNO：2)与脑膜炎奈瑟氏球菌血清组(serogroup)B菌株MC58区域77

登录号AE002435)的部分序列(SEQ ID NO：35)的ClustalW比对。

图9A和B是检测NGDR33的265bp节段的琼脂糖凝胶照片。

图10是检测NGDR33的265bp节段的琼脂糖凝胶照片。

图11是淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9变体(NGDR9Var)序列(SEQ ID NO：36)与来自多种淋病奈瑟氏球菌菌株(菌株1137，SEQ IDNO：61；菌株6676，SEQ ID NO：62；菌株6677，SEQ ID NO：63；菌株6864A，SEQ ID NO：64；菌株2072，SEQ ID NO：65；菌株3533，SEQID NO：66；和菌株6864B，SEQ ID NO：67)的基因组DNA的扩增子序列的序列以及NGDR9序列(SEQ ID NO：1)的比对结果。

图12A和12B检测NGDR9Var的215bp节段的琼脂糖凝胶照片

图13A和13B是同时检测NGDR9的473bp节段和NGDR9Var的394bp节段的凝胶电泳照片。

发明详述

I.定义

在对本发明进行详细描述之前，需要明确的是本发明并不限于特定的寡核苷酸探针，方法，组合物，反应混合物，试剂盒，系统，计算机或计算机可读介质，它们都是可以变化的。还需要明确的是本申请中所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，并非用于限定。而且除非另有定义此处所定义的所有技术和科学术语均与本发明所涉及的领域的技术人员所公知的含义相同。在本申请所描述和请求保护的发明中，下述的术语及其语法上的变型依照如下所述的定义。

A“5’-核酸酶探针”指包含至少两个标记寡核苷酸探针，其在所述的两个标记中的一个被切割或与所述探针分离时放出强度增加的射线。在具体的实施方案中，例如，5’-核酸酶探针用两种不同的荧光染料，如5’末端报告染料和3’末端猝灭染料或组成成份(moiety)，标记。当所述探针完整时，两个荧光团之间能量转移发生，以使得报告染料发射的荧光猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤中，例如结合于模板核酸的5’-核酸酶探针被，例如Taq聚合酶的5’核酸酶活性切割，由此报告染料发射的荧光不再猝灭。作为5’-核酸酶探针的例子，例如参见U.S.Pat.No.5,210,015，U.S.Pat.No.5,994,056，和U.S.Pat.No.6,171,785所述。

术语“改变(alteration)”指核酸序列的变化，包括但不限于取代，插入和/或缺失。

“扩增反应”指由引物引发的一个或多个靶核酸序列或其互补序列的复制。

“扩增子”指例如在转录，克隆和/或聚合酶链式反应(“PCR”)(例如，链置换PCR扩增(SDA)，双链体PCR扩增等)，或其他核酸扩增技术中，通过拷贝或转录另一分子所得的分子。典型地，所述扩增子是所选择的核酸(例如，模板或靶核酸)或其互补序列的拷贝。

“扩增的信号”指增加的可检测的信号，其可在无扩增反应或在扩增反应期间产生。作为信号扩增技术的例子，例如参见Cao et al.(1995)“Clinical evaluation of branched DNA signal amplification forquantifying HIV type 1 in human plasma，”AIDS Res Hum Retroviruses11(3)：353-361，以及U.S Pat.No.5,437,977，U.S.Pat.No.6,033,853，和U.S.Pat.No.6,180,777。

“抗体”指基本上由至少一个免疫球蛋白基因或至少一个免疫球蛋白基因的片段所编码的多肽，其以可检测的方式参与与配体的结合。该术语包含其天然存在的形式，其片段或衍生物。此处所用的术语范围内的片段包括由各种肽酶消化后所产生的那些，例如Fab，Fab′和F(ab)′2片段，通过化学解离，化学切割所产生的那些片段，只要所述的片段能够以可检测的方式结合于疾病的抗原指示物(antigenindicative of a disease)之类的靶分子即可。

“阵列”指元素的装配组合。这些组合可以是空间上有序的(“模式阵列”)或无序的(“随机模式”阵列)。所述的阵列可以形成或包含一个或多个功能性组成成份(例如，微阵列上的探针区域)，其也可以是非功能性的。

术语“附着(attached)”或“偶联(conjugated)”指材料或化合物彼此之间相连接(connected)或相接合(joined)的相互作用或状态。这些相互作用和/或状态，典型地，由例如共价键，离子键，化学吸附，物理吸附或它们的组合产生。在具体的实施方案中，例如，寡核苷酸探针附着于固体支持物。在这些实施方案中，寡核苷酸探针与生物素相偶联(即，生物素化)，固体支持物与抗生物素蛋白相偶联，由此所述的探针可以通过例如生物素与抗生物素蛋白之间的相互作用附着于所述的固体支持物。

分子种类之间通过共价或非共价相互作用彼此相连时，即它们相“结合(bind)”。例如，两条互补的单链核酸彼此之间可以杂交形成具有至少一个双链区域的核酸。进一步举例，如抗体和相应的抗原之间可以非共价地连接。

术语“切割(cleavage)”指由附着于另一种材料或化合物释放一种材料或化合物的过程。在具体的实施方案中，例如，由固体支持物切割下寡核苷酸以通过液相方法对所述寡核苷酸进行分析，请参见例如Wells et al.(1998)“Cleavage and Analysis of Material fromSingle Resin Beads，”J.Org.Chem.63：6430。

“字符(character)”当用于指字符串中的字符时，是指所述字符串的亚单位。在一个实施方案中，所述字符串中的字符编码所编码的生物分子的亚单位。例如当所编码的生物分子是多核苷酸或寡核苷酸时，所述的字符编码单个的核苷酸。

“字符串(character string)”指任何能够储存序列信息(例如，核酸的核苷酸序列之类的生物分子的亚单位结构等)的单位。在一个实施方案中，所述的字符串可以是简单的字符(字母，数字或其他符号)序列，也可以是这些有形或无形的(例如，电或磁等)信息的数字或代码形式。所述的字符串不必一定为“线性”，也可以多种其他形式存在，例如链接表(linked list)或其它非线性的阵列(例如，用作产生字符的线性阵列的编码)等。字符串典型地，是那些直接或间接地编码寡核苷酸或多核苷酸串的，其包括任何编码串(encrypted strings)或图像或对象排列(arrangements)，其可被明白地转化为代表多核苷酸等(无论其是由天然的还是人工的单体制备的)中的单体或多聚体序列的字符串。

术语“砂眼衣原体(Chlamydia.trachomatis)，”“砂眼衣原体(C.trachomatis)”或“CT”指衣原体属的砂眼衣原体种。请参见例如，Stephens et al.(1998)“Genome sequence of an obligateintracellular pathogen of humans：Chlamydia.trachomatis”Science282：754-759，Kalman et al.(1999)“Comparative genomes ofChlamydia pneumoniae and C.trachomatis，”Nature Genetics21：385-389，and Stephens，Chlamydia：Intracellular Biology， Pathogenesis，and Immunity，ASM Press(1999)。例如，砂眼衣原体基因组全序列的

登录号为NC_000117。请参见例如，Internet网www.stdgen.lanl.ggov上的砂眼衣原体数据库(March 12，2004)。

术语“砂眼衣原体(Chlamydia.trachomatis)核酸”或“砂眼衣原体(C.trachomatis)核酸”指由砂眼衣原体分离或衍生的核酸(和/或其扩增子)。

术语“其互补序列(complement thereof)”指与所给定的核酸具有相同的长度且与之完全互补的核酸。

“组合物”指两种或更多种不同组分的组合。在具体的实施方案中，例如，组合物包含固体支持物，所述固体支持物包含一个或多个寡核苷酸探针，例如共价或非共价附着于所述支持物的表面。在另外的实施方案中，组合物包含溶液中的一个或多个寡核苷酸探针。

本发明中术语核酸序列的“缺失”指核酸序列中的至少一个核苷酸从所述核酸序列的，例如5’-末端，3’-末端，和/或从所述核酸序列的中间位置去除的一种改变。

术语“衍生物”指与一种化学物质(chemical substance)在结构上相关的另一种化学物质，或可由另一种化学物质(即，衍生出该化学物质的化学物质)制备的一种化学物质，例如通过化学或酶的修饰。作为说明，寡核苷酸探针任选地与生物素或生物素的衍生物偶联。作为进一步说明，一个核酸可以通过诸如基于另一种核酸的序列信息由化学合成，或另一种核酸的扩增等方式“衍生”自另一种核苷酸。

术语“以可检测的方式结合”可以以一种或多种检测方法、在背景信号(例如，噪声)以上检测出来的至少两种分子(例如，核酸探针和靶核酸，序列特异性抗体和靶核酸等)的结合。

当另外的核苷酸(或其他类似的分子)掺入到所述核酸中，所述的核酸“延伸(extended)”或“延长”。例如，一种核酸任选地可通过诸如聚合酶之类的核苷酸掺入生物催化剂延伸，所述的聚合酶典型地在核酸的3’末端添加核苷酸。

“延伸的核酸引物”指添加或以另外的方式掺入(例如，与之共价结合)了一个或多个另外的核苷酸的核酸引物。

核酸“杂交”或“结合”其典型地，指在溶液中核酸之间的相互连接。核酸杂交是基于多种已知的物理-化学作用力，例如氢键，溶剂排斥(solvent exclusion)碱基堆积等。有关核酸杂交的详尽指导请参见Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid probe第一部分第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays，”(Elsevier，New York)，以及Ausubel(Ed.)Current Protocols in Molecular Biology，Volumes I，II，and III，1997.Hames andHiggins(1995)Gene probe 1 IRL Press at Oxford University Press，Oxford，England，(Hames and Higgins 1)，Hames and Higgins(1995)Gene probe 2 IRL Press at Oxford University Press，Oxford，England(Hames and Higgins 2)中均提供了有关合成，标记，检测和定量包括寡核苷酸在内的DNA和RNA的详细描述。

“严格杂交洗涤条件”在核酸杂交分析或试验，例如核酸扩增反应，Southern和Northern杂交等中是依赖于序列的，并且根据环境参数的不同而不同。有关核酸杂交的详细指导可参见Tijssen(1993)，supra.以及Hames and Higgins，1和2。

为了实现本发明的目的，通常“高度严格”杂交和洗涤条件选择为，在所定义的离子强度和pH下，低于特定序列的热解链温度T_m至少约5℃的条件。所述的T_m是(在所定义的离子强度和pH下)有50％的所述的试验序列与良好匹配的探针杂交的温度。非常严格的条件是选择的相应于特定的探针的T_m。

Southern或Northern印迹中，互补的核酸在膜上进行的严格杂交的示例性条件为在存在50％甲醛，1mg肝素的条件下，于42℃下杂交过夜。严格的洗涤条件的例子为0.2×SSC于65℃下洗15分钟(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)for a description of SSC buffer)。通常在高度严格条件洗涤前进行低严格条件洗涤以去除背景探针信号。低严格条件洗涤例如2×SSC于40℃下洗15分钟。一般，在具体的杂交试验中，信噪比为所观察到的无关探针(unrelated probe)所得结果的5×(或以上)即表明检测到特异性杂交。

比较杂交(Comparative hybridization)可用于鉴定本发明的核酸。

具体而言，在本发明中检测到严格杂交即表明与例如，序列表中的核酸具有高度的结构相似性。例如希望鉴定出与本发明的示例核酸在严格条件下杂交的试验核酸。对严格杂交的一种检测是与所列出的核酸(例如，具有选自SEQ ID NOS：3-27和37-60及其互补序列的序列的核酸)在严格条件下可检测地杂交的能力。对于任何试验核酸，严格杂交和洗涤条件均可根据经验容易地确定。

例如，在确定严格杂交和洗涤条件时，逐渐提高杂交和洗涤条件的严格度(例如，提高杂交或洗涤过程中的温度，降低盐浓度提高洗涤剂的浓度和/或提高甲醛之类的有机溶剂的浓度)，直至达到所选择的一组标准为止。例如逐渐提高杂交和洗涤条件的严格度直至所述的探针与靶序列(也是，包含一个或多个选自SEQ ID NOS：3-27和37-60以及它们的互补多核苷酸序列的核酸序列)以良好匹配地方式结合，其信噪比至少5倍于所观察到的上述探针与非靶核酸之间的杂交，所述的探针由选自SEQ ID NOS：3-27和37-60以及它们的互补核苷酸序列的一种或多种核酸序列组成，或者所述探针包含选自SEQ ID NOS：3-27和37-60以及它们的互补核苷酸序列的一种或多种核酸序列。此种情况下，非靶核酸来自淋病奈瑟氏球菌之外的生物，在具体的实施方案中，其来自砂眼衣原体。非靶核酸的例子包括，例如

登录号，如AE01469(猪布鲁氏菌1330染色体I区域155)和AE002435(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株MC58区域77)。本领域技术人员可以在，例如

中鉴定出其他的此种序列。

当一种测试核酸与一种探针之间的杂交可以达到所述探针同与之良好匹配的互补靶序列之间的杂交的至少一半程度时，即可称一种试验核酸与一种核酸探针特异性杂交，即其信噪比为所述探针与所述靶在下述条件下的杂交的信噪比的至少一半，所述的条件指良好匹配的探针与良好匹配的互补靶之间的结合的信噪比至少约5到10倍(5×-10×)于其与非靶核酸AE01469(猪布鲁氏菌1330染色体I区域155)或AE002435(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株MC58区域77)之间的杂交的条件。

超高严格杂交(Ultra high-stringency hybridization)和洗涤条件是将杂交和洗涤条件的严格度提高至所述探针同与之良好匹配的互补靶核酸之间的结合的信噪比至少10倍于其与非靶核酸AE01469(猪布鲁氏菌1330染色体I区域155)或AE002435(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株MC58区域77)之间的杂交的信噪比。当一种靶核酸与所述探针在上述条件下的杂交的信噪比至少为所述探针同与之良好匹配的互补靶核酸杂交的信噪比的至少一半时，即可称该靶核酸与所述探针在超高严格条件下结合。

类似地，可以通过逐渐提高相关的杂交试验中杂交和/或洗涤条件的严格度来确定更高水平的严格度。例如提高杂交和洗涤条件的严格度直至探针同与之良好匹配的互补靶核酸之间的杂交的信噪比至少10×，20×，50×，100×，500×或更高于所述探针与非靶核酸AE01469(猪布鲁氏菌1330染色体I区域155)或AE002435(脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株MC58区域77)之间杂交的信噪比来确定严格度。当一种靶核酸与所述探针在上述条件下的杂交的信噪比至少为所述探针同与之良好匹配的互补靶核酸杂交的信噪比的一半时，即可称该靶核酸与所述探针在超-超高严格条件(ultra-ultra-high stringencyconditions)下结合。

检测与SEQ ID NOS：3-27和37-60所示的核酸在高，超高，超-超高严格条件下杂交的靶核酸也是本发明的特征。这种核酸的例子包括与所给定的核酸序列相比，具有一个或少量沉默或保守核酸取代的核酸。

术语两种或以上的核酸或多肽序列之间的“同一的”或百分“同一性”指，两种或以上的序列或亚序列在通过例如，本领域技术人员已知的一种序列比对算法或通过目测检测进行最大相应性(maximumcorrespondence)比较或比对时，相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸。适合于确定百分序列同一性和序列相似性的算法，例如BLAST程序，其相关描述可参见Altschul et al.(1990)“Basic localalignment search tool”J.Mol.Biol.215：403-410，Gish et al.(1993)“Identification of protein coding regions by database similarity search”Nature Genet. 3：266-272，Madden et al.(1996)“Applications ofnetwork BLAST server”Meth.Enzymol.266：131-141，Altschul et al.(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of proteindatabase search proggrams”Nucleic Acids Res. 25：3389-3402，andZhang et al.(1997)“PowerBLAST：A new network BLAST applicationfor interactive or automated sequence analysis and annotation”Genome Res.7：649-656。许多其他的最佳比对算法也是本领域技术人员已知的，并可任意选择用以确定百分序列同一性。

词组“溶液中”指试验或反应条件，在该条件下，试验或反应组分不附着于固体支持物，而是存在于液体介质之中。示例性的液体介质包括水和有机液体。例如在本发明的具体试验中，包括将寡核苷酸探针与淋病奈瑟氏球菌核酸或淋病奈瑟氏球菌核酸扩增子在溶液中一起温育以使其杂交。

核酸序列的“插入”指一种改变，其中至少一个核苷酸添加到核酸序列中，例如添加到其5’-末端，或3’-末端，和/或所述核酸序列的中间位置。

“标记”指一种组成成份(moiety)，其(共价地或非共价地)附着，或能够被附着于，一种分子，所述的标记提供或能够提供有关该分子或与所标记的分子相作用(例如杂交)的另一分子的信息(例如，有关该分子的描述或鉴定等信息)。所述标记的例子包括荧光标记(包括，例如猝灭剂或吸收剂)，弱荧光标记，非荧光标记，显色标记，化学发光标记，生物发光标记，放射性标记，质量修饰基团，抗体，抗原，生物素，半抗原，酶(包括，例如过氧化物酶，磷酸酶等)等等。

“接头”指将一种化合物或取代基共价或非共价地附着于另一种组成成分，如核酸，寡核苷酸探针，核酸引物，扩增子，固体支持物等的化学组成成分。例如，接头是任选地用于将寡核苷酸探针附着于固体支持物(例如，在线性或其他逻辑探针阵列中)。进一步地说明，一种接头任选地将标记(例如，荧光染料，放射性同位素等)附着于寡核苷酸引物，核酸探针等。接头典型地是至少双功能的化学组成成分，在具体的实施方案中，它们包含可切割的附着物，所述的附着物可被例如热，酶，化学试剂，电磁辐射等切割，由此从例如，固体支持物上释放出物质或化合物。小心地选择接头以实现在与化合物的稳定性以及试验方法相适应的适当条件下进行切割。一般而言，接头除了，例如将化学物质连接在一起，或使其保持某种最小距离，或使之保持某种另外的空间相互关系之外，不具备特异的活性。但也可以对接头的组分进行选择以影响所连接的化学物质种类的某种性质，例如三维构象，净电荷，疏水性等。接头的例子包括，寡肽，寡核苷酸，低聚酰胺，低聚乙烯甘油，低聚丙烯酰胺，烷基链等等。有关接头分子的其他描述，可参见，例如Hermanson，Bioconjugate Techniques，ElsevierScience(1996)，Lyttle et al.(1996)Nucleic Acids Res.24(14)：2793，Shchepino et al.(2001)Nucleosides，Nucleotides，& Nucleic Acids20：369，Doronina et al(2001)Nucleosides，Nucleotides，& Nucleic Acids20：1007，Trawick et al.(2001)Bioconjugate Chem.12：900，Olejnik et al.(1998)Methods in Enzymology 291：135，and Pljevaljcic et al.(2003)J. Am.Chem.Soc.125(12)：3486。

“质量修饰(mass modifying)”基团对包含所述基团的分子的质量进行修饰，所述分子的质量，典型地为以道尔顿计的分子量。例如，增大在大小或序列方面存在单个碱基差异的至少两个核酸之间的差异的质量修饰基团有利于利用，例如分子量差异进行测序。

