CN101429249A - 抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体、以及该单克隆抗体的制备方法，本发明通过以编码hCGβ的真核表达质粒经肌肉免疫BALB/c小鼠，将分泌高效价抗hCGβ抗体的小鼠脾细胞与小鼠B细胞淋巴瘤融合、经筛选、反复克隆化，获得能稳定分泌抗hCGβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过该抗hCGβ单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌抗hCGβ的单克隆抗体。本发明公开的抗hCGβ单克隆抗体可特异性结合hCGβ蛋白以及肿瘤细胞表达的膜型hCGβ，可在体外和体内有效抑制肿瘤生长，可以直接诱导肿瘤细胞凋亡。

Description

抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体及其制备方法

技术领域：

本发明涉及生物工程领域以及肿瘤免疫治疗领域，涉及一种单克隆抗体，特别是一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体及其制备方法。

背景技术：

肿瘤生物治疗是继手术治疗、放射治疗和化学药物治疗之后新型的肿瘤治疗手段，其中，针对肿瘤抗原物质而研制的单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)是目前肿瘤生物治疗的热点之一。抗原抗体反应的特异性决定了针对肿瘤特异性靶抗原的mAb会优先与相应的肿瘤组织结合，而不识别正常的组织。单克隆抗体不仅可以通过ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)及CDC(细胞依赖的细胞毒作用)等免疫效应机制发挥抗瘤作用，还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡；同时利用单克隆抗体识别肿瘤细胞的特异性，可通过将放疗化疗药物偶联到单克隆抗体上给药从而降低药物对正常组织的非特异损伤，减少治疗的副作用。单克隆抗体正是以其特异性和敏感性成为众所瞩目的肿瘤治疗的新方法。

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)是由孕妇胚胎合体滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，在维持早孕妇女的黄体功能和促进妊娠进行、防止母体排斥妊娠产物等方面具有重要的生理功能。hCG与人黄体生成素(hLH)、卵泡刺激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH)等同属糖蛋白激素家族。hCG由α链和β链组成，hCG与hLH、FSH和TSH具有完全相同的α链，而具有独特的与功能相关的β链。

自Gailani等报道非滋养层肿瘤细胞异位表达hCG以来，肿瘤细胞表达的异位hCG(ectopice hCG，ehCG)与肿瘤发生、发展的关系受到人们关注。许多不同类别和组织来源的肿瘤细胞都能不同程度地表达ehCG。肿瘤细胞自分泌的ehCG具有生长因子活性，能促进和调控肿瘤细胞的增殖、分化和生长，使肿瘤细胞在其微环境中能自我生长；膜结合型ehCG使肿瘤细胞表面呈负电荷，推测可能与肿瘤的转移特性、免疫耐受等有一定的关系，因而，ehCG可以作为mAb生物治疗的一种理想靶抗原。

由于hCG与其他性激素具有相同的α链，因此以hCG独特的β链(hCGβ)作为靶抗原，制备抗hCGβ的mAb，可以成为肿瘤免疫生物治疗的一种理想手段。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体及其制备方法，所述的这种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体及其制备方法要解决现有技术中的抗肿瘤药物治疗肿瘤效果不佳，副作用大的技术问题。

本发明提供了一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白、或者特异性结合表达人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白的肿瘤细胞。

进一步的，所述的人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

进一步的，所述的人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白具有SEQ ID NO：2所示的DNA序列。

进一步的，所述的单克隆抗体的恒定区基因序列等同于所有BALB/c小鼠来源IgG2a抗体的相应序列，与靶抗原特异结合的所述的可变区(含关键CDR序列和附属骨架区序列)具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

进一步的，所述的单克隆抗体的恒定区基因序列等同于所有BALB/c小鼠来源IgG2a抗体的相应序列，与靶抗原特异结合的所述的可变区(含关键CDR序列和附属骨架区序列)具有SEQ ID NO：4所示的DNA序列。

具体的，与靶抗原特异结合的所述的可变区中的关键CDR1序列包括SEQ ID NO：5所示的DNA序列(ACG GTT AGC TCAAGT GTAAGT TCCAGT TAC TTG)。

具体的，与靶抗原特异结合的所述的可变区中的关键CDR2序列包括SEQ ID NO：6所示的DNA序列(AGG ACT TCC AAC CTG GCT TCT)。

具体的，与靶抗原特异结合的所述的可变区中的关键CDR3序列包括SEQ ID NO：7所示的DNA序列(CAC CAG TATCAT CGT TCC CCA CGGACG)。

进一步的，所述的表达人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白的肿瘤包括但不限于HeLa细胞、或者HepG2细胞、或者HL-60细胞、或者7721细胞、或者K562细胞、或者SKOV3细胞、或者PC-3细胞。

