CN101426814B - 组合物和用于植物中n聚糖的人源化和最优化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于改变高等植物中的蛋白质的N糖基化模式的方法。该方法包括向植物中导入在植物中抑制α1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)和β1，2-木糖基转移酶(Xy1T)的表达的重组构建体。这些构建体抑制或压制这两种酶及其同种型的表达的用途有利地提供了具有“人源化的”N糖基化模式的内源性和异源性蛋白质的产生而不影响植物的生长和发育。提供了稳定转化的、具有该蛋白N糖基化模式的高等植物。还提供了具有大体上均一的糖基化特征谱和对于G0糖形是大体上均一的糖蛋白组合物，包括单克隆抗体组合物。

Description

组合物和用于植物中N聚糖的人源化和最优化的方法

发明领域

本发明涉及植物分子生物学领域，更特别地涉及在植物中产生重组哺乳动物蛋白质的领域。

发明背景

许多植物种一直被靶向用于制药目的的哺乳动物蛋白质的“分子农业(molecular farming)”。这些植物表达系统提供了低成本的生物学活性哺乳动物蛋白质的生产并且易于顺从地进行快速和经济的扩大生产(Ma等人(2003)Nat.Rev.Genet.4：794-805；Raskin等人(2002)TrendsBio technol.20：522-531)。大量的哺乳动物和植物蛋白质需要翻译后加工以获得正确地折叠、装配和功能。在这些修饰当中，植物和哺乳动物之间糖基化模式的不同对植物表达系统产生高质量的用于药物用途的重组哺乳动物蛋白质的可行性提出了挑战。

当肽迁移通过内质网(ER)和高尔基体亚细胞区室时，糖残基链或聚糖附着至其上，最终导致糖蛋白的形成。糖链和肽之间的连接通过仅与4种蛋白质氨基酸：天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和羟赖氨酸中的一种形成化学键而发生。基于该连接模式，糖蛋白中的两种基本类型的糖残基链被识别：N-糖苷-连接的糖链(也称为N连接聚糖或N聚糖)，其结合肽上的天冬酰胺残基；和O-糖苷连接的糖链，其结合肽上的丝氨酸、苏氨酸和羟基赖氨酸残基。

N糖苷连接的糖链，或N聚糖，具有不同的结构(参见，例如，Takahashi，ed.(1989)Biochemical Experimentation Method23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(GakujutsuShuppan Center)，但共有共同的寡甘露糖苷(oligomannosidic)核心(参见图29A)。导致N聚糖的形成的糖基化途径中的初始步骤在植物和动物中是保守的。然而，参与复杂的N聚糖的形成的最后的步骤不同(Lerouge等人(1998)Plant Mo.Biol.38：31-48；Steinkellner和Strasser(2003)Ann.Plan tRev.9：181-192)。植物产生具有复杂N聚糖(所述聚糖具有携带2个N乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基的核心)的糖蛋白，所述核心与哺乳动物中观察到的相似。然而，在植物的糖蛋白中，该核心由β1，2-连接的木糖残基(核心木糖)(所述残基在人中不发生)、Lewis^a表位和α1，3-连接的岩藻糖(核心α[1，3]-岩藻糖)而非哺乳动物中的α1，6-连接的核心岩藻糖取代(关于综述，参见，例如，Lerouge等人(1998)Plant Mol.Biol.38：31-48)(也参见图29B)。α(1，3)-岩藻糖和β(1，2)-木糖残基至少部分地负责植物糖蛋白在哺乳动物中的免疫原性(参见，例如，Ree等人(2000)J.Biol.Chem.15：11451-11458；Bardor等人(2003)Glycobiol.13：427-434；Garcia-Casado等人(1996)Glycobiol.6：471-477)。因此，从在植物中重组产生的哺乳动物糖蛋白除去这些潜在的变应原糖残基可克服关于这些蛋白用作用于人的治疗的药物的忧虑。

许多重组产生的糖蛋白目前用作治疗剂或处于临床研究中。实例包括干扰素(IFNs)、红细胞生成素(EPO)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、抗凝血酶、粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和治疗性单克隆抗体(mABs)。糖蛋白的N聚糖结构的寡糖组分可影响它们的治疗功效以及它们的物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、药物动力学、与免疫系统的相互作用以及特定的生物学活性。参见，例如，Jenkins等人(1996)Nature Biotechnol.14：975-981。

需要改变植物表达系统中的糖基化模式，特别地抑制植物特异性的真核细胞核心结构的糖基化，有利地产生具有人源化糖基化模式的重组哺乳动物蛋白的方法。

发明概述

提供用于改变高等植物中蛋白质的N糖基化模式的方法。方法包括用至少一个重组核苷酸构建体稳定地转化植物，所述构建体提供对α1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)和β1，2-木糖基转移酶(XylT)在植物中的表达的抑制。这些构建体用于抑制或压制这两个酶的一个或两个以及同种型(isoform)的表达的用途有利地产生内源和异源的具有“人源化的”N糖基化模式的蛋白质而不影响植物的生长和发育。提供稳定转化的具有该蛋白质N糖基化模式的高等植物。在一些实施方案中，植物是作为双子叶植物的成员例如豌豆、苜蓿和烟草的作物植物；其他实施方案中，植物是作为单子叶植物例如水稻或玉米的作物植物。在其他实施方案中，植物是浮萍(Lemnaceae)科的成员例如浮萍属的某一种(Lemna sp)。

本发明的转基因植物具有产生具有N糖基化模式的重组哺乳动物蛋白质的能力，所述糖基化模式与哺乳动物宿主的糖基化模式更相似。因此，在一些实施方案，重组产生的哺乳动物蛋白质是包含复杂的N聚糖(所述聚糖具有减少的植物特异性α(1，3)-岩藻糖和β(1，2)-木糖残基的附着)的糖蛋白。在其他实施方案中，这些重组产生的糖蛋白包含不含这些植物特异性残基的复杂N聚糖。在其他实施方案中，这些重组产生的糖蛋白具有作为附着至糖蛋白内的天冬酰胺糖基化位点的单个聚糖种类的GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。

在一些实施方案中，重组产生的糖蛋白是单克隆抗体。通过该方式，本发明提供了能够产生特异性结合目的靶蛋白的聚糖最优化的单克隆抗体(包括具有增加的效应子功能的单克隆抗体)的转基因植物。因此，在一些实施方案中，重组产生的聚糖最优化的单克隆抗体包含具有减少的α(1，3)-连接的岩藻糖残基的附着的复杂N聚糖，从则增加了这些抗体的ADCC活性。在一些实施方案中，重组产生的单克隆抗体包含不含这些植物特异性岩藻糖残基的复杂的N连接的聚糖。通过该方式，本发明提供了单克隆抗体组合物的产生，其中至少90％或更多的完整抗体由单个糖形(glycoform)，更特别地G0糖形表示。因此，在本发明的一些实施方案中，重组产生的单克隆抗体具有增加的效应子功能，其中ADCC活性增加和/或ADCC/CDC活性的比率增加。在这些实施方案的一些实施方案中，重组产生的单克隆抗体具有减少的CDC活性，这可有利地减少在施用后与CDC激活相关的不利副作用的潜能。这些聚糖最优化的单克隆抗体有利地可用于改变目前的给药途径和目前的治疗方案，因为它们的增加的效应子功能意味着它们能够以更低的浓度和更低的频率给药，从而减少了抗体毒性和/或抗体耐受性的发生的潜能。此外，它们的提高的效应子功能产生用于治疗临床适应症的新方法，所述适应症之前已对使用在其他重组宿主系统中产生的相应的单克隆抗体的治疗产生了抗性或不显疗效。

提供了用于实施本发明的方法的组合物。组合物包含新的分离的编码浮萍α1，3-岩藻糖基转移酶和β1，2-木糖基转移酶及其变体和片段的多核苷酸和多肽。还提供了靶向这两种蛋白质的表达或其变体的表达的重组核苷酸构建体，同样提供了包含这些重组构建体的植物细胞、植物组织、植物和种子。

附图概述

图1显示浮萍(Lemna minor)α1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)的DNA(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2中所示的编码序列)和氨基酸(SEQIDNO：3)序列。编码序列以粗体显示。由单下划线(-)指示的核苷酸相应于设计用于抑制FucT的表达的RNAi表达盒内的FucT正向片段(参见图5)；由双下划线(＝)指示的核苷酸相应于RNAi表达盒内的间隔区序列。RNAi表达盒的FucT反向片段是此处显示的FucT正向片段的反义片段。

图2显示SEQ ID NO：3的浮萍FucT与来自其他高等植物的α1，3-岩藻糖基转移酶的比对。

图3显示了浮萍β1，2-木糖基转移酶(XylT)同种型#1的DNA(SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5中所示的编码序列)序列和编码的氨基酸(SEQ ID NO：6)序列。由单下划线(-)指示的核苷酸相应于设计用于抑制XylT的表达的RNAi表达盒内的XylT正向片段(参见图6)；由双下划线(＝)指示的核苷酸相应于该RNAi表达盒内的间隔区序列。RNAi表达盒的XylT反向片段是此处显示的XylT正向片段的反义片段。

图4显示SEQ ID NO：6的浮萍XylT与来自其他高等植物的β1，2-木糖基转移酶的比对。

图5显示一个用于设计浮萍FucT的单基因RNAi敲除的策略。

图6显示用于设计基于XylT同种型#1的DNA序列的浮萍XylT的单基因RNAi敲除的一个策略。

图7显示用于设计浮萍FucT和XylT的双基因RNAi敲除的一个策略，其中RNAi敲除的XylT部分基于XylT同种型#1的DNA序列。

图8显示包含设计用于浮萍FucT的单基因RNAi敲除的RNAi表达盒的Fuc02构建体。FucT抑制序列(由FucT正向和FucT反向箭头指示的；参见图5)的表达由有效连接的表达控制元件(表示为AocsAocsAocsAmasPmas)驱动，所述表达控制元件包含来源于与来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)甘露碱合酶基因(AmasPmas)的启动子有效连接的来源于根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的3个上游激活序列(Aocs)。RbcS前导序列，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基前导序列；ADH1，玉米醇脱氢酶1基因的内含子；nos-ter，根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子序列。

图9显示包含设计用于浮萍XylT的单基因RNAi敲除的RNAi表达盒的Xy102构建体。XylT抑制序列(由XylT正向和XylT反向箭头指示；参见图6)的表达由有效连接的AocsAocsAocsAmasPmas表达控制元件驱动。RbcS前导序列，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基前导序列；ADH1，玉米醇脱氢酶1基因的内含子；nos-ter，根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子序列。

图10显示包含设计用于浮萍FucT/XylT的双基因RNAi敲除的嵌合RNAi表达盒的XF02构建体。发夹结构RNA表示为嵌合序列(嵌合发夹结构RNA)，其中两个基因的片段融合在一起且表达为一个转录物。FucT/XylT抑制序列(由FucT和XylT的正向箭头以及XylT和FucT的反向前头指示；参见图7)的表达由有效连接的AocsAocsAocsAmasPmas表达控制元件驱动。RbcS前导序列，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基前导序列；ADH1，玉米醇脱氢酶1基因的内含子；nos-ter，根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子序列。

图11显示包含设计用于浮萍FucT/XylT的双基因RNAi敲除的RNAi表达盒的XF03构建体。表达盒表达2个RNAi发夹结构，一个靶向FucT的表达，另一个靶向XylT的表达。FucT抑制序列(由FucT正向和FucT反向箭头指示；参见图5)的表达由有效连接的表达控制元件驱动，所述表达控制元件包含浮萍泛素(ubiquitin)启动子和5′UTR(LmUbq启动子)以及内含子(LmUbq内含子)(参见SEQ ID NO：7)。XylT抑制序列(由XylT正向和XylT反向箭头指示；参见图6)的表达由有效连接的AocsAocsAocsAmasPmas表达控制元件驱动。RbcS前导序列，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基前导序列；ADH1，玉米醇脱氢酶1基因的内含子；nos-ter，根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子序列。

图12显示提供IgG1单克隆抗体(此处称为mAbI)以及浮萍FucT和XylT的双基因敲除的共表达的mAbI04构建体，其中表达靶向FucT和XylT的表达的嵌合发夹RNA。FucT/XylT抑制序列(由FucT和XylT的正向箭头及XylT和FucT的反向箭头指示的；参见图7)的表达由有效连接的表达控制元件驱动，所述表达控制元件包含紫萍(Spirodellapolyrrhiza)泛素启动子和5′UTR(SpUbq启动子)以及内含子(SpUbq内含子)(参见SEQ ID NO：8)。IgG1轻链的表达由有效连接的表达控制元件驱动，所述表达控制元件包含浮萍泛素启动子和5′UTR(LmUbq启动子)以及内含子(LmUbq内含子)。IgG1重链的表达由有效连接的AocsAocsAocsAmasPmas表达控制元件驱动。RbcS前导序列，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基前导序列；ADH1，玉米醇脱氢酶1基因的内含子；nos-ter，根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子序列。

图13显示提供mAbI以及浮萍FucT和XylT的双敲除的共表达的mAbI05构建体，其中表达2个发夹结构RNA，一个靶向FucT的表达，另一个靶向XylT的表达。FucT抑制序列(由FucT的正向和FucT的反向箭头指示；参见图5)的表达由有效连接的表达控制元件驱动，所述表达控制元件包含紫萍泛素启动子和5′UTR(SpUbq启动子)以及内含子(SpUbq内含子)。XylT抑制序列(由XylT的正向和XylT的反向箭头指示；参见图6)的表达由有效连接的表达控制元件驱动，所述表达控制元件包含稀脉萍(Lemna aequinoctialis)泛素启动子和5′UTR(LaUbq启动子)以及内含子(LaUbq内含子)(参见SEQ ID NO：9)。IgG1轻链的表达由有效连接的表达控制元件驱动，所述表达控制元件包含浮萍泛素启动子和5′UTR(LmUbq启动子)以及内含子(LmUbq内含子)。IgG1重链的表达由有效连接的AocsAocsAocsAmasPmas表达控制元件驱动。RbcS前导序列，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基前导序列；ADH1，玉米醇脱氢酶1基因的内含子；nos-ter，根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子序列。

图14显示提供mAbI的表达的mAbI01构建体，其中不抑制FucT和XylT的表达。IgG1轻链和IgG1重链的表达独立地由有效连接的AocsAocsAocsAmasPmas表达控制元件驱动。RbcS前导序列，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基前导序列；ADH1，玉米醇脱氢酶1基因的内含子；nos-ter，根癌农杆菌胭脂碱合成酶(nos)终止子序列。mAbI01称为“野生型”mAbI01构建体，因为表达的mAbI展示野生型浮萍的糖基化特征。