“混合物(mixture)”指两个或多个不同组分的组合。“反应混合物”指包含可参与或有利于给定反应的分子的混合物。“扩增反应混合物”指包含实施扩增反应所必需的混合物的溶液，其典型地包含处于适当的缓冲液中的引物，耐热性DNA聚合酶，dNTP和二价金属离子。当其包含反应所需的所有试剂时为完整的反应混合物，当其仅包含所需试剂的亚组时为不完整的反应混合物。本领域技术人员应当理解，出于方便和储存稳定性以及便于根据情况调整组分浓度的考虑，反应组分通常是储存在单独的溶液中，每种溶液分别包含全部组分的一个亚组，在实施反应之前将所述组分组合起来形成完整的反应混合物。而且，本领域技术人员还应当理解，反应组分单独包装便于其商业化，有用的商业化试剂盒可以包括，含本发明的经修饰的引物在内的反应组分的任何亚组。

“经修饰的核酸引物”指一种核酸引物，其包含对所述核酸引物提供所需性质的核苷酸组成成份(moiety)或序列。在具体的实施方案中，例如，经修饰的核酸引物包含“改变核酸扩增特异性的修饰”例如，减少非特异性核酸扩增(例如，使引物二聚体(primer dimer)等的形成最小化)，提高所需的靶扩增子的量，和/或等。有关改变核酸扩增特异性修饰的例子的描述，参见U.S.Pat.No.6,001,611。其他的核酸引物修饰的例子包括“限制性位点接头修饰”，其指，例如在核酸引物的5’-末端附加了包含所选择的限制性位点的核苷酸序列。优选地，将限制性位点接头附加于核酸引物以对所得的扩增子进行克隆等操作。

“组成成分(moiety)”或“基团”指将某种物质，例如分子，拆分后所得的各部分中的一个(例如，功能型基团，取代基等)。例如寡核苷酸探针任选地包含猝灭剂组成成分，标记组成成分等。

术语“淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，”“淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)，”或“NG”指奈瑟氏球菌属的淋病奈瑟氏球菌种，参见例如Schoolnik(Ed.)Pathogenic Neisseriae：Proceedings of the Fourth International Symposium，Asilomar，California，21-25 October 1984，Amer.Society for Microbiology(1986)。另外的有关淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原体的描述，参见，例如Struthers and Westran，Clinical Bacteriology，ASM Press and Manson Publishing(2003)，Persinget al.，Molecular Microbiology：Diagnostic Principles and Practice，ASMPress(2003)，Murray，Manual of Clinical Microbiology，8th Ed.，ASMPress(2003)。还可参见Internet网上www.stdgen.lanl.gov的淋病奈瑟氏球菌数据库(March 12，2004)。

术语“淋病奈瑟氏球菌核酸(Neisseria gonorrhoeae nucleicacid)”或“淋病奈瑟氏球菌核酸(N.gonorrhoeae nucleic acid)”指由淋病奈瑟氏球菌衍生或分离的核酸(和/或其扩增子)。

术语“核酸”指核苷酸(例如，核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，双脱氧核糖核苷酸等)以及包含所述核苷酸共价连接在一起所形成的聚合物，其可以为线性的或带有分枝的形式。核酸的例子包括，脱氧核糖核苷酸(DNAs)，核糖核苷酸(RNAs)，DNA-RNA杂合体，寡核苷酸，多核苷酸，基因，cDNAs，适配体，反义核酸，干扰RNAs(RNAis)，分子信标，核酸探针，肽核酸(PNAs)，锁定核酸(LNA^TMs)，PNA-DNA偶联物(conjugates)，PNA-RNA偶联物，LNA^TM-DNA偶联物，LNA^TM-RNA偶联物等。

尽管如下所述在某些情况下可能具有经改变的骨架的核酸类似物也包括在内，但典型地，核酸为单链或双链形式，通常包含磷酸二酯键，所述的经改变的骨架包括但不限于例如，磷酰胺(Beaucage et al.(1993)Tetrahedron 49(10)：1925以及其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem. 35：3800；Sprinzl et al.(1977)Eur.J.Biochem. 81：579；Letsinger et al.(1986)Nucl.Acids Res. 14：3487；Sawai et al.(1984)Chem.Lett. 805；Letsinger et al.(1988)J.Am.Chem.Soc. 110：4470；和Pauwels et al.(1986)Chemica Scripta 26：1419)，硫代磷酸(Mag et al.(1991)Nucleic Acids Res. 19：1437；和U.S.Pat.No.5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu et al.(1989)J.Am.Chem.Soc. 111：2321)，O-甲基氨基磷酸酯键(O-methylphophoroamidite linkages)(参见Eckstein，oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，OxfordUniversity Press(1992))，以及肽核酸骨架以及连接键(参见，Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc. 114：1895；Meier et al.(1992)Chem.Int.Ed. Engl. 31：1008；Nielsen(1993)Nature 365：566；和Carlsson et al.(1996)Nature 380：207)。其他的核酸类似物包括带有正电荷骨架的(Denpcy etal.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097)；非离子的骨架的(U.S.Pat.Nos.5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141 and 4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English 30：423；Letsinger et al.(1988)J. Am.Chem.Soc. 110：4470；Letsinger et al.(1994)Nucleoside & Nucleotide 13：1597；Chapters 2 and 3，ASC Symposium Series 580，“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”，Ed.Y.S.Sanghvi and P.Dan Cook；Mesmaeker et al.(1994)Bioorganic & Medicinal Chem.Lett. 4：395；Jeffs et al.(1994)J.Biomolecular NMR34：17；和Tetrahedron Lett. 37：743(1996))，和非核糖骨架的，以及下述参考文献中所描述的U.S.Pat.Nos.5,235,033 and 5,034,506，andChapters 6 and 7，ASC Symposium Series 580，CarbohydrateModifications in Antisense Research，Ed.Y.S.Sanghvi and P.DanCook。包含一个或多个碳环糖的核酸也包含在本发明的所定义的核酸的范围内(参见Jenkins et al.(1995)Chem.Soc.Rev.pp169-176)。还可参见Rawls，C & E News Jun.2，1997 page 35中所述的几种核酸类似物。进行这些核糖-磷酸骨架的修饰可利于诸如标记等附加组成成分的添加，或改变所述分子在生理环境下的稳定性或半衰期。

除了这些典型地存在于核酸中天然存在的杂环碱基(例如，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶)，核酸类似物还包括那些具有非天然存在的杂环或经修饰的碱基的，其中许多在本申请中进行了描述或引用。具体而言，许多非天然存在的碱基可参见，Seela et al.(1991)Helv.Chim.Acta 74：1790，Grein et al.(1994)Bioorg.Med.Chem. Lett. 4：971976，and Seela et al.(1999)Helv.Chim.Acta 82：1640。更进一步地，任选地，包括用作解链温度(T_m)调节剂的、用于核苷酸中的具体的碱基。例如，其中的一些包括：7-脱氮杂嘌呤(7-deazapurines)(例如，7-脱氮杂鸟嘌呤，7-脱氮杂腺嘌呤等)，吡唑[3，4-d]嘧啶，丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU，丙炔基-dC等)等。参见，例如U.S.Pat.No.5,990,303。其他的代表性的杂环碱基包括、例如、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基6-氯嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基6-氯嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷和黄嘌呤的7-脱氮杂-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶，氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘代尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。

经修饰的碱基和核苷酸的例子还可参见U.S.Pat.No.5,484,908，U.S.Pat.No.5,645,985，U.S.Pat.No.5,830,653，U.S.Pat.No.6,303,315，and U.S.Pat.Application Pub.No.2003/0092905。

术语“核酸检测试剂”指以可检测的方式(例如，核酸杂交中的氢键，抗原抗体识别等，或其他类型的结合相互作用)结合于下述核酸的试剂，所述的核酸包含：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：36的互补序列或其变体。例如，包含选自SEQ ID NOS：3-27和37-60或其互补序列的序列的核酸(例如，核酸引物，核酸探针等)与具有上述序列的核酸特异性结合。其他的示例性核酸检测试剂包括特异性结合于包含下述序列的核酸的序列特异性抗体，所述序列为：SEQID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。

“核苷酸”指核苷的酯，如核苷的磷酸酯。例如，核苷酸可以包括共价连接于核苷的糖组成成分的5’位置的1，2，3，或更多个磷酸基团。

“核苷酸掺入生物催化剂”指催化核苷酸掺入核酸的催化剂。典型的核苷酸掺入生物催化剂是酶。“酶”是基于蛋白质-和/或核酸的催化剂，其降低涉及其他化合物或“底物”的化学反应所需的活化能量。“核苷酸掺入酶(nucleotide incorporating enzyme)”指在例如核酸扩增反应中可催化核苷酸掺入到核酸中的酶。核苷酸掺入酶的例子，如聚合酶，末端转移酶，反转录酶，端粒酶，多核苷酸磷酸化酶等。

“寡核苷酸”指包括至少两个核酸单体单元(例如核苷酸)，优选多于三个单体单元，更优选多于10个单体单元，的核酸。一种寡核苷酸的实际大小通常依赖于多种因素，包括所述寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可任选地由适当的方法制备，所述方法包括但不限于分离已存在的或天然的序列，适合序列的DNA复制或扩增，反转录，克隆和限制性酶切，直接的化学合成法，如Narang et al.(1979)Meth.Enzymol. 68：90-99中所述的磷酸三酯法；Brown et al.(1979)Meth.Enzymol. 68：109-151所述的磷酸二酯法；Beaucage et al.(1981)Tetrahedron Lett. 22：1859-1862所述的二乙基氨基磷酸盐(diethylphosphoramidite法；Matteucci et al.(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191所述的三酯法等方法；或通过自动合成方法；或U.S.Pat.No.4,458,066所述的固体支持物法或其他已知的方法。

术语“寡核苷酸探针”“核酸探针(probe nucleic acid)，”或“探针”指能够在适当的条件下与靶核酸选择性杂交的标记的或非标记的寡核苷酸。典型地，探针与核酸样品中所包含的靶序列充分互补(例如，包含下述序列的淋病奈瑟氏球菌的核酸，所述序列为：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体)，砂眼衣原体核酸序列等)，并与所述的靶序列在选择的杂交条件例如但不限于严格杂交条件下，形成稳定的杂交双链。利用所述探针在足够严格的杂交条件下进行杂交试验可以选择性的检测特定的靶序列。术语“杂交区域”指核酸中恰好或基本上互补于靶序列、并因此与之杂交的区域。为了在杂交试验中应用以区分序列中的单核苷酸差异，杂交区域典型地为约8到约100个核苷酸的长度。尽管所述的杂交区域通常指全部的寡核苷酸，所述的探针也可以包含另外的核苷酸序列，所述的核苷酸序列作为例如，接头结合位点，以提供使所述探针序列附着于固体支持物等的位点。在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸探针包含一个或多个标记(例如，报道染料，猝灭剂组成成分等)，例如FRET探针，分子信标等，其可用于检测所述探针与样品中的靶核酸之间的杂交。在某些实施方案中，所述的寡核苷酸探针的杂交区域与靶序列完全互补，但通常并不需要完全的互补；稳定的双链可以包含错配碱基或非配对碱基。可能需要对所述严格条件进行修饰以适应带有一个或多个错配或非配对碱基的稳定杂交双链。Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)中提供了对所述适当修饰的指导。靶/探针双链的稳定性依赖于多种因素，其包括寡核苷酸的长度，寡核苷酸的碱基组成和序列，温度，离子条件。本领域的技术人员了解，一般而言，给定的探针的互补序列同样可用作探针。示例性的本发明的探针包括选自SEQ ID NOS：3-27和37-60及其互补序列的序列，其结合于具有下述序列的淋病奈瑟氏球菌的核酸，所述序列选自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。本领域技术人员也了解，在具体的实施方案中，核酸探针也可以用作核酸引物。

“核酸引物(primer nucleic acid)”或“引物”是能够与模板核酸(例如，包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体的淋病奈瑟氏球菌核酸，砂眼衣原体核酸等)杂交，且可以利用聚合酶之类的核苷酸掺入生物催化剂，在合适的条件下使链延伸或延长的核酸。引物核酸，典型地是天然的或合成的寡核苷酸(例如单链寡脱氧核糖核苷酸等)。尽管其他的核酸引物的长度可任选地使用，它们典型地包含长度为约8到约100个核苷酸的杂交区域。短核酸引物通常更低的温度以与作为模板的淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体核酸形成充分稳定的杂合复合物。与作为模板的淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体核酸的亚序列至少部分互补的核酸引物，典型地，足以与所述模板杂交、引发链的延伸。需要时，核酸引物可以是经标记的，即掺入可通过，例如光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、化学的或其它技术检测的标记。例如，有用的标记包括放射性同位素，荧光染料，电子密度试剂(electron-dense reagents)，酶(如ELISA中所常用的酶)，生物素，或半抗原以及抗血清或单克隆抗体获得的蛋白质。许多此类或其他的标记还包括在本申请中进一步描述的和/或本领域技术人员已知的那些。本发明的核酸引物的例子包括含有选自SEQ ID NOS：3-27和37-60及其互补序列的序列，其结合于具有下述序列的淋病奈瑟氏球菌的核酸，所述的序列选自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。本领域的技术人员了解在具体的实施方案中，核酸引物也可以用作核酸探针。

“猝灭剂组成成分”或“猝灭剂”指一种组成成分，其降低和/或能够降低由另外的发射下述射线的发射源发射的、可检测的射线，例如荧光或发光射线的发射。猝灭剂典型地，可降低由所述的发射源发射的可检测的射线的至少50％，优选至少80％，更优选至少90％。猝灭剂的例子可参见，例如U.S.Pat.No.6,465,175。

术语“样品”指任何含有或推测含有淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸的物质，其包括但不限于由一个或多个受试者或个体分离的组织或液体，体外细胞培养成分，以及临床样品。示例性的样品包括血液，血浆，血清，尿，滑液、精液、精清、前列腺液、阴道液、子宫颈液、子宫液、子宫颈的刮离物、羊水、肛门的刮离物、粘液、痰、组织等。

词组“来自受试者的样品”指由受试者获得的样品，无论在进行分析之前是否对所述样品实施一个或多个加工步骤(例如，细胞裂解，碎片去除和稳定化等)。例如所述样品可以通过刮取、静脉穿刺、拭子法、活组织检查或其他本领域已知的技术由受试者获取。

术语核酸检测试剂的“选择性地结合”或“选择性结合”指：与在相同的杂交条件下，所述核酸检测试剂与来自表X和表XI中的至少三种生物的核酸的结合相比，所述核酸检测试剂以更大的程度结合于具有下述序列的淋病奈瑟氏球菌核酸，所述的序列选自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。

术语“选择性地检测”指：与检测来自其他生物的核酸相比，能更大程度地检测具有下述序列的淋病奈瑟氏球菌核酸的能力，所述序列选自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。

“选择性地杂交”或“选择性杂交”出现在，与下述核酸序列与非靶核酸之间的杂交相比，该核酸序列以可检测的、更高的程度与特异的靶核酸序列杂交的情况下。选择性地杂交的序列彼此之间具有至少50％，或60％，或70％，或80％，或90％序列同一性或更高，例如优选95-100％序列同一性(即：互补性)。

核酸“序列”指核酸中的核苷酸顺序和核苷酸本身。序列典型地按照5’到3’的方向进行阅读。

“序列特异性抗体”指可检测地结合于具有下述序列的核酸的抗体，所述序列选自：SEQ ID NO：l，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。

“测序反应”指设计用于阐明给定的核酸的核苷酸序列的反应，其包括例如应用终止子核苷酸

“组(set)”指至少两个事物的集合。例如一组可以包括2，3，4，5，10，20，50，100，1,000或其他数量的分子或序列类型。例如，本发明的某些方面包括具有扩增子组的反应混合物。“亚组(subset)”指组的任何部分。

“固体支持物”指能够连接或附着，例如寡核苷酸探针等化学组成成分的固体物质。示例性的固体支持物的例子包括：平板，珠子，微珠，管子，纤维，须状物，梳状物，杂交芯片(包括微阵列底物，包括用于

探针阵列(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA，USA)的那些等等)，膜，单晶，陶瓷层，自组装单层等。

如果存在于寡核苷酸和靶序列之间的错配数量少于所述寡核苷酸与可能存在于所述样品中的非靶序列之间的错配数量，则寡核苷酸探针对于靶序列而言是“特异的”。可以选择杂交条件，在该条件下，只有所存在的错配数量不高于所述寡核苷酸于所述靶序列之间的错配数量时，才能形成稳定双链。在这种条件下所述的靶特异性寡核苷酸可以与靶序列形成稳定的双链。因而在适合的严格扩增条件下，应用靶特异性引物可以特异性地扩增包含靶引物结合位点的那些序列。类似地，在适当的严格杂交条件下，应用靶特异性探针能够检测特异性的靶序列。

“受试者(subject)”指生物体。典型地，所述生物体是哺乳动物，特别是人。在具体的实施方案中，例如，是怀疑具有NG和/或CT感染的患者。

“亚序列(subsequence)”或“节段(segment)”指完整的核酸序列的任何部分。

核酸或多肽的“基本上同一的变体(substantially identicalvariant)”指通过例如序列比较算法或目测检测对最大相应性(maximum correspondence)进行比较或比对时，彼此之间具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的核苷酸或序列同一性的两个或以上的序列。所述的基本上同一通常存在于所述序列中至少约15个核苷酸或氨基酸长度的区域，或至少约20个核苷酸或氨基酸长度的区域，更优选所述序列基本上同一出现在至少约25个核苷酸或氨基酸长度的区域。在一些实施方案中，例如，在所比较的核酸或多肽的全长区域的序列基本上同一。SEQ ID NO：36可视为SEQ ID NO：1的变体的例子。

术语核酸序列的“取代”指一种改变，其中核酸序列中的至少一个核苷酸被一种不同的核苷酸所替换。

术语“靶序列，”“靶区域，”和“靶核酸”指核酸中待扩增、检测和另外分析的区域。

“终止子核苷酸”指，例如通过至少一个核苷酸掺入生物催化剂掺入到核酸序列中即可阻止所述核酸进一步延伸的核苷酸。

“耐热性酶”指一种酶，当其在所选定的一段时间内处于提高的温度下时，所述的酶是热稳定的、耐热的且保持足够的催化活性。例如在使双链核酸变性所需的时间段内处于提高的温度下的耐热性聚合酶保持足够的活性以使得接下来的延伸反应进行。核酸变性所需的加热条件是本领域已知的并可参照U.S.Pat.Nos.4,683,202和4,683,195中的说明。本申请中所用的耐热性聚合酶典型地适合于在诸如聚合酶链式反应(“PCR”)之类的热循环反应中应用。对于耐热性聚合酶，酶活性指催化所述的核苷酸以适当的方式组合形成与模板核酸(例如，淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原体基因组中所选择的亚序列)互补的引物延伸产物。