本发明还提供了一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的制备方法，包括一个获得编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因DNA的步骤，包括一个构建含有编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因的质粒的步骤，包括一个利用表达质粒免疫小鼠的步骤，包括一个利用获得的分泌高效价抗hCGβ抗体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合的步骤，包括一个反复筛选得到分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的步骤，包括一个利用获得的杂交瘤细胞株分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的步骤。

具体的，所述的一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)获得编码hCGβ蛋白的基因DNA；

(2)通过酶切位点插入真核表达质粒载体中；

(3)将表达质粒通过肌肉注射方式免疫；

(4)免疫后以ELISA方法证实小鼠血清中诱导了高效价的抗hCGβ抗体后，分离得到小鼠脾细胞，与B淋巴细胞瘤按照常规方法进行融合，筛选永生化的分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的融合杂交瘤细胞株；

(5)利用获得的杂交瘤细胞株分泌的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体。

具体的，所述的小鼠为BALB/c小鼠。

具体的，所述的真核表达质粒载体为TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，采用如下步骤制备，包括一个获得编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因DNA的步骤，包括一个构建含有编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因的质粒的步骤，包括一个利用表达质粒免疫小鼠的步骤，包括一个利用获得的分泌高效价抗hCGβ抗体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合的步骤，包括一个反复筛选得到分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的步骤。

具体的，所述的一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得编码hCGβ蛋白的基因DNA；

(2)通过酶切位点插入真核表达质粒载体中；

(3)将表达质粒通过肌肉注射方式免疫；

(4)免疫后以ELISA方法证实小鼠血清中诱导了高效价的抗hCGβ抗体后，分离得到小鼠脾细胞，与B淋巴细胞瘤按照常规方法进行融合，筛选永生化的分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的融合杂交瘤细胞株。

具体的，所述的小鼠为BALB/c小鼠。

具体的，所述的真核表达质粒载体为TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。

本发明还提供了一种具有抗肿瘤功能的药物组合物，含有有效量的上述的单克隆抗体、或者含有有效量的上述的杂交瘤细胞株、或者含有有效量的上述的杂交瘤细胞株和抗肿瘤药物的组合，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还提供了一种检测试剂，含有有效量的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体。

本发明所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体可在体外发挥抗肿瘤效应，加入肿瘤细胞培养上清中时，可以剂量依赖性的方式抑制体外培养的肿瘤细胞(HeLa)的增殖。

进一步的，所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体可以在体内发挥抗肿瘤效应。将单克隆抗体注射成瘤小鼠(HeLa细胞注射的裸鼠)后，可以抑制肿瘤的生长并且可延长荷瘤小鼠的存活时间。

本发明所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体可在体内、外发挥抗肿瘤效应的机制在于：单克隆抗体可以诱导肿瘤细胞凋亡，可以导致肿瘤细胞出现明显的细胞皱缩、细胞核固缩、DNA片段化等。

本发明人通过长期广泛的研究发现：虽然抗hCGβ单克隆抗体也可以通过常规的以hCGβ蛋白免疫的方法获得，但是所获得的单克隆抗体不一定具有较强的抗肿瘤活性，此外，蛋白免疫的代价相对基因免疫非常昂贵。更为重要的是，如需对hCGβ进行某种程度的必要的改造或修饰，则基因疫苗可在基因水平上快速简便地进行操作；而在hCGβ蛋白水平上操作难度大、费用昂贵。因此通过基因疫苗形式来构建表达hCGβ蛋白，并诱导hCGβ蛋白特异性抗体从而制备单克隆抗体技术，是行之有效而简便易行的新技术。

本发明中，所述的表达hCGβ的真核表达质粒的载体，包括任何可以转染哺乳动物细胞的高效真核表达质粒载体，包括但不限于：pcDNA3、pVAX和TR421等以及常见和市售的真核质粒载体。

本发明中，hCGβ蛋白编码基因的获得，可以通过多种方式获得，包括但不限于：1)化学合成DNA；2)通过适当引物以PCR技术扩增得到DNA。

本发明中，将编码hCGβ的基因疫苗注射小鼠的方法采用肌肉注射方式，以本领域技术人员熟知的常规技术进行：以注射器吸取<100μl质粒液体直接注射小鼠胫骨前肌肉，可仅注射小鼠一条腿，也可分别取50μl质粒注射于小鼠两条腿。除注射器外，也可选用其他有效的借助于市售仪器的基因免疫的方式，包括但不限于：基因枪技术、电穿孔辅助技术等。

