CN101432314A - 链长极高的菊粉 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长链菊粉和由洋蓟根制备所述菊粉的方法、涉及其在食品和化妆品制剂中的用途、并涉及包含该长链菊粉的食品和化妆品制剂。

Description

链长极高的菊粉

本发明涉及特别长链的菊粉和由洋蓟(artichoke)根制备所述菊粉的方法、涉及其在食品和化妆品制剂中的用途、并涉及包含该特别长链菊粉的食品和化妆品制剂。

对含有极少脂肪和更多天然原材料的食品的需求近几十年来极大增长。已经提出许多物质作为脂肪替代品，例如基于碳水化合物或蛋白质的产品或合成脂肪替代品，如脂肪酸的糖聚酯。但是，这些始终具有缺点，如低的热稳定性、不令人满意的“口感”或对人或环境的不合意影响。

长期以来已知的是，菊粉适用在食品中。菊粉具有可供给人体的低能量值，因此使用菊粉作为脂肪替代品确保了最终产品热值的大量降低。此外，使用菊粉作为食品中的益生素(prebiotic)添加剂和填充剂。

菊粉是属于果聚糖类的多糖。其由β-2-1-连接的果聚糖分子链构成且该链可以在还原端具有α-D-葡萄糖单元。菊粉以可经济回收的量存在于各种植物，如菊苣(chicory)根、菊芋(Jerusalem artichoke)和大丽花(dahlia)块茎中。各种菊粉的平均链长及其物理化学性质随植物物种的不同而不同。

迄今在食品领域中使用的菊粉在其加工性质，如在含水糊料形式下的粘性、热稳定性和酸稳定性、可乳化性和水结合能力方面不完全令人满意。

此外需要具有改进的发酵性质和更高的益生素效应的菊粉。

另一问题在于在用热水从植物组织中提取菊粉时，提取物除了聚合物粗制菊粉外，还含有单糖，如葡萄糖和果糖；二糖，如蔗糖和低聚果糖(fructooligosaccharide，DP 3-10)。这些副产物(单糖和二糖、低聚果糖(DP 3-10))可能妨碍菊粉的进一步加工。例如，单糖和二糖在食疗食品的制造中是不合意的。单糖和二糖和低聚果糖(DP 3-10)的甜味妨碍在食品领域中的某些用途。低聚果糖(DP 3-10)由于其吸湿性和粘性，可能在加工和储存过程中极大妨碍粗制菊粉在食品中的应用。在粗制菊粉例如通过化学衍生化进一步加工的过程中，单糖和二糖和低聚果糖(DP 3-10)可能产生只能通过昂贵的方法提纯或完全不能提纯的不确定的产物混合物。此外，高比例的还原糖的缺点在于，在氨基化合物存在下的热过程中，可能出现不想要的褐变反应、形成臭味和产生丙烯酰胺(美拉德(Maillard)反应)。

本发明的目的是提供可用于解决上述问题的菊粉。

本发明目的特别是要实现用在化妆品和食品工业中的有利加工性质。例如有利的粘性、高的热稳定性和酸稳定性、良好的可乳化性和高的水结合能力。

另外，本发明解决的一个问题是提供用于食品应用的具有改进的发酵性质和改进的益生素效应的菊粉。

最后，希望提供与粗制菊粉相比具有更小的单糖和二糖和低聚果糖(DP 3-10)含量的菊粉。

通过提供权利要求书中定义的实施方案，解决了前述问题。

本发明涉及具有65至81，优选65至79，更优选66至78，非常特别优选66至76，再更优选66至74和最优选66-73的平均聚合度DP_w的菊粉。

在这方面且就本发明而言，术语“...至...”也意在包括分别指出的数值极限。

就本发明而言，术语“菊粉”是指由β-2-1-连接的果糖分子链构成的多聚果糖(polyfructan)。该链优选在其末端具有还原的α-D-葡萄糖单元。

就本发明而言，术语“平均聚合度DP_w”(平均DP重量)是指重均分子量M_w和单体分子量M₀的商。重均分子量M_w得自

$M_w=\frac{\mathrm{\Σ}{N}_i{M}_i^2}{\mathrm{\Σ}{N}_i{M}_i}$

其中Ni是分子量为Mi的分子的数量。

就本发明而言，“平均聚合度DP_w”优选通过下文描述的“与光散射和折光指数检测联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI-MALLS系统)”测量。

本发明的菊粉与现有技术中所述的菊粉相比，表现出令人惊讶的优点，即其可以加工成在热处理或酸处理时具有异常高的稳定性的乳膏，以使它们更适合例如特定工业用途或在化妆品和/或食品工业中的用途。此外，包含本发明的菊粉的乳膏对剪切力表现出出乎意料的高稳定性。本发明的菊粉因此与传统菊粉相比表现出另一优点，即其可以在存在强剪切力的工业方法中更好地加工。

本发明的菊粉进一步突出地具有特别有利的粘性和高凝胶强度和非常低溶解度，这有利于食品用途。

此外，本发明的菊粉表现出作为食品中的脂肪替代品的令人惊讶的良好性质，以及在口中优异的感觉性质。

本发明的菊粉与之前所用的产品相比还表现出更慢的发酵，这有利于预防大肠后端中的疾病。该较慢发酵伴随着肠中减少的气体生成，尤其是氢气生成。

本发明的菊粉另外与之前所用的产品相比具有更高的益生素效应。特别地，本发明的菊粉以有利方式刺激双歧杆菌的生成，同时减少不需要和/或致病的细菌。本发明的菊粉因此适用在食品和/或药剂中以预防和治疗肠机能障碍和疾病，尤其是在大肠后端中。

最后，本发明的菊粉也赋予各种食品有利的应用性质，例如粘性升高、可乳化性、水结合能力和碎屑形成。本发明的菊粉令人惊讶地赋予烘烤食品改进的烘烤性质并提高面团得率。此外，本发明的菊粉是用于改变风味和使泡沫稳定的有效途径。

在另一实施方案中，本发明的菊粉具有小于3％，优选小于1.5％，特别优选小于0.7％，非常特别优选小于0.3％的DP为3至10的低聚果糖(果寡糖)含量。

在另一实施方案中，本发明的菊粉具有小于2％，优选小于1％，特别优选小于0.5％，非常特别优选小于0.2％和最优选小于0.1％的葡萄糖含量。

在另一实施方案中，本发明的菊粉具有小于2.5％，优选小于1.5％，特别优选小于1.0％，非常特别优选小于0.3％和最优选小于0.15％的果糖含量。

在另一实施方案中，本发明的菊粉具有小于2％，优选小于1％，特别优选小于0.5％，非常特别优选小于0.3％和最优选小于0.1％的蔗糖含量。

在本发明的菊粉的一个特别有利于食品用途的实施方案中，单糖和二糖的含量小于0.5％。

除非另行指明，所有百分比都是基于菊粉和其它物质总干重量的重量百分比。“其它物质”是干混合物中不同于菊粉的所有物质。

就本发明而言，果糖、葡萄糖和蔗糖含量通过下文所述光学酶促法(一般方法：“糖测定法”)测量。

在可包括前述实施方案的另一实施方案中，本发明的菊粉具有10 500克/摩尔至13 150克/摩尔，优选10 500至12 800克/摩尔，特别优选10 650克/摩尔至12 650克/摩尔，再更优选10 650克/摩尔至12 350克/摩尔和最优选10 650克/摩尔至12 000克/摩尔的重均分子量M_w。

就本发明而言，重均分子量M_w优选通过下文所述“与光散射和折光指数检测联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI-MALLS系统)”测量。

在可包括前述实施方案的另一实施方案中，本发明的菊粉具有54至75，优选54至72，再更优选57至71，特别优选60至71的通过凝胶渗透色谱法(GPC)测得的平均聚合度DP_n(GPC)。

就本发明而言，“平均聚合度DP_n”优选通过下文所述“与光散射和折光指数检测联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI-MALLS系统)”测量。

就本发明而言，术语“平均聚合度DP_n“(平均DP数)是指数均分子量M_n和结合单体的分子量M₀(脱水果糖＝162克/摩尔)的商。数均分子量M_n得自

$M_n=\frac{\mathrm{\Σ}{N}_i{M}_i}{\mathrm{\Σ}{N}_i}$

其中Ni是分子量为M_i的分子的数量。

在可包括前述实施方案的另一实施方案中，本发明的菊粉具有650至48 000，更优选970至40 000克/摩尔，再更优选1300克/摩尔至34 000克/摩尔和最优选4000克/摩尔至26 800克/摩尔的分子量分布。

在可包括前述实施方案的再一实施方案中，本发明的菊粉中分子量<10000克/摩尔的菊粉分子总质量为所有菊粉分子总质量的25-40％，且分子量>20 000克/摩尔的菊粉分子总质量为所有菊粉分子总质量的5-20％。再更优选地，分子量<10 000克/摩尔的菊粉分子总质量为所有菊粉分子总质量的30-36％且分子量>20 000克/摩尔的菊粉分子总质量为所有菊粉分子总质量的9-15％。

就本发明而言，分子量分布优选通过下文所述“与光散射和折光指数检测联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI-MALLS系统)”测量。

在具有特别有利的性质的本发明的菊粉的一个实施方案中，支化度为0.5-2.0摩尔％，更优选0.7-2.0摩尔％，再更优选0.9至2.0摩尔％，最优选1.1至2.0摩尔％。支化度在本文中是指在具有无规分布分子量的本发明的菊粉样品中测得的，在果糖单体的6位具有附加分支点的β-2-1-连接果糖单体(下文也缩写为“2-1，6-”)基于所有菊粉单体总数的百分数。在其6位，聚果糖链内的“2-1，6-”果糖单体连接到由至少两个β-2-1-连接的果糖单体构成的另一聚果糖链上，或连接到单个果糖单体上。术语“分支点”是指聚果糖链内的与由至少两个β-2-1-连接的果糖单体构成的另一聚果糖链或单干完果糖单体连接的果糖单体位置。支化度通过标准甲基化分析法或通过甲基化后的还原降解法测量。这两种方法都详细描述在所附实施例中。

性质特别有利的本发明的菊粉的一个实施方案(可包括前述实施方案)具有特别窄的由重均聚合度和数均聚合物度之间的商DPw/DPn表示的分子量分布。该量也被称作多分散指数。在优选实施方案中，商DPw/DPn小于1.25，在更优选实施方案中小于1.20，在再更优选实施方案中小于1.15，且在最优选实施方案中小于1.10。在这方面，DPw和DPn的值通过下文所述“与光散射和折光指数检测联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI-MALLS系统)”测量。用于计算转化率的单体分子量设定等于162克/摩尔。

本发明进一步涉及本发明的菊粉的含水糊料，其可通过将菊粉分散在水中、剪切所得分散体直至均匀、将由此获得的产物在4-15℃下储存12-24小时，并在调节至室温后搅拌产生均匀糊料而获得。优选糊料包含水和基于糊料总重量为1-40重量％，更优选1-35重量％，再更优选1-30重量％，再更优选2-25重量％，更优选2-20重量％，特别优选10-20重量％的菊粉。根据本发明，术语“糊料”相当于结晶和/或非晶菊粉的悬浮液。相应地，术语“含水糊料”被理解为是结晶和/或非晶菊粉在水相中的悬浮液。水相基于水，其可任选包含其它溶解或悬浮的物质，例如盐、其它碳水化合物、蛋白质、氨基酸。在一个有利实施方案中，糊料中的菊粉是喷雾干燥的菊粉，即在形成糊料之前喷雾干燥的菊粉。