II.综述

本发明涉及选择性地检测淋病奈瑟氏球菌。具体而言，利用本发明的方法和试剂，根据利用淋病奈瑟氏球菌基因组中的两个靶区域中的至少一个的新的检测策略，即可诊断淋病奈瑟氏球菌感染。在淋病奈瑟氏球菌基因组中这些靶区域中的每一个均具有多个拷贝。因此，相对于靶向基因组中单个拷贝的区域，利用本发明的方法明显有利于检测样品中的淋病奈瑟氏球菌。此外，本发明的核酸检测试剂在所选择的试验条件下，通常以可检测的方式结合于存在于淋病奈瑟氏球菌但不存在于其他物种的核苷酸序列，由此使得例如出现假阳性的情况最小化。该特异性在例如图5-7，9，和10，以及下述实施例的相关描述中进行了说明。此外，还描述了本发明其他的诸多特征。

为了进一步进行举例说明，本发明的具体方法包括使核酸检测试剂与来自受试者(如怀疑受到淋病奈瑟氏球菌感染的患者等)的样品的、或所述样品中的核酸相接触或温育(incubate)。在具体的实施方案中，样品中的核酸的靶区域在与所述核酸检测试剂接触时或接触前进行扩增。所述的核酸检测试剂以可检测的方式结合于具有下述序列的核酸，所述序列选自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：36的互补序列或其变体。如下所述，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2是相应于本发明的方法所靶定的淋病奈瑟氏球菌基因组的两个区域的共有序列；SEQ ID NO：36是SEQ ID NO：1的变体。这些方法还包括(例如，在单一的时间点，在多个离散的时间点，以及在所选定的时间段内连续地等)监测所述的核酸和/或其扩增子与所述核酸检测试剂的结合，由此确定样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌，例如用来诊断获取所述样品的患者，监控被诊断为受淋病奈瑟氏球菌感染的患者的治疗过程等。

在某些实施方案中，所述的方法进一步包括使靶区域的所述的核酸和/或其扩增子与另外的可以与砂眼衣原体核酸以可检测的方式结合的核酸检测试剂接触。在这些实施方案中，所述的方法还包括监控所述的核酸和/或扩增子与上述另外的核酸检测试剂的结合，以确定样品中是否还存在砂眼衣原体。任选地，这些方法也利用另外的样品(例如，来自同一受试者)重复一次或多次以监测，例如被诊断为受淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体感染的患者的治疗过程，感染的复发等。

本发明的其他方法包括使来自样品的核酸与至少第一核酸引物对在核酸扩增反应中相接触或孵育，所述的核酸引物对包括至少一个选自：SEQ ID NOS：3-27和37-60或其互补序列的核酸。如下所述，SEQ ID NOS：3-27和37-60是包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：36的亚序列的寡核苷酸。此外这些方法还包括在所述扩增反应期间或之后检测扩增子，由此检测样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌。任选地，这些方法还包括将来自所述样品的核酸与至少部分地与砂眼衣原体核酸互补的至少第二核酸引物对接触，并在扩增反应期间或之后检测另外的扩增子，由此确定样品中是否存在砂眼衣原体。这些方法，任选地，可以在所选择的时间点重复进行。

除了组合物和反应混合物之外，本发明还涉及用于检测这些病原体的试剂盒和系统，并涉及相关的计算机和计算机可读性介质。

III.核酸检测试剂

本发明的核酸检测试剂包含多种实施方案，包括核酸探针，核酸引物和序列特异性抗体。核酸检测试剂中的一些靶向重复序列130(此处也称作“NGDR9”)，其是淋病奈瑟氏球菌基因组中806bp的同向重复序列，据认为其编码某种蛋白质。淋病奈瑟氏球菌基因组包括两个拷贝的NGDR9，一个位于第458182-458988位核苷酸，另一个位于第1586504-1587310位核苷酸。如表I所示，NGDR9的共有序列相应于SEQID NO：1。尽管表1只示出NGDR9位点的一条链，本领域的技术人员可以理解SEQ ID NO：1标识出了双链基因组核酸区域，所列的序列信息完全可以表明双链的序列。

表I

例如包含SEQ ID NOS：3-12，17-20，24-26或其互补序列的核酸检测试剂靶向NGDR9或其互补序列。SEQ ID NOS：3-12，17-20，和24-26如表II所示。

表II

 

SEQ ID NO：3	5′-CGTTCTCTCAATGCCCAATCA-3′
		SEQ ID NO：4	5′-AGCAGACGAAGCGGATACCTC-3′
SEQ ID NO：5	5′-CTCTCAATGCCCAATCATAAAGC-3′
		SEQ ID NO：6	5′-GTATCCGCTTCGTCTGCTTTATC-3′
SEQ ID NO：7	5′-GTTTGGCGGCAAGCATCT-3′
		SEQ ID NO：8	5′-AAATGGGATGCTGTCGTCAA-3′
SEQ ID NO：9	5′-GGCAAGCTTGTTTGGCGGCAAGCATCT-3′
		SEQ ID NO：10	5′-GGCGGATCCTTGACGACAGCATCCCATTT-3′
SEQ ID NO：11	5′-AAACGCAATCTTCAAACACCTCA-3′
		SEQ ID NO：12	5′-TTTGACGGCCTCACGCATAA-3′
SEQ ID NO：17	5′-CGAGGTCGCCGAATTTAAATTGATAGTT-3′
		SEQ ID NO：18	5′-AACTATCAATTTAAATTCGGCGACCTCG-3′
SEQ ID NO：19	5′-CGAGGTCGCCGAATTTAAATTGATAGTTCA-3′
		SEQ ID NO：20	5′-TGAACTATCAATTTAAATTCGGCGACCTCG-3′
SEQ ID NO：24	5′-GATAAAGCAGACGAAGCGGATAC-3′
		SEQ ID NO：25	5′-TTGACGACAGCATCCCATTT-3′
SEQ ID NO：26	5′-TTATGCGTGAGGCCGTCAAA-3′

本发明另外的核酸检测试剂靶向重复116(此处也称作“NGDR33”)，其是淋病奈瑟氏球菌基因组中1142bp的同向重复序列，据认为其编码某种多肽。淋病奈瑟氏球菌基因组包括两个拷贝的NGDR33，一个位于第491768-492910位核苷酸，另一个位于第1606987-1608129位核苷酸。如表III所示，NGDR33的共有序列相应于SEQ ID NO：2。尽管表III只示出NGDR33位点的一条链，本领域的技术人员可以理解SEQ ID NO：2标识出了双链基因组核酸区域，所列的序列信息完全可以表明双链的序列。

表III

例如相应于SEQ ID NOS：13-16，21-23，27，或其互补序列的核酸检测试剂靶向NGDR33或其互补序列。SEQ ID NOS：13-16，21-23，和27如表IV所示。

表IV

 

SEQ ID NO：13	5′-TCAATGTCGGGTTTGACGAA-3′
		SEQ ID NO：14	5′-AACGTCCGACAACCGGTAAC-3′
SEQ ID NO：15	5′-AATGTCGGGTTTGACGAAACTC-3′
		SEQ ID NO：16	5′-GTTACCGGTTGTCGGACGTT-3′
SEQ ID NO：21	5′-GCGGCAATCAGGGCAATATGGTAT-3′
		SEQ ID NO：22	5′-ATACCATATTGCCCTGATTGCCGC-3′
SEQ ID NO：23	5′-GGCGGCAATCAGGGCAATATGGTAT-3′
		SEQ ID NO：27	5′-AACGTCCGACAACCGGTAAC-3′

在具体的实施方案中，当靶定NGDR9时，探针和/或引物任选地以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：1中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：1中的第：259，260，262，264，265，266，268，269，273，275，276，277，279，297，298，300，301，302，303，304，305，306，308，313，314，315，316，317，318，320，321，325，326，428，429，431，432，433，434，435，440，441，和447位。这些核苷酸位点在表V中突出显示并用下划线标出，其代表与猪布鲁氏菌1330染色体I区域155序列(

登录号AE014469)的具体的错配实例，所述的错配已在NGDR9和猪布鲁氏菌1330染色体I区域155的比对中得以确认。这一序列与猪布鲁氏菌基因组的其他错配如图4所示。与来自其他细菌种的序列相比，猪布鲁氏菌基因组的这一序列与NGDR9具有更高的同一性。在下述的实施例部分进一步描述了NGDR9序列和猪布鲁氏菌序列的比对。

表V

在一些实施方案中，当靶定NGDR33时，探针和/或引物任选地以可检测的方式结合于包含一个或多个选自SEQ ID NO：2中的下述核苷酸位点的核酸节段，所述的核苷酸位点为SEQ ID NO：2中的第：89，90，91，92，95，98，101，105，106，107，216，217，220，222，223，225，233，235，236，238，335，336，337，338，339，342，345，346，和351位。这些核苷酸位点在表V中突出显示并用下划线标出，其代表与脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株MC58区域77序列(

登录号AE002435)的具体的错配实例，所述的错配已在NGDR33与脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株MC58区域77的序列比对中得以确认。这一序列与脑膜炎奈瑟氏球菌基因组的其他错配如图8所示。与来自其他细菌种的序列相比，脑膜炎奈瑟氏球菌基因组的这一序列与NGDR33具有更高的同一性。在下述的实施例部分进一步描述了NGDR33序列和脑膜炎奈瑟氏球菌序列的比对。

表VI

本发明的其他核酸检测试剂靶向重复序列130的变异序列(也称作“NGDR9Var”)。NGDR9Var相应于SEQ ID NO：36的共有序列如表A所示。尽管表A只示出NGDR9Var位点的一条链，本领域的技术人员可以理解SEQ ID NO：36标识出了双链基因组核酸区域，所列的序列信息完全可以表明双链的序列。

表A

例如，包含SEQ ID NOS：37-45或其互补序列的核酸检测试剂靶向NGDR9Var或其互补序列。SEQ ID NOS：37-45如表B所示。

表B

 

SEQ ID NO：37	5’-GTTTCGACAGGCTTGCGAAC-3’
		SEQ ID NO：38	5’-GTTTCGACAGGCTTGCGAA-3’
SEQ ID NO：39	5’-TTTGTTGTTGCCGTTTGCA-3’
		SEQ ID NO：40	5’-CCTGTTTGCGACAAAGAGGA-3’
SEQ ID NO：41	5’-TGCGACAAAGAGGATTCCAA-3’
		SEQ ID NO：42	5’-TTCCCGCGCCTGCCTGATTCCTA-3’
SEQ ID NO：43	5’-ACATCCGCACCGTAGGAATCAGGCA-3’

 

SEQ ID NO：44	5’-AATCCCGACATCCGCACCGTAGGAATCA-3’
		SEQ ID NO：45	5’-AATCCCGACATCCGCACCGTAGGAAT-3’

本发明的其他核酸检测试剂靶向NGDR9和NGDR9Var。例如包含SEQ ID NOS：46-60或其互补序列，靶NGDR9和NGDR9Var或其互补序列的核酸检测试剂。这些序列可以称作“通用”序列。SEQ IDNOS：46-60如表C所示：

表C

 

SEQ ID NO：46	5’-CGTTTGGCGGCAAGCATC-3’
		SEQ ID NO：47	5’-GCGGCAAGCATCTGTTTTGC-3’
SEQ ID NO：48	5’-GTAGCAGGCGCGAAGATTGAA-3’
		SEQ ID NO：49	5’-AGTAGCAGGCGCGAAGATTGA-3’
SEQ ID NO：50	5’-GGGCGGAAGAATTTGCAGATTA-3’
		SEQ ID NO：51	5’-GCCATCAGAAAAGCGATTGAAA-3’
SEQ ID NO：52	5’-GGACAAAACCGCCATCAGAAA-3’
		SEQ ID NO：53	5’-TAATCTGCAAATTCTTCCGCCCTTCAATCTT-3’
SEQ ID NO：54	5’-TTTATCTAATCTGCAAATTCTTCCGCCCTTCA-3’
		SEQ ID NO：55	5’-CAAATTCTTCCGCCCTTCAATCTTCGC-3’
SEQ ID NO：56	5’-CTTCAATCTTCGCGCCTGCTACTTGCC-3’
		SEQ ID NO：57	5’-AAGATTGAAGGGCGGAAGAATTTGCAGATTA-3’
SEQ ID NO：58	5’-GCGAAGATTGAAGGGCGGAAGAATTTG-3’
		SEQ ID NO：59	5’-TCAGGGCTTCGTCTTCCGA-3’
SEQ ID NO：60	5’-TTTAAAGCCTCGTTCCGCAA-3’

如上所述，在本发明的具体实施方案中，核酸检测试剂包含寡核苷酸(例如，核酸探针，核酸引物等)。尽管可以任选地应用其他的长度，但通常寡核苷酸包含的序列典型地在约8到约100个核苷酸长度之间，更优选在约10到约75个核苷酸的长度，更优选在约12到约50个核苷酸的长度，更优选在约15到约35个核苷酸的长度，(例如，约20，约25，或约30个核苷酸的长度)。制备寡核苷酸的方法，例如下面进一步描述的核酸合成方法。

本领域的技术人员可以利用多种方法设计寡核苷酸(例如，具有下述序列的核酸的基本上同一的变体，所述序列选自SEQ ID NOS：3-27和37-60或其互补序列)，所述的寡核苷酸以可检测的方式结合于NGDR9和/或NGDG9Var，或NGDR33，所述的寡核苷酸可用于检测淋病奈瑟氏球菌。为了进行说明，可以利用可由DNASTAR公司(Madison，WI)获得的的DNAstar软件包进行序列比对。例如可将NGDR9和猪布鲁氏菌或NGDR33和脑膜炎奈瑟氏球菌的核酸序列作为单独的文件上传到DNAstar EditSeq程序中。在DNAstar MegAlign序列比对程序中打开几对序列文件(例如，NGDR9和猪布鲁氏菌)，应用Clustal W比对方法。用于Clustal W比对的参数任选地为所述软件中设置的默认值。MegAlign一般不提供两个序列之间百分同一性的概要信息。这通常为人工计算。通过上述的比对，通常可以鉴定彼此之间具有，例如小于85％同一性的区域，可将这一区域中的寡核苷酸序列选择出来。也可以任选地利用许多其他的序列比对算法和软件包。序列比对算法也描述于，例如，Mount，Bioinformatics：Sequence and Genome Analysis，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)，和Durbin et al.，Biological Sequence Analysis：Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids，Cambridge University Press(1998).

为进一步说明，用于比较的最佳序列比对可以通过下述方式实施，例如Smith & Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482所述的局部同源算法，Needleman & Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443所述的同源比对算法，Pearson & Lipman(1988)Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA85：2444的相似性检索方法，和通过计算机实施这些算法(GeneticsComputer Group的Wisconsin Genetics软件包(Madison，WI)中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，甚或通过目测观察。

适合于确定百分序列同一性的算法的另一个例子为BLAST算法，其在如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中有详细描述。BLAST分析的软件运行版本公众可以由Internet网上的国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information)www.ncbi.nlm.nih.gov/(March 12，2004)获得。该算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字符(short words of length W)鉴定高得分序列对(high scoring sequence pairs，HSPs)，当其与数据库序列中相同长度的字符比对时，匹配或满足某种为正值的阈值得分T(positive-valued threshold score T)。T指邻近字符得分阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul et al.，supra)。这些起始的邻近字符命中项作为起始检索其中包含它们的更长的HSP的种子(seeds)。然后这些字符命中项沿着每个序列向两个方向延伸直至累计比对值(cumulative alignment score)可增加。对于核苷酸序列累计值用参数M(一对匹配残基的奖励得分(reward score)；总是>0)和N(错配残基的罚分(penalty score)；总是<0)。对于氨基酸序列利用得分矩阵(scoring matrix)计算累计得分。由于一个或多个负得分残基比对累计或达到任何序列的末端而出现下述的情况下，每一方向上的字符命中项延伸暂停，即当累计比对得分由最大获得值减少数量X时；当累积值变为0或以下时。BLAST算法参数W，T，和X确定所述比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)作为缺省值使用字长(W)为11，期望值(E)为10，截断(cutoff)为100，M＝5，N＝-4，且比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62得分矩阵作为缺省值(参见Henikoff &Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

除了计算百分序列同一性，BLAST算法还可以进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin & Altschul(1993)Proc.Nat’1. Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测定方法为最小总和几率(smallest sum probability，P(N))，其对两个核苷酸序列或两个氨基酸序列之间的匹配偶然出现的可能性提供一种指示。例如，如果在测试核酸和参考核酸的比较中，最小总和几率小于约0.1，或小于约0.01，甚或小于约0.001则认为这种核酸与参考核酸相似(且，因此同源)。

有用的序列比对算法的另一例子是PILEUP.PILEUP发明的用渐进(progressive)配对(pairwise)比对(alignments)对一组相关序列进行多重序列比对。它还可以绘制成树状图以显示用于创建比对的簇关系(clustering relationships)。PILEUP应用一种Feng & Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35：351-360的渐进比对方法(progressive alignmentmethod)的简化方法。所用的这一方法类似于Higgins & Sharp(1989)CABIOS 5：151-153所描述的方法。所述的程序可以比对，例如最长5,000个字母长度的最多达300个序列。对重比对方法由两个最相似的序列的配对比对开始，产生两个相比对的序列的簇。然后将该簇与下一个相关序列或经比对的序列的簇相比对。两个序列簇可以通过两个单个序列的配对比对的简单延伸进行比对。最终的比对是由一系列的渐进，配对比对实现的。该程序还可以用于绘制代表簇关系的树形图(dendogram)或树。所述的程序可以通过指定序列比较区域中特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标(coordinates)来运行。

本发明的探针和引物任选地包括如下所述的一个或多个标记。此外，探针和引物任选地包括多种其他的修饰，例如改变杂交解链温度的经修饰的核苷酸，有利于扩增子克隆的限制性位点接头，提高核酸反应特异性的修饰基团等。例如任选地包含用于提高杂交解链温度的经修饰的核苷酸可以使更小的探针和引物得以应用，例如那些包括约8到约14个核苷酸的。这些经修饰的寡核苷酸的例子包括具有一个或多个LNA^TM单体的寡核苷酸。核苷酸类似物，例如U.S.Pat.No.6,639,059，U.S.Pat.No.6,303,315，和U.S.Pat.Application Pub.No.2003/0092905中所描述的。包含LNA^TM单体的寡核苷酸可以通过商业途径，例如Exiqon A/S(，DK)获得。其他的探针和引物修饰指包括在上述定义中的那些。

在具体的实施方案中，所述的核酸检测试剂是序列特异性抗体，其靶向：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：36上文中有详细描述并分别示于表I，表II和表A中。适用于这些实施方案的抗体可以通过常规的方法和/或遗传工程方法制备。抗体片段可以是遗传工程化的，例如来自轻链和/或重链的可变区(V_H和V_L)，包括超变区在内，或来自V_H和V_L区。例如，此处所用的术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体以及其生物活性片段，以及可能的“单价”抗体(Glennie et al.(1982)Nature 295：712)；包括共价或非共价聚合的Fab′和F(ab′)₂片段的Fab蛋白；单独的轻链或重链，优选地，重链和轻链的可变区(V_H和V_L区域)，更优选地，包括超变区(也被称作V_H和V_L区域的互补决定区(CDRs))；F_c蛋白；能够与一个以上的抗原相结合的“杂合”抗体；恒定-可变区嵌合体；具有不同来源的重链和轻链的“复合(composite)”免疫球蛋白；由标准的重组技术，诱变技术或其他本领域已知的定向进化技术制备的特异性或其他特性得以改善的“改变(altered)”的抗体。

本申请中的序列特异性抗体可以是经标记的或未经标记的。适合的标记包括例如，放射性核素、酶、辅酶、荧光染料、化学发光的染料、色素原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、自由基、等等。这种标记的试剂可以用于多种已知的试验，如放射免疫试验，酶免疫试验，例如ELISA，荧光免疫试验等，参见U.S.Pat.Nos.3,766,162；3,791,932；3,817,837；和4,233,402.其他的标记在本申请中作进一步描述。

在一些实施方案中，靶定由NGDR9和NGDR33以及NGDR9Var编码的、经转录的RNAs和/或经翻译的蛋白用于检测。许多用于检测RNAs和/或蛋白的技术是本领域已知的。例如，本发明的核酸引物和探针可以用于反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试验，用以检测NGDR9和/或NGDR9Var，或NGDR33转录产物。并且，多种电泳试验(例如，SDS-PAGE等)，免疫试验，质谱试验(例如，基于衬质辅助激光解析-电离(MALDI)的试验，基于表面增强激光解析-电离(SELDI)试验等)，和/或其他可用于检测由NGDR9和/或NGDR9Var，或NGDR33编码的蛋白的方法。这些以及许多其他适用于检测RNA和蛋白的方法可参见本申请所引用的参考文献。

许多常规的分子生物学以及重组DNA技术均可任选地用于实施本发明。这些技术已在下述文献中公开，例如：Current Protocols in Molecular Biology，Volumes I，II，and III，1997(F.M.Ausubel ed.)；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；Bergerand Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II，1985(D.N.Glover ed.)；Oligonucleotide Synthesis，1984(M.L. Gait ed.)；Nucleic Acid Hybridization，1985，(Hames and Higgins)；Transcription and Translation，1984(Hames and Higgins eds.)；Animal Cell Culture，1986(Freshney ed.)；Immobilized Cells and Enzymes，1986(IRL Press)；Perbal，1984，A Practical Guide to Molecular Cloning；the series，Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells，1987(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，Cold SpringHarbor Laboratory)；Methods in Enzymology Vol.154 and Vol.155(Wuand Grossman，and Wu，eds.，respectively).