本发明中，所述的含有抗hCGβ单克隆抗体YN2的药物复合物中有效成分的存在形式，包括但不限于以下几类：1)抗hCGβ单克隆抗体YN2蛋白；2)抗hCGβ单克隆抗体YN2蛋白与其他抗肿瘤药物或分子的组合。在给药时，可直接给予1)或2)所述的有效成分，以及药学上可接受的载体。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、变态反应)、有合理效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”成分是用于将具有活性的有效成分传送给人或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂和赋形剂。所述的载体可以是液体、固体或半固体。载体包括但不限于：水、PBS缓冲液、生理盐水、葡萄糖、甘油、叠氮钠及其组合。

本发明的药物组合物，含有上述有效成分和药学上可接受的载体。通常将其配制于无毒、中性、惰性和药学上可接受的水性载体介质中，pH值通常约6—8，但根据具体肿瘤情况以及有效成分性质可有所改变。

本发明通过以编码hCGβ的真核表达质粒进行基因免疫的方式，最后筛选获得了具有较强抗肿瘤活性的但克隆抗体，可通过特异性结合hCGβ蛋白而与膜表达hCGβ蛋白的肿瘤细胞发生结合，进而诱导肿瘤细胞发生调亡，因此可有效发挥体外、更重要的是体内的抗肿瘤效应。该抗hCGβ单克隆抗体在空间有效结合了hCGβ蛋白的功能部位，从而使肿瘤细胞的生长、转移特性被有效抑制。含有上述单克隆抗体的药物组合物能应用于肿瘤的免疫生物治疗。含有该单克隆抗体的检测试剂，可用于体内示踪技术、ELISA检测方法中的抗体以及肿瘤原位组织切片检测中的抗体。

本发明与现有技术相对比，其效果是积极和明显的。本发明所制备的抗hCGβ单克隆抗体，经由基因免疫手段制备，具有有效的抗肿瘤效应。在肿瘤免疫生物治疗、肿瘤定性定量免疫检测、肿瘤示踪定位等方面具有广阔的应用前景。同时本发明不采用常规的蛋白免疫方式制备抗hCGβ单克隆抗体，而是利用基因免疫手段免疫小鼠制备抗hCGβ单克隆抗体，能够得到高效价抗体，为更加有效的利用本发明的单克隆抗体治疗肿瘤提供了坚实的基础。

附图说明：

图1显示了真核表达质粒TR421-hCGβ的构建示意图；其中基因经PCR扩增获得，TR421购自invitrogen，分别经BgIII和BamH I酶切，再连接，得到TR421-hCGβ质粒。

图2显示了真核表达质粒TR421-hCGβ的鉴定结果；A图：PCR鉴定，利用不同引物可得到495、625bp条带，表明基因插入且方向正确；B图显示BgIII/BamH I酶切得到503bp条带；C图显示DNA测序证实构建无误。

图3显示了TR421-hCGβ质粒经肌肉注射BALB/c小鼠诱导的血清抗hCGβ抗体效价；H1、H2和H3为小鼠编号；Normal为未免疫小鼠对照。结果显示三次基因免疫诱导了高强度的抗hCGβ抗体，效价高于10⁵。

图4显示了获得的9株抗hCGβ单抗对Hela肿瘤细胞的抑制效率，其中YN2单抗抑制肿瘤效果最好。

图5显示了单克隆抗体YN2经腹水纯化后的特性，图A：YN2经腹水扩增后经Protein G亲和层析柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯度达到90％以上；1：Marker；2：未纯化腹水；3：纯化YN2单克隆抗体(变性)；4：纯化YN2(非变性)；图B：Western Blot证实YN2可与纯的hCGβ蛋白发生特异性结合；图C：YN2杂交瘤染色体核型分析表明染色体数目90条以上。

图6显示了YN2单克隆抗体与不同肿瘤细胞上表达的hCGβ结合图，结果提示：YN2单克隆抗体可与多种不同肿瘤细胞表达的hCGβ特异结合。

图7显示了YN2单克隆抗体的体外抗肿瘤作用，将YN2加入培养细胞上清，可有效抑制HeLa细胞增值，YN2浓度>60μg/ml时，抑瘤效率达40％，YN2浓度为100μg/ml时，抑瘤效率达58％。

图8显示了YN2单克隆抗体的体内抗肿瘤作用，对荷HeLa肿瘤裸鼠腹腔注射YN2抗体500μg/只/次，每星期3次，其图A显示YN2对肿瘤生长的抑制，荷瘤28天，YN2组肿瘤体积为与对照相比缩小一半以上(p<0.01)，图B显示了荷瘤小鼠生存率：YN2处理组的小鼠平均生存期为77天，而对照小鼠仅为30-37天，证明YN2可有效延长荷瘤动物存活。