图15和16显示包含图10的XF02构建体的转基因RNAi浮萍植物系的初步筛选数据。

图17显示包含图12的mAbI04构建体和图13的mAbI05构建体的转基因RNAi浮萍植物系的初步筛选的数据。

图18显示衍生的野生型浮萍mAbN聚糖的结构和分子量。“GnGn”表示GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N聚糖种类，也称为G0N聚糖种类“GnGnX”表示具有附着的植物特异性β(1，2)-木糖残基的GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N聚糖种类。“GnGnXF”表示具有附着的植物特异性β(1，2)木糖残基和植物特异性α(1，3)-岩藻糖残基的GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂N聚糖种类。

图19显示在浮萍中提供mAbI单克隆IgG1抗体的表达而无浮萍FucT和XylT的RNAi抑制的野生型mAbI01构建体(示于图15)，其产生具有3个主要N聚糖种类的N糖基化特征，包括具有β1，2-连接的木糖的一个种类和具有β1，2-连接的木糖以及核心α1，3-连接的岩藻糖残基的一个种类；使用液相色谱质谱测定法(liquidchromatography mass spectrometry)(LC-MS)(图20)和MALDI(图21)分析验证该特征。

图22显示在包含mAbI01构建体(无FucT或XylT的抑制)的野生型浮萍系中和和在两个包含图12的mAbI04构建体(提供mAbI以及靶向浮萍FucT和XlT的嵌合RNAi构建体的共表达)的转基因浮萍系中产生的mAbI的不同N聚糖种类的相对量的概述。注意无附着的β1，2-连接的木糖或核心α1，3-连接的岩藻糖残基的GnGn(即，G0)聚糖种类的丰富(enrichment)，和不存在具有β1，2-连接的木糖或具有β1，2-连接的木糖和核心α1，3-连接的岩藻糖残基的种类。“MGn”表示N聚糖的前体，其中三甘露糖核心结构Man₃GlcNAc₂具有附着至1，6甘露糖臂的1个N乙酰葡糖胺。这些N聚糖的前体表示样品中存在痕量的总N聚糖。使用质谱测定法(LC-MS)(图23)和MALDI(图24)分析验证该特征。

图25显示在包含mAbI01构建体的野生型浮萍(系20)中产生的mAbI组合物的完整的质量分析(intact mass analysis)。当在浮萍中不抑制XylT和FucT的表达时，重组产生的mAbI组合物是异源的，包含至少9个不同的糖形，G0XF³糖形是存在的占主体的种类。注意非常小的峰代表G0糖形。

图26显示在包含图12的mAbI04构建体的转基因浮萍(系15)中产生的mAbI组合物的完整的质量分析。当在浮萍中使用该嵌合RNAi构建体抑制XylT和FucT表达时，完整的mAbI组合物对于G0N聚糖而言大体上是均质的，只有痕量的前体N聚糖存在(由GnM和MGn前体聚糖种类表示)。此外，mAbI组合物对于G0糖形而言大体上是均质的，其中两个糖基化位点都被G0N聚糖种类占据，3个小峰反映痕量的前体糖形(一个峰显示具有Fc区域的mAbI，其中一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖，另一条重链的C_H2结构域未被糖基化；另一个峰显示具有Fc区域的mAbI，其中一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖，另一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的GnM或MGn前体聚糖；另一个峰显示具有Fc区域的mAbI，其中各C_H2结构域上的Asn297糖基化位点具有附着的G0聚糖种类，第三G0聚糖附着至mAbI结构内的额外的糖基化位点)。

图27显示在包含图13的mAbI05构建体的转基因浮萍(系72)中产生的mAbI组合物的完整的质量分析。当在浮萍中使用该构建体抑制XylT和FucT表达时，完整的mAbI组合物对于G0N聚糖而言大体上是均质的，只存在痕量的前体N聚糖种类(由GnM和MGn前体聚糖种类表示)。此外，mAbI组合物对于G0糖形而言大体上是均质的(至少90％)，相同的3个小峰反映了使用mAbI04构建体获得的前体糖形。

图28概述了用于靶向单独的FucT和XylT基因的表达的两种可能的设计。

图29A显示植物和动物中产生的糖蛋白的复杂N聚糖的共同的寡甘露糖苷核心结构。在哺乳动物中，核心结构可包含其中岩藻糖的1-位点通过α键在还原性末端与N-乙酰葡萄糖胺的6-位点连接的岩藻糖残基(即，α(1，6)-连接的岩藻糖)。图29B显示对这些N聚糖的植物特异性修饰。哺乳动物R基团可以是下列的一个：(a)R＝GlcNAc β(1，2)；(b)R＝Gal β(1，4)-GlcNAc β(1，2)；(c)R＝NeuAc α(2，3)-Galβ(1，4)-GlcNAc β(1，2)；(d)R＝NeuGc α(2，3)-Gal β(1，4)-GlcNAc β(1，2)；和(e)R＝Galα(1，3)-Galβ(1，4)-GlcNAc β(1，2)。植物的R基团可以是下列中的一个：(a)R＝空；(b)R＝GlcNAc β(1，2)；

缩写：Man，甘露糖；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺；Xyl，木糖；Fuc，岩藻糖；Gal，半乳糖；NeuAc(神经氨酸(唾液酸)；*，结合天冬酰胺的糖链的还原末端。

图30显示本发明的说明书和权利要求中提及的糖蛋白的N连接的聚糖G0、G0X和G0XF³种类，以及此处所使用的可供替换的术语。

图31显示了浮萍β1，2-木糖基转移酶(XylT)同种型#2的部分cDNA(SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20中所示的编码序列)序列，和由其编码的部分氨基酸(SEQ ID NO：21)序列。由单下划线(-)指示的核苷酸相应于设计用于抑制XylT的表达的RNAi表达盒内的XylT的正向片段(参见图33)；由双下划线(＝)指示的核苷酸相应于该RNAi表达盒内的间隔区序列。RNAi表达盒的XylT反向片段是此处显示的XylT的正向片段的反义片段。

图32显示SEQ ID NO：6的浮萍XylT同种型#1与SEQ ID NO：21的浮萍部分长度的XylT同种型#2的比对。

图33显示用于设计基于XylT同种型#2的部分DNA序列的浮萍XylT的单基因RNAi敲除的一个策略。

图34显示用于设计浮萍FucT和XylT的双基因RNAi敲除的一个策略，其中RNAi敲除的XylT部分基于XylT同种型#2的部分DNA序列。

图35显示CHO来源的和SP2/0来源的针对新分离的人NK细胞上的FcγRIIIa的mAbI产物的受体结合活性。

图36显示针对从供体1收集的新分离的人NK细胞上的FcγRIIIa的野生型浮萍来源的mAbI产物和转基因浮萍来源的mAbI产物的受体结合活性。

图37显示针对从供体2和3收集的新分离的人NK细胞上的FcγRIIIa的野生型浮萍来源的mAbI产物和转基因浮萍来源的mAbI产物的受体结合活性。

图38显示针对小鼠FcγRIV的Sp2/0来源的mAbI产物、野生型浮萍来源的mAbI产物和转基因浮萍来源的mAbI产物的受体结合活性。

图39显示用于浮萍中FucT和XylT活性的RNAi沉默的MDXA04二元表达载体的图解。阴影线标示的区域显示完全人mAbIκ抗体MDX-060的重链(H)和轻链(L)可变区基因序列以及设计用于靶向编码FucT和XylT的内源性浮萍基因的沉默的嵌合发夹结构RNA(RNAi)。启动子：P1、P2和P3；终止子：T；选择标记：SM；左边界：LB；右边界，RB。用于在野生型浮萍中表达MDX-060mAb的MDXA01表达载体不包含发夹结构RNA区域。

图40显示浮萍野生型和MDX-060LEX^0ptRNAi系中的糖基转移酶活性。在包含GDP-Fuc、UDP-Xyl和GnGn-dabsyl-肽受体的反应缓冲液存在的情况下温育来自野生型(WT)和MDX-060LEX^OptRNAi(标示出系成员)的微粒体膜。通过正反射型模式MALDI-TOFMS(positivereflectron mode MALDI-TOF MS)测量相应于由来自各系的微粒体合成的岩藻糖基化(fucosylated)(白色条块)或木糖基化(xylosylated)(黑色条块)产物的质量峰，将质量峰按百分数对WT阳性对照进行标准化。煮沸的野生型膜(Boiled wild Type，BWT)表示背景离子计数。

图41显示植物提取物和蛋白A或来自MDX-060LEX^Opt的羟基磷灰石纯化的样品分别在非还性条件(图41A)和还原性(图41B)条件下的SDS-PAGE。从CHO细胞系(MDX-060CHO)纯化的MAb用作阳性对照。在凝胶上包括Mark12分子量标记。用胶体蓝(Colloidal Blue)对凝胶进行染色。

图42显示获自2-AA标记的从CHO(MDX-060CHO)、野生型浮萍(MDX-060LEX)或用XylT/FucTRNAi构建体转化的浮萍(MDX-060LEX^Opt)中表达的MDX-060mAb释放的N聚糖的阴性、反射型模式MALDI-TOF质谱分析的谱。通过相应的质量([M-H]^-)鉴定明显的峰。*表示matrix artefact的位置。

图43显示获自2-AA标记的从CHO(MDX-060CHO)、野生型浮萍(MDX-060LEX)或用XylT/FucTRNAi构建体转化的浮萍(MDX-060LEX^Opt)中表达的MDX-060mAb释放的N聚糖的NP-HPLC-QTOF MS分析的谱。通过正相色谱法分离2-AA标记的N聚糖并通过荧光检测。通过在线阴性模式QTOF MS表征来自各样品(标记为a-i)的最丰富的峰，显示它们的相应的QTOF质谱([M-2H]^2-)。

图44显示通过结合L540细胞上表达的CD30的MDX-060CHO、LEX或糖最优化的LEX^OptmAb的流式细胞检测分析测量的MDX-060mAb的体外活性。用浓度不断增加的本说明书下面的实施例6中概述的指定的抗体温育L540细胞。将几何平均荧光强度(GMFI)对所使用的mAb的不同浓度作图。■：MDX-060CHO；▲：MDX-060LEX；

MDX-060LEX^Opt。

图45显示糖最优化的mAb和野生型mAb与两种不同的人FcRγIIIa同种异型(Val¹⁵⁸或Phe¹⁵⁸)的平衡结合。作为FcRγIIIa的函数的结合信号拟合到单位点结合模式(one-site binding model)。■：MDX-060CHO；▲：MDX-060LEX；

MDX-060LEX^Opt。

图46显示来源于CHO、LEX(野生型浮萍糖基化)或LEX^Opt(RNAi转基因浮萍)的MDX-060mAb的ADCC活性。在浓度不断增加的指定的抗体存在的情况下，以50：1的效应子：靶比例将来自FcγRIIIaPhe¹⁵⁸纯合子供体和FcγRIIIaPhe/Val¹⁵⁸杂合子供体的人效应细胞与BATDA标记的L540细胞一起温育。将各mAb浓度上的特定百分数裂解作图。不识别L540细胞上的抗原的人mAbI在所有实验中用作同型(isotype)对照。使用GraphPad Prism3.0软件计算EC₅₀值(μg/mL)、结合常数和最大百分比裂解。■：MDX-060CHO；▲：MDX-060LEX；

MDX-060LEX^Opt。

图47显示在包含MDXA01构建体的野生型浮萍中产生的MDX-060LEX mAb组合物的完整的质量分析。当在浮萍中不抑制XylT和FucT表达时，重组产生的MDX-060LEX mAb组合物包含至少7种不同的糖形，G0XF³糖形为存在的占主体的种类。注意不存在代表G0糖形的峰。

图48显示在包含MDXA01构建体的野生型浮萍中产生的MDX-060LEX mAb的重链的聚糖质量分析。当在浮萍中不抑制XylT和FucT表达时，存在的占主体的N聚糖是G0XF³，额外的主峰反映G0X种类。注意G0聚糖种类的少量存在。

图49显示在包含MDXA04构建体的转基因浮萍中产生的MDX-060LEX^OptmAb组合物的完整的质量分析。当在浮萍中抑制XylT和FucT表达时，完整的mAb组合物只包含G0N聚糖。此外，组合物对于G0糖形(峰2)而言大体上是均质的，其中两个糖基化位点被G0N聚糖种类占据，2个小峰反映痕量的前体糖形(峰1，显示具有Fc区域的mAb，其中一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖种类，另一条重链的C_H2结构域未被糖基化；峰3，显示具有Fc区域的mAb，其中各C_H2结构域上的Asn297糖基化位点具有附着的G0聚糖种类，第三G0聚糖种类附着至mAb结构内的额外的糖基化位点)。

图50显示在包含MDXA04构建体的转基因浮萍中产生的MDX-060LEX^OptmAb的重链的聚糖质量分析。当在浮萍中抑制XylT和FucT表达时，唯一可容易检测的附着至重链的C_H2结构域的Asn297糖基化位点的N聚糖种类是G0。

图51A(MALDI分析)和51B(HPLC分析)显示在包含mAbI04RNAi构建体的转基因浮萍(系24)中产生的mAbI展示的均质的糖基化特征与在扩大生产的情况下观察到的一致。该糖基化特征在通过克隆扩增的转基因系的连续保持的8个月时间中是稳定的。

图52显示使用图12的嵌合RNAim AbI04构建体抑制FucT和XylT的表达导致具有与重组糖蛋白中观察到的糖基化模式一致的均质的糖基化模式的内源性糖蛋白。关于该图，用星号指明附着至三甘露糖核心结构的β1，2-连接的木糖残基。

图53显示下面的实施例6中描述的复杂N聚糖的结构。M＝甘露糖；Gn＝N-乙酰葡糖胺；A＝半乳糖；X＝木糖；F＝岩藻糖。

发明详述

现将在下文中通过参考附图详细地描述本发明，在所述附图中显示了一些但非所有本发明的实施方案。事实上，可以以许多不同的形式体现这些发明，这些发明不应当解释为限定于此处所示的实施方案；相反，提供这些实施方案以使本公开内容将满足可应用法律要求。相同的数字在整个说明书中表示相同的元素。

此处所示的本发明的许多改变和其他实施方案将使本领域技术人员记住这些发明适合具有前述描述和相关附图中所示的教导的益处。因此，要理解本发明不限定于公开的特定的实施方案以及改变和其他实施方案意欲包括在所附权利要求的范围之内。尽管此处使用特定的术语，但它们只以一般的和描述性的意义使用而不是为了限定。

本发明提供了用于改变植物(特别是用作目的重组蛋白的表达系统的植物)中产生的同源和异源多肽的N糖基化模式的组合物和方法。方法包括使用核苷酸构建体，所述构建体包含一种或多种能够抑制α1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)和β1，2-木糖基转移酶(XylT)在植物中表达的序列。还提供了用于实施本发明的方法的组合物和包含具有基本上同源的糖基化特征的糖蛋白(包括具有提高的效应子作用的聚糖最优化的单克隆抗体)的组合物。