上述糊料可用作含水体系中的组分。优选的含水体系是化妆品和基于水的食品，其中在本说明书中的其它地方定义了术语“食品”。在本说明书中的其它地方也列出了优选食品的实例。在食品和化妆品中，本发明的糊料可用作创建结构的(structure imparting)组分、增稠剂、质地剂(texturizing agent)、稳定性增强剂或粘度提高剂，其中在这方面，该糊料可以发挥一个或多个上述功能。在食品中，本发明的糊料也可用作脂肪替代品、油替代品、益生素和/或膳食纤维组分，其中在这方面，该糊料可以发挥一个或多个上述功能。最优选的用途是用作油或脂肪替代品。使用本发明的糊料作为组分的最优选食品是乳制品，如酸奶、酸奶饮料、奶油、新鲜稀奶油(crème fraiche)、凝乳、黄油、奶，尤其是脱脂奶、酪乳、酸乳(soured milk)、酸乳酒、奶酪，如乳脂干酪、软干酪、切片干酪、硬干酪、乳清、奶粉、奶类饮料。

本发明的菊粉表现出对酸的令人惊讶的高稳定性。特别地，本发明的菊粉的含水糊料表现出高的酸稳定性。与市售产品相比，本发明的菊粉含水糊料的剪切稳定性同样出色。

本发明的菊粉与其它市售菊粉的区别在于令人惊讶的高凝胶强度。在菊粉在90℃下溶解然后在室温(23℃)下储存24小时时，在1-35％(w/w)，更优选1-30％(w/w)，再更优选2-25％(w/w)，仍更优选2-20％(w/w)，最优选大约20％(w/w)的本发明菊粉的浓度下，实现4-100N，更有利地10-100N，再更有利地20-100N和最有利地40-100N的凝胶强度。用本发明的菊粉喷雾干燥并随后用于形成凝胶可以特别好地实现上文所示的高凝胶强度。由此获得的凝胶优选表现出微粒特性(粒子凝胶)。在实施例部分中详细描述了用于测定凝胶强度的测量法(通过在水中加热后的菊粉形成结构)。

本发明在另一方面涉及获得菊粉的方法，其中

a)粉碎洋蓟根，

b)通过用水处理粉碎过的根来获得提取液，

c)从所得提取液中去除着色成分，

d)从提取液中沉淀出菊粉，

e)使菊粉再沉淀至少一次。

此方法特别适用于获得前述本发明的菊粉，但不限于此。

使用洋蓟根作为原材料，但此方法不限于特定种类。在粉碎之前，有利地例如通过用高压清洁器用水剧烈洗涤来从所述根中去除任何附带污染物。有利地可以洗涤深冻状态的根以使根材料的质量损失最小化。

如果必要，首先将根粗略弄碎，例如切碎。优选使用切碎机进一步粉碎。所得产品是纤维碎片形式的粉碎的根材料。

在此方法的最有利实施方案中，使用具有下列特性的洋蓟根：就干物质和菊粉的形成而言成熟的根。由菊粉含量与干物质含量的比率和果糖含量与菊粉含量的比率确定成熟度。菊粉含量优选基于根的干物质总重量为30-70重量％，更优选40-65重量％，再更优选50-60重量％，且果糖/菊粉比率优选为3-24重量％，更优选3-12重量％，最优选低于6重量％。清洁过的洋蓟根的干物质含量优选基于清洁过的根总重量为20-50重量％，更优选30-40重量％，更优选30-35重量％。

如果洋蓟根在其用在本发明的方法中之前必须储存，则应该保护根以防止微生物污染、腐败或由酶促降解引起的菊粉的分子量降低。保护根的优选方法是将粉碎的根的冷冻或热风干燥以便储存。

在粉碎后，将粉碎的根材料用水，优选在60℃至95℃，最优选80-95℃的温度下提取。该提取优选在中性至微碱性pH范围内进行。在pH 7-9下至少60℃的温度是有利的，因为在这种情况下，抑制了酶促和酸性水解。粉碎的根材料在水中的浓度优选为10-40重量％，更优选20-30重量％，按根的鲜重基于提取混合物总重量测量。

优选地，确立这样的所用切碎材料的干物质与作为提取介质的水之间的比率，其使提取液中的干物质含量为提取液总重量的8-12重量％且菊粉含量高于6重量％，优选6-8重量％。相应地适当选择提取条件，如水/根重量的比率，可以使根中存在的80-90重量％的菊粉转移到提取液中。根据甚至在低至提取液重量的5重量％的浓度下也能从提取液中结晶出高分子量菊粉的观察结果，上述条件适用于实现菊粉从提取液中的有利结晶和高收率。

对提取设备没有特殊限制，并且可以使用植物材料的传统提取技术。根据本发明，提取最优选在护套加热的带有搅拌器的提取器中进行。在另一高度优选的实施方案中，使用可加热的滤桶作为搅拌式提取器。由此，从根中提取菊粉与通过过滤将提取液与废碎料分离相结合，如下所述。根/水混合物平衡后的提取时间优选为30分钟-4小时，优选1-2小时。在此时间后，例如通过泵出或排出或过滤来将提取液与废碎料分离。

在将提取液与废碎料分离后，在适当情况下，纤维状材料和植物片段可能作为悬浮材料留在提取液中。如果存在，同样将这些悬浮材料从提取液中去除。在本方法的这一方案中，因此，在方法的步骤b)之后，在步骤c)之前，进行从提取液中去除主要由纤维构成的悬浮材料的步骤。悬浮材料的可接受的量和是否进行去除由技术人员根据具体情况决定。悬浮材料的去除可以通过传统分离技术，如离心或过滤进行。经证实除渣分离器特别合适。也可以使用具有适当细度的筛网或过滤器。

在高度优选的实施方案中，可以使用废碎料作为过滤材料滤除所述悬浮材料。在这种实施方案中，废碎料沉淀在底部配有筛子的提取器如滤桶的底部。筛子优选为狭缝筛(slit sieve)。使用沉淀废碎料作为提取液流过的过滤床。通过使用这种技术，可以在将提取液进一步精制或增白或使菊粉结晶之前几乎定量去除悬浮材料而无需采用其他过滤步骤。

提取液由于其中的着色成分和胶态悬浮的有色物质含量，是有色的。着色成分尤其由单宁类物质和类黄酮构成，并通常赋予提取液黄色或棕黄色和/或深棕色。可由这类提取液直接获得的菊粉不符合对中性颜色的所需要求。因此必须在该方法的步骤c)中从提取液中去除着色成分。本发明的用于从植物提取液中去除着色成分的工艺步骤c)通常也称作植物提取液的脱色、澄清或“增白”。这些术语在本发明中相等。

增白可以根据本发明通过添加石灰和随后碳化(添加CO₂)来进行。石灰添加法是现有技术中已知的，并例如用于由制糖甜菜获得蔗糖。在另一增白法中，使用离子交换剂去除干扰成分。

在此方法的特别有利的实施方案中，在步骤c)中如下所述去除着色成分，其中：

i)将镁离子(Mg²⁺)混入植物提取液，

ii)将至少一种碱性组分混入植物提取液，

iii)形成沉淀物，和

iv)从植物提取液中去除已形成的沉淀物。

在这种特别优选的方案中，步骤i)-iv)是工艺步骤c)的子步骤。

该方法方案令人惊讶地与石灰增白法相比能够更有效地将提取液脱色。此外，所用助剂，镁盐和碱是低成本的。此方法因此比使用离子交换剂便宜。用于实施该工艺步骤的装置和时间支出也特别低。最后，这种类型的增白也同时从提取液中去除造成混浊的材料。

根据本发明将镁离子(Mg²⁺)混入植物含水提取液中。在步骤i)的方案中可以将镁盐的水溶液添加到植物提取液中。在另一更优选的方案中，将镁盐以固体形式直接添加到植物提取液中并溶解在其中。

如果添加镁盐，其优选是由于其高溶解度产物而非常容易溶解在水中的盐。特别合适的镁盐选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁、低级脂肪酸的镁盐，如乙酸镁和丙酸镁，及其混合物。

ii)中的碱性组分根据本发明是指包含氢氧根离子(OH^-)或在与植物提取液合并后在该提取液中形成氢氧根离子的组分。碱性组分可以是液态、固态或气态的。优选使用液态碱性组分。

在如该方法的步骤i)和ii)中所述添加镁离子和碱性组分时，通过沉淀反应形成沉淀物。在本方法中，步骤i)和ii)原则上可以同时进行，尤其是在步骤i)中使用镁离子的溶液并在步骤ii)中使用碱性液体的情况下。但是，优选首先进行工艺步骤i)，然后进行步骤ii)。

对工艺步骤c)而言有利的是，镁离子和碱性组分都尽可能均匀地分布在提取液中以使提取液中的沉淀反应也均匀和尽可能定量。因此优选使用可以迅速均匀地混入植物提取液中的含水碱液，例如碱性溶液或碱性悬浮液作为碱性组分。碱性溶液或悬浮液根据本发明包含氢氧根离子(OH^-)或在与植物提取液合并后形成氢氧根离子。

在非常优选的方法方案中，首先在步骤i)中将镁盐均匀溶解在提取液中。随后，在步骤ii)中，加入碱性水溶液或悬浮液。

在一个实施方案中，碱性组分是碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物的水溶液或悬浮液。该氢氧化物优选选自碱金属和碱土金属的氢氧化物，如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和氢氧化钡。

在一个非常特别优选的方案中，碱性组分是氢氧化钙的悬浮液。使用氢氧化钙的优点在于，在步骤iii)中获得特别少量的离心液。此外，氢氧化镁和硫酸钙的同时沉淀实现了更高沉降速率和更高的沉淀物压缩率。沉淀物具有特别小的凝胶状稠度。沉淀物中菊粉的结合量在这一方法方案中保持特别低。

可用的另一碱性组分是氨，优选为水溶液形式。原则上不排除使用气态氨，但不如使用水溶液优选。

在另一实施方案中，碱性组分是有机碱如乙二胺和三乙醇胺的水溶液或悬浮液。

也可以使用弱有机酸的盐，如碱金属乙酸盐和碱土金属乙酸盐，尤其是乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙和乙酸镁。

作为沉淀物形成氢氧化镁。含水提取液的着色成分根据本发明留在沉淀物中，并因此与液相分离。获得基本脱色的提取液。Mg²⁺离子和碱性组分的用量，和因此所形成的沉淀物的量，尤其决定了该脱色的定量程度。反应物的量的优化在技术人员的能力范围内。在硫酸镁的情况下，优选浓度为含水提取液的0.5-3重量％，更优选0.5-2重量％。

在步骤c)的优选方案中，如上所述，氢氧根离子与镁离子OH^-:Mg²⁺的摩尔比优选为2.2:1至1.8:1。该比率最优选为完全化学计量的，即OH^-:Mg²⁺＝2:1。因此选择碱性组分的量以便对镁离子而言，存在适当量的氢氧根离子。

在工艺步骤i)和ii)中，镁盐的溶解和碱性组分的混合优选在搅拌下进行以实现尽可能快的溶解和均化和因此实现快速反应。但是，对混合技术没有特别的进一步限制。因此，此方法可以例如也通过技术人员熟悉的其它混合技术进行。