IV.序列变体

本发明涉及许多核酸和多肽序列。例如，图1示出淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9(NGDR9)序列与多种淋病奈瑟氏球菌菌株基因组DNA的至少部分扩增子的序列比对。更具体而言，扩增来自5株淋病奈瑟氏球菌菌株(即，NG菌株1117，1120，6346，6359，和6364)的基因组DNA并用相应于DK101(SEQ ID NO：7)和DK102R(SEQ ID NO：25)的核酸引物进行测序。如图1所示，NGDR9序列中用下划线示出寡核苷酸DK101、DK102R的互补序列(即，DK102(SEQ ID NO：8))，和寡核苷酸NG519(SEQ ID NO：5)以及NG514(SEQ ID NO：6)的位置。此外，还示出了所述的DR9序列和5株淋病奈瑟氏球菌菌株的多数(majority)或共有序列。

进一步地，具体的NGDR9-相关核酸序列变体的例子涉及Gene ID号NG0465，NG0466，NG0467，IGR0389，IGR0390，NG1616，NG1617，NG1618，IGR1318，和IGR1319，具体的NGDR33-相关核酸序列变体的例子涉及Gene ID号NG0518，NG0519，NG0520，IGR0430，IGR0431，NG1649，NG1650，IGR1345，和IGR1346，以上均可在Internet网址www.stdgen.lanl.gov(March 12，2004)获得。但是NGDR9Var序列(SEQ ID NO：36)2007年8月1日以前未在任何公众可以获得的数据库中公开。SEQ ID NO：36是在对NGDR9进行广泛的序列分析研究中意外鉴定出的。

沉默的变异

本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性可以产生多种编码NGDR9和NGDR33以及NGDR9Var多肽的核酸序列，其中的一些可能与本申请中所阐述的核酸序列具有最低的序列同源性。NGDR9多肽的例子涉及Gene ID号NG0465，NG0466，NG0467，NG1616，NG1617，和NG1618，NGDR33多肽的例子涉及Gene ID号NG0518，NG0519，NG0520，NG1649，和NG1650，以上均可在Internet网址www.stdgen.lanl.gov(March 12，2004)获得。

表VII

密码子表

 

氨基酸	密码子
		丙氨酸      Ala  A半胱氨酸    Cys  C天冬氨酸    Asp  D谷氨酸      Glu  E苯丙氨酸    Phe  F甘氨酸      Gly  G组氨酸      His  H异亮氨酸    Ile  I赖氨酸      Lys  K亮氨酸      Leu  L甲硫氨酸    Met  M天冬酰胺    Asn  N脯氨酸      Pro  P谷胺酰胺    Gln  Q精氨酸      Arg  R丝氨酸      Ser  S苏氨酸      Thr  T缬氨酸      Val  V色氨酸      Trp  W酪氨酸      Tyr  Y	GCA    GCC   GCG   GCUUGC    UGUGAC    GAUGAA    GAGUUC    UUUGGA    GGC   GGG   GGUCAC    CAUAUA    AUC   AUUAAA    AAGUUA    UUG   CUA   CUC   CUG   CUUAUGAAC    AAUCCA    CCC   CCG   CCUCAA    CAGAGA    AGG   CGA   CGC   CGG    CGUAGC    AGU   UCA   UCC   UCG    UCUACA    ACC   ACG   ACUGUA    GUC   GUG   GUUUGGUAC    UAU

例如研究上述密码子表(表VII)可见密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，和CGU全部编码精氨酸。因此在本发明的核酸的任何位置的编码精氨酸的密码子均可替换为上述的任何相应的密码子而不会对所编码的多肽带来改变。已知RNA序列中的U相应于DNA序列中的T。

“沉默变异”是如下所述的“保守修饰变异”中的一种。本领域技术人员了解，核酸序列中的每种密码子(除通常只编码甲硫氨酸的AUG密码子之外)均可通过标准的技术进行修饰以编码功能同一的多肽。因此每种编码一种多肽的沉默变异均包含于所述的任何序列中。本发明提供基于可能的密码子选择的组合制备的、编码NGDR9和NGDR33以及NGDR9Var多肽的任一和全部可能的核酸序列变体。这些选择是根据用于编码NGDR9和NGDR33以及NGDR9Var多肽的核酸序列的标准的三联体密码(例如，表1所示的)制备的。本申请中的每个核酸的全部所述变异均基于序列与密码子的组合进行提供并描述。

保守变异

具体的核酸序列的“保守性修饰的变异”或简称为“保守变异”指编码同一的或基本上同一的氨基酸序列的核酸，或者，当所述的核酸序列不编码氨基酸序列时，指编码基本上同一的序列。本领域技术人员了解，在所编码的序列中改变，添加或缺失单个或小比例的(优选小于5％，更优选小于4％，2％或1％)氨基酸的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰的变异”，其中，所述的改变导致氨基酸的缺失，添加，由一种化学性质相似的氨基酸取代另一种氨基酸。

提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域已知的。表VIII列出了6组，其包含彼此之间可进行“保守取代”的氨基酸。

表VIII

保守取代组

 

1	丙氨酸(A)     丝氨酸(S)    苏氨酸(T)
		2	天冬氨酸(D)   谷氨酸(E)
3	天冬酰胺(N)   谷氨酰胺(Q)
		4	精氨酸(R)     赖氨酸(K)
5	异亮氨酸(I)   亮氨酸(L)    甲硫氨酸(M)    缬氨酸(V)
		6	苯丙氨酸(F)   酪氨酸(Y)    色氨酸(W)

由此，所述的NGDR9或NGDR33或NGDR9Var多肽的“保守取代的变异”包括用处于相同保守性取代组的、保守性选择出的氨基酸取代所述多肽序列中小比例的，优选小于5％，更优选小于2％或1％的氨基酸。

不改变所编码的核酸分子的活性的序列添加，如添加非功能性的序列也属于基础核酸的保守性变异。

本领域的技术人员了解，本申请所述的多种核酸序列的保守性变异均得到功能上等同的核酸。例如，根据上述的遗传密码子的简并性，“沉默取代”(即，在核酸序列中不导致其所编码的多肽的改变的取代)是所有编码氨基酸的核酸序列所包含的特征。类似地，在氨基酸序列中的一个或一些氨基酸的“保守氨基酸取代，”是用具有高度相似性质的不同氨基酸的取代，也已容易地鉴定出与已公开的结构具有高度的相似性。每一公开序列的这种保守性变异也属于本发明的特征。

V.探针和引物的合成

本发明的寡核苷酸探针和引物可任选地利用本领域已知的任何技术制备。在具体的实施方案中，例如，所述的寡核苷酸探针主要利用核酸合成方法由化学合成制备，所述的核酸合成方法包括，例如Beaucage and Caruthers(1981)，Tetrahedron Letts. 22(20)：1859-1862，所述的固相氨基磷酸三酯法(phosphoramidite triester method)或本领域已知的其他合成方法，例如利用自动合成仪，如Needham-VanDevanteret al.(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-6168所述进行合成。自动合成寡核苷酸的多种设备均可通过商业途径获得。也可任选地利用多核苷酸合成方法(例如三核苷酸合成等)。而且本发明所述的核酸引物任选地包括多种修饰。在具体的实施方案中，例如，引物包括限制性位点接头，例如，以利于所得的扩增子的克隆等。此外，如U.S.Pat.No.6,001,611所述，还可任选地对引物进行修饰以提高扩增反应的特异性。引物和探针也可以利用本申请所述的以及本领域已知的多种其他的修饰合成。

基本上可以任选地利用任何标记来标记本发明的核酸检测试剂。在一些实施方案中，例如，所述的标记包含荧光染料(例如，罗丹明染料(例如，R6G，R110，TAMRA，ROX等)，荧光素染料(例如，JOE，VIC，TET，HEX，FAM等)，卤素荧光素染料，花青染料(例如，CY3，CY3.5，CY5，CY5.5等)，

染料(例如，FL，530/550，TR，TMR等)，ALEXA 

 染料(例如，488，532，546，568，594，555，653，647，660，680等)，二氯罗丹明染料，能量传递染料(例如，BigDye^TM v1染料，BIGDYE^TMv2染料，BIGDYE^TMv3染料等)，荧光素染料(例如，荧光素黄等)，CASCADE Oregon Green等。其他的荧光染料的例子参见，例如Haugland，Molecular Probe Handbook of FluorescentProbe and Research Products，Ninth Ed.(2003)及其更新。荧光染料通常可通过多个供应商获得，例如Molecular Probe，Inc.(Eugene，OR)，Amersham Biosciences Corp.(Piscataway，NJ)，Applied BioSystems(Foster City，CA)等其他标记包括，例如生物素，弱荧光标记(Yin et al.(2003)Appl Environ Microbiol. 69(7)：3938，Babendure et al.(2003)Anal. Biochem. 317(1)：1，and Jankowiak et al.(2003)Chem Res Toxicol.16(3)：304)，非荧光标记，显色标记，化学发光标记(Wilson et al.(2003)Analyst.128(5)：480，和Roda et al.(2003)Luminescence 18(2)：72)，拉曼标记，电化学标记，生物发光标记(Kitayama et al.(2003)Photochem Photobiol. 77(3)：333，Arakawa et al.(2003)Anal.Biochem. 314(2)：206，and Maeda(2003)J.Pharm.Biomed.Anal. 30(6)：1725)，和α-甲基-PEG标记的试剂，参见U.S.临时专利申请No.60/428,484。下文将对核酸标记进行进一步地描述。

此外，基本上任何核酸(事实上的任何标准的或非标准的标记核酸)均可按照习惯或常规由多种来源获得，如The Midland CertifiedReagent Company，The Great American Gene Company，ExpressGen Inc.，Operon Technologies Inc.，Proligo LLC等。

VI.样品的制备和核酸扩增

样品通常来自或分离自怀疑受淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体感染的受试者，优选为哺乳动物，更优选为人。样品或样本的例子包括血液，血浆，血清，尿，滑液、精液、精清、前列腺液、阴道液、子宫颈液、子宫液、子宫颈的刮离物、羊水、肛门的刮离物、粘液、痰、组织等。基本上，任何获取这些样品的技术均可任选地使用，例如通过刮取、静脉穿刺、拭子法、活组织检查和其他本领域已知的技术获取。进一步地，例如由受试者获取的咽拭子。在具体的实施方案中，例如作为筛选淋球菌咽炎等的一部分。

储存样本，培养细胞，以及从这些来源分离和制备核酸的方法均是本领域已知的，在本申请所引用的参考文献以及下述的实施例中有进一步的说明。

进一步地，例如在对本申请的靶核酸进行分析之前，可以从典型地包括不同组分的复合混和物的样品中纯化或分离这些核酸。优选地，裂解所收集的样品中的细胞以去除细胞内容物。例如在具体的样品中的淋病奈瑟氏球菌和其他细胞可通过与多种酶、化学物质接触来裂解，和/或通过本领域已知的，例如降解细菌细胞壁等的其他方法裂解。在一些实施方案中，可以在细胞裂解物中直接对核酸进行分析。在另外的实施方案中，在进行检测之前将核酸从细胞裂解物中进一步纯化或提取出来。基本上任何核酸提取方法均可用于纯化用于本发明方法中的样品中的核酸。可用于纯化核酸的示例性的技术包括，例如亲和层析，与固定于固体支持物上的探针杂交，液-液提取(例如，酚氯仿提取等)，沉淀(例如，利用乙醇等)，用滤纸提取，利用微团形成试剂提取(例如，十六烷基-三甲基-溴化铵等)，结合于固定的插入染料(例如，溴化乙锭，吖啶等)，在离液序列高的条件(chaotropic condition)下的硅胶或硅藻土吸附，磁性玻璃颗粒或有机硅烷颗粒吸附等。有关样品加工的内容还可参见US Pat.Nos.5,155,018，6,383,393，和5,234,809。

进一步地，例如，未经修饰的核酸可结合于带有二氧化硅表面的材料。本领域已知的许多此类方法均可任选地采用以实施本发明的方法，例如Vogelstein et al.(1979)Proc. Natl.Acad.Sci.USA 76：615-619，描述了利用研碎的含铅玻璃(ground flint glass)在碘化钠存在下由琼脂糖凝胶纯化核酸。Marko et al.(1982)Anal.Biochem. 121：382-387描述了在高氯酸钠存在下在玻璃粉上由细菌纯化核酸。DE-A 3734442中，通过玻璃纤维滤器纯化核酸。将结合于玻璃纤维滤器上的核酸清洗后，用含甲醇的Tris/EDTA缓冲液洗脱。Jakobi et al.(1988)Anal. Biochem. 175：196-201中描述了类似的方法。具体而言Jakobi等描述了在离液序列高的盐溶液中，将核酸选择性地结合于玻璃表面，由杂质中分离核酸，所述的杂质例如琼脂糖，蛋白质和细胞残留物。为了从所述的杂质中分离玻璃颗粒可以通过离心所述的颗粒或者将所述的液体通过玻璃纤维滤器过滤。此外，所述的在加盐和乙醇沉淀后利用磁性颗粒将核酸固定的有关内容参见例如Alderton et al.(1992)Anal.Biochem. 201：166-169and PCT/GB91/00212。在该方法中，所述的核酸与磁性颗粒凝集在一起。通过施加磁场和一个或多个洗涤步骤将上述的凝集物从最初的溶剂中分离出来。在至少一个洗涤步骤之后，优选将所述的核酸溶于Tris缓冲液中。

覆有一层，包括例如链霉抗生物素蛋白的多孔玻璃基质中的磁性颗粒也可用于本发明的实施方案。这些颗粒可用于，例如，分离生物素-偶联的核酸和蛋白质。可任选地应用亚铁磁、铁磁和超顺磁性颗粒。适合用于本发明的方法的磁性玻璃颗粒以及相关方法的描述还可参见，例如WO 01/37291。

一种最有效、最基本的用于分离和检测核酸的技术是核酸扩增技术。在本发明中，优选地将对所感兴趣的核酸的扩增在DNA检测之前或与之同时进行。此外，所述的寡核苷酸探针任选地可在例如化学合成等之后进行扩增。在一些实施方案中，例如利用分枝核酸或其他本领域已知的核酸扩增形式扩增可检测的信号。

适用于所述的寡核苷酸的扩增方法包括，例如多种聚合酶和连接酶介导的扩增方法，如聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，链置换扩增(SDA)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，滚环扩增(RCA)等。多种文章和/或教科书中均可找到应用这些和其他扩增方法的详细描述，例如Berger，Sambrook，Ausubel，和PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis et al.eds)Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(1990)(Innis)，Schweitzer et al.(2001)“Combining nucleicacid amplification and detection，”Curr Opin Biotechnol.12(1)：21-27。许多现有的生物书籍中对于PCR和相关的扩增方法有进一步的讨论。关于核酸扩增还可参见Mullis et al.，(1987)U.S.Patent No.4,683,202，以及Sooknanan and Malek(1995)Biotechnology 13：563.Improvedmethods of amplifying large nucleic acids by PCR are summarized inCheng et al.(1994)Nature 369：684.在具体的实施方案中，利用双链PCR扩增靶核酸。关于双链PCR扩增在下述文献中有进一步的描述，例如Gabriel et al.(2003)“Identification of human remains byimmobilized sequence-specific oligonucleotide probe analysis of mtDNAhypervariable regions I and II，”Croat.Med.J. 44(3)293和La et al.(2003)“Development of a duplex PCR assay for detection ofBrachyspira hyodysenteriae and Brachyspira pilosicoli in pig feces，”J. Clin.Microbiol. 41(7)：3372。任选地，利用经标记的引物(例如，生物素化的引物，Scorpion引物等)扩增样品中的核酸，例如以便于检测扩增子等。Scorpion引物在，例如Whitcombe et al.(1999)“Detection ofPCR products using self-probing amplicon and fluorescence”Nat Biotechnol. 17(8)：804-807中也有描述。关于标记下文有进一步的描述。

可任选地通过任何本领域已知的方法从其他反应组分中回收并纯化扩增子，所述方法包括，电泳，层析，沉淀，透析，过滤和/或离心。关于核酸纯化可参见，例如Douglas et al.，DNA Chromatography，Wiley，John & Sons，Inc.(2002)，and Schott，Affinity Chromatography： Template Chromato graphy of Nucleic Acids and Proteins，Chromatographic Science Series，#27，Marcel Dekker(1984)。在具体的实施方案中，在进行检测前并不对扩增子进行纯化。对于扩增子的检测在下文中有进一步的描述。

VII.探针阵列

在本发明的具体实施方案中，所述的寡核苷酸探针可共价地或非共价地附着于固体支持物，然后再将其与包含经扩增或标记的、来自受试者的样品接触。在另外的实施方案中，本发明的探针游离于溶液中。基本上可任选地采用任何基质(substrate)材料用于本发明的这些方面。在具体的实施方案中，例如，所述的基质可由硅、玻璃或聚合材料(例如，玻璃或聚合的载玻片，硅片等)制备。适用的玻璃或聚合的基质包括，载玻片等可由供应商，例如Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)等处购买。在一些实施方案中，用于本发明的固体支持物是膜。适合的膜材料任选地选自，例如聚芳酰胺膜、聚碳酸酯膜、多孔塑料基质膜(例如，