定义：

“多肽”是指任何单体或多聚体蛋白或肽。

“生物活性多肽”是指具有进行在生物学背景中通常归因于多肽的一种或多种生物学功能或成套的活性的能力多肽。本领域技术人员将理解，术语“生物活性”包括其中与天然蛋白质相比生物活性性被改变(例如，被抑制或增强)的多肽，只要蛋白质具有足够的目的活性以用于工业或化学方法或用作治疗剂、疫苗或诊断剂。可通过本领域内可获得的任何方法确定生物活性。例如，可通过许多方法中的任何方法确定蛋白质的干扰素家族成员的生物活性，包括它们与干扰素特异性抗体的相互作用、它们增加对病毒感染的抗性或它们调节受干扰素调控的基因靶的转录的能力。通过相似的方式，可通过许多方法中的任何方法，例如使用用于抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的测定法确定单克隆抗体的生物活性，所述方法包括但不限于，用于测量结合特异性和效应子作用的测定法。

“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列的细胞。尽管可将本发明的核酸序列和其片段及变体导入任何目的细胞，但特定目的的细胞是植物宿主细胞。在一些实施方案中，植物宿主细胞是用作用于表达重组蛋白的植物的细胞，例如用于产生在下面提到的目的重组哺乳动物蛋白质的植物表达系统。

“目的异源多肽”意指不由宿主细胞天然表达的多肽。相反地，“同源多肽”意指在宿主的细胞内天然产生的多肽。经历翻译后N糖基化的异源和同源多肽此处称为异源或同源糖蛋白。根据本发明的方法，在植物的细胞内改变异源和同源糖蛋白的N糖基化模式以使这些糖蛋白具有与使用哺乳动物宿主观察到的糖基化模式更相似的N糖基化模式。

示例性目的异源多肽序列和异源核苷酸序列包括，但不限于，编码哺乳动物多肽例如胰岛素、生长激素、α-干扰素、β-干扰素、β-葡糖脑苷脂酶、β-葡萄糖醛酸酶(glucoronidase)、视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein)、p53蛋白、制管张素、瘦素、红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、纤维蛋白溶酶原、组织纤溶酶原激活物、血液凝血因子例如因子VII、因子VIII、因子IX和激活蛋白C、α1-抗胰蛋白酶、单克隆抗体(mAbs)、Fab片段、单链抗体、细胞因子、受体、激素、人疫苗、动物疫苗、肽和血清白蛋白的序列。

为了本发明的目的，术语“N聚糖”、“N-连接的聚糖”和“聚糖”可互换使用，是指N连接的寡糖，例如通过与蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基所附着的寡糖。糖蛋白上发现的主要的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NeuAc))。糖基的加工在ER的内腔中伴随翻译发生且在高尔基体中继续进行以产生N连接的糖蛋白。

复杂N聚糖的“寡甘露糖苷核心结构”或“三甘露糖核心结构”示于图29A中，其中核心包含附着至糖蛋白的天冬酰胺残基的3个甘露糖(Man)和2个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)单糖残基。天冬酰胺残基通常在保守的肽序列Asn-Xxx-Thr或Asn-Xxx-Ser内，其中Xxx是除了脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸外的任何残基。随后的糖基化步骤产生最终的复杂的N聚糖结构。三甘露糖核心结构此处表示为“Man₃GlcNAc₂”。

附着至糖蛋白的N聚糖在包含加至三甘露糖核心结构的外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(天线)的数目方面不同。通常根据它们的分支组成(例如，复杂、高甘露糖或杂交)对N聚糖分类。“复杂”类型的N聚糖通常具有至少一个附着至1，3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个附着至“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂的GlcNAc。当1个GlcNAc附着至每一个甘露糖臂，N连接的聚糖的种类此处表示为“GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂”或“GnGn”。当只有1个GlcNac被附着，N聚糖种类此处表示为“GlcNAc₁Man₃GlcNAc₂”，其中GlcNac附着至1，3甘露糖臂(此处表示为“MGn”)或1，6甘露糖臂(此处表示为“GnM”)(参见图30)。复杂的N聚糖还可具有任选地用唾液酸或衍生物(例如，“NeuAc”，其中“Neu”表示神经氨酸，“Ac”表示乙酰基)修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(″GalNAc″)糖残基。当半乳糖残基附着至各甘露糖臂上的每一个GlcNAc时，N连接的聚糖的种类此处表示为“Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂”。复杂的N聚糖还可具有包含“二等分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复杂的N聚糖还可在“三甘露糖核心”上具有多个天线，通常称为“多个天线聚糖(multiple antennary glycans)”。“高甘露糖”类型的N聚糖具有5个或更多个甘露糖残基。“杂交”N聚糖在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端上具有至少一个GlcNAc和在三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上具有0个或多个甘露糖。

术语“G0聚糖”和“G0聚糖结构”和“G0聚糖种类”可互换使用且欲意表示具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂结构的复杂的N连接的聚糖，其中不存在末端唾液酸(NeuAcs)或末端半乳糖(Gal)糖残基。如果G0聚糖包含附着至三甘露糖核心结构的岩藻糖(“Fuc”)残基，那么其在此处称为“G0F³聚糖”(具有植物特异性α1，3-连接的岩藻糖残基)或“G0F⁶聚糖”(具有哺乳动物的α1，6-连接的岩藻糖残基)。在植物中，包含附着至三甘露糖核心结构的植物特异性β1，2-连接的木糖残基的G0聚糖此处称为“G0X聚糖”，包含附着至三甘露糖核心结构的植物特异性β1，2-连接的木糖残基和植物特异性α1，3-连接的岩藻糖残基的G0聚糖此处称为“G0XF³聚糖”。

术语“G1聚糖”和“G1聚糖结构”和“G1聚糖种类”可互换使用且意欲表示具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂结构的复杂的N连接的聚糖，其中一个末端半乳糖(Gal)残基附着至1，3甘露糖或1，6甘露糖臂，且不存在末端唾液酸。术语“G2聚糖”和“G2聚糖结构”和“G2聚糖种类”可互换使用且意欲表示具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂结构的复杂的N连接的聚糖，其中末端半乳糖(Gal)残基附着至1，3甘露糖臂和1，6甘露糖臂，且不存在末端唾液酸。

此处使用的“糖形”是指包含特定碳水化合物结构的糖蛋白。因此，例如，“G0糖形”是指只包含附着至其糖基化位点的G0聚糖种类的糖蛋白。公认地，具有多个糖基化位点的糖蛋白可具有附着至每一个糖基化位点的相同聚糖种类，或可具有附着至不同糖基化位点的不同聚糖种类。这样，聚糖附着的不同模式产生不同糖形的糖蛋白。

术语“糖基化特征谱”欲意表示通过酶促或化学作用从糖蛋白组合物或糖蛋白产品释放的，然后就它们的碳水化合物结构使用例如LC-HPLC或MALDI-TOF MS等进行分析产生的代表性N聚糖种类的特征“指纹”。参见，例如，the review in Current Analytical Chemistry，第1卷，No.1(2005)，pp.28-57；此处通过引用其全文将其纳入本文。

术语“大体上均一的”、“大体上一致的”和“大体上均质的”在关于糖蛋白组合物或糖蛋白产物的糖基化特征的背景中可互换使用且意欲表示糖基化特征，其中至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的总的特征内的N聚糖种类由一个希望的N聚糖种类代表，痕量的前体N聚糖种类出现在特征谱中。“痕量”意指存在于糖基化特征谱中的任何给定的前体N聚糖种类以低于5％，优选低于4％，低于3％，低于2％，低于1％和甚至低于0.5％或甚至低于0.1％的特征谱中出现的N聚糖种类的总量存在。“前体”N聚糖种类意指未被完全加工的N聚糖种类。以痕量存在于本发明的糖蛋白组合物或糖蛋白产品中，从而出现在其糖基化特征谱中的前体N聚糖种类的实例是上述Man₃GlcNAc₂、MGn(GlcNaclMan₃GlcNAc₂，其中GlcNacl附着至1，3甘露糖臂)和GnM(GlcNaclMan₃GlcNAc₂其中GlcNacl附着至1，6甘露糖臂)前体N聚糖种类。

因此，例如，当糖蛋白产品或组合物内希望的N聚糖种类是G0时，该产品或组合物的大体上均一的糖基化特征谱是其中至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的出现在产品或组合物的糖基化物特征谱中的N聚糖种类的总量由G0聚糖种类代表，痕量前体N聚糖种类出现在糖基化特征谱中的特征谱。对于这样的组合物，出现在其糖基化特征谱中的代表性前体N聚糖种类是上述Man₃GlcNAc₂、MGn(GlcNacl Man₃GlcNAc₂，GlcNacl附着至1，3甘露糖臂)和GnM(GlcNaclMan₃GlcNAc₂，其中GlcNacl附着至1，6甘露糖)前体N聚糖种类。

术语“大体上均一的”、“大体上一致的”和“大体上均质的”在糖蛋白组合物或糖蛋白产品的背景下可互换使用，且意欲表示其中至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的存在于产品或组合物中的糖蛋白由一种希望的糖形代表，痕量的前体或不希望的糖形存在于组合物中的糖蛋白产品或糖蛋白组合物。“痕量”意指存在于糖蛋白产品或组合物中的任何给定的前体或不希望的糖形以少于5％、优选少于4％、少于3％、少于2％、少于1％和甚至少于0.5％或甚至少于0.1％的总糖蛋白存在。“前体”糖形意指其中至少一个糖基化位点未被糖基化，或被代表希望的N聚糖种类的前体的N聚糖种类占据的糖形，或其中一个或多个额外的糖基化位点存在(相对于希望的糖形)，且被希望的N聚糖种类或不希望的N聚糖种类占据(即，已附着至其上)的糖形。

因此，例如大体上均一的包含G0糖形的糖蛋白组合物或产品是其中至少80％、80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的存在于产品或组合物中的糖蛋白由G0糖形代表，其中所有预期的糖基化位点由G0聚糖种类占据，痕量的前体或不希望的糖形存在于组合物中的组合物或产品。在这样的组合物中，代表性前体糖形可以是其中糖基化位点未被占据的糖形，示例性不希望的糖形是具有G0聚糖和附着至其糖基化位点的G0X或G0XF³聚糖种类的混合的糖形。

术语“抗体”以广义的意义使用，包括完全组装的抗体、可结合抗原的抗体片段(例如，Fab′、F′(ab)₂、Fv、单链抗体、双抗体)以及包括前述抗体的重组肽。抗体代表由本发明的方法和组合物涉及的许多种糖蛋白中的一种。本发明还涉及抗体的衍生物。衍生物包括包含免疫球蛋白或其部分例如具有C_H2结构域的Fc区域的融合蛋白。

此处所使用的“单克隆抗体”是指从大体上均一的抗体的群体获得的抗体，即各个抗体，其包含除了可能可以以极少量存在的天然发生突变外，是相同的群体。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是大约150,000道尔顿、由2个相同的轻(L)链和2个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。各轻链通过一个共价二硫键与重链连接，然而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同型的重链之间是变化的。各重链和轻链还具有有规律地间隔的链内二硫键。各重链在一端具有可变结构域(V_H)，之后是许多恒定结构域。各轻链在一端具有可变结构域(V_L)和在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对准。特定的氨基酸残基据认为形成了轻链和重链可变结构域之间的界面。

术语“可变的”是指可变结构域的某些部分的序列在抗体之间差异很大且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性不是均匀地分布在抗体的整个可变结构域中。其集中在轻链和重链可变结构域中的称为互补性决定区(CDR)或高变区的3个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架(FR)区。天然重链和轻链的可变结构域各自包含4个FR区，它们主要采取β折叠片构型，通过3个形成连接β折叠片结构的环的CDR连接，所述环在一些情况下形成了β折叠片结构的部分。各链中的CDR通过FR区紧密相邻地保持在一起，与来自其他链的CDR一起，促成了抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人(1991)NIH PublNo.91-3242，第1卷，pages647-669)。

恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展示不同的效应子功能，例如Fc受体(FcR)结合、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的抗体的沉淀、调理作用、补体依赖性细胞毒性(CDC活性)的起始以及肥大细胞脱颗粒作用。

“抗体片段”包括完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗本片段的示例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段、双抗体、线性抗体(Zapata等人(1995)ProteinEng.8(10)：1057-1062)、单链抗体分子以及从抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生2个完全相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自具有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生了具有2个抗原结合位点且仍然能够交联接抗原的F(ab′)₂片段。

“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，该区域由紧密、非共价结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一条重链和一条轻链的可变结构域可由易曲的肽连接体共价连接，以使轻链和重链能够在类似于双链Fv种类中的结构的“二聚体”结构中结合。在该构型中，各可变结构域的3个CDR相互作用以确定V_H-V_L二聚体的表面上的抗原结合位点。综合起来，6个CDR为抗体提供了抗原结合特异性。然而，甚至单个可变结构域(或只包含3个对于抗原是特异性的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点低的亲和力结合。

Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(C_H1)。Fab片段与Fab′片段的不同在于，在包含一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸的重链C_H1结构域的羧基端加入了少数几个残基。Fab′-SH在此处是其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab′的名称。F(ab′)₂抗体片段最初产生为在它们之间具有铰链区的Fab′片段对。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

基于它们的恒定结构域的氨基酸序列，可将来年自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分配至两种不同类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。

取决于它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的种类。存在5个主要类型的人免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，这些种类中的几种可进一步分为亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。相应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同为的免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是众所周知的。不同同型具有不同效应子作用。例如，人IgG1和IgG3同型介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。

免疫球蛋白具有保守的两条重链的各链的Fc区域的N连接糖基化。因此，例如，IgG类型的免疫球蛋白具有在天冬酰胺297(Asn-297)上携带N连接的寡糖的糖基化C_H2结构域。取决于附着至这两个糖基化位点的各位点的特定N聚糖种类和取决于免疫球蛋白组合物内所述2个位点被糖基化的程度，存在免疫球蛋白的不同糖形。

参照异源多肽的表达，此处所使用的“目的核苷酸序列”是指编码希望在宿主特别是植物宿主中(例如在高等植物(包括双子叶科和单子叶科的成员)中)表达的异源多肽的任何多核苷酸序列。例如，按照本发明，可使用转化的植物宿主例如浮萍表达编码治疗性(例如，用于兽医或医学用途)或免疫原性(例如，用于接种)多肽的多核苷酸序列。

术语“多核苷酸”的用途无意将本发明限定于包括DNA的多核苷酸。本领域技术人员公认，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然发生的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还包括序列的所有形式，包括但不限于，单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。

此处所使用的术语“抑制”、“抑制作用”和“禁止”是指靶基因产物的表达或功能的任何降低，包括表达或功能的任何相对减少直至和包括靶基因产物的表达或功能的完全废除。此处所使用的术语“表达”在基因产物的背景中是指该基因产物的生物合成，包括基因产物的转录和/或翻译和/或装配。靶基因产物(即，目的基因产物)的表达或功能的抑制可以是在任何两个植物之间的比较(例如遗传改变的植物中的靶基因产物的表达或功能对相应的野生型植物中的该靶基因的表达或功能)的背景中。可选择地，靶基因产物的表达或功能的抑制可以在相同植物内的或植物间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间的比较，并包括相同植物内的或植物间的发育或时间阶段之间的比较的背景下。在转录或翻译水平上下调靶基因产物的表达，或下调靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物可用于获得靶基因产物的表达或功能的抑制。