为了加快此方法，步骤i)优选在60-80℃的温度下进行。添加碱性组分后的反应时间通常为大约1至15分钟，平均大约10分钟。

去除步骤iv)优选通过沉降或过滤进行。可以通过离心机，优选盘式离心机，特别是除渣离心机使该沉降更快。但是，也可以使用技术人员熟悉的其它分离技术。这些技术也可以彼此结合进行，例如增白的提取液的离心除渣与除渣后的提取液的随后过滤(例如用板式过滤器过滤)结合进行。

如果需要，本发明的方法的整个步骤c)也可以进行一次以上。如果使用具有子步骤i)-iv)的步骤c)的前述优选方案，各子步骤i)-iv)也可以进行一次以上。

在步骤c)后，在步骤d)中从提取液中沉淀出菊粉。可以例如通过添加醇，如乙醇、甲醇或异丙醇来实现沉淀。在这种情况下，根据所添加的醇的量或调节过的液相极性，最先沉淀出高分子量菊粉级分，因此可以经由所添加的醇的量影响提取液中存在的菊粉定量沉淀的程度和主要获得哪种分子量级分。除醇外，也可以使用与水混溶的其它非极性有机液体。

为此，在此工艺步骤的特别有利的实施方案中，为了限制醇，尤其是乙醇和异丙醇的使用，先将制成的提取液浓缩，优选浓缩至其初始体积的1/4至1/5。该浓缩可以通过蒸发或膜过滤或这两种方法的组合进行。在这种情况下必须小心地使浓缩物在浓缩过程中保持热，优选保持在60-95℃，以避免菊粉沉淀。膜过滤的优点是与菊粉相伴的低分子量物质的随之贫化。可以通过选择提高醇浓度来控制菊粉从浓缩物中的后继沉淀，从而根据例如由重均聚合度(DPw)表征的分子大小范围将菊粉分级。根据沉淀条件的选择，得到具有符合本发明的DPw的级分。这取决于所需纯度。

与通过醇式沉淀相比，更优选通过冷却提取液来获得菊粉。优选条件使得提取液被冷却至2-10℃，更优选2-8℃，并在此温度下保持6至140小时，优选6至48小时，在此过程中菊粉沉淀。冷却速率和温度和冷却持续时间影响菊粉从提取液中沉淀以及分子量分布的幅度，并因此同时影响量。较长时间和较低温度的选择导致更低分子量菊粉的沉淀和更宽的分子量分布，因此沉淀的级分的平均分子量更低。通过传统分离技术，例如离心、滗析、过滤，将沉淀的菊粉与液相分离。

在优选实施方案中，菊粉在上述方法的提取步骤b)之后和步骤c)之前初次结晶。这种结晶优选如上所述进行。与提取液直接增白相比步骤c)之前的结晶导致高分子量菊粉的收率提高，并使增白剂、即镁化合物和碱性组分的使用经济。有利地在菊粉的初次结晶后将提取液增白，因为在这种情况下，仅必须去除结合到菊粉晶体上的着色成分，这导致类似更少量的菊粉结合到增白淤渣上。

在沉淀出的菊粉的初次沉淀和移除后，可以重新将提取液冷却或添加醇以获得仍然溶解的任何菊粉级分。根据需要的从植物中获得菊粉的定量程度和在最终产物中需要哪种分子量分布，随具体情况作出关于重复的决定。

提取液中的菊粉浓度基本取决于根的菊粉含量和提取液中粉碎的根的浓度，并且是其影响冷却提取液而沉淀菊粉的另一变量。因此可以利用沉淀对浓度的依赖性，从而在初次沉淀后来浓缩液相，例如通过蒸发，如果需要，从而也沉淀出低分子量级分。

在最后工艺步骤e)中，使沉淀出的菊粉再沉淀。“再沉淀”在本发明中是指将获自前述工艺步骤的固体菊粉再溶解并随后再从该溶液中沉淀和/或结晶出来。因此，工艺步骤e)也可以表达为：再次将菊粉溶解并沉淀和/或结晶，其中该步骤进行至少一次。结晶与沉淀的不同之处在于，获得主要结晶的结构。

菊粉优选在热的影响下溶解，优选在水中溶解。温度70-100℃，特别是90-100℃的水特别合适。

步骤e)中的沉淀可以通过如上所述的醇式沉淀进行。但是，优选通过将该溶液冷却至2-10℃，更优选2-8℃达6至140小时，优选6至48小时来获得菊粉。

在步骤e)中，可以重复将溶解的菊粉沉淀，以获取仍留在液相中的菊粉。根据需要的从植物中获得菊粉的定量程度和在最终产物中需要哪种分子量分布，随具体情况作出关于重复的决定。可以浓缩液相以简化沉淀。

在再沉淀后，通过传统分离技术，如离心、滗析、过滤，将所得菊粉固体与液相分离。

为了影响所得菊粉产物的分子量分布和纯度，工艺步骤e)可以进行一次以上。已经表明，在重复再沉淀步骤e)时，分子量平均值和聚合度平均值移向更高的值。因此可以在所要求的范围内设定本发明的菊粉的各种分子量/聚合度平均值。

如果仍存在细粒杂质，有利地在此方法中插入一个或多个过滤步骤。在过滤中去除所存在的任何细粒杂质。过滤器的细度由技术人员根据杂质的粒度选择。

可以在此方法中在获得提取液后的任何时刻插入过滤步骤。过滤步骤紧随在步骤b)获得提取液之后例如是有利的。过滤步骤与如上所述的悬浮材料的去除不同，因为通过过滤去除的粒子比主要由纤维构成的悬浮材料细。在另一优选实施方案中，在步骤d)之前进行过滤步骤。

过滤步骤优选与如对工艺步骤e)所述的再沉淀结合。这要求如上文对步骤e)所述将菊粉溶解，并随后过滤该溶液。在过滤后，使菊粉从滤出的溶液中沉淀或结晶出来。沉淀或结晶后产生的固体菊粉可以通过传统分离技术，如离心、滗析、过滤与液相分离。

在某些情况下，所得菊粉可能被不能过滤去除的物质染色。在这种情况下，优选通过活性炭处理去除着色杂质。在一个实施方案中，将活性炭悬浮在水中并添加到温度高于80℃，优选高于90℃的菊粉溶液中。在20重量％菊粉溶液的情况下，活性炭的量基于菊粉溶液重量优选为1-10重量％，优选2-6重量％，更优选2-3重量％。在吸附着色杂质后，通过离心和/或过滤去除活性炭。活性炭悬浮液可以通过活性炭淤渣的离心分离来预澄清，随后通过两级过滤来澄清，例如用硅藻土预涂布过滤器和片状过滤器的组合。重要的是，在从菊粉溶液中分离活性炭的过程中，温度保持高于80℃，优选高于90℃，以使菊粉保持在溶液中。在去除活性炭后，菊粉可以如上所述沉淀或结晶并与液相分离。

在与液相分离后，最终产物可以再用水或水/醇混合物洗涤。用2-10℃的冷水洗涤是优选的。为此，将菊粉沉淀物在水中成浆，然后再使菊粉沉降。

优选在进一步的最后工艺步骤中将所得菊粉干燥。该干燥可以通过冻干、喷雾干燥或转鼓干燥进行。

在优选实施方案中，本发明的菊粉为喷雾干燥形式。合适的喷雾干燥参数描述在所附实施例中。不言自明的是，在喷雾干燥法的情况下，必须使沉淀或结晶的菊粉再次悬浮(在低于大约80℃的水中)或溶解(在高于大约80℃的水中)。或者，可以省略如上所述的最后沉淀或结晶步骤，并将来自该方法的悬浮或溶解的菊粉直接喷雾干燥。通过向液体制成食品中加入本发明的喷雾干燥菊粉，可以特别有效地提高粘度。与添加另一方式干燥(例如冻干)的菊粉相比，添加等量的本发明的菊粉，用喷雾干燥菊粉实现更大的粘度升高。

在另一优选实施方案中，本发明的菊粉是喷雾粒化形式。喷雾粒化的菊粉通过已知方法获得，例如通过引入预先喷雾干燥的材料作为粒化种并进一步喷雾干燥菊粉。粒度为10-100微米的菊粉例如可充当初始进料。合适的喷雾粒化条件是例如80％水和30％菊粉的进料组成和90℃的进料温度。

本发明的菊粉非常特别优选具有50-350微米，更优选80-300微米，再更优选100-250微米和最优选100-200微米的平均粒径。这种菊粉因此是本发明的另一方面。

平均粒径可以通过干燥样品的筛析和通过光散射测定。但是，优选方法是筛析以使本发明的菊粉优选具有50-350微米，更优选80-300微米，再更优选100-250微米和最优选100-200微米的通过筛析测定的平均粒径。

在一个实施方案中，通过喷雾干燥或喷雾粒化法获得具有所述粒度的本发明的菊粉。具有前述粒度的喷雾干燥或喷雾粒化的菊粉因此是本发明的另一方面。

在干燥后仍然在优选范围外的情况下，可以通过筛分级法调节干燥菊粉的优选平均粒径。合适的筛目的选择在普通技术人员的能力范围内。

本发明的菊粉粒子优选具有小于45％，更优选小于40％，再更优选小于35％的结晶比例。在进一步优选实施方案中，小于20％，再更优选小于10％。在最优选实施方案中，结晶度小于1％。所述结晶度通过Ruland-Vonk法(W.Ruland，Acta Cryst，14，1180(1961)；C.G.Vonk，J.Appl.Cryst.6，148(1973))测定。测定结晶度的方法在所附实施例中详细描述。低结晶度赋予菊粉更好的溶解性质，这在某些食品用途中是有利的。

在又一方面，本发明还涉及包含前述本发明的菊粉和一种或多种可食用或可药用成分的组合物。典型的组合物包括人和动物食品、饮料、功能食品、药剂和药物组合物(包括预防性组合物和治疗性组合物)及其中间体。

功能食品在本发明中是指除传统营养素外还包含可能具有健康促进作用的成分的食品(Institute of Medicine of the National Academy of Sciences，USA，1994的定义)。

所述可食用或可药用成分优选选自糖(例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、异麦芽糖、聚右旋糖)、多元醇(例如山梨糖醇、乳糖醇、麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇、甘露醇、木糖醇)、麦芽糖糊精、甜味剂、氢化葡萄糖浆、人和动物食品添加剂、人和动物食品的中间体、人和动物食物、可食用液体、饮料、生物可利用的矿物源、可药用载体、制药活性和治疗活性物质、药物组合物和药剂。

本发明的特别优选的组合物包括在可食用或可药用的生物可利用的矿物源(尤其是钙和/或镁和/或铁源，例如乳制品和钙、镁和铁的盐和络合物)存在下的本发明的菊粉。

如上所述，本发明的目的是提供具有特别有利的用在食料中的性质的菊粉，根据本发明，术语食品和食料相等。另一方面，本发明因此也涉及包含前述菊粉的食品和膳食补充剂。术语食品根据本发明包括人的食品和动物食品或动物饲料。膳食补充剂包括人和动物用的膳食补充剂。