 Porous Plastic等)，多孔金属基质膜，聚乙烯薄膜、聚(亚乙烯基二氟化物)膜、聚酰胺膜、尼龙膜、陶瓷的膜、聚酯膜、聚四氟乙烯

膜、编织网孔膜、微滤膜、纳米滤膜、超滤膜、渗析膜、复合膜、亲水膜、疏水膜、基于聚合体的膜、基于非聚合体的膜、粉状活性炭膜、聚丙烯膜、玻璃纤维膜、玻璃膜、硝酸纤维素膜、纤维素膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维薄膜、聚砜膜、聚醚砜膜、聚烯烃膜等。许多这述的膜材料均可通过多种商业途径获得，例如P.J.Cobert Associates，Inc.(St.Louis，MO)，MilliporeCorporation(Bedford，MA)等。其他可任选地应用的固体支持物的例子包括，例如陶瓷、金属、树脂、凝胶、平皿、珠子，微珠(例如，磁性微珠等)，管子(例如，微管等)，须状物，纤维，梳状物，单晶以及自组装单层。

本发明的寡核苷酸探针可直接或间接地(例如通过接头，如牛血清白蛋白(BSA)等)附着于所述的支持物上，例如通过任何已知的化学或物理方法。有多种连接化学物质可用于将连接分子与多种固体支持物相连。更具体地，可利用偶联剂通过共价连接将核酸附着于固体支持物，也可利用非共价地连接，例如静电相互作用，氢键，或抗体抗原偶联或上述方法的组合将核酸附着于固体支持物。典型的偶联剂包括生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A/IgG抗体F_c片段和链霉抗生物素蛋白/蛋白A嵌合体(Sano et al.(1991)Bio/Technology 9：1378)，或上述试剂的衍生物或其组合。核酸可以通过光切割键(photocleavable bond)静电键(electrostatic bond)，二硫键，肽键，二酯键或其组合附着于固体支持物。核酸还可任选地通过选择性释放键，例如4，4′-二甲氧基三苯甲基或其衍生物附着于固体支持物。有用的衍生物包括3或4[双(4-甲氧基苯基)]-甲基安息香酸、N-琥珀酰亚胺基-3或4[双(4-甲氧基苯基)]-甲基安息香酸、N-琥珀酰亚胺基-3或4[双(4-甲氧基苯基)]-羟甲安息香酸、N-琥珀酰亚胺基-3或4[双(4-甲氧基苯基)]-氯甲基-安息香酸以及上述酸的盐。

如上所述，寡核苷酸探针可任选地通过核酸与固体支持物之间的接头附着于固体支持物。有用的接头包括上述的偶联剂，其用于结合其他或另外的偶联对象，或使附着物可以从固体支持物上切割下来。

可切割的附着物可通过将可切割的化学组成成分连接于探针和固体支持物之间的方式制备，例如寡肽，寡核苷酸，低聚酰胺，低聚丙烯酰胺，低聚乙烯甘油，约6-20个碳原子的烷基链及其组合。这些组成成分可由，例如添加的化学试剂，电磁辐射，或酶来切割。可由酶切割的附着物包括可由蛋白酶切割的肽键，可由核酸酶切割的磷酸二酯键。

化学试剂，如β-巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)和其他还原试剂切割二硫键。其他有用的试剂包括氧化剂、水合剂及其他可选择的活性化合物。电磁辐射，如紫外线、红外线和可见光切割可被光切割的键.附着可以是可逆的，例如，用热或酶处理，或可逆的化学或磁附着物。可利用，例如磁和电场进行释放并再附着。

基于阵列的杂交特别适合于检测淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸，其可用于同时检测许多扩增子的存在。包括可由下列供应商购得的、已公开的多种系统均适用与本发明，所述供应商如Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA，USA)等。有关阵列的构建和应用可参见，例如Sapolsky et al.(1999)“High-throughput polymorphism screening andgenotyping with high-density oligonucleotide arrays.”Genetic Analysis： Biomolecular Engineering 14：187-192；Lockhart(1998)“Mutant yeaston drugs”Nature Medicine 4：1235-1236；Fodor(1997)“Genes，Chipsand the Human Genome.”FASEB Journal 11：A879；Fodor(1997)“Massively Parallel Genomics”Science 277：393-395；and Chee et al.(1996)“Accessing Genetic Information with High-Density DNAArrays”Science 274：610-614。

作为除上述的探针和引物之外的其他用于检测淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸的探针和引物可任选地用于实施本发明，相关描述可参见，例如U.S.Pat.No.5,550,040和U.S.Pat.No.6,090,557。

VIII.核酸杂交

可通过选择适当的杂交条件使寡核苷酸探针与靶淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸的杂交。选择探针：靶核酸杂合体的稳定性使之适合于试验和洗涤条件，以使得只在探针和靶淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体之间形成稳定的、可检测的杂合体。通过试验一个或多个不同的试验参数确定具体杂交试验的灵敏性和特异性。

更具体而言，DNA，RNA，PNA，或其组合的互补碱基之间的杂交可在宽泛的多种条件下出现，所述的条件指不同的温度，盐浓度，静电强度，缓冲组合物等。应用这些条件的方法的例子，参见，例如Tijssen(1993)，supra，and Hames and Higgins，supra.杂交通常发生在约0℃到约70℃之间，在约1分钟到约1小时的时间范围，依赖于参与杂交的序列本身及其长度。但是，根据反应条件杂交也可以发生于几秒钟或数小时的时间段。例如，用于两个20-mer的混合物典型的杂交条件为，将2微升所述混合物置于68℃，随后冷却至室温(22℃)5分钟，或在很低的温度下，如2℃。利用缓冲液，例如Tris-EDTA(TE)，Tris-HCl和HEPES，盐溶液(例如NaCl，KCl，CaCl₂)，或其他水溶液，试剂和化学物质可利于核酸之间杂交的进行。这些试剂的例子包括单链结合蛋白，如Rec A蛋白，T4基因32蛋白，大肠杆菌单链结合蛋白，和主要或次要核酸沟结合蛋白。其他的此种试剂和化学物质的例子包括二价离子，多价离子和插入物质，如溴化乙锭，放线菌素D、补骨脂素，以及白芷根素。示例性的本发明的杂交方法可按照与COBAS

砂眼衣原体(CT)/淋病奈瑟氏球菌(NG)试验方案(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)中所述的类似的条件进行。

IX.检测和探针变异

如上所述，本发明的方法中，样品中经扩增的靶淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸，任选地被标记以用于寡核苷酸探针-靶杂交双链的检测。通常，标记可以是任何能附着于，例如用于扩增的引物，以提供可检测的信号(例如，可计量的信号)的组成成份。标记可通过多种现有技术中已知的技术直接或间接地附着于引物。根据所使用的引物的类型，所述的标记可附着于其末端(引物的5’或3’末端)或非末端核苷酸，并且可以通过不同大小和组份的接头或间隔臂间接附着。利用可商购的氨基磷酸盐试剂，可以由适当地保护的氨基磷酸盐制备在5’或3’末端包含功能性基团的寡聚体(例如，硫醇或伯胺)，并可利用在例如PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis etal，eds.Academic Press，Inc.(1990))所述的方案标记这种寡核苷酸。在一个实施方案中，所述的标记由共价连接于所述引物5’末端的生物素分子组成。术语“生物素化的引物”指一个或多个生物素分子或直接结合于所述引物或通过插入接头分子间接结合于所述引物。

作为进一步的说明，寡核苷酸探针-靶杂交双链的检测任选地利用例如Whitehead，et al.(1983)Nature 30(5)：158中描述并可购得的、基于鲁米诺的试剂通过化学发光试验进行。在所述探针与经标记的靶DNA杂交后，附着于靶DNA的生物素分子与，例如链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(SA-HRP)偶联。可选择地，所述的靶DNA可用辣根过氧化物酶直接标记，由此省略单独的偶联步骤。在任何一种情况下，接下来的鲁米诺被辣根过氧化物酶氧化导致的光子发射，其可通过，例如标准的放射自显影膜检测。信号的强度是DNA量的函数。一系列含有已知量的DNA的DNA标准与一个或多个未知样品一起分析。由已知的DNA标准的信号强度得到根据经验确定的信号强度与DNA的量之间的函数关系，由此可以对未知的样品进行定量。许多其他的检测方法也可以任选地用于实施本发明的方法，其在所引用的参考文献中有描述和/或是公知的。

任何已有的检测淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体扩增子的方法均可用于本发明。常用的方法包括利用分子信标或或5’-核酸酶探针实时扩增，检测插入的染料，检测掺入到扩增的探针或扩增的核酸本身的标记，例如在未掺入标记的扩增产物的凝胶电泳分离之后)，基于杂交的试验(例如，基于阵列的试验)和/或检测结合于核酸的第二试剂。例如，在本发明的具体实施方案中，利用所述的寡核苷酸在试验中检测NG和/或CT。

进一步地，例如分子信标或5’-核酸酶探针任选地设计为包含本发明的寡核苷酸探针(即，选自SEQ ID NOS：3-27)或其互补序列)，所述的分子信标或5’-核酸酶探针可用于检测淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体扩增子。分子信标或5’-核酸酶探针在下文中进一步描述。关于这些一般的方法的详细描述可参见本申请中所引述的参考文献，例如Sambrook and Ausubel。其他的用于标记核酸的标记策略以及相应的检测策略可参见，例如Haugland(2003)Handbook of Fluorescent探针 and Research Chemicals Ninth Edition by MolecularProbe，Inc.(Eugene，OR)。

分子信标(MBs)是设计来用于实时检测和定量靶核酸(例如，靶淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体扩增子)的寡核苷酸。MB的5’和3’共同地包含一对赋予MB可检测特性的组成成分。一个末端附加荧光团，另一个末端附加能够猝灭荧光团发射的荧光的猝灭剂组成成分。例如，作为荧光团-猝灭剂对的一个例子，荧光团，如5’-末端的EDANS或荧光素，以及位于3’-末端猝灭剂，如Dabcyl。当MB游离于溶液中，即未与第二核酸杂交，MB的基区(stem)因互补的碱基对得以稳定。这种自互补对形成MB的“发夹环”结构，其中，所述的荧光团和猝灭组成成分彼此临近。在这种构象中，所述的荧光组成成分被荧光团猝灭。所述的分子信标环典型地包含本发明的寡核苷酸探针(即，选自SEQ ID NOS：3-27和37-60或其互补序列)因此互补于淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸中的待检测序列，使得所述的环与靶中的其互补序列的杂交迫使所述的基区解离，由此使荧光团和猝灭剂彼此分开。由此使荧光团不被猝灭，使MB的荧光增强。

有关MB的制备和使用在文献中有详细描述，由多种商业试剂来源均可获得MB。有关MB的制备方法的进一步的描述可参见Leone etal.(1995)“Molecular beacon combined with amplification by NASBAenable homogenous real-time detection of RNA，”Nucleic Acids Res.26：2150-2155；Hsuih et al.(1997)“Novel，ligation-dependent PCRassay for detection of hepatitis C in serum”J Clin Microbiol34：501-507；Kostrikis et al.(1998)“Molecular beacons：spectralgenotyping of human alleles”Science 279：1228-1229；Sokol et al.(1998)“Real time detection of DNA：RNA hybridization in livingcells”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：11538-11543；Tyagi et al.(1998)“Multicolor Molecular beacons for allele discrimination”Nature Biotechnology 16：49-53；Fang et al.(1999)“Designing a novel分子信标for surface-immobilized DNA hybridization studies”J.Am.Chem. Soc. 121：2921-2922；and Marras et al.(1999)“Multiplex detection ofsingle-nucleotide variation using Molecular beacons”Genet.Anal. Biomol.Eng.14：151-156。有关MB的构建和应用也可参见专利文献，例如U.S.Pat.No.5,925,517，U.S.Pat.No.6,150,097和U.S.Pat.No.6,037,130。

MB组分(例如，寡聚的，包括用荧光团或猝灭剂标记的)可用常规方法合成。这些方法已在上文中详细描述。例如，寡核苷酸或肽核酸(PNAs)可通过商业途径获得的自动寡核苷酸/PNA合成仪器利用标准的方法合成。标记可在自动合成过程中或合成反应之后附着于所述的寡核苷酸或PNAs，相关内容参见前述的，例如Tyagi and Kramer(1996)，supra。有关功能性寡核苷酸的合成参见Nelson，et al.(1989)“Bifunctional Oligonucleotide Probe Synthesized Using A Novel CPGSupport Are Able To Detect Single Base Pair Mutations”Nucleic Acids Res.17：7187-7194。标记/猝灭剂可引入到所述的寡核苷酸或PNAs，例如利用可控孔度的玻璃柱(controlled-pore glass column)引入，例如猝灭剂(例如，4-二甲氨基偶氮苯-4′-磺酰组成成分(DABSYL)。例如，所述猝灭剂可在自动合成过程中添加到所述寡核苷酸的3′末端；当附加位点是伯氨基基团时，可使用4-(4′-二甲氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL)的琥珀酰亚胺基酯；当附加位点为巯基(sulphydryl)基团时，可使用4-二甲氨基苯基偶氮基苯基4′-马来酰亚胺(DABMI)。类似地，用荧光素替换核苷酸的荧光素氨基磷酸盐，或利用通过接头在胸腺嘧啶环引入荧光素组成成分的荧光素dT氨基磷酸盐可将荧光素引入到所述寡核苷酸。为了将荧光素组成成分连接到末端位置，可将碘乙酰氨基荧光素偶联于巯基基团。可以在自动合成过程中用5′-四氯-荧光素氨基磷酸盐将四氯荧光素(TET)引入。其他的反应性荧光团衍生物及其相应的附着位点包括偶联于氨基基团的5-羧基罗丹明-6G(RHD)的琥珀酰亚胺酯；偶联于巯基基团的、四甲基罗丹明碘乙酰胺；偶联于氨基基团的、四甲基罗丹明的异硫氰酸酯；或偶联于巯基基团的、得克萨斯红的磺酰氯。在合成这些标记组分的过程中，需要时，可利用高压液相色谱或其他的方法纯化偶联的寡核苷酸或PNA。

许多供应商生产标准的和常用的分子信标，所述的供应商包括Cruachem(cruachem.com)，Oswel Research Products Ltd.(UK；oswel.com)，Research Genetics(a division of Invitrogen，Huntsville AL(resgen.com))，the Midland Certified Reagent Company(Midland，TXmcrc.com)and Gorilla Genomics，LLC(Alameda，CA)。多种利用分子信标的试剂盒也可通过商业途径获得，如来自Stratagene(La Jolla，CA)的Sentinel^TM Molecular beacons Allelic Discrimination Kits，来自Eurogentec SA(Belgium，eurogentec.com)的多种试剂盒，以及IsogenBioscience BV(The Netherlands，isogen.com)。

在具体的实施方案中，包括一个或多个5’-核酸酶探针的实时PCR分析系统用于检测扩增的淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸。这些系统基于：利用特定聚合酶的内源核酸酶活性由包含猝灭剂和标记的、本发明的寡核苷酸切除其中的猝灭剂或标记，以使得所述的标记不被猝灭。所述的聚合酶仅在复制起始时切割猝灭剂或标记，也就是说，当所述寡核苷酸与模板结合后，所述的聚合酶延伸所述的引物。由此适当标记的寡核苷酸探针和包含适当的核酸酶活性的聚合酶可用于检测所关注的淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸。实时PCR产物分析由，例如FRET等(和相关的实时反转录PCR)进行，其提供了一种已知已广泛应用于多种环境下的、用于实时PCR监控的技术，其适于配合本发明的探针使用(参见Laurendeau et al.(1999)“TaqMan PCR-based gene dosage assay for predictive testing inindividuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency”Clin Chem 45(7)：982-6；Laurendeau et al.(1999)“Quantitation ofMYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reversetranscription-PCR assay”Clin Chem 59(12)：2759-65；and Kreuzer et al.(1999)“LightCycler technology for the quantitationof bcr/ab1 fusiontranscripts”Cancer Research 59(13)：3171-4)。

X.系统

本发明提供用于检测样品中的淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体的系统。所述系统包括一个或多个本申请中所述的核酸检测试剂(例如，核酸探针，序列特异性抗体等)。在具体的实施方案中，所述的核酸检测试剂以阵列形式置于固体支持物上，在另外的情况下，将其置于一个或多个容器中，例如用于在溶液中进行的试验。所述的系统还包括至少一个检测器(例如，分光光度计等)，其用于检测来自样品的核酸和/或其扩增子与核酸检测试剂的结合。其他的检测器在下文进一步描述。此外，所述的系统还包括至少一个与所述检测器可操作地连接的控制器。所述的控制器包括一个或多个指令组(instructions sets)，其将由所述检测器检测到的结合与样品中存在的淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体相关联。

在一些实施方案中，还包括至少一个包装核酸检测试剂的容器。在这些实施方案中，所述的系统任选地进一步包括至少一个与上述容器可操作连接的热调节器，用来调节容器中的温度，和/或至少一个液体运送组分(例如，自动吸管等)，其用来向和/或自所述容器运送液体，用以在所述容器中实施一个或多个核酸扩增技术等。

示例性的可通过商业途径获得的、可任选地通过本发明的核酸检测试剂(例如，包含下述序列的寡核苷酸探针，所述序列选自：SEQ IDNOS：3-27和37-60或其互补序列，序列特异性抗体等)检测淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸的系统包括，例如COBAS AMPLICOR

Analyzer，其可由Roche Diagnostics Corporation(Indianapolis，IN)获得，LUMINEX 100^TM System，其可由Luminex Corporation(Austin，TX)获得，ABI PRISM

 Sequence Detection System，which is available fromApplied Bio Systems(Foster City，CA)等。

本发明进一步提供包含下述数据组的计算机和计算机可读介质，所述的数据组包含相应于下述多个序列的多个字符串，所述的序列相应于SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的亚序列；与SEQID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。典型地，至少一个所述的字符串相应于选自：SEQID NOS：3-27和37-60或其互补序列的序列。典型地，所述的计算机或计算机可读介质进一步包括连接与计算机或所述计算机可读介质的输出设备的自动合成仪。所述的自动合成仪接受来自计算机或计算机可读介质的指令，所述的指令指导合成，例如相应于数据组中的一个或多个字符串的一个或多个核酸探针。示例性的系统和系统组分在下文中进一步描述。

构建检测器用来检测所述系统的另一组分中或附近(例如，容器中或固体支持物上等)产生的可检测的信号。适合的用于或适合于这些系统的检测器用来检测，例如荧光、磷光、放射性、吸光度、折射率、发光等。所述的检测器任选地监测来自，例如给定的分析步骤上游和/或下游的一个或多个信号。例如，所述的检测器任选地监测多种光信号，其相应于“实时”结果的位置。检测器或传感器的例子包括光电倍增管、CCD阵列、光学传感器、温度传感器、压力传感器、pH传感器、电导传感器、扫描检测器等。上述任一种或其他类型的传感器任选地容易地整合到本发明所述的系统中。任选地，本发明的所述系统包括多个检测器。