图9显示了YN2单克隆抗体诱导HeLa细胞核凋亡，YN2处理后，Hoechst33258染色发现细胞核固缩并出现核碎裂、分离，证实细胞凋亡。

图10显示了YN2单克隆抗体诱导HeLa细胞染色体降解，YN2处理后的细胞的染色体DNA发生了典型的100bp片段化，证实发生细胞调亡。

具体实施方式：

以下所述本发明的具体实施例用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。

实施例中所采用的质粒载体可通过购买获得，SP2/0细胞等可通过中国科学院上海细胞所购买；常见生化试剂购自Sigma公司、限制性内切酶购自Takara公司；细胞培养试剂购买自Gibco BRL和Invitrogen公司，基因DNA合成委托上海生工公司；hCGβ蛋白购买自上海麦莎生物科技有限公司，Annexin V和PI购自BD公司。6-8周龄雌性BALB/c(H-2d)小鼠购自复旦大学实验动物中心，清洁级饲养。动物饲养及操作符合国家相关规定。

实施例1 基因疫苗TR421-hCGβ真核质粒的构建、鉴定及其大量纯化

1.PCR法获得ehCGβ-hCGβ编码基因

引物序列hCGβ-P1：5’-GGAAGATCTATGGAGATGTTCCAGG-3’(SEQ ID NO：8)、和引物序列hCGβ-P2：5’-CGGGATCCTTGTGGGAGGATCGGGGT-3’(SEQ ID NO：9)由上海生工公司合成；Taq DNA多聚酶、dNTP等PCR试剂购自Biostar公司；胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司。以pGEM3Z-hCGβ质粒(美国东卡罗来纳大学Ross TM教授馈赠)为模板、hCGβ-P1和hCGβ-P2为上下游引物进行PCR(美国Perkin Elmer公司PE2400型PCR仪)，PCR反应条件：总体积50μl，依次加入10X缓冲液5μl、25mM MgCl₂3μl、10mM dNTP1μl、10mM正反向引物各1μl、Taq酶1U、模板1μl，三蒸水至50μl。反应程序为：94℃预变性5分钟，进入PCR循环：94℃变性45秒、58℃复性45秒、72℃延长1分钟，重复30个循环，最后延长10分钟。以1％琼脂糖凝胶电泳回收hCGβ基因(503bp)。

2.TR421-hCGβ重组质粒的构建与鉴定

TR421-hCGβ重组质粒构建如图1所示。具体步骤如下：

A.基因片段和载体的酶切与回收

以Bam HI和Bg/II(TaKaRa)对hCGβ基因的PCR回收产物进行双酶切，以Bg/ll对TR421质粒(invitrogen)进行单酶切，方法如下：1μg的质粒DNA或PCR回收产物，2U相应内切酶、2μl缓冲液，加双蒸水至20μl，37℃反应6小时，65℃终止反应，以1％琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物。

B.酶切载体与酶切基因片段的连接

取适量酶切载体和目的片段加入反应管，使载体和片段的摩尔数之比为1∶3，然后加1μlT4 DNA连接酶(MBI公司)、1μl缓冲液，补双蒸水至10μl，混合后置16℃反应4℃过夜。

C.连接产物转化宿主细菌

取5μl连接产物DNA，加200μl DH5α感受态，冰浴30分钟，42℃热休克90秒，冰浴5分钟，加入800μlLB，37℃120rpm振荡培养45分钟，3000rpm离心3分钟，弃上清，留约100μl液体悬浮菌体，涂布卡那青霉素(60μg/ml)平板上，37℃培养16小时。

D.阳性克隆的筛选鉴定

菌落PCR：采用TR421载体上、下游引物T7U：5′-TTAAT ACGACTCACT ATAG-3′(SEQ ID NO：10)和T7D：5′-TAGAA GGCAC AGTCGAGGCT GAT-3(SEQ ID NO：11)。将PCR所有试剂按比例混和，用无菌牙签挑取菌落涂于管底，PCR反应条件同上，预变性时间延长至15分钟。以ehCGβ-P1/ehCGβ-P2为正反向引物进行PCR鉴定hCGβ基因是否插入载体；以T7U/ehCGβ-P2或hCGβ-P1/T7D为正反向引物鉴定插入方向。

酶切鉴定：小量抽提菌落质粒DNA，以BamHI和Bg/II进行双酶切，进行1％琼脂糖凝胶电泳观察能否切下503bp左右的产物。

DNA测序检测：委托上海申友生物公司采用ABI PRISMTM377 DNASequencer测序仪完成。

按上述步骤将hCGβ编码基因克隆于TR421质粒，获得TR421-hCGβ重组质粒。PCR、酶切法、DNA测序证实hCGβ基因插入方向正确，读码框架准确(图2)。