特别优选的食品选自乳制品、酸奶、冰淇淋、奶类软冰淇淋、奶类装饰物、布丁、冰冻牛奶、蛋奶甜羹、奶酪、营养棒、能量棒、早餐棒、糖果、烘烤产品、薄脆饼干、曲奇饼、饼干、谷类片、休闲零食、冰茶、由果汁制成的软冰淇淋、疗效饮料(diet drinks)、成品饮料(finished drinks)、运动饮料、活力饮料(stamina drinks)、用于膳食补充的粉状饮品混合物、婴幼儿食品、加钙橙汁、面包、羊角面包(croissant)、早餐谷物、面条、涂抹酱、无糖饼干和巧克力、钙咀嚼品、肉产品、蛋黄酱、沙拉调料、果仁奶油、深冻食品、调味汁、汤和即食食品。包含本发明的菊粉的食品最优选是乳制品，尤其是酸奶。本发明的菊粉对乳制品，尤其是酸奶的稳定性、质地、身体和口的感受表现出特别好的作用，可以是搅拌或罐发酵的酸奶或酸奶饮料。

根据本发明，其它可行的乳制品是奶油、新鲜稀奶油(crème fraiche)、凝乳、黄油、奶，尤其是脱脂奶、酪乳、酸乳(soured milk)、酸乳酒、奶酪，如乳脂干酪、软干酪、切片干酪、硬干酪、乳清、奶粉、奶类饮料。

食品，尤其是乳制品，特别是酸奶中菊粉的优选含量基于所述食品、乳制品或酸奶的所有组分总重量为0.2-5重量％，优选0.5-4.5重量％的干菊粉。

在本发明的一个实施方案中，食品是通过挤出法制成的食品，例如早餐谷物。

另一方面，本发明涉及包含前述菊粉的化妆品制剂。该化妆品制剂特别优选呈乳霜形式，特别是护肤霜和面霜。

另一方面，本发明还涉及前述菊粉作为食品、功能食品和化妆品制剂中的添加剂的用途。该用途特别涉及上文提到的所有具体食品和化妆品制剂。

再一方面，本发明涉及本发明的菊粉用于制造药物组合物或药剂的用途。

本发明的菊粉可以有利地用在用于改变或调节人、哺乳动物和其它脊椎动物的大肠中，尤其是大肠远端区域中的细菌菌落组成的食品、功能食品、药物组合物或药剂中。

本发明的菊粉也可以用在用于改变或调节人、哺乳动物和其它脊椎动物的大肠中，尤其是大肠远端区域中的菊粉发酵模式的食品、功能食品、药物组合物或药剂中。

本发明的菊粉的另一优选用途是用作脂肪或油替代品和/或用作食品中的膳食纤维，其中术语“食品”至少包括所有上述食品，尤其是所有上述乳制品。有利地，与传统菊粉相比，感官性质，尤其是口感优异。因此，本发明的菊粉也可用作食品中的感官性质增强剂，尤其是口感增强剂。

本发明的菊粉的另一用途是用作质地剂(texturizing agent)、稳定性增强剂、粘度提高剂，尤其是用在食品和化妆品中。术语“食品”至少包括所有上述食品，尤其是所有上述乳制品。

最后，本发明的菊粉可用在具有下列有利作用的食品、功能食品、药物组合物或药剂中：粗食效应、肠功能调节、益生素效应和/或致双歧杆菌生成性(bifidogenicity)、提高矿物(如钙、镁和铁)的吸收、提高骨矿物密度、提高骨矿物含量、提高最大骨质量、改善骨结构、降低骨矿物密度损失、降低骨结构损失、调节脂质代谢、刺激免疫系统、预防癌症和降低癌症风险、预防大肠癌和降低大肠癌风险以及预防乳腺癌。

下面通过实施例解释本发明，这些实施例不是要限制本发明的总体构思。

实施例

一般方法

1.果聚糖测定

1.1通过用外切菊粉酶水解来测定果聚糖

通过将50.0+/-5.0毫克菊粉精确称入1毫升量瓶，准备要测量的菊粉溶液。加入700微升dd H₂O以溶解。然后将样品摇振以尽可能好地使样品材料离开容器底部，然后在几乎沸腾的水浴(～99℃)中放置8分钟。在培育过程中，每隔30秒摇振量瓶。在培育后，使样品冷却至室温，然后用dd H₂O补充至1毫升刻度。样品溶液具有5.0+/-0.5％的菊粉浓度。

对于消化前的糖测定，取出200微升并在-20℃下冷冻。在糖测量之前，将该样品在室温下解冻，混合，通过在加热部件中在95℃下以1400rpm摇振5分钟来溶解，并在4000rpm下离心2分钟。为了水解，将50微升大约5％浓度菊粉溶液加入由50微升1M柠檬钠pH4.6、25微升外切菊粉酶(Megazyme International Ireland Ltd，Wicklow，Ireland，制品号E-EXO1，2.5 U/μl)和375微升dd H₂O构成的消化混合物中。使该消化液混合并在4000rpm下离心1分钟。然后将该消化液在加热部件上在40℃下培育4小时。将消化的样品在-20℃下冷冻。在糖测量之前，将这些样品在室温下解冻，混合并在4000rpm下离心2分钟。为了测量果糖，通过将10微升消化液添加到90微升dd H₂O中，制备1:10稀释液。

为了测定该消化液中释放出的果糖和葡萄糖，如在“糖测定(葡萄糖，果糖，蔗糖)”部分中所述在所有样品中进行葡萄糖和果糖的光度测定。除了葡萄糖和果糖外，也在消化前测定样品中的蔗糖。

使用未稀释的5％浓度菊粉溶液进行消化前的糖测量。将10微升该溶液添加到200微升测量缓冲液中。对于消化后的样品中的葡萄糖测量，将10微升未稀释样品添加到200微升测量缓冲液中。对于消化后的样品中的果糖测量，将100微升1:10稀释的样品添加到200微升测量缓冲液中。

如糖测定中那样，基于NADP转化成NADPH的6.23l＊mmol^-1＊cm^-1的摩尔消光系数进行计算。从消化后的样品的葡萄糖和果糖浓度中减去消化前存在的葡萄糖和果糖的浓度。同样地，减去从消化前的样品中存在的水解蔗糖中释放出的葡萄糖和果糖。

然后获得菊粉消化过程中形成的果糖和葡萄糖浓度。通过葡萄糖和果糖含量的相加并考虑测得的游离己糖向结合在果聚糖中的己糖的转化系数162/180，获得果聚糖含量。

2.糖测定(葡萄糖，果糖和蔗糖)

通过酶化验法中的光度测定法经由NADP⁺(氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)向NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的转化测定葡萄糖、果糖和蔗糖含量。烟酰胺环的芳族特性在还原中损失，因此吸收谱改变。吸收谱的这种改变可以通过光度测定法检测。

借助己糖激酶和三磷酸腺苷(ATP)将葡萄糖和果糖转化成6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖。然后通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶将6-磷酸葡萄糖氧化成6-磷酸葡萄糖酸酯。在这种反应中将NADP⁺还原成NADPH，并通过光度测定法测量所形成的NADPH的量。所形成的NADPH与提取液中存在的葡萄糖的比率为1:1，以便可以根据Lambert-Beer’s定律使用NADPH的摩尔消光系数(6.23l mmol^-1cm^-1)由NADPH含量计算葡萄糖含量。

在6-磷酸葡萄糖的氧化完成后，通过葡糖磷酸异构酶将同样在溶液中生成的6-磷酸果糖转化成6-磷酸葡萄糖，其又被氧化成6-磷酸葡萄糖酸酯。果糖与所形成的NADPH的量的比率也为1:1。如对葡萄糖所述，由所形成的NADPH的量计算果糖含量。

随后，通过蔗糖酶(来自Megazyme)将提取液中存在的蔗糖裂解成葡萄糖和果糖。释放出的葡萄糖和果糖分子随后在依赖于NADP⁺的反应中被上述酶转化成6-磷酸葡萄糖酸酯。在1分子蔗糖转化成6-磷酸葡萄糖酸酯时形成2分子NADPH。同样通过光度测定法测量所形成的NADPH的量，并由该量使用NADPH的摩尔消光系数计算蔗糖含量。

使用如“通过用外切菊粉酶水解来测定果聚糖”部分中所述的5％浓度菊粉溶液进行糖测量。将10微升该溶液添加到200微升测量缓冲液中。该测量在微滴定板中使用SPECTRAmax光度计(Molecular Devices)一式两份进行。所有的所用酶溶液都在由50mM咪唑HCl pH6.9、2.5mMMgCl₂、1mM ATP和0.4mM NADP构成的测量缓冲液中配制。在340纳米波长下追踪NADP向NADPH的转化。

通过添加己糖激酶(来自酵母，0.3U/μl)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(来自酵母，0.14U/μl)的2μl混合物，进行葡萄糖测定。在葡萄糖的转化完成后，加入2微升磷酸葡糖异构酶(来自酵母，0.14U/μl)以测定果糖。当果糖完全转化时，加入2微升蔗糖酶(来自Megazyme，0.2U/μl)以将存在的蔗糖裂解。如所述进行葡萄糖、果糖和蔗糖的计算。

3.分子量分布的分析

3.1与光散射和折光指数检测联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI-MALLS系统)

将菊粉/果聚糖以0.5％(w/v)浓度溶解在超纯水中。将该溶液在95℃下加热30分钟。使用下列设备分析聚合物：Alliance色谱系统(Waterscorporation，Milford，Massachusetts，USA)、λ_o＝658nm的DAWN-EOS光散射检测器(Wyatt Technology，Santa Barbara，USA)和在14.4至163.3°的角范围内的16个检测器，K5流动吸收池。聚合物在预置柱和分离范围为300-10⁴、5 x 10⁴-2×10⁶和10⁶-10⁸的三个柱(SUPREMA-Gel，PSSPolymer Standards Service GmbH，Mainz，Germany)上分级。注入100微升溶液。分级在30℃的温度和0.8毫升/分钟的流速下用0.05M NaNO₃作为洗脱剂进行。使用Astra V5.1.8.0程序(来自Wyatt Technology，SantaBarbara，USA)分析样品的分子量分布。

3.2与折光指数检测联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI系统)

通过在热摇振器中在95℃下温和摇振10分钟，将菊粉以1％(w/v)的浓度溶解在洗脱剂(DMSO+90mM NaNO₃)中。在短暂冷却后，将菊粉溶液用洗脱剂稀释至0.1％(100微升菊粉溶液+900微升洗脱剂)，并立即置于60℃自动取样器中。使用下列装置分析聚合物：Dionex P580泵、Dionex AS50自动取样器、Dionex型号585柱式炉(Dionex GmbH，Idstein，Germany)、Shodex RI-71检测器(Shodex/Shoko Co.LTD，Tokyo，Japan)。通过Chromeleon软件(Dionex GmbH，Idstein，Germany)控制该系统。该聚合物在PSS GRAM，10μ，预置柱和PSS GRAM 3000，10μ和PSSGRAM100，10μ分离柱(PSS Polymer Standards Service GmbH，Mainz，Germany)上分级。注入50微升0.1％菊粉溶液以进行分析。分级在柱式炉中在60℃的温度和0.7毫升/分钟的流速下用洗脱剂DMSO+90mMNaNO₃进行。为了测定分子量，该系统用下列葡聚糖标样(产品号31430，Fluka Riedel-deHaen，Seelze，Germany)校准：葡聚糖T1(Mw 1270)、T5(Mw 5220)、T12(Mw 11 600)、T25 Mw 23 800)、T50(Mw 48 600)、T80(Mw80900)、T150(Mw 147 600)、T270(Mw 273 000)、T410(Mw 409 800)、T670(667 800)。使用PSS WinGPC compact V.6.20程序(PSS，Mainz，Germany)分析样品的分子量分布。