术语“抑制性序列”包括能够在例如在转录或翻译水平上抑制靶基因产物的表达，或能够抑制靶基因产物的功能的任何多核苷酸或多肽序列。抑制性序列的实例包括，但不限于，全长多核苷酸或多肽序列、截短的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、有义核苷酸序列、反义核苷酸序列、有义或反义方向的核苷酸序列的互补序列、核苷酸序列的倒转区域、核苷酸序列的发夹结构、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列、其组合等。术语“多核苷酸序列”包括RNA、DNA、化学修饰的核酸、核苷酸类似物的序列、其组合等。

已承认，抑制性多核苷酸包括直接(即，不需要转录)或间接(即，需要转录或转录及翻译)抑制靶基因产物的表达的核苷酸序列。例如，抑制性多核苷酸可包括当导入植物细胞、组织或器官时可直接(尽管短暂地)沉默目的靶基因产物的表达的化学合成的或体外产生的小干扰RNA(siRNA)或micro RNA(miRNA)。可选择地，抑制性多核苷酸可包括编码设计用于沉默目的基因产物的表达的抑制性核苷酸分子的核苷酸序列，例如有义方向的RNA、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、发夹结构RNA(hpRNA)、包含内含子的hpRNA、催化RNA、miRNA等。在其他实施方案中，抑制性多核苷酸可包括编码mRNA的核苷酸序列，所述mRNA的翻译产生抑制目的靶基因产物的表达或功能。这样，当抑制性多核苷酸包括编码抑制性核苷酸分子或该多肽的mRNA的核苷酸序列时，编码序列与在植物细胞中驱动表达的启动子有效连接，从而使被编码的抑制性核苷酸分子或mRNA被表达。

抑制性序列此处以靶基因产物的名称命名。因此，例如，“α1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)抑制性序列”是指能够在例如转录和/或翻译水平上抑制FucT的表达，或能够抑制FucT的功能的抑制性序列。类似地，“β1，2-木糖基转移酶(XylT)抑制性序列”是指能够转录和/或翻译水平上抑制XylT的表达，或能够抑制XylT的功能的抑制性序列。当短语“能够抑制”用于多核苷酸抑制性序列的背景中时，其意指抑制性序列本身产生抑制效应；或，当抑制性序列编码抑制性核苷酸分子(例如，发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸)或编码抑制性多肽(即，抑制靶基因产物的表达或功能的多肽)时，在其转录后(例如，在编码发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸的抑制性序列的情况下)或在其转录和翻译后(在编码抑制性多肽的抑制性序列的情况下)，转录的或翻译的产物分别对靶基因产物产生了抑制效应(即，抑制靶基因产物的表达或功能)。

多核苷酸例如目的核苷酸构建体的背景中的术语“导入”意指以使多核苷酸进入植物的细胞的内部的方式给植物提供多核苷酸。当要导入一个以上多核苷酸时，可将这些多核苷酸装配为单个核苷酸构建体的部分，或装配为分开的核苷酸构建体，和可位于相同或不同的转化载体上。因此，可将这些多核苷酸在单个转化事件中、在分开的转化事件中或例如作为育种方案的部分在植物中导入目的宿主细胞。本发明的方法不依赖于用于将1个或多个多核苷酸导入植物的特定方法，只要多核苷酸进入植物的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸导入植物的方法在本领域内是已知的，包括，但不限于，瞬时转化法、稳定转化法和病毒介导的方法。

多核苷酸背景中的“瞬时转化”意指多核苷酸被导入植物且不整合入植物的基因组。

“稳定导入”或“稳定导入的”在被导入植物的多核苷酸的背景中意指被导入的多核苷酸被稳定地整合入植物基因组，从而植物稳定地转化有多核苷酸。

“稳定的转化”或“稳定地转化的”意指被导入植物的多核苷酸例如此处描述的核苷酸构建体整合入植物的基因组且能够通过其后代，更特别地通过多个连续代的后代遗传。在一些实施方案中，连续代包括营养生长(即，无性繁殖)例如使用克隆繁殖产生的后代。在其他实施方案中，连续代包括通过有性生殖产生的后代。用至少一个核苷酸构建体(所述构建本能够抑制此处描述的FucT和/或XylT的表达)“稳定地转化”的高等植物宿主是指具有整合入其基因组的核苷酸构建体且能够通过无性或有性生殖产生后代的高等植物，所述后代也包含稳定地整合入它们的基因组的抑制性核苷酸构建体，从而该后代也将展示希望的具有改变的N糖基化模式的表型，所述改变的N糖基化模式的特征在于α1，3-岩藻糖和/或β1，2-木糖残基至在其中产生的同源或异源糖蛋白的N聚糖的附着的减少。

如此处所使用的，术语“植物”包括提及完整的植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞和其后代。要理解包括例如源于之前用本发明的DNA分子转化的转基因植物或后代从而至少部分由转基因细胞构成的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、胚珠、茎、果实、叶、根、根尖等的转基因植物的部分在本发明的范围内之内。如此处所使用的，术语“植物细胞”包括但不限于种子、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝(shoot)、配子体、孢子体、花粉和小胞子的细胞。

可用于本发明的方法的植物的种类通常与易于进行转化技术的高等植物的种类一样广泛，包括单子叶的(单子叶植物)和双子叶的(双子叶植物dicot)植物。双子叶植物的实例包括但不限于豆科植物包括大豆和苜蓿、烟草、马铃薯、番茄等。单子叶植物的实例包括但不限于，玉米、水稻、燕麦、大麦、小麦、浮萍科的成员、草等。“低等植物”是指不开花(non-flowering)植物，包括厥类、问荆(horsetail)、石松、苔藓、苔类植物(liverwort)、金鱼藻、藻类，例如红藻、褐藻和绿藻、蕨类植物的配子体、孢子体等。在一些实施方案中，目的植物是植物的浮萍科的成员。

术语“浮萍”是指浮萍科的成员。该科目前如下分成5个属和38个浮萍种：浮萍属(Lemna)(稀脉萍(Lemna aequinoctialis)、L.disperma、L.ecuadoriensis、膨胀浮萍(L.gibba)、L.japonica、浮萍(L.minor)、L.miniscula、L.obscura、L.perpusilla、L.tenera、L.trisulca、L.turionifera，L.valdiviana)；紫萍属(Spirodela)(S.intermedia、紫萍、S.punctata)；芜萍属(Wolffia)(Wa.angusta、Wa.arrhiza、Wa.australina、Wa.borealis、Wa.brasiliensis、Wa.columbiana、Wa.elongata、Wa.globosa、Wa.microscopica、Wa.neglecta)；Wolfiella属(W1.caudata、W1.denticulata、W1.gladiata、W1.hyalina、W1.lingulata、W1.repunda、W1.rotunda和W1.neotropica)和Landoltia属(L.punctata)。浮萍科的任何其他属或种，如果存在，也是本发明的方面。可使用Landolt(1986)BiosystematicInvestigation on the Family of Duckweeds：The family ofLemnaceae-AMonograph Study(Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)中描述的分类学方案对浮萍种类进行分类。

此处所使用的术语“浮萍结节(duckweed nodule)”是指包含其中至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞是分化细胞的浮萍细胞的浮萍组织。“分化细胞”，如此处所使用的，是具有至少一种将其与未分化细胞或与其他组织类型中发现的细胞区分的表型特征(例如，不同的细胞形态或标记核酸或蛋白质的表达)的细胞。此处描述的浮萍结节培养物的分化细胞形成了在它们的相邻的细胞壁处融合的互连细胞的倾斜的光滑表面，已开始组织成叶原基的结节分散在整个组织中。节培养物的组织的表面具有通过胞间连丝相互连接的表皮细胞。通过克隆繁殖产生的浮萍科的成员，从而所述成员代表了通过克隆繁殖的植物。

此处所使用的“浮萍优选的密码子(Duckweed-preferred codons)是指在浮萍中具有大约17％的密码子选择的频率的密码子。

此处所使用的“Lemna优选密码子”是指在Lemna属中具有大约17％的密码子选择的频率的密码子。

此处所使用的“膨胀浮萍优选密码子”是指在膨胀浮萍中具有大约17％的密码子选择的频率的密码子，其中从密码子选择数据库(Codon Usage Database)(GenBank Release113，0；于http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi？species＝Lemna+gibba+[gbpln])获得膨胀浮萍中的密码子选择频率。

“翻译起始密码子”是指起始从目的核苷酸序列转录的mRNA的翻译的密码子。

此处所使用的“翻译起始上下文核苷酸序列(translationinitiation context nucleotide sequence)”是指紧挨着翻译起始密码子的5′的3个核苷酸的本体。

此处所使用的“分泌”是指多肽穿过宿主植物细胞的质膜和细胞壁的迁移。

此处所使用的涉及核苷酸序列的“有效连接的”是指按相互之间的功能关系放置的多个核苷酸序列。一般地，有效连接的DNA序列是连续的和，其中必要时，按读框连接2个蛋白质编码序列。

分离的多核苷酸和多肽

本发明提供了参与植物N连接的聚糖(也称为“N聚糖”)特别是浮萍(浮萍科的成员)中鉴定的α1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)和β1，2-木糖基转移酶(XylT)的进一步修饰的分离的多核苷酸和多肽以及这些多核苷酸和多肽的变体及片段。在表达这些蛋白质的植物中抑制这两种蛋白质的一种或两种或其生物性变体的表达有益地产生了具有减少的α1，3-岩藻糖和β1，2-木糖残基至糖蛋白N聚糖的附着的N糖基化模式。在一些实施方案中，此处公开的方法提供了对FucT和XylT的表达的完全抑制，从而产生了其中N连接的聚糖不含α1，3-岩藻糖和β1，2-木糖残基的植物中产生的糖蛋白的N糖基化模式。

浮萍α1-3岩藻糖基转移酶(FucT)的全长cDNA序列，包括5′-和3′-UTR，示于图1；也参见SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：2中所示的开放阅读框架)。预测的由此编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3。已鉴定了浮萍FucT基因的至少两个同种型；同种型之间的同源性为大约90％。编码的蛋白质与来自其他高等植物的其他FucT共有一定的相似性。参见图2。例如，浮萍FucT序列与图2中显示的拟南芥FucT共有大约50.1％的序列同一性。

浮萍β1-2木糖基转移酶(XylT)(同种型#1)的全长cDNA序列，包括5′-和3′-UTR，示于图3；也参见SEQ ID NO：4(SEQ ID NO：5中所示的ORF)。预测的由此编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6。已鉴定了浮萍XylT基因的至少两个同种型；同种型之间的同源性为大约90％。编码的蛋白质与来自其他高等植物的其他XylTs共有一定的相似性。参见图4。例如，浮萍XylT序列与图4中显示的拟南芥XylT共有大约56.4％的序列同一性。浮萍β1-2木糖基转移酶(XylT)(同种型#2)的部分长度的cDNA序列，包括3′-UTR，示于图31；也参见SEQID NO：19(ORF示于SEQ ID NO：20中)。预测的由此编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：21。部分长度的XylT同种型#2与全长XylT同种型#1的相应区域共有高度的序列同一性，可从图32中显示的比对看出这一点。

本发明包括分离的或大体上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质，或其生物活性部分，大体上或基本上不含通常伴随或与在其天然发生的环境中发现的多核苷酸或蛋白质相互作用的组分。因此，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质大体上不含其他细胞材料或培养基(当通过重组技术产生时)或大体上不含化学前体或其他化学物质(当化学合成时)。最优地，“分离的”多核苷酸不含在所述多核苷酸所来源的生物的基因组DNA中天然地侧翼所述多核苷酸(即，序列位于所述多核苷酸的5′和3′末端)的序列(最优地蛋白质编码序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的多核苷酸可包含少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述多核苷酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地侧翼所述多核苷酸的核苷酸序列。大体上不含细胞材料的蛋白质包括具有少于大约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的污染蛋白质的蛋白质制品。当重组产生本发明的蛋白质或其生物活性部分时，最优地培养基提供少于大约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的化学前体或非目的蛋白质化学物质。

浮萍FucT基因的编码序列示为SEQ ID NO：1的核苷酸(nt)243-1715和示为SEQ ID NO：2，编码的FucT多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3。浮萍XylT同种型#1基因的编码序列示为SEQ ID NO：4的核苷酸63-1592和示为SEQ ID NO：5，编码的XylT多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6。部分长度的浮萍XylT同种型#2基因的编码序列示为SEQ ID NO：19的核苷酸1-1276和示为SEQ ID NO：20，编码的部分长度的XylT多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：21。

特别地，本发明提供了包含编码SEQ ID NOS：3、6和21中显示的氨基酸序列的核苷酸序列的分离的多核苷酸。进一步提供了具有由此处描述的多核苷酸(例如SEQ ID NOS：1、2、4、5、19和20中所示的多核苷酸)编码的氨基酸序列的多肽和其片段及变体。还提供了包含这些核苷酸序列的互补序列的核酸分子。经验证，FucT和/或XylT基因的编码序列可在植物中表达以过量表达编码的FucT和/或XylT。然而，为了压制或抑制这些蛋白质的表达，SEQ ID NO：1、2、4、5、19和20的各自的核苷酸序列将用于设计用于抑制各自的FucT和/或XylT蛋白的表达的构建体。因此，在抑制FucT蛋白的背景中，多核苷酸是指FucT编码序列和指当表达时例如通过直接或间接的压制(如本说明书下面所提及的)来压制或抑制FucT基因的表达的多核苷酸。类似地，多核苷酸，在压制或抑制XylT蛋白的背景中，是指XylT编码序列和指当表达时例如通过直接或间接的压制(如本说明书下面所提及的)来压制或抑制XylT基因的表达的多核苷酸。

本发明还包括公开的多核苷酸和由其编码的蛋白质的片段或变体。“片段”意指FucT或XylT多核苷酸的部分或由其编码的FucT或XylT氨基酸序列的部分。多核苷酸的片段可编码保持天然蛋白质的生物活性，从而具有本说明书中其他地方提及的FucT活性或XylT活性的蛋白质片段。可选择地，用作杂交探针的多核苷酸的片段通常不编码保持生物活性的片段蛋白质。FucT或XylT多核苷酸的片段还可用于设计用于抑制FucT和/或XylT多肽的表达的抑制性序列。因此，例如，核苷酸序列的片段可在从至少大约15个核苷酸、大约20个核苷酸、大约50个核苷酸、大约100个核苷酸、大约150个核苷酸、大约200个核苷酸、大约250个核苷酸、大约300个核苷酸、大约350个核苷酸、大约400个核苷酸、大约450个核苷酸、大约500个核苷酸、大约550个核苷酸、大约600个核苷酸、大约650个核苷酸、大约700个核苷酸、大约750个核苷酸、大约800个核苷酸至编码本发明的蛋白质的全长多核苷酸的范围内变化。