3.TR421-hCGβ重组质粒的大量纯化

按照QIAGEN Plasmid Mega Kit质粒DNA纯化试剂盒(基因公司)说明操作，以PBS溶解DNA。以紫外分光光度计测定DNA溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，接近1.9时认为达到纯度，以OD₂₆₀＝0.1时DNA的含量为50μg/ml计算DNA的浓度，将质粒DNA调整为1μg/μl，-20℃冻存。

实施例2 TR421-hCGβ基因免疫小鼠

质粒DNA免疫前24小时，用0.75％戊巴比妥钠120-180μl腹腔注射麻醉小鼠(50μg/g体重)，消毒腿部皮毛，在胫骨前肌肉中注射100μl0.25％丁哌卡因(Sigma公司)，促进局部肌肉坏死再生。24小时后麻醉小鼠在同一部位注射质粒DNA(100μg/100μl)-PBS溶液，于第14、第28天按同样方法经肌肉免疫小鼠，眼眶后眦静脉采血，血清于-20℃冻存。第42天经小鼠尾静脉注射hCGβ纯蛋白20μg，5天后处死小鼠取脾脏用于细胞融合。

实施例3 TR421-hCGβ基因免疫诱导特异性血清抗体

三次基因免疫后在小鼠血清诱导的抗hCGβ抗体采用常规，E LISA方法检测：以10ug/ml hCGβ蛋白溶解于包被液中(0.1M Na₂CO₃，pH9.6、0.1％BSA)4℃包被96孔酶标板；以5％milk-PBS封闭；依次加1：100稀释血清、HRP-羊抗小鼠IgG、OPD，显色中止，测OD_490nm。

结果如图3所示，三次基因免疫后在小鼠诱导了高滴度的血清抗hCGβIgG抗体，抗体效价高于10⁵。加强免疫后抗体的水平持续增高，各免疫小鼠的抗体上升水平趋向一致，提示TR421-hCGβ基因免疫小鼠可诱生高效价的特异性抗体。

实施例4 抗hCGβ单克隆抗体的制备：

1.细胞融合：

1)饲养细胞的制备：取未免疫过的BALB/C小鼠摘眼球放血，置于EP管中，留取血清作阴性对照。脱颈推处死小鼠，超净台内剪开小鼠腹腔，吸取少许无血清1640培养基注入小鼠腹腔内，吹打2-3次，吸出腹腔内细胞悬液(主要为巨噬细胞)，1500rpm离心5分钟，弃上清加入HAT培养基，制成饲养细胞悬液置CO₂培养箱中培养，次日供细胞融合用。

2)SP2/0淋巴瘤细胞的准备：融合前两周用8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)对SP2/0细胞作选择培养。融合当天收集处于指数生长期的、活率大于95％的SP2/0细胞，用无血清RPMI-1640洗细胞一次，取5×10⁷SP2/0细胞备用。

3)小鼠脾细胞制备：选取血清抗体效价最高小鼠，脱颈处死，无菌取脾，用200目尼龙指套制成单细胞悬液，无血清1640悬浮，取2×10⁸细胞备用。

4)细胞融合：采用常规方法进行细胞融合：将小鼠脾细胞和SP2/0按4∶1～5∶1的比例混合，无血清1640洗涤2～3次，离心弃上清；轻弹使沉淀细胞疏松，37℃下将预热的1ml50％PEG于1分钟内逐滴加入细胞沉淀中，边加边缓慢均匀地旋转离心管，使液滴沿管壁加入，静置融合90秒，然后于2分钟内加完1ml无血清1640，再于1分钟内加完1ml无血清1640，再于30秒钟内加1ml无血清1640，逐滴加入无血清164030-40ml，低速离心5分钟，弃上清，沉淀细胞用含20％小牛血清HAT培养液重悬，滴加于预先铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μl。置37℃，5％　CO2孵箱培养。融合后的细胞在HAT培养基中培养14天后换用HT培养基，再过两周后逐步换成含20％胎牛血-RPMI1640完全培养液。

2.阳性杂交瘤细胞筛选：

待杂交瘤细胞长至孔底1/3面积时，取培养上清液，用ELISA法进行阳性克隆检测。标本OD值大于阴性对照值2.1倍判为阳性。记录好阳性培养孔，1-2日后对阳性孔进行复测，保留阳性孔，及时进行亚克隆。

3.杂交瘤细胞克隆化培养：

克隆前一天按照前述方法制备1×10⁵/ml小鼠腹腔巨噬细胞，每孔加入100μl。挑取阳性孔的细胞计数并以有限稀释法克隆：取50个活细胞悬浮于10ml培养液中(5/ml)，按每孔100μl接种于96孔板中，置37℃，5％CO2孵箱中培养，于第五天补加一次培养液，之后每三天换液一次。待克隆长大后再次行抗体检测，连续进行克隆化直至所检测的克隆阳性率达100％，挑取阳性反应最强克隆扩大培养并冻存。