4.水含量的测定

使用AQUA 40.00Karl-Fischer滴定器(来自analytikjena AG)测定水含量。使用Hydranal-Coulomat AG(

，制品号34 836)作为阳极液。所用参比物质是含湿量为15.61-15.71％的二水合酒石酸二钠(

，制品号32 323)。将10-20毫克样品称入5毫升样品瓶(N20-5DIN，Machery-Nagel，制品号702 04.36)，将瓶子用压接盖(N20TS/oA，Machery-Nagel，制品号702 815)封闭，并使用Karl-Fischer滴定器测定样品的水含量。

5.支化度的测定

将菊粉首先全甲基化(permethylated)并通过ATR-IR光谱法(装置和条件见下文)检查甲基化是否完成。然后将样品通过酸性水解(标准甲基化分析)或通过还原性降解成其单体结构单元，并通过部分甲基化糖醇乙酸酯和无水糖醇乙酸酯的气相色谱法(装置和条件见下文)和气相色谱质谱法(GC-MS，装置和条件见下文)测定相对摩尔组成。

ATR-IR

装置：Bruker Tensor 27

技术：Diamond ATR

GC：

装置：Carlo Erba HRGC 5160 Mega Series

柱：具有保留间隙(1.5m)的Chrompack CPSi18CB(25m)

     ID：0.25mm      FD：0.25微米

载气：He(80kPa)

检测器：FID

注射器：柱上

积分器：Merck Hitachi D-2500 Chromato-Integrator

温度程序：60℃(1分钟等温)，10℃/分钟至170℃，3℃/分钟至230℃，

          20℃/分钟至290℃(20分钟等温)

GC-MS

GC：装置：     Agilent 6890 GC

    柱：       HP-5，30m

    载气：     He

    注射器：   Split 5∶1

    温度程序： 60℃(1分钟等温)，10℃/分钟至170℃，3℃/分钟至

               230℃，20℃/分钟至290℃(20分钟等温)

MS：装置：JEOL GCmate II双聚焦扇形场光谱仪

    模式：EI，70eV

    评测：AMDIS32，Wsearch32

5.1全甲基化

(根据Ciucanu和Kerek/Ciucanu，I.& Kerek，F.(1984)A simple andrapid method for the permethylation of carbohydrates(碳水化合物的简单迅速全甲基化方法)Carbohydr.Res.131，209-217.)

将大约50毫克样品溶解在2.5毫升二甲亚砜中。然后加入3eq/OH的细磨氢氧化钠和3eq/OH碘甲烷，并在室温下搅拌24小时。然后再次加入一半量的各试剂。随后将样品用蒸馏水渗析4天(渗析膜Spectra/PorMWCO 3500，Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA，USA)并冻干。通过ATR-IR光谱法检查甲基化的完全性。如果已全甲基化，则在3300-3400cm^-1范围内的OH拉伸振动应消失。

5.2标准甲基化分析

水解

将大约2毫克的全甲基化菊粉在1毫升V小瓶中与0.9毫升0.5M三氟乙酸混合，并通过在90℃下搅拌1小时来水解。在溶液已经冷却后，在氮气流中将其蒸发至干。通过用甲苯共蒸馏，去除三氟乙酸残留物。

还原

将水解样品与500微升在2M NH₃中的0.5M NaBD₄溶液混合并在60℃下加热1小时。在冷却后，通过加入几滴冰醋酸，使过量硼氢化钠(sodiumborohydrite)分解。通过用15％浓度的甲醇-乙酸共蒸馏，去除所得硼酸盐。

乙酰化

将还原产生的部分甲基化的糖醇与200微升乙酸酐和50微升吡啶混合并在90℃下乙酰化2小时。将该溶液冷却，然后加入饱和碳酸氢钠溶液直至没有观察到进一步气体形成。然后用二氯甲烷将其萃取4次，每次15毫升。将合并的有机相用饱和NaHCO₃溶液洗涤两次，每次15毫升，用20毫升冷0.1M HCl洗涤一次，并用25毫升蒸馏水洗涤一次。然后将溶液在氯化钙上干燥并在真空中浓缩，并溶解在二氯甲烷中以进行GC测量。

5.3还原降解

在螺纹盖玻璃瓶中将大约1毫克全甲基化样品溶解在500微升二氯甲烷中，与6eq/糖苷键的三乙基硅烷和4eq的TMS三氟甲磺酸混合并在室温下搅拌2小时。在加入20微升乙酸酐后，在室温下继续搅拌2小时。然后通过添加饱和NaHCO₃水溶液，终止反应，并继续搅拌1小时。通过用二氯甲烷萃取并随后用饱和NaHCO₃水溶液和蒸馏水洗涤合并的有机相，进行后处理。该溶液最后在氯化钙上干燥，在氮气流中浓缩并溶解在二氯甲烷中以进行GC测量。

5.4定性和定量分析

通过与柱上注射和火焰离子化检测器(FID)联用的气相色谱法，定量分析降解产物。根据它们的有效碳响应，校正峰面积。峰基于其质谱(GC-MS)和已知对比样品的停留时间进行归属。

6.菊粉的差示扫描量热法

在50毫升刻度聚丙烯管(30.0 x 115mm，来自Greiner，订单号227261)中制备40毫升15％浓度(w/v)菊粉溶液。这通过将各粉末添加到重蒸馏水中并摇振来进行。随后，将所有制成的悬浮液置于水浴(95℃)中并通过摇振数次来溶解。在20分钟后，目测确定所有悬浮液完全溶解。然后将制成的溶液等分到2个50毫升刻度聚丙烯管(30.0 x 115mm，来自Greiner，订单号227261)中并立即在液氮中深冻。然后将冷冻溶液冷冻干燥2天(水含量大约20％)并在研钵中研磨。

使用自动Karl-Fischer滴定器测定样品的水含量(参见一般方法4)。

对于DSC测量，将大约10毫克菊粉干物质称入不锈钢坩锅(体积50微升)，测定精确重量，并加入30微升蒸馏水。然后将坩锅密封。使用空的不锈钢坩锅作为参照物。将样品在带有自动取样器(Perkin Elmer；Diamond)的DSC装置中以10℃/分钟的加热速率从10℃加热至160℃。通过PYRIS 7.0软件程序(Perkin Elmer，63110 Rodgau-Jügesheim，Germany)进行数据分析。这要求必须测定To(开始)和自由焓dH。

7.粘度测定

通过在98℃下摇振，制备各种浓度(重量/蒸馏水体积)的菊粉水溶液，并在不超过13分钟的溶解时间后立即测量该澄清溶液。在BOHLINGemini Advanced Rheometer(Malvern Instruments；Herrenberg，Germany)中使用等温(90℃)粘度模式在CP4°/40mm锥板系统上进行测量。测量间隙被一层特轻石蜡油覆盖。使用10s^-1剪切速率进行预剪切60秒，松驰时间10秒。在剪切速率模式中以对数幅度测量剪切。在递增形式下，初始剪切速率为20s^-1，最终剪切速率为30s^-1，滞留时间为20秒，且积分时间为10秒。数据基于在20s^-1至30s^-1范围内的平均值并且对每数据点是三次独立测量的平均值。平均值中不包括作为异常值列出的所有测量。通过所谓的“四分位数法”定义“异常值”。这将异常值指定为是落在范围标准Q₂-k＊(Q₃-Q₁)≤非异常值≤Q₂-k＊(Q₃-Q₁)(SACHS，Lothar：Angewandte Statistik，第10版，Springer-Verlag Berlin(2002)，第364页及以后各页)外的所有测量。Q₁和Q₃在此分别是25％四分位数和75％四分位数，Q₂是测得数据的中值(50％四分位数)。使用1.5的数值作为系数k。

8.凝胶强度和粘弹性性能的测定

将70克17重量％菊粉在(蒸馏)水中的悬浮液装入Haake RotoviscoVT 550粘度计的MV量杯中。然后在该预热的(90℃，加热护套)装置中插入并安装桨式搅拌器。然后将该混合物在以128rpm搅拌下加热15分钟。

在15分钟后，将该混合物在90℃下转移到由底座和壁构成的容器中，该壁由彼此叠加并用胶带(19毫米宽)固定在一起的两个丙烯酸片圆柱环(各20毫米高，30毫米直径)构成。将该混合物无泡沫地引入容器，直至液面为上缘以下5毫米。然后将该容器用铝箔覆盖密封，并在室温(23℃)下放置过夜。

在室温(23℃)下储存大约20小时后，使用TA XT2质地分析器测量凝胶强度。为了能在平滑的未干燥表面上测量凝胶强度，首先去除将容器的两个圆柱环固定在一起的胶带。然后在环之间用刀片分离凝胶以使下部凝胶呈现平滑表面。

通过侵入(1毫米)凝胶中的水准穹(level dome)(直径24.5毫米)用TA XT2质地分析器测量凝胶强度。质地分析器的设置如下：

测量原理：压力方向上的力

前进速度：2mm/s

试验速度：2mm/s

触发值：0.01N

后退速度：2mm/s

移动：1mm

显示以牛顿计的一次侵入该穹(dome)时的最大值。

实施例1

来自洋蓟根的菊粉的表征

1.洋蓟植物的培植

在西班牙的Valencia附近种植Madrigal品种的洋蓟植物。在2005年4月播种，并在2005年8/9月收割植物。将根与地上部分分离，去除附着的土壤，并干燥。然后将这些根在不冷却的情况下从西班牙运至德国。将这些根储存在-20℃下直至提取菊粉。

2.由洋蓟根制备菊粉

使用来自大约4-5个月的Madrigal品种洋蓟植物的根制备菊粉。通过在深冻阶段中用高压清洁机(

，Winnenden，型号HD 700)洗涤，从60千克根上去除其上附着的土壤成分，然后将它们在切碎机(GloriaUniversal园艺切碎机natura 2800L)中进一步加工成碎料。将碎料装入含有预热至70-90℃的水的带有框式搅拌器的护套加热提取器中。加入的水的总量为180千克。通过添加NaOH，将提取液的pH值调节至9.0。在经由提取器的护套将碎料浆迅速加热至80-85℃后，将该浆料在80-85℃下搅拌大约60分钟以从碎料中提取菊粉(果聚糖)。此后，通过泵出，从碎料中分离粗制提取液。

在两段法中通过形成总共0.7克Mg(OH₂)/100毫升提取液来将粗制提取液脱色。在第一阶段中，将3400克MgSO₄＊7H₂O(相当于0.5克Mg(OH₂)/100毫升提取液)在搅拌下经过10分钟溶解在170升深棕色提取液中。随后将1015克96％浓度的Ca(OH)₂作为在3升水中的悬浮液添加并搅拌10分钟。设定9.4的pH值。将整个沉淀混合物在板式分离器(GEA，Westfalia型SC 6-06-076)中经过120分钟定量澄清。脱色的提取溶液具有浅黄色并且不含造成混浊的材料。作为去除的淤渣级分获得粘稠糊形式的固相。对由此获得的包含150升MgSO₄＊7H₂O(相当于0.2克Mg(OH₂)/100毫升提取液)和410克96％浓度Ca(OH)₂(作为在1.5升水中的悬浮液)的提取溶液重复整个脱色步骤。将整个沉淀混合物在板式分离器中经过30分钟定量澄清。该pH值为9.4的脱色提取溶液是澄清的，具有浅黄色，并且不含造成混浊的材料。再次获得作为淤渣级分的粘稠糊形式的7升离心液。