编码本发明的FucT蛋白的生物活性部分的FucT多核苷酸的片段将编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、475、500个连续氨基酸，或达到存在于本发明的全长FucT蛋白中的氨基酸的总数(例如，对于SEQ ID NO：3，509个氨基酸)。编码本发明的全长XylT蛋白的生物活性部分的XylT多核苷酸的片段将编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、475个连续氨基酸，或达到存在于本发明的全长XylT蛋白中的氨基酸的总数(例如，对于SEQ ID NO：3，490个氨基酸)。编码本发明的部分长度的XylT蛋白的生物活性部分的XylT多核苷酸的片段将编码至少15、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400个连续氨基酸，或达到存在于本发明的部分长度的XylT蛋白中的氨基酸的总数(例如，对于SEQ ID NO：21，490个氨基酸)。

因此，FucT或XylT多核苷酸的片段可分别编码FucT或XylT蛋白的生物活性部分，或其可以是可用作杂交探针或PCR引物，或通过使用下面公开的方法用于设计用于抑制的抑制性序列的片段。可通过分别分离本发明的FucT或XylT多核苷酸中的一种的部分，表达FucT或XylT蛋白的部分(例如，通过体外重组表达)，和估计编码的FucT或XylT多肽的部分的活性来制备FucT或XylT蛋白的生物活性部分。作为FucT或XylT核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400或1450个连续核苷酸，或达到存在于此处公开的FucT或XylT多核苷酸的核苷酸的数目(对于SEQ ID NOS：1、2、4、5、19和20分别为1865、1473、1860、1530、1282或1275个核苷酸)。

“变体”意指大体上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的1个或多个位点上包含1个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在天然多核苷酸的1个或多个位点上包含1个或多个核苷酸的置换。如此处所使用的，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然发生的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括因为遗传密码子的简并性，编码本发明的FucT或XylT多肽中的一种的氨基酸序列的那些序列。可使用熟知的分子生物学技术例如，使用下面概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术鉴定天然发生的等位基因变体例如这些变体。变体多核苷酸还包括合成产生的多核苷酸，例如通过例如使用定向诱变产生的但仍然编码本发明的FucT或XylT蛋白的多核苷酸。通常，如通过本说明书的其他地方描述的序列比对程序和参数所确定的，本发明的特定多核苷酸的变体(例如，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20，其片段和这些序列的互补序列)具有与该特定多核苷酸至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。

还可通过由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分数序列同一性的比较来评估本发明的特定多核苷酸(即，参照多核苷酸)的变体。因此，例如，公开了编码分别与给定的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：21的FucT或XylT多肽具有百分数序列同一性的多肽的分离的多核苷酸。可使用本说明书中其他地方描述的序列比对程序和参数计算任何2个多肽之间的百分数序列同一性。当通过由它们编码的2个多肽共有的百分数序列同一性的比较评估任何给定的本发明的多核苷酸对时，2个被编码的多肽之间的百分数序列同一性是至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。

“变体”蛋白意指通过在天然蛋白质的1个或多个位点缺失或添加1个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的1个或多个位点置换1个或多个氨基酸而从天然蛋白质产生的蛋白质。本发明包括的变体蛋白是有生物活性的，即它们继续具有希望的天然蛋白质的生物活性，即，如此处所描述的在植物中将α1，3-连接的岩藻糖残基(FucT的活性)或β1，2-连接的木糖残基(XylT的活性)附着至糖蛋白的N聚糖的酶促活性。此类变体可由例如遗传多态性或人工操作产生。如通过本说明书中其他地方描述的序列比对程序和参数所确定的，本发明的天然FucT或XylT蛋白的生物活性变体将具有与天然蛋白质的氨基酸序列至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性。本发明的蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相异少至1至15个氨基酸，少至1至10个，例如6至10个，少至5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。

可以以不同的方式包括氨基酸置换、缺失、截短和插入改变本发明的蛋白质。用于此类操作的方法在本领域内是众所周知的。例如，可通过DNA中的突变制备FucT和XylT蛋白的氨基酸序列变体和片段。用于诱变和多核苷酸改变的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol154：367-382；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)和此处引用的参考资料。关于不影响本发明的蛋白质的生物活性的恰当的氨基酸置换的指导可见于Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)(通过引用纳入本文)的模型。保守置换，例如将一个氨基本与具有相似性质的另一个交换，可以是最优的。

因此，本发明的多核苷酸包括天然发生的FucT和XylT序列和突变形式。同样，本发明的蛋白质包括天然发生的FucT和XylT蛋白质以及其变体和改性形式。此类变体将继续具有希望的活性。因此，当希望表达功能性蛋白质时，表达的蛋白质将具有希望的FucT或XylT的活性，即如此处所描述的，在植物中将α1，3-连接的岩藻糖残基(FucT的活性)或β1，2-连接的木糖残基(XylT的活性)附着至糖蛋白的N聚糖的酶促活性。当目的是抑制FucT和/或XylT多肽的表达或功能时，变体多核苷酸或多肽的希望的活性是抑制各自的FucT和/或XylT多肽的表达或功能。很明显，当希望表达功能性FucT或XylT变体时，在编码变体的DNA上产生的突变一定不能把序列置于读框之外，最优地将不产生可产生二级mRNA结构的互补区域。参见，欧洲专利申请公开号75,444。

当希望功能性蛋白质时，不期望此处包括的蛋白质序列的缺失、插入和置换在蛋白质的特征方面产生根本改变。然而，当在这样做之前难以预测置换、缺失或插入的确切效应时，本领域技术人员将认识到，可通过常规筛选测定法包括在下述实验部分中用于监测FucT和XylT的活性的测定法来评估效应。

变体多核苷酸和蛋白质还包括通过诱变和重组基因方法例如DNA改组产生的序列和蛋白质。通过这样的方法，可操作1个或多个不同的FucT或XylT编码序列产生具有希望的性质的新的FucT或XylT蛋白。通过该方法，从相关的序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸的文库，所述相关的序列多核苷酸包含具有相当高的序列同一性和可进行体外或体内同源重组的序列区域。例如，通过使用该方法，可在本发明的FucT或XylT基因与其他已知的FucT或XylT基因之间分别对编码目的结构域的序列基序进行改组，从而获得编码具有提高的目的性质的蛋白质的新基因。用于该DNA改组的策略在本领域内是已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature391：288-291；和美国专利5,605,793及5,837,458。

可使用数学算法进行两个序列之间的序列比较以及百分数同一性和百分数相似性的确定。在优选实施方案中，使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：444-453的算法(该算法整合入GCG软件包(可在www.accelrys.com上获得)中的GAP程序)，使用BLOSSUM62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口重量(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度重量(length weight)确定2个氨基酸序列之间的百分数同一性。在另一个优选实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序，使用BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA89：10915)以及40、50、60、70或80的缺口重量和1、2、3、4、5或6长度重量确定2个核苷酸序列之间的百分数同一性。特别优选成套参数(和如果实施者不确定应当使用什么参数来确定分子是否在本发明的序列同一性的限制内时应当使用的参数)是使用具有60的缺口重量和3的长度重量的BLOSUM62评分矩阵。

还可使用Meyers和Miller(1989)CABIOS4：11-17的算法(该算法已整合入ALIGN程序(版本2.0))，使用PAM120重量残基表、12的缺口长度罚分(gap length penalty)和4的缺口罚分(gap penalty)确定2个氨基酸或核苷酸序列之间的百分数同一性。

2个核苷酸分子密切相关的可选的标志是2个分子在严格条件下相互杂交。严格条件是序列依赖性的且在不同的环境参数下是不同的。通常，选择比特定的序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(thermal melting point)(T_m)低大约5℃至20℃的严格条件。T_m是50％的靶序列对完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH)。可在例如Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)和Tijssen(1993)Hybridization With NucleicAcid Probes，Part I：Theory and Nucleic Acid Preparation(Laborato ry Techniques in Biochemistry and Molecular Biol ogy，Elsevier Science Ltd.，NY，NY)中找到用于核酸杂交的条件和严格性的计算。

为了本发明的目的，“严格条件”包括在其下，只有当杂交分子与靶序列之间的错配低于25％时才发生杂交的条件。“严格条件”可被分成特定的用于更精确定义的严格性水平。因此，如此处所使用的，“轻度(moderate)严格性”条件是在其下具有大于25％的序列错配的分子将不杂交的条件；“中度(medium)严格性”的条件是在其下超过15％的错配将不杂交的条件，以及“高度严格性”的条件是在其下具有超过10％的错配的序列将不杂交的条件。“非常高的严格性”的条件是在其下具有超过6％的错配的序列将不杂交的条件。

本发明的FucT和XylT多核苷酸可用作用于分离其他生物更特别地其他植物种中的相应的同源序列的探针。通过该方式，可使用方法例如PCR、杂交等基于它们对本发明的序列的同源性鉴定此类序列。参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratoryManual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)和Innis等人(1990)，PCR Protocols；AGuide to Methodsand Applications(Academic Press，New York)。本发明包括基于它们与本发明的完整的FucT或XylT多核苷酸(即，对于FucT，SEQ IDNOS：1和2；对于SEQ ID NO：6的XylT同种型#1，SEQ ID NOS：4和5；和对于SEQ ID NO：21的XylT同种型#2，SEQ ID NOS：19和20)的序列同一性的分离的多核苷酸序列或其片段和变体。

在PCR方法中，可设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，所述PCR用于扩增来自从任何目的生物提取的cDNA或基因组DNA的相应DNA序列。已知的PCR的方法包括，但不限于，使用成对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配的引物等。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域内是普遍已知的，且公开于Sambrook等人(1989)MolecularCloning：ALaboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plaiview，New York)。也参见Innis等人，eds.(1990)PCRProtocols：AGuide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCRMe thods Manua l(Academic Press，New York)。

在杂交方法中，所有或部分已知的核苷酸序列可用作探针，所述探针与存在于来自另一个目的生物的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即，cDNA或基因组文库)中的其他相应多核苷酸选择性杂交。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，和可用可检测基团例如³²P或任何其他可检测标记进行标记。可通过标记基于目的核苷酸序列例如本发明的FucT或XylT多核苷酸的合成的寡核苷酸来产生用于杂交的探针。另外可使用基于已知的核苷酸或编码的氨基酸序列中的保守的核苷酸或氨基酸残基设计简并引物。用于cDNA和基因组文库的构建以及用于制备杂交探针的方法在本领域内通常是已知的，和公开于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Labora tory Manual(第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，P lainview，New York)，通过引用合并入本文。

例如，全部或部分明确已知的FucT或XylT多核苷酸序列可用作与其他FucT或XylT核苷酸和信使RNA选择性杂交的探针。为获得在不同条件下的特异性杂交，此类探针包括作为独特的且优选长度为至少大约10个核苷酸，更优地长度为至少大约20个核苷酸的序列。该技术可用于分离来自希望的生物的其他相应的FucT或XylT核苷酸序列或用作确定FucT或XylT编码序列在生物中存在的诊断测定。杂交技术包括涂板的DNA文库的杂交筛选(噬菌斑或集落；参见，例如，Innis等人，eds.(1990)PCR Protocols：AGuide to Methods andApplications(Academic Press，New York))。

因此，除了天然的FucT和XylT多核苷酸和其片段及变体外，本发明的分离的多核苷酸还包括同源DNA序列或其变体，所述同源DNA序列是通过与获自本发明的FucT或XylT多核苷酸的完整的或部分序列或其变体杂交从其他生物鉴定和分离的DNA序列。可根据本领域内通常普遍已知的技术确定允许其他DNA序列与此处公开的DNA序列杂交的条件。例如，可在本说明书中上面指出的轻度、中度、高度或非常高的严格性的不同条件下进行此类序列的杂交。

发明方法

本发明涉及用于改变高等植物，特别是用作生产生重组蛋白(特别是制药目的的重组哺乳动物蛋白)的宿主的高等植物中的蛋白质糖基化模式的方法。方法用于产生高等植物，所述高等植物能够产生具有与哺乳动物中发现的N糖基化模式更密切相似的N糖基化模式的重组蛋白。本发明的组合物包括被稳定地转化，从而包含它们的内源的(即，同源的)和重组产生的异源性蛋白质的改变的N糖基化模式的高等植物。在一些实施方案中，高等植物是产生抗哺乳动物蛋白的单克隆抗体(mAb)的转基因植物，所述单克隆抗体与对照植物中产生的mAb相比具有增强的ADCC活性，所述对照植物还未具有经改变从而减少α1，3-岩藻糖残基至从其产生的同源性和异源性糖蛋白的N聚糖的植物特异性附着的糖基化机构(machinery)。

本发明的方法靶向对一个或两个在高等植物中参与复杂糖蛋白的产生的酶的压制(即，抑制)。特别有益的是对岩藻糖基转移酶或其的一个或多个同种型的抑制，或对木糖基转移酶或其一个或多个同种型的抑制，或对这两种蛋白两者和其一个或多个同种型的抑制。要认识到可短暂进行对岩藻糖基转移酶和/或木糖基转移酶和其一个或多个同种型的抑制。可选择地，通过稳定地抑制岩藻糖基转移酶和/或木糖基转移酶的表达，可能产生转基因高等植物，所述转基因高等植物代代(无性或有性的世代)具有产生具有与哺乳动物更特别地人中发现的N糖基化模式更密切相似的N糖基化模式的糖蛋白的能力。这有利地提供了具有减少的植物β1，2-连接的木糖残基和/或α1，3-连接的岩藻糖残基至糖蛋白的N聚糖的附着的重组哺乳动物糖蛋白的产生。

可使用本领域内已知的任何方法在植物例如双子叶或单子叶植物例如浮萍植物中进行这两种蛋白质的一种或有利地两种的表达的抑制。通过该方式，从而将包含FucT、XylT的抑制性序列或其组合的多核苷酸导入目的宿主细胞。对于瞬时表达，可以通过化学合成或以体外产生的小干扰RNA(siRNA)或micro RNA(miRNA)的形式产生FucT或XylT抑制性序列，所述抑制性序列，当导入宿主细胞时，将通过沉默这些靶基因产物的表达来直接(尽管短暂地)抑制FucT、XylT或其组合。

可选择地，如本说明书中上面所指出的，希望稳定地抑制FucT、XylT或其组合的表达。因此，在一些实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞来减少或消除本发明的FucT或XylT多肽的活性，所述表达盒表达抑制FucT或XylT或两者的表达的多核苷酸。多核苷酸可通过阻止FucT或XylT信使RNA的转录或翻译直接地，或通过编码抑制编码FucT或XylT或两者的基因的转录或翻译的多肽来间接地抑制FucT或XylT或两者的表达。用于抑制或消除植物中基因的表达在本领域内是熟知的，且任何这样的方法可用于本发明以抑制FucT或XylT或两者的表达。