用于这些系统的更具体的检测器的例子包括，例如共振光散射检测器、发射分光镜、荧光分光镜、磷光分光镜、荧光分光镜、分光光度计、光度计等等。用于或适用于本发明的系统的多种合成组分包括自动核酸合成仪，例如本申请中所描述的用于合成寡核苷酸探针的合成仪。本发明系统中所包含的检测器和合成仪的进一步描述可参见例如Skoog et al.，Principles of Instrumental Analysis，5^th Ed.，HarcourtBrace College Publishers(1998)and Currell，Analytical Instrumentation： Performance Characteristics and Quality，John Wiley & Sons，Inc.(2000)。

本发明的系统典型地还包括可操作地连接于所述系统的一个或多个组分(例如，检测器，合成组分，热调节器，液体运送组分等)的控制器。具体而言，所述的控制器通常包括单独或整合的系统组分，其用于，例如接收来自检测器的数据，影响和/或调节容器中的温度，影响和/或调节液体流入或流出所选择的容器等。控制器和/或其他系统组分任选地偶联于合适地编程的处理器，计算机，数据设备或其他信息设备(例如，根据需要包括模拟-数字的或数字-模拟变换器)，其作用为指示这些设备按照预定的程序或用户输入的指令运行，接收来自这些设备数据和信息以及向用户解释、操作和报告这些信息。适合的控制器是本领域已知的并可通过多种商业途径获得。

控制器和计算机任选地可包含显示器，其通常是一种阴极射线管(“CRT”)显示器，一种平板显示(例如，活性基质液晶显示器、液晶显示器等)，或其他。电脑电路通常被置于一个箱子里，其中包括许多的集成电路片，如微处理器、存储器、接口电路等。所述的盒子任选地包括硬盘驱动器，软盘驱动器大容量可移动驱动器，如可写入的CD-ROM，以及其他的常用外部组成成分。键盘鼠标等输入设备任选地由用户提供。这些组分将在下文进一步描述。

所述的计算机典型地包括用于接受用户指令的适当的软件，既可以是用户输入一组参数域的形式，例如在GUI中，也可以是预编程指令形式，例如用于多种不同的特定操作的预编程。所述的软件将这些指令转化成适当的语言以指导一个或多个控制器以进行所需的操作。计算机接受来自，例如系统中的传感器或检测器的数据，并解释数据以用户可以明白的形式提供数据，或根据程序利用这些数据开始进一步的控制器指令，例如根据从重量标尺(weight scale)等接收到的液体重量数据相应地控制液流调节器等。

所述的计算机可以是，例如PC(基于Intel x86或Pentiumchip-compatible DOS^TM，OS2^TM，WINDOWS^TM，WINDOWS NT^TM，WINDOWS95^TM，WINDOWS98^TM，WINDOWS2000^TM，WINDOWSXP^TM，LINUX的机器，基于MACINTOSH^TM，Power PC，或UNIX的(例如，SUN^TM工作站)的机器)或其他本领域技术人员已知的可商购的计算机。标准的桌面应用程序，如字处理软件(例如，Microsoft Word^TM或Corel WordPerfect^TM)和数据库软件(例如，电子数据表软件，如Microsoft Excel^TM，Corel Quattro Pro^TM，或数据库程序，如MicrosoftAccess^TM或Paradox^TM)均适用于本发明。用于执行，例如温控调节器和液体流速调节器的软件任选地可由本领域技术人员利用标准的程序语言，如Visual basic，Fortran，Basic，Java等编写。

图2和3是表示包括逻辑器件的示例性系统的图解说明，其中涵盖了本发明的多个方面。通过本申请所公开的内容，本领域技术人员可以了解，可以在硬件和/或软件中实施本发明。在一些实施方案中，本发明的不同方面可以客户端逻辑(client-side logic)或服务器端逻辑(server-side logic)实施。应当理解，本发明或其组成部分可以包含于包括逻辑指令(logic instructions)和/或数据的介质程序组成成分(例如，固定的介质组成成分)，当其装载于适当构建的计算装置中时，可使所述的装置按照本发明执行。还应当理解，包含逻辑指令的固定介质可以传送到固定于介质上的阅读器(viewer)上以完全存入阅读器的计算机中，或者包含逻辑指令的固定介质也可以留在远程服务器上，阅读器通过通讯介质访问以下载程序组分。

具体而言，图2是以图解说明的形式说明可操作地连接了检测器(detector)202和液体运送组件(fluid transfer component)204的计算机200。任选地，检测器202和/或液体传送组件204通过服务器(server)可操作地连接于计算机200(图2中没有示出)。操作过程中液体传送组件204运送液体，如包含标记的淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体扩增子的样品等分试样至核酸检测试剂阵列206，如本申请中所述，例如所述阵列包含以阵列形式排布的寡核苷酸探针，序列特异性抗体等。在通过一个或多个洗涤步骤用液体运送组件204从核酸检测试剂阵列206洗去非杂交的核酸后，检测器202典型地检测经标记扩增子与附着于核酸检测试剂阵列206的探针杂交所产生的可检测的信号(例如，荧光发射等)。如附加显示的，热调节器(thermal modulator)208也与计算机200相连。在实施杂交试验前，靶淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸利用标记的核酸引物(例如包含选自SEQ ID NOS：3-27和37-60的序列的引物)扩增。如上所述，这些扩增反应的扩增子典型地经由液体运送组件204运送至核酸检测试剂阵列206以实现结合试验。在一些实施方案中，结合试验利用包含选自SEQ ID NOS：3-27和37-60的序列的分子信标5’-核酸酶探针等与淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸扩增在热调节器208中同时进行。在这些实施方案中，利用热调节器208进行扩增反应时，检测器202检测所产生的可检测的信号。

图3图解说明信息装置(information appliance)或数字装置(digitaldevice)300，其可以理解为可以阅读来自介质302和/或网络端口304的指令的逻辑装置(logical apparatus)，其可任选地与具有固定介质308的服务器306相连。如本领域技术人员可以理解的那样，数字装置300可由此利用这些指令指导服务器或客户逻辑，其包含本发明的不同方面。一种包含本发明的逻辑设备时如300中所示的计算机系统，其包含CPU310，可选择的输入设备312和314，磁盘驱动器316和可选择的显示器318。端口(port)304之上的固定的介质302或固定介质308可用于规划这样一种系统并可以代表磁盘型的光或磁介质，磁带，固态动力学的或静态存储器等。在特定的实施方案种，本发明可以完全地，或部分地包含于记录在固定介质上的软件中。通信端口304可以用于在开始时接受用于规划所述系统的指令并可以代表任何类型的通信连接。任选地，本发明完整地或部分地包含于专用集成电路(ACIS)或可编程逻辑器件(PLD)的电路。在此种情况下，本发明可以包含在一种计算机可以理解的、可用于创建一种ASIC或PLD的描述符语言中。

图3还包括自动合成仪320，其通过服务器306可操作地连接于数字设备300。任选地，自动合成仪320直接连接于数字设备300。在操作过程中，自动合成仪320典型地接收合成包含选自SEQ ID NOS：3-27和37-60或其互补序列的一个或多个引物或探针的指令，其包含于被包括在，例如数字设备300和/或固定介质302和/或308之类的计算机可读介质的数据组中。

XI.试剂盒

本发明的方法中所用的核酸检测试剂任选地被包装到试剂盒中。如本申请中所述，本发明的核酸检测试剂以可检测的方式结合于具有下述序列的核酸，所述序列选自：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：36；与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36之一具有至少90％序列同一性；或SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：36的互补序列或其变体。此外，所述的试剂盒还包括适当地装入DNA固定，杂交和/或检测所需的试剂和材料，固体支持物，缓冲液，酶和DNA标准品以及用于指导试验进行的说明书。任选地，本发明所述的核酸检测试剂(例如，寡核苷酸探针，序列特异性抗体等)以已附着于或固定到固体支持物上的形式提供。作为另外的选择，所述的核酸检测试剂以游离于存在于容器中的溶液中的形式提供，例如为了在溶液相中实施本发明的检测方法。在这些实施方案中，试剂盒中的核酸检测试剂包括标记和/或猝灭剂组成成分，例如当分子信标，5’-核酸酶探针等包含选自SEQ ID NOS：3-27和37-60的序列时。在具体的实施方案中，试剂盒进一步包含经标记的、用于扩增样品中的靶淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体序列的引物。

所述的试剂盒还包含一个或多个：使核酸检测试剂与来自样品的核酸或其扩增子的接触检测所述的核酸检测试剂与淋病奈瑟氏球菌和/或砂眼衣原体核酸(如果样品中存在的话)的结合的一套使用说明，或至少一个用于包装所述核酸检测试剂和所述说明书的容器。包括在本发明的试剂盒中的示例性的固体支持物任选地选自平板，微孔板，珠子，微珠，管子(例如，微管等)，纤维，须状物，梳状物，杂交芯片，膜，单晶，陶瓷层，自组装单层等。

在某些实施方案中，所述的试剂盒进一步包括至少一个核酸引物，所述核酸引物至少部分互补于淋病奈瑟氏球菌核酸的至少一个节段，用于扩增淋病奈瑟氏球菌核酸的一个节段。在具体的实施方案中，所述的试剂盒还包括一个或多个用于扩增一个或多个砂眼衣原体核酸节段的引物。在这些实施方案中，所述的试剂盒典型地进一步包括关于用所述的核酸引物扩增一个或多个这些核酸的亚序列的一组说明，至少一个核苷酸掺入生物催化剂，和一个或多个核苷酸。在具体的实施方案中，所述的核酸引物包含至少一个标记(例如，荧光染料，放射性同位素等)。下面对适合的标记进一步进行描述。例如核酸引物任选地与生物素或生物素衍生物偶联。在这些实施方案中，所述的试剂盒典型地进一步包括与抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，或者链霉抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白衍生物偶联的酶，例如用于检测本发明的核酸检测试剂与靶核酸之间的结合。在这些实施方案中，所述的试剂盒通常进一步包括至少一个核苷酸掺入生物催化剂(例如，聚合酶，连接酶等)。在这些实施方案中，所述的试剂盒典型地进一步包含一个或多个例如用于扩增靶核酸的核苷酸任选地，至少一个所述的核苷酸包含一种标记。在这些实施方案中，所述的试剂盒进一步包括至少一个例如，用于使焦磷酸解作用最小化的焦磷酸酶(例如，耐热性焦磷酸酶)，例如，在需要防止携带时的污染时使用的尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)(例如，耐热性UNG)。

XII.实施例

应当理解，下述的实施例和实施方案仅是示例性的，并不意味着对本发明请求保护的范围进行限定。也应当可以理解本领域的技术人员可以在下述的实施例和实施方案的启示的基础上进行多种修饰和改变，其均包括在本申请及后附的权利要求的精神和范围内。

实施例I：通过淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9检测淋病奈瑟氏球菌 用于PCR分析的奈瑟氏球菌同向重复序列9特异性寡核苷酸引物的选择 与合成

以往鉴定的淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9(NGDR9)为淋病奈瑟氏球菌基因组中的两个拷贝的DNA序列。所述的NGDR9序列通过Internet网stdgen.lanl.gov/stdgen/bacteria/ngon/由Los Alamos NationalLaboratory Sexually Transmitted Diseases database获得。全部806bp的NGDR9序列与脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)基因组中的任何序列均缺乏实质上的同一性，但是其与猪布鲁氏菌(Brucellasuis)1330染色体I区域(section)155(

登录号AE014469)具有36.85％带有gaps的同一性(44.4％无gaps的同一性)。图4描述了NGDR9序列(SEQ ID NO：1)与这种布鲁氏菌序列的一部分的Clustal W比对。扫描NGDR9序列寻找其与猪布鲁氏菌的最低序列同一性(minimal sequence identity)区域，分别合成了跨NGDR9的190bp区域的、上游和下游寡核苷酸引物(NG519(5’-CTCTCAATGCCCAATCATAAAGC-3’(SEQ ID NO：5))和NG514的互补序列(即，5’-GATAAAGCAGACGAAGCGGATAC-3’(SEQ IDNO：24))。如U.S.Pat.No.6,001,611所述的，位于这些引物3’末端的脱氧胞苷酸盐单元(deoxycytidylate units)已被修饰为包括叔丁基苯甲基基团。NG519和NG514在NGDR9中的位置在图4中用下划线标出。

其他示例性的上游和下游寡核苷酸引物对的位置也在图4中用下划线标出。具体而言，示出了DK101(5’-GTTTGGCGGCAAGCATCT-3’(SEQ ID NO：7))和DK102(5’-AAATGGGATGCTGTCGTCAA-3’(SEQ ID NO：8))。引物对DK101、以及DK102的互补序列(即，5’-TTGACGACAGCATCCCATTT-3’(SEQ ID NO：25))是设计来用于扩增NGDR9的416bp区域。还合成了相应于DK101、以及DK102的互补序列的引物对，其进一步包括5’-末端限制性位点接头，称作HINDDK101(5’-GGCAAGCTTGTTTGGCGGCAAGCATCT-3’(SEQID NO：9)；HindIII限制性位点以下划线标出)和BAMDK102(5’-GGCGGATCCTTGACGACAGCATCCCATTT-3’(SEQ ID NO：10)；BamHI限制性位点以下划线标出)。下面提供了显示用下述的引物对检测淋病奈瑟氏球菌的琼脂糖凝胶照片。DK103(5’-AAACGCAATCTTCAAACACCTCA-3’(SEQ ID NO：11))和DK104(5’-TTTGACGGCCTCACGCATAA-3’(SEQ ID NO：12))也在图4中用下划线标识出。引物对DK103、以及DK104的互补序列(即，5’-TTATGCGTGAGGCCGTCAAA-3’(SEQ ID NO：26))是设计来用于扩增NGDR9的384bp的区域的。

奈瑟氏球菌基因组DNA的纯化

从多种奈瑟氏球菌菌株提取基因组DNA是利用

 DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis MN)进行的。细菌细胞在Choco1ate琼脂(Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)上于37℃、5％CO₂.条件下生长48小时。从琼脂表面刮下细胞，将其重悬于PBS，13,000-16,000×g离心5秒获得细胞颗粒化沉淀。吸除上清液，留下10-20μl残余液体。将所述的样品剧烈涡旋振荡使所述颗粒化沉淀重悬于上述残余液体中。按照使用说明书提取DNA。简要地，将300μl细胞裂解溶液添加到上述重悬的细胞中，来回抽吸以裂解细胞。再向上述细胞裂解物中加入1.5μl的RNAse A溶液，然后将所述样品反复颠倒25次使样品混合，于37℃下温育5分钟。然后，将所述样品在冰上放置1分钟使其冷却至室温。将100μl体积的蛋白沉淀溶液(Protein Precipitation Solution)添加到上述经RNAse处理的细胞裂解物中，然后将样品高速剧烈涡旋振荡20秒以混合。13,000-16,000×g离心1分钟沉淀蛋白碎片。将含有DNA样品的上清液转移至各含300μl 100％异丙醇的干净的1.5ml微离心管中。轻柔地颠倒所述离心管50次来进行混合，接下来13,000-16,000×g离心1分钟。弃上清，将颗粒化沉淀用300μl 70％乙醇洗涤。再将离心管以13,000-16,000×g离心1分钟。弃上清，将离心管倒置使其干燥，将DNA沉淀重悬于50μl的水合溶液(Hydration Solution)中。基因组DNA用PicoGreendsDNA Quantitation Reagents(Molecular Probe，Eugene，OR)定量，将所述的重悬的DNA保存于-20℃备用。

NGDR9节段的扩增

以NG519、以及NG514的互补序列(如上所述)为引物对，用由不同的奈瑟氏球菌菌种分离的基因组DNA为模板分别进行PCR反应。在100μl的体积中实施PCR，所述的反应体系包含50mM Tricine(pH8.3)，80mM K(OAc)₂(pH7.5)，2mM Mn(OAc)₂(pH6.5)，50μMdATP，50μM dGTP，50μM dCTP，100μM dUTP，20U of ZO5 DNA聚合酶(Roche Molecular Systems，Alameda，CA)，5U 

 UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)，和引物各0.5μM以及1ng/μl的溴化乙锭。加入基因组DNA作为模板，对于淋病奈瑟氏球菌每一反应加入10³基因组等同物(genomic equivalents)，对于脑膜炎奈瑟氏球菌以及其他奈瑟氏球菌属的菌种每一反应加入10⁶基因组等同物。利用COBAS

 PCR系统(Roche Molecular Systems，Alameda，CA)进行60个反应循环，每个循环为：95℃变性15秒，58℃退火20秒以及72℃下最终延伸5分钟。

以HINDDK101和BAMDK102(如上所述)为引物对，用由不同的奈瑟氏球菌菌种分离的基因组DNA为模板分别进行PCR反应。用与上述类似的方法扩增NGDR9的190bp节段。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

将20μl的DNA样品加入8μl of 10×凝胶上样缓冲液(0.025％溴酚蓝染料，100mM EDTA，和30％蔗糖)中制备用于凝胶电泳分析的PCR产物。将所述样品上样于水平浸入地凝胶中的泳道里，所述的凝胶含有1×TB缓冲液(0.089M Tris，0.09M硼酸，2mM EDTA，pH8.0)中的3.0％(w/v)Nusieve，0.5％(w/v)琼脂糖凝胶和0.5μg/ml溴化乙锭。电泳缓冲液为含有0.5μg/ml溴化乙锭的1×TB缓冲液。将上述凝胶在95-100V电压下跑1小时，将其移出后，用长波UV透射仪进行观察。检测具体的凝胶中是否存在预期的190或416bp大小的PCR扩增产物。

图5A和B以及图6A和B是检测NGDR9的190bp节段的琼脂糖凝胶照片，图7是检测NGDR9的416bp节段的琼脂糖凝胶照片。

实施例II：举例说明选择性检测淋病奈瑟氏球菌的试验

这一实施例提供了包括与砂眼衣原体引物相结合、或单独应用核酸引物NG519(具有相应于SEQ ID NO：5的序列)和NG514R(具有相应于SEQ ID NO：24的序列)以及5’-核酸酶探针(具有相应于SEQ IDNO：18的序列)的试验中所分析的生物的列表。具体而言这些试验的包容性(inclusivity)(即，对于样品中作为靶生物的淋病奈瑟氏球菌的检测能力的测定)如表IX所示。

表IX

 

属	种	数量	引物	结果
					奈瑟氏球菌属(Neisseria)	淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)	108	CT/NG	全部为阳性

这些试验的排除性(exclusivity)(即，对于当样品中的奈瑟氏球菌属的生物为非淋病奈瑟氏球菌种时，排除假阳性的能力的测定)如表X所示。

表X

 