4.阳性杂交瘤细胞的扩大培养及冷冻保存：

将阳性单克隆杂交瘤细胞依次转入24孔、6孔培养板，与完全1640培养液中扩大培养；待细胞长满孔底时，取出1500rpm离心10分钟，弃上清；用冻存液稀释(含10％DMSO的完全培养液)，分装至冻存管中(1ml/管)；4℃放置30分钟；-20℃放置2个小时；-70℃放置1小时；转至液氮中冻存，第一、二、三代筛选的克隆分别按上述方法冻存于液氮中。

结果显示：在8块96孔板中，共有340孔可见明显杂交瘤细胞生长，融合率为45％。对已融合的杂交瘤细胞用E LISA检测其抗hCGβ抗体分泌，对阳性孔进行有限稀释法克隆和上清筛选，经过三次亚克隆，共获得9株分泌特异性抗hCGβ单抗的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞经体外连续传代培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，持续稳定分泌抗体。

通过检测9株杂交瘤细胞的培养上对HeLa细胞增殖的影响，如图4显示：YN2杂交瘤细胞培养上清与HeLa细胞共孵育48小时后，抗体处理组活细胞数占未处理组细胞数的81.67±7.63％，提示YN2能够抑制体外培养的HeLa细胞的增殖。

实施例5 YN2单克隆抗体的制备和纯化

采用小鼠腹水法制备高效价高纯度的YN2单克隆抗体，取8-10周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注入液体石蜡0.5ml/只，一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁶/只，同时另一侧腹腔再次注入液体石蜡和IFA的，一般在7-10天后收获腹水，腹水产生阳性率为80％，收获量平均5ml/只，腹水抗体效价达1：10⁶。离心取腹水上清按50％饱和度加入等体积的饱和(NH4)₂SO₄溶液，混匀后置40℃4-6小时，离心弃上清。取沉淀加0.01mol/L PBS(PH7.4)复溶。透析去除(NH4)₂SO₄，按照Pharmacia公司提供的Protein G亲和层析进行单抗纯化，步骤如下：柱子再生与平衡：先用5CV甘氨酸-盐酸(20mmol/L，pH2.7)再生层析柱，再用5CV平衡缓冲的磷酸盐缓冲液(PB20mmol/l，pH7.0)平衡层析柱，流速1.0ml/min；上样：将预处理好的腹水上样，流速1.0ml/min；再平衡：用平衡缓冲液冲洗层析柱，使其在280nm处紫外吸收接近基线，流速1.0ml/min；洗脱：用甘氨酸-盐酸(20mmol/L，pH2.7)洗脱液洗脱，流速1.Oml/min，接收蛋白洗脱峰，立即用1mol/LTris-HCl(pH9.0)调节至中性。PBS(PH7.0)透析后用紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量，其浓度的计算公式为：抗体蛋白含量(mg/ml)＝OD280×1.55-OD260×0.76。用SDS-PAGE鉴定单克隆抗体纯度：分离胶浓度10％，浓缩胶浓度5％，分别在还原状态和非还原状态下处理样品，上样量15ml，电泳采用恒压方式，浓缩胶150V，分离胶120V。电泳后以考马斯亮蓝R250染色，然后经凝胶成像仪扫描鉴定纯度，结果显示：腹水经Protein G亲和层析柱纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯度达到90％以上(图5A)。Western Blot检测证实：该单抗YN2可与纯的hCGβ蛋白发生特异性结合(图5B)。此外，YN2杂交瘤细胞染色体分析表明：染色体数目90条以上(图5C)。

实施例6 流式细胞术证实YN2可与肿瘤细胞表面hCGβ有效结合：

收获对数生长期的SP2/0细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、HL-60细胞、7721细胞、K562细胞、SKOV3细胞、PC-3细胞，ECV-304细胞，PBS洗3次，弃上清，使每管细胞总数为5×105，加入100μl杂交瘤培养上清，轻混细胞置4℃冰箱30min，PBS洗1次，加50μl FITC标记羊抗小鼠IgG多抗置4℃冰箱0.5h，PBS洗3次，用流式细胞检测仪检测，

结果如图6A、图6B、图6C、图6D、图6E、图6F、图6G、图6H、图6I所示：YN2可与多种不同肿瘤细胞表面hCGβ有效结合。

实施例7 YN2单克隆抗体发挥体内外抗肿瘤作用：

1.YN2可在体外有效抑制肿瘤细胞增殖活性：

获取对数生长期的天然高表达hCGβ的人HeLa细胞，按1×10⁴/100μl/孔加入96孔细胞板，加入100μl单克隆抗体溶液，置37℃、CO₂条件培养44h，观察肿瘤细胞形态变化，然后每孔加入CCK-8溶液继续培养2h后，在450nm测定吸光度，以单纯加入培养液的对照孔OD值为100％，根据处理组细胞培养孔的OD值，计算YN2抗体孵育后细胞的相对增殖活性。