因此，在一些实施方案中，可通过向植物中导入核苷酸构建体例如包含编码抑制性核苷酸分子的序列的表达盒来抑制FucT和/或XylT蛋白的表达，所述抑制性核苷酸分子设计用于沉默目的FucT和/或XylT基基因产物的表达，所述抑制性核苷酸分子是例如有义方向的RNA、反义RNA、双链RNA(dsRNA)、发夹结构RNA(hpRNA)、包含内含子的hpRNA、催化RNA、miRNA等。在其他实施方案中，核苷酸构建体，例如表达盒，可包含编码mRNA的序列，所述mRNA的翻译产生抑制目的FucT和/或XylT基因产物的表达或功能的目的多肽。当核苷酸构建体包含编码目的多肽的抑制性核苷酸分子或mRNA的序列时，将序列与在植物中驱动表达的启动子有效连接以致可表达编码的抑制性核苷酸分子或mRNA。

根据本发明，如果FucT或XylT的蛋白质水平在统计学上低于植物(所述植物未被遗传改变或诱变以抑制该FucT或XylT的表达)中相同的FucT或XylT的水平，则FucT或XylT基因的表达被抑制。在本发明的特定的实施方案中，本发明的改变的植物中的FucT或XylT或两者的蛋白质水平是植物(所述植物是未突变的或未经遗传改变以抑制该FucT或XylT的表达、或FucT或XylT两者的表达的植物)中的相同FucT或XylT的蛋白质水平的低于95％、低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％或低于5％。可以例如通过测定在植物细胞或植物中表达的FucT或XylT的水平直接地，或通过在表型水平上观察转基因植物中的效应，即通过转基因植物分析(观察为植物中β1，2-木糖和/或α1，3-岩藻糖残基至糖蛋白的N聚糖的附着的减少或消除)来间接地测量FucT或XylT或两者的表达水平。

在本发明的其他实施方案中，通过用包含编码抑制FucT或XylT或两者的活性的多肽的多核苷酸的表达盒转化植物细胞来减少或消除FucT或XylT的活性。如果FucT或XylT的活性在统计学上低于植物(所述植物未被遗传改变以抑制该FucT或XylT的活性)中相同的FucT或XylT的活性，则根据本发明FucT或XylT的活性被抑制。在本发明的特定实施方案中，本发明的改变的植物中的FucT或XylT的活性是植物(所述植物未经遗传改变以抑制该FucT或XylT的表达)中的相同的FucT或XylT的活性的低于95％、低于90％、低于80％、低于70％、低于60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％或低于5％。当其不能通过本说明书中其他地方描述的测定方法检测时，FucT或XylT的活性被“消除”。

在其他实施方案中，可通过破坏编码FucT或XylT的基因或这两个基因来减少或消除FucT或XylT或两者的活性。本发明包括诱变的植物，特别是作为浮萍科的成员的植物，所述植物在FucT或XylT基因或这两个基因中具有突变，其中该突变减少FucT和/或XylT基因的表达或抑制编码的FucT和/或XylT的活性。

本发明的方法可包括本领域内已知的用于减少或消除高等植物的细胞中的FucT和/或XylT的活性或水平的任何方法或机制，其包括但不限于反义抑制、有义抑制、RNA干扰、定向缺失或突变、显性负性策略等。因此，此处公开的方法和组合物不限定于作用的任何机制或理论，其包括其中在目的高等植物的细胞中抑制FucT和/或XylT的表达或功能，从而改变植物中产生的内源性和异源性糖蛋白的N糖基化模式的任何方法。

例如，在一些实施方案中，以有义方向表达FucT抑制性序列或XylT抑制性序列(或两者)，其中有义方向的转录物引起这两个酶中的一个或两个酶的表达的共抑制。可选择地，可以以反义方向表达FucT和/或XylT抑制性序列(例如，序列的全长序列、截短的序列、片段、其组合等)，从而通过反义机制抑制内源性FucT和/或XIyT的表达或功能。

在其他实施方案中，以发夹结构RNA表达FucT和/或XylT抑制性序列，所述发夹结构RNA包含有义序列和反义序列。在包含发夹结构的实施方案中，环结构可包含任何合适的核苷酸序列，包括例如要抑制的基因的5′非翻译和/或翻译区，例如SEQ ID NO：1或2的FucT多核苷酸的5′UTR和/或翻译区，或SEQ ID NO：4、5、19或20的XylT多核苷酸的5′UTR和/或翻译区等。在一些实施方案中，表达为发夹结构的FucT或XylT抑制性序列由FucT或XylT核苷酸序列的倒转区域编码。在其他实施方案中，FucT和/或XylT抑制序列表达为双链RNA，其中一个FucT和/或XylT抑制性序列以有义方向表达，另一个互补序列以反义方向表达。包含FucT核苷酸序列、XylT核苷酸序列或其组合的双链RNA、发夹结构和其组合可通过RNA干扰、共抑制、反义机制、其任何组合，或通过引起FucT和/或XylT的表达或功能的抑制的任何其他机制来起作用。

因此，许多方法可用于减少或消除FucT或XylT或这两种蛋白两者以及其任何同种型的活性。“同种型”意指目的FucT或XylT蛋白的天然发生的蛋白质变体，其中变体由不同的基因编码。通常，特定的目的FucT或XylT蛋白的同种型由具有与编码目的FucT或XylT蛋白的核苷酸序列至少90％的序列同一性的核苷酸序列编码。可使用多种方法减少或消除单个植物FucT或XylT和其同种型的活性。下面提供减少或消除植物FucT或XylT的活性的方法的非限定性实例。

基于多核苷酸的方法

在本发明的一些实施方案中，用能够表达抑制FucT或XylT或两者的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞。此处所使用的术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括基因产物的翻译和/或转录。例如，为了本发明的目的，能够表达抑制FucT或XylT的至少一种或两者的表达的多核苷酸的表达盒是能够产生抑制FucT或XylT的至少一种或两者的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。从DNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指转录和翻译编码序列以产生蛋白质或多肽，而从RNA分子“表达”或“产生”蛋白质或多肽是指翻译RNA编码序列以产生蛋白质或多肽。

下面给出抑制FucT或XylT或两者的表达的多核苷酸的实例。

有义抑制/共抑制

在本发明的一些实施方案中，可通过有义抑制或共抑制获得FucT或XylT或两者的表达的抑制。关于抑制，设计表达盒以以“有义”方面表达相应于编码FucT或XylT或两者的信使RNA的全部或部分RNA分子。RNA分子的过表达可导致天然基因的减少的表达。因此，筛选用共抑制表达盒转化的多个植物系以鉴定显示FucT或XylT表达的最大抑制的系。

用于共抑制的多肽可相应于编码FucT或XylT的序列的全部或部分、FucT或XylT转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或编码FucT或XylT的转录物的编码序列和非翻译区的全部或部分。在其中多核苷酸包含FucT或XylT蛋白的编码区的全部或部分的一些实施方案中，设计表达盒以消除多核苷酸的起始密码子以使蛋白质产物不被转录。

共抑制可用于抑制植物基因的表达，从而产生具有不可检测的由这些基因编码的蛋白质的蛋白质水平的植物。参见，例如，Broin等人(2002)Plant Cell14：1417-1432。共抑制还可用一抑制相同植物中多个蛋白质的表达。参见，例如，美国专利5,942,657。用于使用共抑制抑制植物中内源基因的表达的方法描述于Flavell等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA91：3490-3496；Jorgensen等人(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等人(2002)Plant Cell14：1417-1432；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等人(2003)Phytochemistry63：753-763；和美国专利5,034,323、5,283,184和5,942,657；其各自通过引用包含和本文。可通过将在表达盒中在有义序列的3′和多腺苷酸化信号的5′位置包含poly-dT区来增加共抑制的功效。参见，美国专利公开20020048814，通过引用纳入本文。通常，这样的核苷酸序列具有与内源基因的转录物的序列的充分的序列同一性，优选大于大约65％的序列同一性，更优选大于大约85％的序列同一生，最优选大于大约95％的序列同一性。参见，美国专利5,283,184和5,034,323；通过引用纳入本文。

反义抑制

在本发明的一些实施方案中，可通过反义抑制来获得对FucT或XylT或两者的表达的抑制。关于反义抑制，表达盒经设计用于表达与编码FucT或XylT的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。反义RNA分子的过表达可导致减少的天然基因的表达。因此，筛选用反义抑制共表达盒转化的多个植物系以鉴定显示FucT或XylT表达的最大抑制的系。

用于反义表达的多核苷酸可相应于编码FucT或XylT的序列的互补序列的全部或部分、FucT或XylT转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或编码FucT或XylT的转录物的编码序列和非翻译区的全部或部分。此外，反义多核苷酸对于靶序列可以是完全互补的(即与靶序列的互补序列100％的同一性)或部分互补的(即与靶序列的互补序列小于100％的同一性)。反义抑制可用于在相同的植物中抑制多种蛋白质的表达。参见，例如，美国专利5,942,657。此外，反义核苷酸的部分可用于中断靶基因的表达。一般地，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制抑制内源基因在植物中的表达的方法描述于例如Liu等人(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和美国专利5,759,829和5,942,657，其各自通过引用合并入本文。可通过在表达盒中在反义序列的3′和多腺苷酸化信号的5′的位置包含poly-dT来增加反义抑制的功效。参见，美国专利申请号20020048814，通过引用纳入本文。

双链RNA干扰

在本发明的一些实施方案中，可通过双链RNA(dsRNA)干扰获得对FucT或XylT或两者的表达的抑制。关于dsRNA干扰，在相同的细胞中表达有义RNA分子如上述用于共抑制的RNA分子和与有交RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子，从而导致相应的内源信使RNA的表达的抑制。

可通过设计表达盒使之包含有义序列和反义序列来实现有义和反义分子的表达。可选择地，可将分开的表达盒用于有义和反义序列。然后筛选用dsRNA干扰表达盒转化的多个植物系以鉴定显示对FucT或XylT的表达最大抑制的系。使用dsRNA干扰抑制内源植物基因的表达的方法描述于Waterhouse等人(1998)Proc.Natl Acad.Sci USA95：13959-13964，Liu等人(2002)Plant Physiol129：1732-1743和WO99/49029、WO99/53050、WO99/61631和WO00/49035，其各自通过引用纳入本文。

发夹结构RNA干扰和包含内含子的发夹结构RNA干扰

在本发明的一些实施方案中，可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或包含内子的发夹RNA(ihpRNA)干扰获得对FucT或XylT或两者的表达的抑制。这些方法在抑制内源基因的表达上高度有效。参见，Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38，通过引用纳入本文。

关于hpRNA干扰，设计表达盒以使之表达与其本身杂交从而形成发夹结构的RNA分子，所夹结构包含单链环区域和碱基对茎。碱基对茎区域包含相应于编码其表达要被抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与有义序列完全或部分互补的反义序列。因此，分子的碱基对茎区域通常确定RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达上高度有效，它们诱导的RNA干扰通过植物的后代得到遗传。参考，例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci USA97：4985-4990；Stout jesdijk等人(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；和Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。使用Methods for using hpRNA干扰抑制或沉默基因的表达的方法描述于例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stout jesdi jk等人(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等人BMC Biotechnology3：7，以及美国专利申请20030175965；其各自通过引用纳入本文。由Panstruga等人(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(通过引用纳入本文)描述了测定hpRNA构建体在体内沉默基因表达的功效的瞬时测定。

关于ihpRNA，干扰分子具有与，hpRNA相同的一般结构，但RNA分子额外地包含能够在其中表达ihpRNA的细胞中被剪接的内含子。内含子的使用合使发夹结构RNA分子中的环的大小在剪接后变得最小，这增加了干扰的功效。参见，例如，Smith等人(2000)Nature407：319-320。事实上，通过使用ihpRNA介导的干扰，Smith等人显示了对内源基因的100％的抑制。使用ihpRNA干扰抑制内源植物基因的表达的方法描述于例如Smith等人(2000)Nature407：319-320；Wesley等人(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse(2003)Methods30：289-295，以及美国专利申请20030180945，其各自通过引用纳入本文。

还可设计用于hpRNA干扰的表达盒以使有义和反义序列不相应于内源RNA。在该实施方案中，有义和反义序列侧翼连接包含相应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列的环序列。因此，正是环区域确定了RNA干扰的特异性。参见，例如WO02/00904，通过引用纳入本文。

可通过使用hpRNA构建体实现转录基因沉默(transcriptionalgene silencing)(TGS)，在所述构建体中，发夹的反转重复顺序与被沉默的基因的启动子区域共有序列同一性。hpRNA至可与同源启动子区域相互作用的短RNA的加工可触发降解或甲基化，从而导致沉默(Aufsatz等人(2002)PNAS99(Suppl.4)：16499-16506；Mette等人(2000)EMBO J19(19)：5194-5201)。

设计用于表达形成发夹结构的RNA分子的表达盒此处称为RNAi表达盒。在一些实施方案中，按照图28中概述的策略设计RNAi表达盒。在此类实施方案中，可设计RNAi表达盒以抑制单个的FucT和XylT基因的表达(即，各表达盒提供单个基因的基因敲除)，或可设计RNAi表达盒以抑制FucT和XylT基因两者的表达(即，单个RNAi表达盒表达提供对这两种基因两者的表达的抑制的抑制性分子)。当RNAi表达盒抑制FucT和XylT基因两者的表达时，其在此处称为“嵌合”RNAi表达盒。可设计单个基因和嵌合RNAi表达盒以表达更大的hpRNA结构或，可选择地，小hpRNA结构，如本说明书中下面所指出的。

因此，在一些实施方案中，设计RNAi表达盒以表达更大的hpRNA结构，所述hpRNA结构具有与靶mRNA转录物充分的同源性，从而提供FucT和XylT基因中的一个或两者的转录后基因沉默。关于更大的hpRNA结构，设计RNAi表达盒的有义链以使以5′至3′方向包含下列有效连接的元件：目的启动子、分别包含FucT或XylT的有义链链的大约500至大约800个核苷酸(nt)的FucT或XylT基因序列的正向片段、包含大约本说明书中下面指出的任何序列的100至大约700nt的间隔区序列以及XylT或FucT基因序列的反向片段，其中反向片段包含与各自(即FucT或XylT)正向片段互补的反义序列。因此，例如，如果正向片段由核苷酸“...acttg...”表示，那么相应的反向片段由核苷酸“...caagt...”表示，这样的RNAi表达盒的有义链可包含下列序列：‘5′-...acttg...nnnn...caagt...-3′，其中“nnnn“表示间隔区序列。