属	种	数量	引物	结果
					奈瑟氏球菌属(Neisseria)	动物奈瑟氏球菌(Neisseria animalis)	3	CT/NG	全部为阴性
奈瑟氏球菌属	豚鼠奈瑟氏球菌(Neisseria caviae)	2	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	灰色奈瑟氏球菌(Neisseria cinerea)	6	＂	＂
奈瑟氏球菌属	兔奈瑟氏球菌(Neisseria cuniculi)	1	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	反硝化奈瑟氏球菌(Neisseria denitrificans)	2	＂	＂
奈瑟氏球菌属	长奈瑟氏球菌(Neisseria elongata)	4	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	黄色奈瑟氏球菌(Neisseria flava)	1	＂	＂
奈瑟氏球菌属	浅黄奈瑟氏球菌(Neisseria flavescens)	7	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	(Neisseria kochi)	1	＂	＂
瑟氏球菌属	乳糖奈瑟氏球菌(Neisserialactamica)	6	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)	21	＂	＂
奈瑟氏球菌属	粘液奈瑟氏球菌(Neisseria mucosa)	14	＂	＂

 

属	种	数量	引物	结果
					奈瑟氏球菌属	深黄奈瑟氏球菌(Neisseria perflava)	6	＂	＂
奈瑟氏球菌属	多糖奈瑟氏球菌(Neisseriapolysaccharea)	3	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	干燥奈瑟氏球菌(Neisseria sicca)	7	＂	＂
奈瑟氏球菌属	微黄奈瑟氏球菌(Neisseria subflava)	1	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	微黄奈瑟氏球菌黄色生物变种(Neisseria subflava biovar flava)	1	＂	＂
奈瑟氏球菌属	微黄奈瑟氏球菌微黄/黄色生物变种(Neisseria subflava biovarsubflava/flava)	2	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	微黄深黄奈瑟氏球菌(Neisseriasubflava perflava)	2	＂	＂
奈瑟氏球菌属	浅黄奈瑟氏球菌(Neisseriaflavescens)	5	＂	＂
						总计	95		全部为阴性

上述试验的特异性(即，当样品中存在非奈瑟氏球菌属生物时排除假阳性的能力)如表XI所示。

表XI

 

属	种	数量	引物	结果
					衣原体属(Chlamydia)	砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)	15	NG	全部为阴性
衣原体属	肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)	1	＂	＂
					衣原体属	鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)	1	＂	＂
无色杆菌属(Achromobacter)	Achromobacter Xerosis	1	＂	＂
					不动杆菌属(Acinetobacter)	鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffi)	1	＂	＂

 

属	种	数量	引物	结果
					不动杆菌属	乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)	1	＂	＂
不动杆菌属	(Acinetobacter sp.genospecies3)	1	＂	＂
					放线菌属(Actinomyces)	衣氏放线菌(Actinomyces isrealii)	1	＂	＂
气球菌属(Aerococcus)	绿色气球菌(Aerococcus viridans)	1	＂	＂
					气单胞菌属(Aeromonas)	嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)	1	＂	＂
土壤杆菌属(Agrobacterium)	放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)	1	＂	＂
					产碱菌属(Alcaligenes)	粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)	1	＂	＂
芽孢杆菌属(Bacillus)	苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)	1	＂	＂
					芽孢杆菌属	枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)	1	＂	＂
拟杆菌属(Bacteriodes)	脆弱拟杆菌(Bacteriodes fragilis)	1	＂	＂
					拟杆菌属(Bacteroide)	粪拟杆菌(Bacteroides caccae)	1	＂	＂
乳杆菌属(Bifidobacillus)	长乳杆菌(Bifidobacillus longum)	1	＂	＂
					长双歧杆菌属(Bifidobacterium)	青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)	1	＂	＂
布兰汉氏球菌属(Branhamella)	粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)	1	＂	＂
					短杆菌属(Brevibacterium)	扩展短杆菌(Brevibacterium linens)	1	＂	＂
假丝酵母属(Candida)	白色假丝酵母(Candida albicans)	1	＂	＂
					色杆菌属(Chromobacter)	紫色色杆菌(Chromobacter	1	＂	＂

 

属	种	数量	引物	结果
						violaceum)
柠檬酸杆菌属(Citrobacter)	弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)	1	＂	＂
					梭菌属(Clostridium)	无害梭菌(Clostridium innocuum)	1	＂	＂
梭菌属	产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)	1	＂	＂
					棒杆菌属(Corynebacterium)	生殖道棒杆菌(Corynebacterium genitalium)	1	＂	＂
棒杆菌属	干燥棒杆菌(Corynebacterium xerosis)	1	＂	＂
					隐球菌属(Cryptococcus)	Cryptococcus neoformans	1	＂	＂
异常球菌属(Deinococcus)	耐放射异常球菌(Deinococcus radiopugnans)	1	＂	＂
					异常球菌属(Derxia)	德克斯氏异常球菌(Derxia gummosa)	1	＂	＂
埃希氏菌属(Echerichia)	大肠杆菌(Echerichia coli)	1	＂	＂
					艾肯氏菌属(Eikenella)	啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)	1	＂	＂
肠杆菌属(Enterobacter)	阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)	1	＂	＂
					肠球菌属(Enterococcus)	鸟肠球菌(Enterococcus avium)	1	＂	＂
肠球菌属	粪肠球菌(Enterococcus faecalis)	1	＂	＂
					肠球菌属	屎肠球菌(Enterococcus faecium)	1	＂	＂
丹毒丝菌属(Erysipelothrix)	猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)	1	＂	＂
					爱文氏菌属(Ewingella)	美洲爱文氏菌	1	＂	＂

 

属	种	数量	引物	结果
						(Ewingella americana)
黄杆菌属(Flavobacterium)	脑膜脓毒性黄杆菌(meningosepticum)	1	＂	＂
					孪生球菌属(Gamella)	溶血孪生球菌(Gamella haemolysans)	1	＂	＂
孪生球菌属	麻疹孪生球菌(Gamella morbillorum)	1	＂	＂
					加德纳氏菌属(Gardnerella)	阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)	1	＂	＂
嗜血菌属(Haemophilus)	流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)	1	＂	＂
					嗜血菌属	软性下疳嗜血菌(Haemophilus ducreyi)	1	＂	＂
金氏菌属(Kingella)	金氏金氏菌(Kingella kingae)	1	＂	＂
					克雷伯氏菌属(Klebsiella)	肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella pneumoniaessozaenae)	1	＂	＂
乳杆菌属(Lactobacillus)	口乳杆菌(Lactobacillus oris)	1	＂	＂
					乳杆菌属	阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)	1	＂	＂
乳杆菌属	嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)	1	＂	＂
					乳杆菌属	短乳杆菌(Lactobacillus brevis)	1	＂	＂
乳杆菌属	Lactobacillus crisptus	1	＂	＂
					乳杆菌属	Lactobacillus lactis lactis	1	＂	＂
乳杆菌属	类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchnerri)	1	＂	＂
					乳球菌属(Lactococcus)	Lactis cremoris	1	＂	＂

 

属	种	数量	引物	结果
					军团菌属(Legionella)	博兹曼军团菌(Legionella bozemanii)	1	＂	＂
军团菌属	嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)	1	＂	＂
					明串珠菌属(Leuconostoc)	类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)	1	＂	＂
微球菌属(Micrococcus)	藤黄微球菌(Micrococcus luteus)	1	＂	＂
					莫拉氏菌属(Moraxella)	奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)	1	＂	＂
摩根氏菌属(Morganella)	摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)	1	＂	＂
					分枝杆菌属(Mycobacterium)	耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)	1	＂	＂
枝原体属(Mycoplasma)	人型枝原体(Mycoplasma hominis)	1	＂	＂
					沙雷氏菌属(Serratia)	反硝化沙雷氏菌(Serratia denitrificans)	1	＂	＂
巴斯德氏菌属(Pasteurella)	(Pasteurella maltocida)	1	＂	＂
					片球菌属(Pediococcus)	乳酸片球菌(Pediococcus acidilactica)	1	＂	＂
消化链球菌属(Peptostreptococcus)	大消化链球菌(Peptostreptococcu magnus)	1	＂	＂
					消化链球菌属	产生消化链球菌(Peptostreptococcuproductus)	1	＂	＂
普雷沃氏菌属(Prevotella)	双路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)	1	＂	＂
					普雷沃氏菌属	人体普雷沃氏菌(Prevotella corporis)	1	＂	＂
普雷沃氏菌属	中间普雷沃氏菌	1	＂	＂

 

属	种	数量	引物	结果
						(Prevotella intermedia)
丙酸杆菌属(Propionibacterium)	疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)	1	＂	＂
					变形菌属(Proteus)	奇异变形菌(Proteus mirabilis)	1	＂	＂
普罗威登斯菌属(Providencia)	斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)	1	＂	＂
					假单胞菌属(Pseudomonas)	铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)	1	＂	＂
假单胞菌属	恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)	1	＂	＂
					拉恩氏菌属(Rahnella)	水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)	1	＂	＂
沙门氏菌属(Salmonella)	明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)	1	＂	＂
					沙门氏菌属	鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)	1	＂	＂
少雷氏菌属(Serratia)	粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)	1	＂	＂
					葡萄球菌属(Staphylococcus)	金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)	1	＂	＂
葡萄球菌属	表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)	1	＂	＂
					链球菌属(Streptococcus)	唾液链球菌(Streptococcus salivarius)	1	＂	＂
链球菌属	无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)	1	＂	＂
					链球菌属	Streptococcus　anginosus	1	＂	＂
链球菌属	牛链球菌(Streptococcus bovis)	1	＂	＂
					链球菌属	(Streptococcus dysgalatia)	1	＂	＂

 

属	种	数量	引物	结果
					链球菌属	咽峡炎链球菌(Streptococcus equinis)	1	＂	＂
链球菌属	肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)	1	＂	＂
					链球菌属	酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)	1	＂	＂
弧菌属(Vibrio)	副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)	1	＂	＂
					耶尔森氏菌属(Yersinia)	小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)	1	＂	＂
密螺旋体属(Treponema)	苍白密螺旋体(Treponema pallidumv)	1	＂	＂
					单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus)1		1	＂	＂
单纯疱疹病毒2		1	＂	＂
					EB病毒(Epstein BarrVirus)		1	＂	＂
人乳头瘤病毒(Humanpapilloma virus)16型		1	＂	＂
					人乳头瘤病毒18型		1	＂	＂
	总计	111		全部为阴性

实施例III：通过淋病奈瑟氏球菌同向重复序列33检测淋病奈瑟氏球菌 选择并合成用于PCR分析的淋病奈瑟氏球菌同向重复序列33特异性寡核 苷酸引物

以往鉴定的淋病奈瑟氏球菌同向重复序列33(NGDR33)为淋病奈瑟氏球菌基因组中的两个拷贝的DNA序列。所述的NGDR33序列通过Internet网stdgen.lanl.gov/stdgen/bacteria/ngon/由Los AlamosNational Laboratory Sexually Transmitted Diseases database获得。NGDR33通过blast同源性检索显示其与脑膜炎奈瑟氏球菌有多个显著的命中结果(significant hits)，并且全部1142bp的NGDR33序列与脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株MC58区域77(登录号AE002435)具有38.09％的带有gaps序列同一性(50.44％无gaps的同一性)。图8描述了NGDR33序列(SEQ ID NO：2)与该脑膜炎奈瑟氏球菌序列(SEQ ID NO：35)的Clustal W比对。扫描NGDR33序列寻找其与脑膜炎奈瑟氏球菌的最低序列同一性。分别合成了跨NGDR33的265bp区域的、上游和下游寡核苷酸引物(NG613(5’-AATGTCGGGTTTGACGAAACTC-3’(SEQ ID NO：15))和NG614的互补序列(即，5’-AACGTCCGACAACCGGTAAC-3’(SEQIDNO：27))。NG613和NG614的位置在图8中用下划线示出。如上所述，位于这些引物3’末端的脱氧胞苷酸盐单元已被修饰为包括叔丁基苯甲基基团。

奈瑟氏球菌基因组DNA纯化，扩增和琼脂糖凝胶电泳分析

多种奈瑟氏球菌种的基因组DNA的纯化如上述实施例1中所述。以NG613、以及NG614的互补序列(如上所述)为引物对，用由不同的奈瑟氏球菌菌种分离的基因组DNA为模板分别进行PCR反应。用与上述类似的方法扩增NGDR9的190bp节段。此外，如上述实施例I所述将所述扩增反应所获得的PCR产物通过电泳分离。检测凝胶中是否存在预期的265bp大小的PCR扩增产物。图9A和B以及图10是检测NGDR33的265bp节段的琼脂糖凝胶照片。

实施例IV：在临床样品中检测淋病奈瑟氏球菌/砂眼衣原体

这一预示性的实施例描述了用于检测临床样品中的淋病奈瑟氏球菌和砂眼衣原体的方案。

临床样品

用本领域常规的方法收集来自女性子宫颈内拭子样本和来自男性尿道拭子的样本。将拭子接种于适当的培养物运送培养基(例如，2SP，M-4(Microtest，Inc.，Atlanta，GA)，Bartel’s chlamydial(IntracelCorp.，Issaquah，WA)等)，而后将其用于PCR分析(参见Van der Pol etal.(2000)J.Clin.Microbiol. 38：1105-1112)。这些样本通常在2到8℃储存，并典型地在采集后的24到72小时内运送到实验室。典型地，所述的样本在保持拭子处于试管中的状态下进行涡旋振荡，接种细胞培养物，将每个样本的等分试样转移到新的试管中，通常于2到8℃储存，最多至自收集后7天，然后进行PCR分析。

任选地，收集来自男性和女性的50ml等分试样的初次收集(first-catch)的尿样。女性的尿样可以在拭子采集之前或之后收集。男性的尿样在获得了尿道拭子样本之后采集。典型地，尿样于室温下保存，在24小时内运送到实验室，如果不能在收集后24小时内运送到实验室则可，例如在2到8℃下保存。一旦样本运送到实验室，典型地，将500μl等分试样于2到8℃储存最多至自收集后7天，以备进行PCR分析。

PCR分析

按照制造商包装中的说明书将每个样本进行处理并实施

和COBAS 

试验中的任意项或两项。在一个反应混合物中，对每个进行处理的样本同时扩增砂眼衣原体，淋病奈瑟氏球菌以及内部对照(IC)靶DNA，所述的反应混合物包含至少两个引物对，至少一个引物对特异于砂眼衣原体，至少一个引物对特异于淋病奈瑟氏球菌(例如，包含至少一个选自SEQ ID NOS：3-27的序列)。所得的扩增产物通常被分别捕获并通过与微孔板(

format)杂交利用显色进行检测(Crotchfelt et al.(1997)“Detection ofNeisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis in genitourinaryspecimens from men and women by a coamplification PCR assay，”J. Clin.Microbiol.35：1536-1540)，或者通过与淋病奈瑟氏球菌特异的寡核苷酸探针(例如，包含至少一个选自SEQ ID NOS：3-27的序列)、砂眼衣原体特异的寡核苷酸探针或IC特异的寡核苷酸探针包被的磁性微粒(COBAS 

 format)杂交通过显色法进行检测。所述的COBAS 

分析仪自动执行全部的扩增，杂交和检测步骤(DiDomenico et al.(1996)“COBAS AMPLICOR^TM：a fully automatedRNA and DNA amplification and detection system for routine diagnosticPCR，”Clin.Chem.42：1915-1923，Jungkind et al.(1996)“Evaluationof automated COBAS AMPLICOR PCR system for detection of severalinfectious agents and its impact on laboratory management，”J.Clin. Microbiol.34：2778-2783)。在

形式(format)中，扩增是利用，例如

 PCR System 9700热循环仪(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)进行，杂交和检测通过人工进行(Loeffelholz et al.(1992)“Detection of C.trachomatis in endocervical specimens by polymerasechain reaction，”J.Clin.Microbiol.30：2847-2851).

数据分析

样本产出信号在阳性阈值(对于砂眼衣原体光密度[OD]2.0(A₆₆₀)，对于淋病奈瑟氏球菌OD为3.5(A₆₆₀))以上，无论IC结果如何，典型地均解释为特定生物为阳性。样本产出的淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体信号在阴性阈值(例如，OD为0.2)以下，如果IC信号在给定的阈值(例如，OD为0.2)以上且所述试验有效，则典型地解释为特定生物为阴性。样本产出的淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体信号低于相应于淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体，以及IC的信号的阈值，通常解释为被禁止的(inhibitory)。被禁止的样本典型地要通过加工冷冻的原始样品的等分试样进行再次试验。根据上述原则对再次试验的结果进行分类。

样本产出信号在阴性和阳性阈值之间(对于淋病奈瑟氏球菌为≥0.2，<3.5；对于砂眼衣原体为≥0.2，<2.0)，无论IC信号如何通常认为特定生物处于两可之间。对于模棱两可的结果通常要通过加工原始样本的等分试样，一式两份进行分析，并将再次试验的结果与原始试验的结果进行比较。如果对于特定的生物，至少两次有效试验得到的淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体OD>2.0，典型地认为其为阳性。如果对于特定的生物，重复试验所得的淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体信号OD<0.2，且IC信号在给定的阈值(例如，OD为0.2)以上则相应于所述样品的特定生物为阴性。对于特定生物，如果两次重复试验所得的淋病奈瑟氏球菌或砂眼衣原体OD<0.2，但IC信号在任何一次重复试验中均处于给定的阈值以下，则所述的样本通常视为被禁止的。

实施例V：通过淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9变体检测淋病奈瑟氏球菌

选择并合成用于PCR分析的NGDR9Var寡核苷酸

如上述实施例I所述，以往鉴定的淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9(NGDR9)为淋病奈瑟氏球菌基因组中的两个拷贝的DNA序列。后来被证实为3拷贝DNA序列。但是在利用NGDR9引物的原型NG试验的包容性(inclusivity)检测中，从临床样品中分离的4个淋病奈瑟氏球菌菌株(包括菌株NG889)没有扩增。对菌株NG889基因组DNA接下来的序列分析结果显示存在3个同一的变体序列(NGDR9Var)的拷贝，在NGDR9靶区域存在明显的错配，由此阻止了通过NG519(SEQID NO：5)和NG514(SEQ ID NO：24)引物的扩增。完整的727bp的NGDR9Var序列(SEQ ID NO：36)与脑膜炎奈瑟氏球菌基因组中的任何序列均无同一性，但与NGDR9序列(SEQ ID NO：1)具备70％总体同一性(overall identity)。扫描NGDR9Var序列寻找其与来自另外的淋病奈瑟氏球菌菌株的变体序列之间的最大序列同一性，并合成了跨NGDR9Var215bp区域的、上游和下游寡核苷酸引物NG579(5’-GTTTCGACAGGCTTGCGAA-3’)(SEQ ID NO：38)和NG552(5’-CCTGTTTGCGACAAAGAGGA-3’)(SEQ ID NO：40)。如U.S.Pat.No.6,001,611中所述，位于这些引物3’末端的脱氧腺苷碱基已被修饰为包括t-苯甲基基团。NG579和NG552在NGDR9Var中的位置在图11中用下划线标出。