通过在4℃下冷却48小时，从由此增白过的提取液中获得固体菊粉。使用板式分离器通过离心沉积获得作为淤渣状沉积物的菊粉。

以与增白过的提取液中存在的相同的浓度，将沉降物进一步接连提纯两次，通过将菊粉溶解在热水中并通过在2℃下储存48小时来重新沉淀进行。将二次沉淀后获得的菊粉沉降物冷冻干燥。

图1显示了提取过程的示意图。

在提取过程中，在各提取和提纯步骤后通过与折光指数检测和葡聚糖标样校准联用的凝胶渗透色谱法(GPC-RI系统，参见“一般方法”中的方法3.2)分析聚合物分布。从图2中看出，热水提取后提取液(B)的聚合物分布与洗过的根(A)相当。图2显示了洗过的洋蓟根(A)和热水提取后的菊粉提取液(B)中的聚合物分布的GPC-RI分析。

菊粉的冷(4℃)沉淀后的聚合物分布的分析表明，高分子量菊粉级分(C)与低分子量级分(D)分离(图3)。图3显示了菊粉的热水提取后的提取液(B)、在4℃下菊粉沉淀后的沉降物(C)和在沉淀后的菊粉离心后获得的上方液(upper run，D)中的聚合物分布的GPC-RI分析。

通过高分子量菊粉级分的再沉淀，实现高分子量菊粉的进一步富集和低分子量物质，尤其是单糖和二糖的贫化(图4)。图4：在4℃下沉淀的菊粉(C)、再沉淀后的沉降物(F)和再沉淀后的澄清相(E)中的聚合物分布的GPC-RI分析。

3.制成的菊粉的纯度测定

通过测定冻干材料的果聚糖和水含量，测定在第2部分中获得的制成的洋蓟菊粉的纯度。对洋蓟菊粉测得的水含量为1.7％(参见方法“水含量的测定”)。

通过用外切菊粉酶水解菊粉，测定果聚糖含量(参见方法“通过用外切菊粉酶水解来测定果聚糖”)。由果聚糖含量和水含量得出基于干物质(DM)的纯度。纯度＝果聚糖含量×100/(100-水含量)。

从表1中看出，制成的洋蓟菊粉的平均纯度为干物质(DM)的97％。

表1：制成的洋蓟菊粉的纯度测定

4.通过GPC-RI-MALLS测定分子量

由第2部分中获得的纯化的洋蓟菊粉和由购得的Raftiline HP参比样品(来自Orafti，批号：HPBNH4DNH4)和获自大丽花块茎的菊粉(来自Sigma，制品号1-3754，批号：75H7065)制备0.5％(w/v)水溶液，并通过凝胶渗透色谱法测定菊粉的分子量分布(参见方法3.1)。这种分布描绘在图5中，且由其计算出的分子量(脱水果糖＝162克/摩尔)和平均链长总结在表2中。

使用GPC-RI-MALLS系统分析分子量分布得出洋蓟菊粉的的重均分子量Mw为12088克/摩尔和数均分子量Mn为11500克/摩尔。这相当于对DPw而言的平均链长为75和对DPn而言平均链长为71。纯化的洋蓟菊粉的平均链长明显长于Raftiline HP(DPw＝33，DPn＝29)和大丽花菊粉(DPw＝39，DPn＝33)。这也体现在最小和最大分子量上，洋蓟菊粉的明显更大。

表2：各种菊粉的分子量分布

 

材料	Mw[克/摩尔]	Mn[克/摩尔]	聚合物分布(最小-最大)[克/摩尔]	DPw	DPn	分子分散度
							洋蓟菊粉	12088	11500	4385-26086	75	71	1.06
Raftiline HP	5391	4738	999-15162	33	29	1.14
							大丽花菊粉	6250	5407	1139-19569	39	33	1.18

5.葡萄糖、果糖和蔗糖测定的结果

在第2部分中获得的洋蓟菊粉中葡萄糖、果糖和蔗糖的比例通过如方法3(“糖测定”)中所述的5％浓度菊粉溶液中糖的光度测定法测得。

从表3中看出，纯化洋蓟菊粉中的葡萄糖和蔗糖含量小于菊粉粉末的0.1％，且果糖含量为菊粉粉末的0.12％。

表3：纯化洋蓟菊粉中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量

 

材料	葡萄糖(克/100克菊粉粉末)	果糖(克/100克菊粉粉末)	蔗糖(克/100克菊粉粉末)
				洋蓟菊粉	<0.1	0.12	<0.1

6.支化度

6.1标准甲基化分析

在本发明的DPw为75、DPn为71且分布为1256-31631克/摩尔的菊粉样品中测量支化度。所用对比样品为Raftiline HP(来自Orafti，批号HPBNO3DNO3和HPBNH4DNH4)和获自大丽花块茎的菊粉(来自Sigma，制品号1-3754，批号：022K7045或75H7065)和菊芋根(Sigma，制品号1-2880批号111H7045和88F7220)，通过甲基化分析测定支化度(参见一般方法5.1)。

2-1-连接的果聚糖的水解、还原和乙酰化产生1，2，5-三-O-乙酰基-3，4，6-三-O-甲基-D-甘露醇和1，2，5-三-O-乙酰基-3，4，6-三-O-甲基-D-山梨糖醇。末端果糖基提供2，5-二-O-乙酰基-1，3，4，6-四-O-甲基-D-甘露醇和2，5-二-O-乙酰基-1，3，4，6-四-O-甲基-D-山梨糖醇。末端吡喃葡萄糖基单元产生1，5-二-O-乙酰基-2，3，4，6-四-O-甲基-D-山梨糖醇。在6位另外支化的结构单元产生相应的1，2，5，6-四-O-乙酰基-3，4-二-O-甲基糖醇(methylalditols)。

除了表现出2-1连接的产物，在所有果聚糖样品中可检出来自末端果糖和葡萄糖结构单元的那些产物。色谱图另外显示出在氮气流中从2-1连接的果糖中去除TFA后形成的二果糖二酐(DFDA，大约3摩尔％)。

从该质谱中，在所有样品中，可以另外识别出由2-1，6连接产生的产物。也识别出1，3-和1，4-乙酰基化化合物，它们分别来自于3位和4位带有的分支，但也可能衍生自不完全甲基化。1，3-和1，4-乙酰基化产物的非特异性出现是甲基化不足的指示。假设6位与3位和4位在相同程度上受到甲基化不足的影响，从2-1，6-支化果糖单元的比例中减去非特异性比例(1，3-Ac和1，4-Ac化合物的平均)。下表4显示了由此获得的结果。

表4

 

样品	2-1，6-果糖[摩尔％]＊
		菊粉 洋蓟RaftilineHP大丽花菊芋	1.1＊＊0.40.2未检出

^＊基于发现的所有种类

^＊＊两次测量的平均值

甲基化分析的评测表明，洋蓟菊粉的支化度为1.1摩尔％。这种菊粉的支化度因此明显高于来自菊苣(Raftiline HP)、大丽花和菊芋的参比样品的菊粉。

实施例2

来自洋蓟根的菊粉的性质

所有下列研究均涉及之前在实施例1中所述的和在表1-4中详述的本发明的洋蓟菊粉。对比性的Raftiline HP和大丽花菊粉同样是实施例1中详述的那些。

1.菊粉的差示扫描量热法研究

菊粉的差示扫描量热分析(其程序参见方法部分)表明，各种材料(见下表5)之间熔融性能的差异明显。这两种菊粉样品的熔化焓相差极大。对洋蓟菊粉而言这高于29J/g，而对Raftiline HP而言仅为22.8J/g。T_开始(To)差异略小，但洋蓟菊粉的初始熔融温度为40.4℃，其比对比性菊苣菊粉高2.5℃以上。洋蓟菊粉的这种提高的热稳定性在食品领域中的某些热过程中可能是显著优点，因为洋蓟菊粉对高温的敏感性明显低于菊苣菊粉。

表5

 

材料	To[℃]	熔化焓dH[焦/克]
			洋蓟菊粉	40.4	29.1
Raftiline HP	37.8	22.8

2.粘度

表6：作为浓度函数(T＝90℃)的菊苣菊粉和洋蓟菊粉在水中的动态粘度的比较

从上表中看出，这两种菊粉在高达24％(w/v)浓度下表现出非常低的90℃粘度(水＝1mPas)。本发明的菊粉在26％(w/v)，尤其在28％的浓度下变粘，而Raftiline HP在高达28％(w/v)浓度下仍保持与水非常相似的粘度。

3.冻干后的粒度

将来自实施例1的冻干样品在磨碎机(Grindomix GM200，RetschTechnologie GmbH，Haan，Germany)中磨碎并通过筛析(振动筛机，来自Fritsch的“Analysette 3”，频率2.0，筛分辅助材料：8个玛瑙球(10mmΦ)/筛子，筛分时间1-2分钟，加载量大约50克)测定粒度。结果显示在下表7中。可以通过筛析测定平均粒径为126微米。

表7

 

筛目宽度/微米	质量/克	％
			<63	12.80	25.78
<90	4.99	10.05
			<125	6.60	13.29
<160	6.26	12.61
			<200	5.09	10.25
<500	13.75	27.69
			>500	0.16	0.32
总计	49.65	100.00

4.喷雾干燥，粒度

如实施例1中所述制备DPw＝81的菊粉。在中间冻干后，将其再溶解，然后在Glatt GPCG3.1流化床喷雾干燥装置上喷雾干燥。为此，将冻干的菊粉引入水中，加热至85-90℃并溶解。将加热的溶液以不同的出口空气温度喷雾干燥，并观察工艺性质和产物性质。入口温度在120℃下保持恒定。进料由80％水和20％菊粉构成，进料温度为85-90℃且出口空气温度为80℃。

通过如上所述的筛析测定粒度分布。喷雾干燥样品的筛析结果显示在下表8中。由筛析的粒度分布测定喷雾干燥产物的平均粒度为<60微米。

表8

 

筛目宽度/微米	质量/克	％
			<63	34.63	69.9
<90	9.43	19.0
			<125	3.03	6.1
<160	1.05	2.1
			<200	0.53	1.1
<500	0.86	1.7
			>500	0.00	0.0
总计	49.53	100.00

5.结晶度

在两个PET覆盖膜之间的2毫米厚样品支架(标准)中制备粉状菊粉样品，不进一步预处理。用来自Bruker-AXS的D5000双圆衍射计在对称透射中使用单色(Ge(111)单色仪)Cu-Kα辐射进行X-射线测量。在3-29°(步幅Δ2θ＝0.1°)和29.5-104(步幅Δ2θ＝0.5)的2θ角范围内在30mA和40kV下进行记录，步幅/Δ2θ：60秒。

使用基于Ruland-Vonk法的软件(WAXS7，Fraunhofer Instituts fürangewandte Polymerforschung Potsdam(DE)开发，描述在http:∥edocs.tu-berlin.de/diss/2003/rihm_rainer.pdf，第19页和以后各页中)从散射图中得出结晶度x_c、微晶尺寸D_(hkl)和作为微晶中的晶格扰动的衡量标准的无序参数k。使用样品2的散射图(见下文)作为非晶背景。使用果糖作为化学基础，用1.65g/cm³的密度计算。通过Scherrer公式在2θ＝8°和12°的前两个主干涉下由X-射线反射的半宽度测定微晶尺寸D_(hkl)。

测量DPw为77-82的冻干菊粉和DPw为81的转鼓干燥菊粉样品。所得结果在下表9中：

表9

 