结果如图7证实，YN2与HeLa细胞共孵育后显示明显的细胞毒作用，并且呈剂量依赖性，当YN2达100μg/ml时，HeLa细胞生长抑制率达58％。

2.YN2可在体内有效抑制肿瘤在荷瘤裸鼠体内的生长：

收集HeLa细胞，按5×10⁶/100μl注射于裸鼠肩胛部皮下，定期观察肿瘤大小和生存率。每周用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤的体积。肿瘤的体积以如下公式计算：1/2×1×w2，其中1是肿瘤的长径(mm)，w代表肿瘤与长径垂直的短径(mm)。在接种后第3天，将成瘤裸鼠随机分组，8只/组，共三组，分别为PBS处理组、抗HBV M蛋白(无关)单克隆抗体(同型对照)组和YN2单克隆抗体处理组，腹腔注射抗体500μg/只/次，每星期3次，进行抗体干预。记录小鼠的生存率。

结果如图8显示：通过YN2抗体对裸鼠HeLa肿瘤的干预，荷瘤后第28天，YN2处理组肿瘤平均体积为1.76cm³，与对照抗体组3.41cm³、PBS组3.63cm³相比，显著减小(p<0.01)。荷瘤小鼠生存周期表明：PBS、对照抗体处理小鼠的平均生存期分别为30和37天，而YN2处理组的小鼠直至第48天，仍有100％的存活率，小鼠平均生存期为77天。证明YN2单克隆抗体可以抑制体内HeLa肿瘤细胞的生长，有效延长荷瘤动物存活。

实施例8 YN2单克隆抗体可诱导肿瘤细胞凋亡：

1.Hoechst33258染色检测细胞核崩解：

在6孔板内铺清洁无菌盖玻片，将处于对数生长期肿瘤细胞消化后均匀铺在板内，24小时后，细胞在玻片上生长至80％后，加入6H1单克隆抗体及对照抗体作用24-48小时，细胞出现明显凋亡迹象后，弃去培养液，加入PBS洗涤，以3.7％多聚甲醛1ml固定细胞爬片30min，PBS洗涤一次，滴加100μl Hoechst 33258染液，37℃孵箱染色5min，荧光显微镜下观察。

结果如图9所示：YN2单克隆抗体处理后，Hoechst 33258染色从形态学上提示：细胞核出现固缩，细胞核亮度增加，并出现核碎裂、分离，证实YN2单克隆抗体可以诱导HeLa细胞凋亡。

2.DNA片段化检测：

收集经不同浓度抗体作用的HeLa细胞(5×106)，以PBS洗1次，抽取细胞总DNA：加含蛋白酶K和RNase的细胞裂解液500μl，混匀后于50℃水浴5h；加0.5ml酚：氯仿：异戊醇抽提；离心后上清移至另一离心管，加0.5ml氯仿：异戊醇抽提；离心后上清移至另一离心管，加10μl的3mol/L乙酸钠和1ml预冷无水乙醇，混匀后置液氮5min，沉淀DNA，离心去上清，经70％乙醇洗涤后置室温干燥10min，加30TE缓冲液溶解DNA。以1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳后用EB染色。以凝胶图像分析仪拍摄照片。

结果如图10，与正常对照组细胞基因组DNA相比，YN2单克隆抗体处理后的细胞的染色体DNA发生了典型的100bp为基础的片段化现象，证实发生了细胞调亡。

3.流式细胞仪测定细胞凋亡：

采用Annexin V-FITC/PI双色标记法，HeLa细胞以不同浓度抗体作用，调为10⁶/ml。PBS洗涤2次，弃上清，细胞重悬于100μl的标记缓冲液中，每管分别加入AnnexinV-FITC溶液和PI溶液，混匀后于室温下避光孵育15min。最后补PBS 400μl，以流式细胞仪检测细胞凋亡。每个样品检测1万个细胞，用cellquest软件进行细胞凋亡分析。

对YN2处理的HeLa细胞进行Annexin V/PI双染，FACS检测结果显示：YN2作用48小时后，发生早期凋亡(Annexin V+/PI-)的HeLa细胞占12.16％，发生晚期凋亡(Annexin V+/PI+)的占6.95％，显著多于对照组(0.80％，0.71％)，坏死细胞(Annexin V-/PI+)也较对照组有部分增加。说明YN2通过引起肿瘤细胞凋亡介导其抗肿瘤作用。