NGDR9Var 215bp节段的扩增

以NG579和NG552(如上所述)为引物对，用由不同的奈瑟氏球菌菌种(如实施例I所述)分离的基因组DNA为模板分别进行PCR反应。在100μl的体积中实施PCR，所述的反应体系包含50mMTricine(pH8.3)，80mM K(OAc)₂(pH7.5)，1mM Mn(OAc)₂(pH6.5)，5％甘油，1mM Mg(OAc)₂(pH6.5)，50μM dATP，50μM dGTP，50μMdCTP，100μM dUTP，20U of  DNA聚合酶(Roche MolecularSystems，Alameda，CA)，5U  UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)，和引物各0.5μM。加入基因组DNA作为模板，对于淋病奈瑟氏球菌每一反应加入10³基因组等同物(genomic equivalents)，对于脑膜炎奈瑟氏球菌以及其他奈瑟氏球菌属的菌种每一反应加入10⁶基因组等同物。利用COBAS 

 PCR系统(Roche Molecular Systems，Alameda，CA)进行60个反应循环，每个循环为：95℃变性15秒，58℃退火40秒，以及72℃下最终延伸5分钟。

NGDR9Var PCR 产物的凝胶电泳分析

如实施例I中所述制备用于凝胶电泳分析的PCR产物。检测凝胶中是否存在预期的215bp大小的PCR扩增产物。

图12A和B显示是检测NGDR9Var的215bp节段的琼脂糖凝胶照片。

实施例VI：通过淋病奈瑟氏球菌同向重复序列9检测淋病奈瑟氏球菌 选择并合成用于PCR分析的NGDR9Univ寡核苷酸

为了利用一组寡核苷酸同时扩增和检测NGDR9和NGDR9Var序列，扫描了两个序列以寻找最大序列同一性区域，并合成了跨NGDR9的473bp区域、跨NGDR9Var的394bp区域的共有序列上游和下游寡核苷酸NGSU2(5’-GCGGCAAGCATCTGTTTTGC-3’)(SEQ ID NO：47)和NGSL2(5’-AGTAGCAGGCGCGAAGATTGA-3’)(SEQ ID NO：49)。如U.S.Pat.No.6,001,611所述的，分别位于NGSU2和NGSL2引物3’末端的脱氧胞嘧啶(deoxycytosine)和脱氧腺苷碱基已被修饰为包括t-苯甲基基团。NGSU2和NGSL2在NGDR9和NGDR9Var中的位置在图11中用下划线标出。

扩增NGDR9的473bD节段和NGDR9Var 394bp节段

用引物对NGSU2和NGSL2(如上所述)，以由不同的奈瑟氏球菌种(如实施例I所示)分离的基因组DNA为模板分别进行PCR反应。在100μl的体积中实施PCR，所述的反应体系包含50mMTricine(pH8.3)，80mM K(OAc)₂(pH7.5)，1mM Mn(OAc)₂(pH6.5)，1mM Mg(OAc)₂(pH6.5)，5％甘油，50μM dATP，50μM dGTP，50μMdCTP，100μM dUTP，20U of  DNA聚合酶(Roche MolecularSystems，Alameda，CA)，5U  UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)，和引物各0.5μM。加入基因组DNA作为模板，对于淋病奈瑟氏球菌每一反应加入10³基因组等同物(genomic equivalents)，对于脑膜炎奈瑟氏球菌以及其他奈瑟氏球菌属的菌种每一反应加入10⁶基因组等同物。利用COBAS 

 PCR系统(Roche Molecular Systems，Alameda，CA)进行60个反应循环，每个循环为：95℃变性15秒，58℃退火40秒以及72℃下最终延伸5min。

NGDR9Univ PCR产物的琼脂糖凝胶分析

如实施例I所述制备用于琼脂糖凝胶分析的PCR产物。检测所述的凝胶是否存在所期望大小的PCR扩增产物——针对NGDR9为473bp，针对NGDR9Var为394bp。

图13A和B是检测NGDR9的473bp节段和NGDR9Var的394bp节段的琼脂糖凝胶照片。

实施例VII：说明利用NGDR9VAR引物选择性地检测淋病奈瑟氏球 菌的试验

这一实施例提供了包括与砂眼衣原体引物相结合，或单独应用核酸引物NG579(SEQ ID NO：38)和NG552(SEQ ID NO：40)以及5’-核酸酶探针(具有相应于SEQ ID NO：42的序列)的试验中所分析的生物的列表。

这些试验的包容性(inclusivity)(即，对于样品中作为靶生物的淋病奈瑟氏球菌的检测能力的测定)如表XII所示。

表XII

 

属	种	检测数量	引物	阳性数量
					奈瑟氏球菌属(Neisseria)	淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)	538	NGDR9Var	62

这些试验的排除性(exclusivity)(即，当样品中存在非淋病奈瑟氏球菌的奈瑟氏球菌属生物时，排除假阳性的能力的测定)如表XIII所示。

表XIII

 

属	种	数量	引物	结果
					奈瑟氏球菌属(Neisseria)	动物奈瑟氏球菌(Neisseria animalis)	3	NGDR9Var	阴性
奈瑟氏球菌属	豚鼠奈瑟氏球菌(Neisseria caviae)	2	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	灰色奈瑟氏球菌	5	＂	＂

 

	(Neisseria cinerea)
					奈瑟氏球菌属	兔奈瑟氏球菌(Neisseria cuniculi)	1	＂	＂
奈瑟氏球菌属	反硝化奈瑟氏球菌(Neisseria denitrificans)	2	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	长奈瑟氏球菌(Neisseria elongata)	5	＂	＂
奈瑟氏球菌属	黄色奈瑟氏球菌(Neisseriaflava)	1	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	浅黄奈瑟氏球菌(Neisseriaflavescens)	7	＂	＂
奈瑟氏球菌属	(Neisseria kochi)	1	＂	＂
					瑟氏球菌属	乳糖奈瑟氏球菌(Neisserialactamica)	6	＂	＂
奈瑟氏球菌属	脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)	24	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	粘液奈瑟氏球菌(Neisseriamucosa)	14	＂	＂
奈瑟氏球菌属	深黄奈瑟氏球菌(Neisseriaperflava)	6	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	多糖奈瑟氏球菌(Neisseriapolysaccharea)	3	＂	＂
奈瑟氏球菌属	干燥奈瑟氏球菌(Neisseriasicca)	7	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	微黄奈瑟氏球菌(Neisseriasubflava)	1	＂	＂
奈瑟氏球菌属	微黄奈瑟氏球菌黄色生物变种(Neisseria subflava biovarflava)	1	＂	＂
					奈瑟氏球菌属	微黄奈瑟氏球菌微黄/黄色生物变种(Neisseria subflavabiovar subflava/flava)	3	＂	＂

 

奈瑟氏球菌属	微黄深黄奈瑟氏球菌(Neisseria subflavaperflava)	7	＂	＂
						总计	99

上述试验的特异性(即，当样品中存在的非奈瑟氏球菌属生物时排除假阳性的能力)如表XIV所示。

表XIV

 

属	种	数量	引物	结果
					衣原体属(Chlamydia)	砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)	15	NGDR9Var	阴性
衣原体属	肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)	1	＂	＂
					衣原体属	鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)	1	＂	＂
无色杆菌属(Achromobacter)	Achromobacter Xerosis	1	＂	＂
					不动杆菌属(Acinetobacter)	鲁氏不动杆菌(Acinetobacter Lwoffi)	1	＂	＂
不动杆菌属	乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)	1	＂	＂
					放线菌属(Actinomyces)	衣氏放线菌(Actinomyces isrealii)	1	＂	＂
气球菌属(Aerococcus)	绿色气球菌(Aerococcus viridans)	1	＂	＂
					气单胞菌属(Aeromonas)	嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)	1	＂	＂
土壤杆菌属(Agrobacterium)	放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)	1	＂	＂
					产碱菌属(Alcaligenes)	粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)	1	＂	＂

 

芽孢杆菌属(Bacillus)	苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)	1	＂	＂
					芽孢杆菌属	枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)	1	＂	＂
拟杆菌属(Bacteriodes)	脆弱拟杆菌(Bacteriodes fragilis)	1	＂	＂
					拟杆菌属	粪拟杆菌(Bacteroides caccae)	1	＂	＂
乳杆菌属(Bifidobacillus)	长乳杆菌(Bifidobacillus longum)	1	＂	＂
					长双歧杆菌属(Bifidobacterium)	青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)	1	＂	＂
布兰汉氏球菌属(Branhamella)	粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)	1	＂	＂
					短杆菌属(Brevibacterium)	扩展短杆菌(Brevibacterium linens)	1	＂	＂
假丝酵母属(Candida)	白色假丝酵母(Candida albicans)	1	＂	＂
					色杆菌属(Chromobacter)	紫色色杆菌(Chromobacter violaceum)	1	＂	＂
柠檬酸杆菌属(Citrobacter)	弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)	1	＂	＂
					梭菌属(Clostridium)	无害梭菌(Clostridium innocuum)	1	＂	＂
梭菌属	产气荚膜梭菌(Clostridium　perfringens)	1	＂	＂
					棒杆菌属(Corynebacterium)	生殖道棒杆菌(Corynebacterium genitalium)	1	＂	＂
棒杆菌属	干燥棒杆菌(Corynebacterium xerosis)	1	＂	＂
					隐球菌属(Cryptococcus)	Cryptococcus neoformans	1	＂	＂

 

埃希氏菌属(Echerichia)	大肠杆菌(Echerichia coli)	1	＂	＂
					艾肯氏菌属(Eikenella)	啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)	1	＂	＂
肠杆菌属(Enterobacter)	阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)	1	＂	＂
					肠球菌属(Enterococcus)	鸟肠球菌(Enterococcus avium)	1	＂	＂
肠球菌属	粪肠球菌(Enterococcus faecalis)	1	＂	＂
					肠球菌属	屎肠球菌(Enterococcus faecium)	1	＂	＂
丹毒丝菌属(Erysipelothrix)	猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)	1	＂	＂
					爱文氏菌属(Ewingella)	美洲爱文氏菌(Ewingella americana)	1	＂	＂
黄杆菌属(Flavobacterium)	脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)	1	＂	＂
					孪生球菌属(Gamella)	麻疹孪生球菌(Gamella morbillorum)	1	＂	＂
加德纳氏菌属(Gardnerella)	阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)	1	＂	＂
					嗜血菌属(Haemophilus)	流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)	1	＂	＂
嗜血菌属	软性下疳嗜血菌(Haemophilus ducreyi)	1	＂	＂
					金氏菌属(Kingella)	金氏金氏菌(Kingella kingae)	1	＂	＂
克雷伯氏菌属(Klebsiella)	肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(Klebsiella pneumoniaessozaenae)	1	＂	＂

 

乳杆菌属(Lactobacillus)	口乳杆菌(Lactobacillus oris)	1	＂	＂
					乳杆菌属	阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)	1	＂	＂
乳杆菌属	嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)	1	＂	＂
					乳杆菌属	短乳杆菌(Lactobacillus brevis)	1	＂	＂
乳杆菌属	类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchnerri)	1	＂	＂
					军团菌属(Legionella)	博兹曼军团菌(Legionella bozemanii)	1	＂	＂
军团菌属	嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)	1	＂	＂
					明串珠菌属(Leuconostoc)	类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)	1	＂	＂
微球菌属(Micrococcus)	藤黄微球菌(Micrococcus luteus)	1	＂	＂
					莫拉氏菌属(Moraxella)	奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)	1	＂	＂
摩根氏菌属(Morganella)	摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)	1	＂	＂
					分枝杆菌属(Mycobacterium)	耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)	1	＂	＂
枝原体属(Mycoplasma)	人型枝原体(Mycoplasma hominis)	1	＂	＂
					沙雷氏菌属(Serratia)	反硝化沙雷氏菌(Serratia denitrificans)	1	＂	＂
巴斯德氏菌属(Pasteurella)	(Pasteurella maltocida)	1	＂	＂
					消化链球菌属(Peptostreptococcus)	大消化链球菌(Peptostreptococcu magnus)	1	＂	＂

 

消化链球菌属	产生消化链球菌(Peptostreptococcu productus)	1	＂	＂
					普雷沃氏菌属(Prevotella)	双路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)	1	＂	＂
普雷沃氏菌属	人体普雷沃氏菌(Prevotella corporis)	1	＂	＂
					普雷沃氏菌属	中间普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)	1	＂	＂
丙酸杆菌属(Propionibacterium)	疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)	1	＂	＂
					变形菌属(Proteus)	奇异变形菌(Proteus mirabilis)	1	＂	＂
普罗威登斯菌属(Providencia)	斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)	1	＂	＂
					假单胞菌属(Pseudomonas)	铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)	1	＂	＂
假单胞菌属	恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)	1	＂	＂
					沙门氏菌属(Salmonella)	明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)	1	＂	＂
沙门氏菌属	鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)	1	＂	＂
					沙雷氏菌属(Serratia)	粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)	1	＂	＂
葡萄球菌属(Staphylococcus)	金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)	1	＂	＂
					葡萄球菌属	表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)	1	＂	＂
链球菌属(Streptococcus)	唾液链球菌(Streptococcus salivarius)	1	＂	＂
					链球菌属	无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)	1	＂	＂

 

链球菌属	牛链球菌(Streptococcus bovis)	1	＂	＂
					链球菌属	(Streptococcus dysgalatia)	1	＂	＂
链球菌属	咽峡炎链球菌(Streptococcus equinis)	1	＂	＂
					链球菌属	肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)	1	＂	＂
链球菌属	酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)	1	＂	＂
					弧菌属(Vibrio)	副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)	1	＂	＂
耶尔森氏菌属(Yersinia)	小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)	1	＂	＂
					密螺旋体属(Treponema)	苍白密螺旋体(Treponema pallidumv)	1	＂	＂
单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus)1		1	＂	＂
					单纯疱疹病毒2		1	＂	＂
EB病毒(Epstein BarrVirus)		1	＂	＂
					人乳头瘤病毒(Humanpapilloma virus)16型		1	＂	＂
人乳头瘤病毒18型		1	＂	＂
						总计	100

上述出于清楚和明了的目的详细描述了本发明，通过阅读上述内容本领域的技术人员能够在不背离本发明的精神的范围内作出形式和细节上的多种改变。例如可以将上述描述的各种技术、装置进行多种组合。

序列表

<110>F.HOFFMANN-LA ROCHE AG

<120>用于检测淋病奈瑟氏球菌的试剂和方法

<130>24326 HS

<140>11/873,324

<141>2007-10-16

<150>11/017,476

<151>2004-12-17

<160>67

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>806

<212>DNA

<213>淋病奈瑟氏球菌

<400>1

<210>2

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<213>淋病奈瑟氏球菌

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<213>淋病奈瑟氏球菌

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<213>淋病奈瑟氏球菌

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<213>Brucella suis

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<213>Neisseria meningitidis

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<213>淋病奈瑟氏球菌

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<213>淋病奈瑟氏球菌

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Claims (15)

1.一种寡核苷酸，其具有50个或以下的核苷酸，且包含与SEQ IDNOS：37-60之一或其互补序列具有至少90％序列同一性的核酸。

2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述的核酸与SEQ IDNOS：37-60之一或其互补序列具有至少95％的序列同一性。

3.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述的寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。

4.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述的寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂组成成分。

5.一种检测样品中的淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的方法，该方法包括：

(a)将来自所述样品的核酸与至少第一核酸引物对在至少一个核酸扩增反应中接触，所述的核酸引物包含至少一个选自下述的核酸：SEQ ID NOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体；和，

(b)在(a)期间或之后检测所述的核酸和/或来自所述核酸扩增反应的、所述核酸的一个或多个扩增子，由此检测样品中的淋病奈瑟氏球菌。

6.如权利要求5所述的方法，其中，(a)包含将来自所述样品的核酸与至少第二核酸引物对接触，所述的第二核酸引物对与砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)核酸至少部分互补，(b)包含(a)期间或之后检测来自所述核酸扩增反应的一个或多个附加的扩增子，由此检测样品中的砂眼衣原体。

7.如权利要求5所述的方法，其中，(b)包含监测所述的核酸扩增子与一个或多个核酸检测试剂的结合，所述的核酸检测试剂以可检测的方式结合于具有下述序列的核酸，所述序列为：SEQ ID NO：36组成的序列；与SEQ ID NO：36组成的序列基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：36具有至少90％的序列同一性；或SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。

8.如权利要求7所述的方法，其中，至少一个所述的核酸检测试剂包含具有下述序列的核酸，所述的序列选自：SEQ ID NOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ IDNOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。

9.检测样品中的淋病奈瑟氏球菌的方法，该方法包括：

(a)将来自所述样品的核酸与至少第一核酸引物对在至少一个核酸扩增反应中接触，所述的每个核酸引物均具有12-100个核苷酸，且其中至少一个所述的核酸引物与SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列包含至少90％的序列同一性；和，

(b)在(a)期间或之后检测所述的核酸和/或来自所述核酸扩增反应的、所述核酸的一个或多个扩增子，由此检测样品中的淋病奈瑟氏球菌。

10.如权利要求9所述的方法，其中(a)包含将来自所述样品的核酸与至少第二核酸引物对接触，所述的第二核酸引物对与砂眼衣原体核酸至少部分互补，(b)包含在(a)期间或之后检测核酸扩增反应的一个或多个附加的扩增子，由此检测样品中的砂眼衣原体。

11.如权利要求9所述的方法，其中，(b)包含监测所述的扩增子与一个或多个核酸检测试剂的结合，所述的核酸检测试剂以可检测的方式结合于具有下述序列的核酸，所述序列为：SEQ ID NO：36组成的序列；与SEQ ID NO：36组成的序列基本上同一的变体，所述的变体与SEQ ID NO：36具有至少90％的序列同一性；SEQ ID NO：36的互补序列或其变体。

12.一种试剂盒，其包含：

(a)至少一个具有50个或以下的核苷酸的寡核苷酸，所述的寡核苷酸包含与SEQ ID NO：36的亚序列或其互补序列至少90％的序列同一性；以及一个或多个：

(b)通过监测来自所述样品的核酸和/或其扩增子与所述寡核苷酸的结合来确定样品中存在淋病奈瑟氏球菌的使用说明，其中，样品中是否存在淋病奈瑟氏球菌是未知的或无确实根据的；

(c)至少一个包装至少所述的寡核苷酸的容器。

13.权利要求12的试剂盒，其中，所述的寡核苷酸具有下述序列，所述序列选自：SEQ ID NOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。

14.权利要求12所述的试剂盒，其还包括一种或多种以可检测的方式结合于砂眼衣原体核酸的核酸检测试剂。

15.一种反应混合物，其包含一组扩增子，所述扩增子具有相应于：SEQ ID NO：36的一个或多个亚序列；与SEQ ID NO：36基本上同一的变体，的序列，其中，所述的变体与SEQ ID NO：36具有至少90％的序列同一性；或SEQ ID NO：36的互补序列或其变体，所述的扩增子缺少终止子核苷酸，其中，所述扩增子组的至少一种亚组是用至少一个具有下述序列的核酸引物制备的，所述序列选自SEQ IDNOS：37-60；与SEQ ID NOS：37-60基本上同一的变体，其中所述的变体与SEQ ID NOS：37-60之一具有至少90％的序列同一性；以及SEQ ID NOS：37-60的互补序列及其变体。

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