	结晶度xc[％]	无序参数k[10-2nm2]	D(hkl)2θ＝8°[nm]	D(hkl)2θ＝12°[nm]
					冷冻干燥菊粉	35	4.9	5.7	7.3
转鼓干燥菊粉	28	2.4	6.7	10.1

6.在水中加热后菊粉的结构形成

分别在铝烧杯(来自Winopal Forschungsbedarf GmbH的RVA-3d烧杯；容积大约70毫升，直径38毫米)中配制几份15毫升的20％浓度菊粉在水中的悬浮液，烧杯是搅拌的并装配磁搅拌棒，并最后加盖。使用多重热搅拌器(来自H+P Labortechnik AG的VARIOMAG Multitherm 15)在搅拌下加热悬浮液。在这种情况下使用放在位于加热部件上的含蒸馏水的加盖参比烧杯中的PT100探针(VARIOMAG Multitherm 15的配件)控制温度。将多重热搅拌器预热以使参比样品的温度在90℃下保持稳定。将要加热的悬浮液放在多重热搅拌器上并在90℃下搅拌8分钟。然后从在室温下储存24小时的多重热搅拌器中取出样品。然后使用TA-TX2质地分析器(Stable Micro Systems)测量所得凝胶的浓度。使用直径12毫米的侵入塞(penetrating plunger)(Stable Micro Systems)作为测量系统进行这种测量。对于使用5千克测量池的TA测量，使用下列参数：

·选项：在压力方向上测量力

·单一试验

·参数：前进速度2.00mm/s

·试验速度0.50mm/s

·后退速度0.50mm/s

·移动(侵入深度)3mm

·触发力2g

研究各种菊粉在水中热处理后的结构形成性能。由此显示，来自菊苣的菊粉(Raftiline HP

和Beneo HPX

)在这些条件下不形成凝胶状结构(表10)。与此相反，DPw＝77-81或DPw＝75的来自洋蓟的菊粉形成极强的结构。令人惊讶地，使用DPw＝81的喷雾干燥菊粉的样品也形成比将果聚糖冻干的对比样品(DPw＝77-81或DPw＝75)明显更强的凝胶。这由仅用15％(w/w)浓度的菊粉形成的凝胶强度与20％冻干对比样品类似这一事实清楚地看出。

表10：在水中加热后果聚糖的结构形成.

^＊--n＝2

^＊＊-n＝4

7.益生素性质

在三阶段发酵系统(肠模型)中在体内模型研究中研究本发明的菊粉的益生素效应。确定发酵系统中群集的细菌类型及其代谢活动(短链脂肪酸的形成)。

1.材料和方法：

a)连续的三阶段培养系统：

在此研究中使用之前Pereira等人(2003)Appl Environ Microbiol 69(8)，4743-4752和Probert等人(2004)Appl Environ Microbiol 70，4505-4511描述的连续三段培养系统。肠模型由串联排列的工作容积为0.28、0.30和0.30升的三个培养容器V1、V2和V3构成。各容器带有磁搅拌器，利用水浴将温度保持在37℃，并通过Electrolab pH控制器控制各容器中的pH值。通过将无菌的无氧氮气通过液体，整个系统(包括培养基储器)在厌氧条件下运行。通过向5.5(V1)、6.2(V2)和6.8(V3)中加入适量的0.5MHCl-NaOH，调节三个容器中的pH值。容器1模拟大肠前部中的微生物状况。其与具有更中性pH值和相对更少底物的容器3相比，相对富含营养素，具有相对更酸性的pH值和更短的停留时间。容器3模拟大肠的后部。容器2模仿大肠的中间横部(横结肠)。

将无氧氮气连续鼓入无菌培养基，将其借助蠕动泵引入V1，其相继导向V2和V3。培养基由在蒸馏水中的下列组分(克/升)构成：马铃薯淀粉，5.0；果胶(柑橘)，2.0；酪蛋白(钠盐)，3.0；Raftiline LS(Orafti，Tienen；BE)，1.0；木聚糖(燕麦壳)，2.0；阿拉伯半乳聚糖(Fluka)，2.0；瓜尔胶(guargam)，1.0；粘蛋白(猪胃类型III)，4.0；胰蛋白胨(Oxoid)，5.0；胨水(Oxoid)，5.0；酵母提取物(Oxoid)，4.5；胆汁盐No.3(Oxoid)，0.4；L-半胱氨酸HCl，0.8；NaHCO3(Fisher Scientific)，1.5；氯化血红素，0.05；NaCl(Fisher Scientific)，4.5；KCl(Fisher Scientific)，4.5；CaC12 x 6H2O(BDH)，0.15；KH2PO4(BDH)，0.5；FeSO4 x 7H2O(BDH)，0.005；MgSO4 x 7H2O(Fisher Scientific)，1.25。此外，加入1.0毫升Tween 80(BDH)和10微升维生素K。将4毫升浓度0.025％(w/v)刃天青溶液作为厌氧条件的指示剂添加到生长培养基中。将该培养基在121℃下高压处理15分钟并在氮气氛下冷却。除非另行指明，所有化学品购自Sigma Chemical Co.，UK。

粪便材料的收集和准备

各容器的剩余容积由来自在试验前三个月未摄入任何抗生素的30岁男性的新制粪便悬浮液构成。用预先还原的磷酸盐缓冲盐水(PBS)制备20％(w/w)新鲜粪便悬浮液并在消化装置(胃)中在正常速度下消化2分钟。通过滤袋去除大的食物残渣。然后使用100毫升所得悬浮液培养三个发酵容器的每一个。该系统首先使用培养基作为分批培养物运行48小时。在48小时分批培养物发酵后，将模拟肠液组成的复杂生长培养基引入V1，然后经由蠕动泵引入V2和V3。作为各容器的稀释率的倒数，计算停留时间(R)。停留时间设定为27.1小时，且该系统在最初48小时平衡期后运行12天以确保稳态。总停留时间为各发酵器的各自停留时间R的总和。

取样：

在发酵24小时后提取第一样品(5毫升)(0天)。发酵继续至达到稳态(10-12天后)(SS1)。在此阶段，从各容器中取出培养液样品以随后分析细菌和短链脂肪酸，并用作SS1的指示剂。在达到SS1后，每天向容器1中加入试验底物，再持续10-12天。发酵继续至达到进一步稳态(SS2)，并再次从各容器中提取培养液样品以进行后继分析。

通过FISH分析法计数粪便样品中和来自肠模型的样品中的细菌数：来自发酵系统的各容器的样品如下所示处理。样品制备：从分批培养物中取出样品(375微升)，添加到1125微升滤过的4％(w/v)低聚甲醛溶液(pH7.2)中，混合并在4℃下储存过夜以固定细胞。将固定的细胞在13000rpm下离心5分钟并在滤过的磷酸盐缓冲溶液中洗涤两次，再悬浮在150微升PBS中。加入乙醇(150微升)，将样品混合并储存在-20℃下直至使用，但不超过3个月。

杂交：

将固定的细胞(16微升)添加到264微升预热(箱)的滤过的杂交缓冲液(在X(30mM Tris-HCl，1.36M NaCI，pH7.2，0.1％v/v十二烷基硫酸钠，SDS)中预热)中并混合。将该混合物以9∶1比率(v/v)添加到合适的Cy3标记的探针(50纳克/微升)中，混合并在合适的温度下在杂交箱中放置过夜。

洗涤和过滤：

将杂交的样品(合适的等分试样，以实现每视场30至150个细胞)与20微升DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，500纳克/微升)一起添加到5毫升预热的滤过的杂交缓冲液(20mM Tris-HCl，0.9M NaCl，pH7.2)中，并在合适的杂交温度下放置30分钟。将该混合物置于孔径大小为0.2微米的黑膜过滤器(GTBP 01300，Millipore Corp.)上。将Slowfade-LightAntifade(Molecular Probes Europe，Leiden，NL)置于过滤器上以防止荧光褪色，并将这些载体在黑暗中在4℃下储存最多3天。

用Nikon Microphot EPI荧光显微镜(1000x放大率)检查每个载体最少15个视场。使用DM510过滤器(550纳米)计数杂交细胞，并对DAPI-染色细胞使用DM400提取过滤器。

使用下列公式计算各样品中细胞C的浓度(细胞数/毫升)：

C＝N×15.56×14873.74×(1000/q)

N：每视场计数的平均细胞数

q：所用杂交混合物的体积

14 873.74：放大系数

15.56：所有稀释的系数

使用用已经预先设计和验证的荧光染料Cy 3标记的属特异性16SrRNA-靶向寡核苷酸探针计数重要的细菌类属。所用探针是对双歧杆菌(Bifidobacterium)特异性的Bif164(Langedijk(1995)，Appl EnvironMicrobiol 61，3069-3075)、对拟杆菌属(Bacteroides)特异性的Bac303(Manz等人(1996)Microbiology 142，1097-1106)、对溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)亚类特异性的His150和对球形梭菌(Clostridiumcoccoides)-直肠真杆菌(Eubacterium rectale)类特异性的Erec482(Franks等人(1998)Appl Environ Microbiol 64，3336-3345)、对乳杆菌(Lactobacillus)/肠球菌(Enterococcus)特异性的Lab 158(Harmsen等人(1999)Microb Ecol Health Dis 11，3-12)、对奇异菌(Atopobium)菌落特异性的Ato291。使用核酸染料4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行总细胞计数(表11)。

表11

 

探针	靶类属	序列(5’至3’)	T-杂交/℃
				Bif 164	双岐杆菌属	CATCCGGCATTACCACCC	50
Bac 303	拟杆菌属	CCAATGTGGGGGACCTT	45
				Chis 150	溶组织梭菌属	TTTCCYTCTAATTATGGCGTATT	50
Lab 158	乳杆菌/肠道球菌属	GGTATTAGCATCTGTTTCCA	50
				Ato 291	奇异菌属菌落	GGTCGGTCTCTCAACCC	50
Erec 482	球形梭菌-直肠真杆菌	GCTTCTTAGTCARGTACCG	52

短链脂肪酸的分析：

如Pereira等人，Appl.Environ Microbiol(2003)69(8)，4743-4752中所述分析从肠模型的各种容器中提取的样品中的短链脂肪酸(SCFA)。将样品离心(6000g，10分钟)以去除细菌和固体，然后通过孔大小为0.2微米的聚砜HPLC过滤器过滤。然后将各滤出的上清液200微升用800微升含有3.7mM 2-乙基丁酸作为内标的乙腈(1∶4)稀释。使用配有热解法二氧化硅填充的毛细管柱的HP 5890 series II GC系统(Permabond FFAP，Macherey Nagel，DE)(25m x 0.32mm，膜厚度0.25微米)通过气相色谱法测定脂肪酸，使用氦气作为载气，体积流速2.42毫升/分钟。柱温度为140℃，且注射器和检测器温度为240℃。在样品注射后5分钟，将柱温度以20℃/分钟逐步升至240℃并使该系统进一步运行5分钟。使用HP 3365series II ChemStation Apg-top Software，Version A0.03.34分析气体组成。使用下列酸作为外标，各自浓度为0.5至40mM：乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异戊酸(Fluka)、异丁酸(Fluka)和正己酸。除非另行指明，所有酸都购自Sigma，且纯度大于99％。使用内标校准法计算SCFA浓度，以mM/升为单位。