序列表

<110>复旦大学

<120>抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体及其制备方法

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>165

<212>PRT

<213>人hCGβ蛋白

<400>1

<210>2

<211>495

<212>DNA

<213>人hCGβ

<400>2

<210>3

<211>108

<212>PRT

<213>抗hCGβ单抗轻链可变区蛋白

<400>3

<210>4

<211>324

<212>DNA

<213>抗hCGβ单抗轻链可变区基因

<400>4

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>抗hCGβ单抗轻链可变区CDR1基因

<400>5

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>抗hCGβ单抗轻链可变区CDR2基因

<400>6

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>抗hCGβ单抗轻链可变区CDR3基因

<400>7

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人hCG蛋白的上游引物

<400>8

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人hCG蛋白的下游引物

<400>9

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>TR421载体上游引物t7u

<400>10

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>TR421载体下游引物T7U

<400>11

Claims (19)

1.一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体特异性结合人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白、或者特异性结合表达人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白的肿瘤细胞。

2.如权利要求1所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：所述的人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：所述的人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白具有SEQ ID NO：2所示的DNA序列。

4.如权利要求1所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体的恒定区基因序列等同于所有BALB/c小鼠来源IgG2a抗体的相应序列，与靶抗原特异结合的所述的抗体可变区具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体的恒定区基因序列等同于所有BALB/c小鼠来源IgG2a抗体的相应序列，与靶抗原特异结合的所述的抗体可变区具有SEQ ID NO：4所示的DNA序列。

6.如权利要求5所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：与靶抗原特异结合的所述的可变区中的关键CDR1序列包括SEQID NO：5所示的DNA序列。

7.如权利要求5所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：与靶抗原特异结合的所述的可变区中的关键CDR2序列包括SEQID NO：6所示的DNA序列。

8.如权利要求5所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：与靶抗原特异结合的所述的可变区中的关键CDR3序列包括SEQID NO：7所示的DNA序列。

9.如权利要求1所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体，其特征在于：所述的表达人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白的肿瘤包括HeLa细胞、或者HepG2细胞、或者HL-60细胞、或者7721细胞、或者K562细胞、或者SKOV3细胞、或者PC-3细胞。

10.一种制备如权利要求1所述的的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的制备方法中包括一个获得编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因DNA的步骤，包括一个构建含有编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因的质粒的步骤，包括一个利用表达质粒免疫小鼠的步骤，包括一个利用获得的分泌高效价抗hCGβ抗体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合的步骤，包括一个反复筛选得到分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的步骤，包括一个利用获得的杂交瘤细胞株分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的步骤。

11.如权利要求10所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

(1)获得编码hCGβ蛋白的基因DNA；

(2)通过酶切位点插入真核表达质粒载体中；

(3)将表达质粒通过肌肉注射方式免疫；

(4)免疫后以ELISA方法证实小鼠血清中诱导了高效价的抗hCGβ抗体后，分离得到小鼠脾细胞，与B淋巴细胞瘤进行融合，筛选永生化的分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的融合杂交瘤细胞株；

(5)利用获得的杂交瘤细胞株分泌的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体。

12.如权利要求11所述的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的小鼠为BALB/c小鼠。

13.如权利要求11所述的一种抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的真核表达质粒载体为TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。

14.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：采用如下步骤制备，包括一个获得编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因DNA的步骤，包括一个构建含有编码人绒毛膜促性腺激素β亚基蛋白基因的质粒的步骤，包括一个利用表达质粒免疫小鼠的步骤，包括一个利用获得的分泌高效价抗hCGβ抗体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合的步骤，包括一个反复筛选得到分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的杂交瘤细胞株的步骤。

15.一种制备如权利要求14所述的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)获得编码hCGβ蛋白的基因DNA；

(2)通过酶切位点插入真核表达质粒载体中；

(3)将表达质粒通过肌肉注射方式免疫；

(4)免疫后以ELISA方法证实小鼠血清中诱导了高效价的抗hCGβ抗体后，分离得到小鼠脾细胞，与B淋巴细胞瘤进行融合，筛选永生化的分泌抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体的融合杂交瘤细胞株。

16.如权利要求15所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述的小鼠为BALB/c小鼠。

17.如权利要求15所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述的真核表达质粒载体为TR421、或者pcDNA3、或者pVAX。

18.一种具有抗肿瘤功能的药物组合物，其特征在于：含有有效量的权利要求1所述的单克隆抗体、或者含有有效量的权利要求14所述的杂交瘤细胞株、或者含有有效量的权利要求14所述的杂交瘤细胞株和抗肿瘤药物的组合，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

19.一种检测试剂，其特征在于：含有有效量的抗人绒毛膜促性腺激素β亚基的单克隆抗体。

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