要认识到，正向片段可包含与靶FucT或XylT基因序列的有义链的相应部分100％同一的核苷酸序列，或可选择地，可包含与待沉默的靶FucT或XylT基因的有义链的相应部分共有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的序列。通过相似的方式，要理解反向片段不必与正向片段的互补序列共有100％的序列同一性；相反，其必须足够长且对正向片段序列具有足够的互补性，这样当表达抑制性RNA分子时，相应于正向片段和反向片段的转录的区域将杂交以形成hpRNA结构的碱基对茎(即，双链部分)。“足够的长度”意指为正向片段的长度的至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％，更优选正向片段的长度的至少50％、至少75％、至少90％或至少95％的长度。“足够的互补性”意指反向片段的序列与将与反向片段杂交从而形成hp

RNA结构的碱基对茎的正向片段的该部分的互补序列共有至少至少90％、至少95％、至少98％的序列同一性。因此，在一些实施方案中，反向片段是正向片段的互补序列(即，反义版本)。

在设计这样的RNAi表达盒中，选择正向片段的长度、间隔区序列和反向片段的长度以使编码hpRNA结构的多核苷酸的组合长度为大约650至大约2500nt、大约750至大约2500nt、大约750至大约2400nt、大约1000至大约2400nt、大约1200至大约2300nt、大约1250至大约2100nt或大约1500至大约1800。在一些实施方案中，表达的发夹结构构建体的组合长度为大约650nt、大约700nt、大约750nt、大约800nt、大约850nt、大约900nt、大约950nt、大约1000nt、大约1050nt、大约1100nt、大约1150nt、大约1200nt、大约1250nt、大约1300nt、大约1350nt、大约1400nt、大约1450nt、大约1500nt、大约1550nt、大约1600nt、大约1650nt、大约1700nt、大约1750nt、大约1800nt、大约1850nt、大约1900nt、大约1950nt、大约2000nt、大约2050nt、大约2100nt、大约2150nt、大约2200nt、大约2250nt、大约2300nt或大约650nt和大约2300nt之间的任何长度。

在一些实施方案中，正向片段包含大约500至大约800nt，例如，500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775或800nt的FucT或XylT的有义链，例如SEQIDNO：1或2(FucT)或SEQIDNO：4、5、19或20(XylT)中所示的有义链；间隔区序列包含大约100至大约700nt，例如，100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675或700nt的下面指出的任何序列，反向片段包含正向片段序列的反义链，或具有足够长度和对于正向片段序列具有足够的互补性的序列。

间隔区序列可以是对靶基因即FucT或XylT没有足够的同源性且对其本身没有足够同源性的任何序列，这样相应于间隔区区域的表达的抑制性RNA分子的部分就不能自我杂交从而形成了发夹RNA结构的环。在一些实施方案中，间隔区序列包含内含子，从而表达的抑制性RNA分子形成本说明书中上面提及的ihpRNA。在其他实施方案中，间隔区序列包含待沉默的FucT或XylT基因的有义链的部分，例如SEQIDNO：1或2(FucT)或SEQIDNO：4、5、19或20(XylT)中所示的有义链的部分，特别是紧接正向片段序列下游的有义链的部分。

有效连接的启动子可以是提供目的植物中的有交连接的抑制性多核苷酸表达的任何目的启动子，包括本说明书中下面公开的任一个启动子。调控区可包含增强抑制性多核苷酸的表达的额外的调控元件，包括，但不限于，本说明书中下面讨论的5′前导序列和5′前导序列加植物内含子。

在一个实施方案中，设计RNAi表达盒以使之抑制SEQ ID NO：3的FucT多肽、SEQ ID NO：3的FucT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列至少75％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性)编码的FucT多肽的表达。通过该方式，设计RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；FucT基因的正向片段，其中正向片段包含SEQ ID NO：1的nt255-985；包含大约100至大约700nt的上述任何序列的间隔区序列；和FucT基因序列的反向片段，其中反向片段包含的SEQ ID NO：1的nt255-985的互补序列(即，反义版本)。在一个这样的实施方案中，间隔区序列由SEQ ID NO：1的nt986-1444表示，相应于hpRNA结构的编码序列的RNAi表达盒的有义链的该部分的总长度为1918nt。用包含该RNAi表达盒的核苷酸构建体例如图8中显示的载体稳定转化植物有效地抑制了FucT在其中表达hpRNA结构的植物的植物细胞中的表达。在一个实施方案中，目的植物是浮萍家族的成员，例如浮萍科的成员，且植物已用图8中显示的载体稳定地转化。

在本发明的其他实施方案中，RNAi表达盒设计用于抑制SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的序列至少75％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性)编码的FucT多肽的表达。通过该方式，设计RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；XylT基因序列的正向片段，其中正向片段包含SEQ ID NO：4的nt318-1052；包含大约100至大约700nt的上述任何序列的间隔区序列；和XylT基因序列的反向片段，其中反向片段包含SEQ ID NO：4的nt318-1052的互补序列(即，反义版本)。在一个这样的实施方案中，间隔区序列由SEQ ID NO：4的nt1053-1599表示，相应于hpRNA结构的编码序列的RNAi表达盒的有义链的该部分的总长度为2015nt。用包含该RNAi表达盒的核苷酸构建体例如图9中显示的载体稳定转化植物有效地抑制了FucT在其中表达hpRNA结构的植物的植物细胞中的表达。在一个实施方案中，目的植物是浮萍家族的成员，例如浮萍科的成员，且植物已用图9中显示的载体稳定地转化。

在其他实施方案中，设计RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；XylT基因序列的正向片段，其中正向片段包含SEQ ID NO：19的nt1-734；包含大约100至大约700nt的上述任何序列的间隔区序列；和XylT基因序列的反向片段，其中反向片段包含SEQ ID NO：19的nt1-734的互补序列(即，反义版本)。在一个这样的实施方案中，间隔区序列由SEQ ID NO：19的nt735-1282表示，相应于hpRNA结构的编码序列的RNAi表达盒的有义链的该部分的总长度为2015nt。用包含该RNAi表达盒的核苷酸构建体例如图9中显示的载体稳定转化植物，有效地抑制了FucT在其中表达hpRNA结构的植物的植物细胞中的表达。在一个实施方案中，目的植物是浮萍家族的成员，例如浮萍科的成员，且植物已用图9中显示的载体稳定地转化。

在其他实施方案中，可设计更大的hpRNA结构，以使反义和有义序列处于相对的方向。通过该方式，设计RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；反义方向的全长FucT或XylT基因序列，和以有义方向包含序列的3′半部分的FucT或XylT基因序列的正向片段(参见图28，设计1)。在该类型的构建体中，序列的3′半部分形成了hpRNA的碱基对茎(即，双链)，序列的5′半部分用作间隔区序列。不受任何理论或机制的束缚，选择FucT或XylT序列的3′区域以形成该构建体的hpRNA的双链区域，因为与5′区域相比，该区域在不同植物物种之间是相对保守的。

在一个这样的实施方案中，设计RNAi表达盒经以使之抑制SEQ IDNO：3的FucT多肽、SEQ ID NO：3的FucT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列至少75％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性)编码的FucT多肽的表达。通过该方式，设计RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；反义方向的SEQ I DNO：1的核苷酸1-1865和有义方向的SEQ ID NO：1的核苷酸950-1865。用包含该RNAi表达盒的核苷酸构建体稳定转化植物，有效地抑制了FucT在其中表达hpRNA结构的植物的植物细胞中的表达。在一个实施方案中，目的植物是浮萍家族的成员，例如浮萍科的成员。

在另一个实施方案中，设计RNAi表达盒经以使之抑制SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的序列至少75％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性)编码的XylT多肽的表达。通过该方式，设计RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；以反义方向排列的SEQ ID NO：4的核苷酸1-1860和以有义方向排列的SEQ ID NO：4的核苷酸950-1860。用包含该RNAi表达盒的核苷酸构建体稳定转化植物，有效地抑制了XylT在其中表达hpRNA结构的植物的植物细胞中的表达。在一个实施方案中，目的植物是浮萍家族的成员，例如浮萍科的成员。

在另一个实施方案中，设计RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；以反义方向排列的SEQ ID NO：19的核苷酸1-1282和以有义方向排列的SEQ ID NO：19的核苷酸652-1282。用包含该RNAi表达盒的核苷酸构建体稳定转化植物，有效地抑制了XylT在其中表达hpRNA结构的植物的植物细胞中的表达。在一个实施方案中，目的植物是浮萍家族的成员，例如浮萍科的成员。

当希望同时抑制FucT和XylT蛋白的表达时，可通过例如在单个转化载体(例如与图11中显示的载体相似的载体)内装配这些单基因RNAi表达盒来将这些单基因RNAi表达盒以单个转化事件来导入植物，或通过在两个转化载体(例如与图8和9中显示的载体相似的载体)内装配这些单基因RNAi表达盒，使用本领域内已知的任何转化方法(包括但不限于本书明书中其他地方公开的转化方法)，以分开的共转化事件方式导入植物。

可选择地，可通过向目的高等植物导入本说明书中上面提及的嵌合RNAi表达盒来获得FucT和XylT蛋白两者的表达的抑制。因此，在本发明的一些实施方案中，设计嵌合RNAi表达盒的有义链以使之以5’至3’的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子；嵌合正向片段，其包含FucT的有义链的大约500至大约650个核苷酸(nt)和XylT的有义链的大约500至大约650个核苷酸(nt)，其中FucT序列和XylT序列可以任一顺序排列；包含大约100至大约700nt的任何序列的间隔区序列；和嵌合正向片段的反向片段，其中反向片段包含与各自嵌合正向片段互补的反义序列。

关于单个RNAi表达盒，如之前所指出的，认识到，嵌合正向片段内的单个FucT或XIyT序列可包含分别与靶FucT和XylT基因序列的有义链的相应部分100％的同一性的核苷酸序列，或可选择地，可包含与待沉默的靶FucT或XylT基因的有义链的相应部分共有至少90％、至少95％或至少98％的序列同一性的序列。同样，认识到，反向片段不必与嵌合正向片段的互补序列共有100％的序列同一性；相反地，如此处上面所定义的，其必须足够长且对嵌合正向片段序列具有足够的互补性，这样当表达抑制性RNA分子时，相应于嵌合正向片段和反向片段的转录的区域将杂交以形成hpRNA结构的碱基对茎(即，双链部分)。在设计这样的RNAi表达盒中，选择正向片段、间隔区序列和反向片段的长度以使编码hpRNA结构的多核苷酸的组合长度为大约1200至大约3300nt、大约1250至大约3300nt、大约1300至大约3300nt、大约1350至大约3300nt、大约1400至大约3300nt、大约1450nt至大约3300nt、大约1500至大约3300nt、大约2200至大约3100nt、大约2250至大约2800nt、或大约2500至大约2700nt。在一些实方案中，表达的发夹结构构建体的组合长度为大约1200nt、大约1250nt、大约1300nt、大约1350nt、大约1400nt、大约1450nt、大约1500nt、大约1800nt、大约2200nt、大约2250nt、大约2300nt、大约2350nt、大约2400nt、大约2450nt、大约2500nt、大约2550nt、大约2600nt、大约2650nt、大约2700nt、大约2750nt、大约2800nt、大约2850nt、大约2900nt、大约2950nt、大约3000nt、大约3050nt、大约3100nt、大约3150nt、大约3200nt、大约3250nt、大约3300nt或为大约1200nt至大约3300nt之间的任何这样的长度。

在一些实施方案中，嵌合正向片段包含大约500至大约650nt，例如500、525、550、575、600、625或650nt的FucT的有义链，例如SEQIDNO：1或2中所示的有义链，和大约500至大约650nt，例如，500、525、550、575、600、625或650nt的XylT的有义链，例如SEQ ID NO：4、5、19或20所示的有义链，其中可以以任一顺序融合FucT和XylT序列；间隔区序列包含大约100至大约700nt，例如，100、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675或700nt的任何目的序列；和反向序列片段包含嵌合正向片段序列的反义链，或具有足够的长度和对嵌合正向片段序列足够的互补性的序列。

关于单基因RNAi表达盒，如上面所提及的，间隔区序列可以是对靶基因即FucT或XylT不具足够的同源性和对其本身不具有足够的同源性，这样相应间于隔子区域的表达的抑制性RNA分子的部分不能自我杂交从而形成hpRNA结构的环。在一些实施方案中，间隔区序列包含内含子，从而表达的抑制性RNA分子形成了本说明书中上面提及的ihpRNA。在其他实施方案中，间隔区序列包含待沉默的FucT或XylT基因的有义链的部分，例如SEQ ID NO：1或2(FucT)或SEQ ID NO：4、5、19或20(XylT)所示的有义链的部分。在一个实施方案中，嵌合正向片段包含以该顺序融合的FucT和XylT序列，间隔区序列包含正好处于嵌合正向片段内包含的XylT序列下游的XylT有义链的部分。在另一个实施方案中，嵌合正向片段包含以该顺序融合的XylT和FucT序列，间隔区序列包含正好处于嵌合正向片段内包含的FucT序列下游的FucT有义链的部分。

在一些实施方案中，设计嵌合RNAi表达盒以抑制SEQ ID NO：3的FucT多肽、SEQ ID NO：3的FucT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列至少75％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性)编码的FucT多肽的表达，和抑制SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的序列至少75％的序列同一性，例如与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性)编码的XylT多肽的表达。对于这些实施方案中的一些实施方案，选择嵌合正向片段内的FucT序列以使其相应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2nt700至nt1400，和/或选择嵌合正向片段内的XylT序列以使其相应于SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的nt700至nt1400，或SEQ ID NO：19或20的nt383至1083。不受理论的束缚，据认为该区域(特别是对于FucT)在不同植物种类中是相对保守的，从而是潜在的良好的靶。

在另一个实施方案中，设计嵌合RNAi表达盒的有义链以使之以5′至3′的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子、包含SEQ ID NO：1(FucT序列)的nt254-855和SEQ ID NO：4(XIyT序列)的nt318-943的嵌合正向片段；包含大约100至大约700nt的上面提及的任何序列的间隔区序列；和包含嵌合正向片段的互补序列(即，反义版本)即包含SEQ IDNO：4的nt318-943的互补序列和SEQ ID NO：1的nt254-855的互补序列的反向片段。在特定的实施方案中，该嵌合RNAi表达盒中的间隔区序列由SEQ ID NO：4的nt944-1443表示，相应于hpRNA结构的编码序列的RNAi表达盒的有义链的该部分的总长度是2956nt。

在另一个这样的实施方案中，设计嵌合RNAi表达盒的有义链以使之以5′至3′的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子、包含SEQ ID NO：4(XIyT序列)的nt318-943和SEQ ID NO：1(FucT序列)的nt254-855的嵌合正向片段；包含大约100至大约700nt的上面提及的任何序列的间隔区序列；和包含嵌合正向片段的互补序列(即，反义版本)即包含SEQ ID NO：1的nt254-855的互补序列和SEQ ID NO：4的nt318-943的互补序列的反向片段。在特定的实施方案中，该嵌合RNAi表达盒中的间隔区序列由SEQ ID NO：1的nt856-1355表示，相应于hpRNA结构的编码序列的RNAi表达盒的有义链的该部分的总长度是2956nt。