2.结果

在上述肠模型中测试下列菊粉：

本发明的菊粉：DPw＝77-81

对比样品：Raftinline 

(Orafti)，DPw＝33

在第二稳态(SS2)和第一稳态(SS1)之间进行比较，并使用Student’t试验分析数据。

图5显示了在用本发明的菊粉处理后，稳态1(SS1)和稳态2(SS2)时容器1(V1)中的细菌数的比较。图6和7显示了容器2(V2)和3(V3)的相应比较。

图8显示了在用对比样品处理后，稳态1(SS1)和稳态2(SS2)时容器1(V1)中的细菌数的比较。图9和10显示了容器2(V2)和3(V3)的相应比较。

在将本发明的菊粉添加到肠模型中后，观察致双歧杆菌生成响应。在所有三个容器中，双歧杆菌的增加程度显著，在容器2中，乳杆菌的增加程度显著(P<0.05)。梭菌保持不变。对于对比试样，观察到容器1中双歧杆菌的增加，但这不显著。容器3中乳杆菌的数量明显更高(P<0.05)，但没有观察到梭菌数量的变化。在容器2中，类杆菌和球形梭菌-直肠真杆菌属明显更低(P<0.05)。

图11显示了在用本发明的菊粉处理后，稳态1(基线)(SS1)和稳态2(SS2)时，所有容器中短链脂肪酸(SCFA)浓度的比较。各脂肪酸在每种情况下作为各容器和稳态的bile图(例如V1-SS1)绘制。从左到右：乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、正戊酸、己酸。

图12显示了在用对比样品处理后，稳态1(基线)(SS1)和稳态2(SS2)时，所有容器中短链脂肪酸(SCFA)浓度的比较。

在肠模型中添加本发明的菊粉导致容器3中丁酸盐和丙酸盐浓度的显著提高(V3)(P<0.05)。在其它容器中，丁酸盐浓度没有显著提高。在肠模型中添加对比样品导致所有容器中乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐浓度的提高，但这仅在容器2中是显著的(V2)。

该体内试验表明，本发明的菊粉是强的潜在益生素，因为在所有三个容器中，双歧杆菌的数量和乳杆菌的数量均提高。这在所有容器中伴随着丁酸盐浓度的提高并在容器3中伴随着丁酸盐和丙酸盐的显著增加。容器3中丁酸盐和丙酸盐的增加强烈表明，本发明的菊粉在大肠后部表现出益生素效应。这是有利的，因为大部分肠癌发生在大肠后部区域/直肠中。

8.酸奶的制造

方法

以700克批量制备酸奶。将奶标准化至在基于总组合成为11.0-14.0重量％范围内的不同非脂乳固体(MSNF)含量。将菊粉(本发明的菊粉和来自Orafti的对比性菊粉Beneo 

)的量调节至0.0至4.5重量％。酸奶配方列在表12中。本发明的菊粉(极长链菊粉，下文缩写为VLCI)相当于来自实施例1/表2的菊粉并具有75的平均聚合度DPw，对比样品Beneo 

具有的DPw为34。除非另行指明，所有百分比都是指基于总组成的重量百分比。

将干成分混合在一起以促进菊粉和脱脂奶粉的分散，然后在中等剪切下添加到奶中以形成酸奶基料。将标准化的基料在4℃下保持3小时以使脱脂奶粉可完全溶解。将各批料在80℃下巴氏消毒30分钟，迅速冷却至44℃，并用Yo-Flex 88(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，来自Chr.Hansen Inc.)以3.6克/升的浓度培养。对于罐发酵的酸奶(乳蛋羹型酸奶(custard style yogurt))，将培养的基料在培养前倒入最终包装中。将搅拌过的酸奶在大罐中培养。将基料混合物在44℃下培养4-6小时直至它们达到pH4.5(初始pH大约6.8)。当酸奶达到pH4.5时，将乳蛋羹型酸奶样品冷却至4℃并在此保持48小时以达到最大粘度。将搅拌过的样品冷却至35℃，在低剪切下混合，包装在塑料罐中，冷却至4℃，并在此保持48小时以达到最大粘度。用带有heliopath接头的布鲁克菲尔德粘度计测量粘度。

结果：

图13显示了菊粉和乳固体对酸奶粘度的影响。本发明的菊粉(VLCI)在脱脂酸奶中产生显著粘度，使用4.5％VLCI达到的粘度水平为不用任何菊粉的含1.5％脂肪的酸奶的两倍高。在含大约13.5％乳固体的酸奶中的VLCI含量从1.5％升至4.5％时，图13中右侧的曲线表现出粘度的急剧变化。与此相比，Beneo 含量的变化仅微不足道地影响粘度，即使乳固体含量变化1％。图13中的左上曲线显示了在含有3.5％VLCI的酸奶中提高乳固体的影响。一般而言，VLCI升高1％会使脱脂酸奶的粘度升高大约30％，而Beneo 对粘度具有小得多的影响。取决于乳固体的含量，产生含有1.5％脂肪的对比性酸奶的粘度所必需的VLCI的量为1.5-3.5％。为了实现含有1.5％脂肪的对比性酸奶的粘度，必需至少3.5％的Beneo 

在另一试验中，将2.5％VLCl和4.5％Beneo 在脱脂酸奶中混合。使用含有1.5％脂肪的低脂酸奶作为比较。如下表中所示，含VLCI的样品具有比含Beneo 

和1.5％脂肪的两个对比样品高的粘度。

表13

VLCI在改变脱脂酸奶的质地方面明显比Beneo 

更有效，因为以较低含量实现较高粘度。这开启了在酸奶中更经济地使用菊粉同时保持实现良好增体(bulking)效应所必需的菊粉含量的可能性。在上述实施方案中，作为增体效应必需的量，保持每份中3克菊粉的最低量。

表14显示了罐发酵酸奶(乳蛋羹型)的进一步试验。如上所述进行制造。明显的是，本发明的喷雾干燥菊粉与冻干和转鼓干燥的菊粉相比具有特别强的增粘作用。2.5％喷雾干燥或转鼓干燥的本发明的菊粉仍导致比来自对比例的4.5％菊粉更大的粘度升高。

表15显示了未搅拌的罐发酵酸奶(乳蛋羹)和搅拌型酸奶的试验。样品A-D正常发酵。将一份各样品在温和剪切下混合，同时酸奶仍温热(37-40℃)。在48小时后分析搅拌和未搅拌型(乳蛋糕型)制品的各样品的粘度。样品E-I再正常发酵，但搅拌过的部分E-G如上所述温热混合，并在混合过程中加入蔗糖。在温度降至10℃后，混合样品H和I，从而研究温度对菊粉粘度和酸奶粘度的影响。

本发明的喷雾干燥菊粉的添加(试验C)提高了搅拌制品和型制品中的粘度，达到全脂酸奶的粘度(试验D)。在第二系列(试验E-I)中，在添加对比性菊粉Beneo 

后的粘度与添加本发明的菊粉后的大致相同，但来自试验F的产物是颗粒状的且平滑度低。另外观察到，在所有实验中，在发酵容器底部上形成5毫米的变性乳清蛋白层-加入了本发明的菊粉的实施例除外。这表明本发明的菊粉对酸奶稳定性具有有益作用。

Claims (33)

1.平均聚合度DP_w为65至81的菊粉。

2.如权利要求1所述的菊粉，其具有65至79的平均聚合度DP_w。

3.如权利要求1或2所述的菊粉，其具有基于所有菊粉单体为0.5至2.0摩尔％2-1，6连接果糖单体的支化度。

4.如权利要求1-3任一项所述的菊粉，其中DPw/DPn的商小于1.25。

5.如权利要求1-3任一项所述的菊粉，其中DPw/DPn的商小于1.20。

6.如权利要求1-3任一项所述的菊粉，其中DPw/DPn的商小于1.15。

7.如权利要求1-6任一项所述的菊粉，其中葡萄糖含量基于总干重量小于2重量％。

8.如权利要求1-6任一项所述的菊粉，其中葡萄糖含量基于总干重量小于1重量％。

9.如权利要求1-8任一项所述的菊粉，其中果糖含量基于总干重量小于2.5重量％。

10.如权利要求1-8任一项所述的菊粉，其中果糖含量基于总干重量小于1.5重量％。

11.如权利要求1-10任一项所述的菊粉，其是喷雾干燥的菊粉。

12.如权利要求1-11任一项所述的菊粉，其是平均直径为100-250微米的粒子形式。

13.获得菊粉的方法，其中

a)粉碎洋蓟根，

b)通过用水处理粉碎的根来获得提取液，

c)从所得提取液中去除着色成分，

d)从提取液中沉淀出菊粉，

e)使菊粉再沉淀至少一次。

14.如权利要求13所述的方法，其包括附加过滤步骤。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中在步骤c)中如下去除着色成分，通过

i)将镁离子(Mg²⁺)混入植物提取液，

ii)将至少一种碱性组分混入植物提取液，

iii)形成沉淀物，和

iv)从植物提取液中去除已形成的沉淀物。

16.如权利要求15所述的方法，其中在步骤i)中混入镁盐。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述镁盐选自氯化镁、硫酸镁、硝酸镁、乙酸镁和丙酸镁。

18.如权利要求15-17任一项所述的方法，其中所述步骤i)在60-80℃的温度下进行。

19.如权利要求15-18任一项所述的方法，其中选择碱性组分的量以使OH^-:Mg²⁺摩尔比为2.2:1至1.8:1。

20.如权利要求15-19任一项所述的方法，其中所述碱性组分是碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物的水溶液或悬浮液。

21.如权利要求15-20任一项所述的方法，其中所述碱性组分是氢氧化钙悬浮液。

22.包含如权利要求1-12任一项所述的菊粉的食品。

23.如权利要求22所述的食品，其选自乳制品、酸奶、冰淇淋、奶类软冰淇淋、奶类装饰物、布丁、冰冻牛奶、蛋奶甜羹、奶酪、营养棒、能量棒、早餐棒、糖果、烘烤产品、薄脆饼干、曲奇饼、饼干、谷类片、休闲零食、冰茶、由果汁制成的软冰淇淋、疗效饮料、成品饮料、运动饮料、活力饮料、用于膳食补充的粉状饮品混合物、婴幼儿食品、加钙橙汁、面包、羊角面包、早餐谷物、面条、涂抹酱、无糖饼干和巧克力、钙咀嚼品、肉产品、蛋黄酱、沙拉调料、果仁奶油、深冻食品、调味汁、汤和即食食品。

24.如权利要求22或23所述的食品，其是挤出产品。

25.包含如权利要求1-12任一项所述的菊粉的膳食补充剂。

26.包含如权利要求1-12任一项所述的菊粉的化妆品制剂。

27.如权利要求1-12任一项所述的菊粉作为食品添加剂的用途。

28.如权利要求27所述的菊粉用途，其用作具有益生素性质的添加剂、质地剂、稳定性增强剂、粘度提高剂和/或膳食纤维。

29.如权利要求1-12任一项所述的菊粉在食品中作为脂肪或油替代品的用途。

30.如权利要求1-12任一项所述的菊粉作为化妆品制剂中的添加剂的用途。

31.如权利要求30所述的菊粉用途，其用作质地剂、稳定性增强剂和/或粘度提高剂。

32.如权利要求1-12任一项所述的菊粉的含水糊料。

33.根据权利要求32的含水糊料在食品或化妆品制剂中作为创建结构的组分、脂肪替代品、油替代品、质地剂、稳定性增强剂和/或粘度提高剂的用途。

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