在另一个这样的实施方案中，设计嵌合RNAi表达盒的有义链以使之以5′至3′的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子、包含SEQ ID NO：1(FucT序列)的nt254-855和SEQ ID NO：19(XIyT序列)的nt1-626的嵌合正向片段；包含大约100至大约700nt的上面提及的任何序列的间隔区序列；和包含嵌合正向片段的互补序列(即，反义版本)即包含SEQ ID NO：19的nt1-626的互补序列和SEQ ID NO：1的nt254-855的互补序列的反向片段。在特定的实施方案中，该嵌合RNAi表达盒中的间隔区序列由SEQ ID NO：19的nt627-1126表示，相应于hpRNA结构的编码序列的RNAi表达盒的有义链的该部分的总长度是2956nt。

在另一个这样的实施方案中，设计嵌合RNAi表达盒的有义链以使之以5′至3′的方向包含下列有效连接的元件：目的启动子、包含SEQ ID NO：19(XIyT序列)的nt1-626和SEQ ID NO：1(FucT序列)的nt254-855的嵌合正向片段；包含大约100至大约700nt的上面提及的任何序列的间隔区序列；和包含嵌合正向片段的互补序列(即，反义版本)即包含SEQ ID NO：1的nt254-855的互补序列和SEQ ID NO：19的nt1-626的互补序列的反向片段。在特定的实施方案中，该嵌合RNAi表达盒中的间隔区序列由SEQ ID NO：1的nt856-1355表示，相应于hpRNA结构的编码序列的RNAi表达盒的有义链的该部分的总长度是2956nt。

用包含此处描述的RNAi表达盒的核苷酸构建体稳定转化植物，例如使用图10中显示的载体的稳定转化，有效地抑制了FucT和XylT两者在其中表达hpRNA结构的植物的植物细胞中的表达。在一个实施方案中，目的植物是浮萍家族的成员，例如浮萍科的成员，植物已用图10中显示的载体稳定地转化。

要认识到，可用这些嵌合RNAi表达盒中的至少两个稳定地转化植物，从而提供非常有效的FucT和XylT蛋白的基因沉默，包括这两种蛋白质的任何同种型的沉默。参见，例如，图28的“可能的设计2”中提供的两个方向。通过该方式，可用第一嵌合RNAi表达盒(其中嵌合正向片段包含以该顺序融合的FucT和XylT序列，和包含正好处于嵌合正向片段内包含的XylT序列下游的XylT有义链的部分的间隔区序列)；和第二嵌合RNAi表达盒(其中嵌合正向片段包含以该顺序融合的XylT和FucT序列，和包含正好处于嵌合正向片段内包含的FucT序列下游的FucT有义链的部分的间隔区序列)稳定地转化植物。

编码大hpRNA结构或大ihpRNA结构的RNAi表达盒中的任一个中的有效连接的启动子可以是任何目的启动子，包括本说明书中下面公开的启动子中的一个启动子，所述目的启动子在目的植物中提供有效连接的抑制性多核苷酸的表达。调控序列可包含增强抑制性多核苷酸的表达的额外的调控元件，包括但不限于，本说明书中下面讨论的5′前导序列和5′前导序列+植物内含子。

在其他实施方案中，可设计RNAi表达盒以提供具有包含大约200个碱基对或更少的碱基配对的茎区域的小hpRNA结构的表达。优选通过由DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子驱动小hpRNA结构的表达。参见，例如，美国专利申请20040231016，通过引用其全文将其纳入本文。

通过该方式，这样设计RNAi表达盒以使转录的DNA区域编码包含有义和反义核苷酸区域的RNA分子，其中有义核苷酸序列包含大约19个连续的核苷酸，所述连续的核苷酸具有与来自从目的基因转录的RNA的大约19个连续核苷酸大约90％至大约100％的序列同一性，和其中反义核苷酸序列包含大约19个连续核苷酸，所述大约19个连续核苷酸具有与有义序列的大约19个连续核苷酸的互补序列至少大约90％至大约100％的序列同一性。RNA分子的有义和反义核苷酸序列应当能够形成长度为大约19至大约200个核苷酸，可选择地大约21至大约90或100个核苷酸或可选择地大约40至大约50个核苷酸的RNA碱基配对(即，双链)的茎区域。然而，RNA分子的碱基配对的茎区域的长度在长度上可以是大约30、大约60、大约70或大约80个核苷酸。当RNA分子的碱基配对的茎区域大于19个核苷酸时，只需要存在至少一个大约19个核苷酸的双链区(其中有义和反义区域之间可存在大约1个错配)，所述双链区的有义链与目的靶FucT或XylT多核苷酸的19个连续核苷酸是“同一的”(允许一个错配)。该类型的RNAi表达盒的转录的DNA区域可包含位于有义和反义编码核苷酸区域之间的间隔区序列。间隔区序列与被靶向的FucT或XylT多肽不相关，且可在大约3至大约100个核苷酸或可选择地大约6至大约40个核苷酸的长度范围内变化。该类型的RNAi表达盒还可包含位于表达盒的编码反义序列的核苷酸区域的下游的由RNA聚合酶III识别的终止子序列，该序列为寡聚dT片段的序列。“寡聚dT片段”是连续的T残基的片段。其应当包含至少4个T残基，但显然可包含更多的T残基。

要认识到，在设计短hpRNA中，选择被靶各的基因序列的片段(即，FucT或XylT基因序列的片段)和RNAi表达盒的hpRNA编码部分内包含的任何间隔区序列，以避免富含GC的序列，特别是具有3个连续G/C的序列，和避免4个或更多个连续的T或A的发生，因为片段“TTTT...”用作由RNA聚合酶III识别的终止子序列。

因此，当想要用短hpRNA沉默基因时，设计RNAi表达盒以使之以5′至3′的方向包含下列有效连接的元件：由植物细胞的DNA依赖性RNA聚敛酶III识别的启动子，如本说明书中下面所定义的启动子；包含有义和反义核苷酸序列的DNA片段，其中有义核苷酸序列包含至少19个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与来自目的FucT或XylT基因的有义链的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列大约90％至大约100％的序列同一性，和其中反义核苷酸序列包含大约19个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与有义序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列的互补序列至少大约90％至大约100％的序列同一性，其中有义和反义核苷酸序列能够形成长度为大约19至大约200个核苷酸的双链RNA；和包含至少4个连续T残基的寡聚dT片段。

在本发明的一些实施方案中，设计RNAi表达盒以使之表达抑制SEQ ID NO：3的FucT多肽、SEQ ID NO：3的FucT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列至少90％的序列同一性)编码的FucT多肽的表达的小hpRNA。通过该方式，可设计RNAi表达盒以使之以5′至3′的方向包含下列有效连接的元件：由植物细胞的DNA依赖性RNA聚敛酶III识别的启动子，如本说明书中下面所定义的启动子；包含有义和反义核苷酸序列的DNA片段，其中有义核苷酸序列包含至少19个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与SEQ ID NO：1的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列大约90％至大约100％的序列同一性，和其中反义核苷酸序列包含大约19个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与有义序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列的互补序列至少大约90％至大约100％的序列同一性，其中有义和反义核苷酸序列能够形成长度为大约19至大约200个核苷酸的双链RNA；和包含至少4个连续T残基的寡聚dT片段。

在本发明的其他实施方案中，设计RNAi表达盒以表达抑制SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：21的XylT多肽的生物活性变体或由序列(所述序列具有与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的序列至少90％的序列同一性)编码的XylT多肽的表达的小hpRNA。通过该方式，设计RNAi表达盒以使之以5′至3′的方向包含下列有效连接的元件：由植物细胞的DNA依赖性RNA聚敛酶III识别的启动子，如本说明书中下面所定义的启动子；包含有义和反义核苷酸序列的DNA片段，其中有义核苷酸序列包含至少19个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与SEQ ID NO：4的至少大约19个连续核苷酸的核苷酸序列大约90％至大约100％的序列同一性，和其中反义核苷酸序列包含大约19个连续核苷酸，所述连续核苷酸具有与有义序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列的互补序列至少大约90％至大约100％的序列同一性，其中有义和反义核苷酸序列能够形成长度为大约19至大约200个核苷酸的双链RNA；和包含至少4个连续T残基的寡聚dT片段。

扩增子介导的干扰

扩增子表达盒包含植物病毒来源的序列，所述序列包含靶基因的全部或部分但通常不包含所有的天然病毒的基因。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列允许转录产物指导其自已的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即，FucT或XylT或两者的信使RNA)可以是有义的或反义。使用扩增子抑制内源性植物基因的表达的方法描述于例如Angell和Baulcombe(1997)EMBO J.16：3675-3684，Angell和Baulcombe(1999)Plant J.20：357-362，和美国专利6,646,805，其各自通过引用纳入本文。

核酶

在一些实施方案中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是催化性RNA或具有对于FucT或XylT或两者的信使RNA是特异性的核酶活性。因此，多核苷酸引起内源性信使RNA的降解，从而导致FucT或XylT或两者的减少的表达。该方法描述于例如美国专利4,987,071，通过引用纳入本文。

小干扰RNA或Micro RNA

在本发明的一些实施方案中，可通过表达编码micro RNA(miRNA)的基因通过RNA干扰来获得FucT或XylT或两者的表达的抑制。miRNA是由大约22个核糖核苷酸组成的调节剂。miRNA在抑制内源性基因的表达方面是高度有效的。参见，例如Javier等人(2003)Nature425：257-263，通过引用纳入本文。

关于miRNA干扰，设计表达盒以使其表达根据内源性miRNA基因构建的RNA分子。miRNA基因编码形成包含与另一个内源性基因(靶序列)互补的22个核苷酸的序列的发夹结构的RNA。为了抑制FucT或XylT表达，22个核苷酸的序列选自FucT或XylT转录物序列和以有义方向包含所述FucT或XylT序列的22个核苷酸以及相应的与有义序列互补的反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源性基因的表达方面是高度有效的，它们诱导的RNA干扰通过植物的后代得到遗传。

基于多肽的基因表达的抑制

在一个实施方案中，多核苷酸编码结合编码FucT或XylT或两者的基因的锌指蛋白，从而导致减少的基因表达。在特定的实施方案中，锌指蛋白结合FucT或XylT基因的调控区。在其他实施方案中，锌指蛋白结合编码FucT或XylT的信使RNA并且阻止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已描述于例如美国专利6,453,242中，使用锌指蛋白抑制植物中基因的表达的方法描述于例如美国专利申请20030037355；其各自通过引用纳入本文。

基于多肽的蛋白质活性的抑制

在本发明的一些实施方案中，多核苷酸编码结合至少一个FucT或XylT的抗体，和减少FucT或XylT的活性。在另一个实施方案中，抗体的结合通过细胞质量控制机制导致增加的FucT或XylT复合物的周转。植物细胞中抗体的表达和植物中通过抗体的表达和其对蛋白质的结合导致的分子途径的抑制在本领域内是熟知的。参见，例如，Conrad和Sonnewald(2003)Nature Biotech.21：35-36，通过引用合并入本文。

基因破坏Gene Disruption

在本发明的一些实施方案中，通过破坏编码FucT或XylT或两者的基因来减少或消除FucT或XylT或两者的活性。可通过本领域内已知的任何方法破坏编码FucT或XylT或两者的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标记技术破坏基因。在另一个实施方案中，通过使用随机或定向突变诱变处理植物，然后选择具有减少的FucT和/或XylT活性的植物来破坏基因。

转座子标记技术

在本发明的一个实施方案中，使用转座子标记技术减少或消除FucT或XylT或两者的活性。转座子标记技术包括在内源性FucT或XylT基因内插入转座子以减少或消除FucT或XylT的表达。“FucT”或“XylT”基因意指根据本发明分别编码FucT或XylT的基因。

在该实施方案中，通过在调控区或编码FucT或XylT的基因的编码区内插入转座子来减少或消除FucT或XylT的表达。FucT或XylT或两者的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子可用于减少或消除被编码的FucT或XylT的表达和/或活性。

用于植物中特定基因的转座子标记技术的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Maes等人(1999)Trends Plant Sci4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等人(2000)Plant J.22：265-274；Phogat等人(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等人(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等人(1999)Genetics153：1919-1928)。此外，用于在选择的基因中选择Mu插入的TUSC方法描述于Bensen等人(1995)Plant Cell7：75-84；Mena等人(1996)Science274：1537-1540；其各自通过引用纳入本文。

本发明包括用于减少或消除FucT或XylT的活性的其他方法。用于在植物中改变或突变基因组核苷酸序列的其他方法的实例在本领域内是已知的，包括但不限于，RNA：DNA载体的使用、RNA：DNA突变的载体的使用、RNA：DNA修复载体的使用、混合双链体寡核苷酸的使用、自我互补的RNA：DNA寡核苷酸的使用和重组基因寡核碱基(oligonucleobases)的使用。使用的此类载体和方法在本领域内是已知的。参见，例如，美国专利5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984；其各自通过引用纳入本文。也参见，WO98/49350、WO99/07865、WO99/25821和Beetham等人(1999)Proc.Natl Acad.Sci USA96：8774-8778；其各自通过引用纳入本文。

因此，可通过前述方法中任一种方法来抑制FucT和/或XylT在目的高等植物中的表达，以改变在该植物中产生的内源性和异源性糖蛋白的N糖基化模式，以使这此糖蛋白包含具有减少的β1，2-连接的木糖残基和/或α1，3-连接的岩藻糖残基的量的复杂N聚糖。β1，2-连接的木糖残基和/或α1，3-连接的岩藻糖残基至糖蛋白的N-聚糖的附着的程度减少通过XylT和FucT酶的各自表达的抑制程度来控制。

在本发明的一些实施方案中，使用此处描述的靶向XylT表达的方法稳定地转化的植物宿主中产生的重组糖蛋白具有N连接的聚糖，所述聚糖包含低于50％、低于40％、低于30％的植物宿主(所述植物未被遗传修饰以抑制XylT酶和其同种型的表达)中产生的糖蛋白的各个N连接的聚糖中发生的β1，2-连接的木糖残基。在其他实施方案中，这些重组糖蛋白具有N连接的聚糖，所述聚糖包含低于25％、低于20％、低于15％、低于10％、低于5％或低于1％的植物宿主(所述植物未被遗传修饰以抑制XylT酶和其同种型的表达)中产生的糖蛋白的各个N连接的聚糖中发生的β1，2-连接的木糖残基。在其他实施方案中，本发明的方法在稳定转化的植物中提供了XylT基因和其任何同种型的完全沉默，这样植物中产生的重组糖蛋白具有不含β1，2-连接的木糖残基的N连接的聚糖。

通过类似的方式，当使用此处描述的靶向FucT表达的方法稳定地转化植物宿主细胞时，植物中产生的重组糖蛋白具有N连接的聚糖，所述聚糖包含低于50％、低于40％、低于30％的植物宿主(所述植物未被遗传修饰以抑制FucT酶和其同种型的表达)中产生的糖蛋白的各个N连接的聚糖中发生的α1，3-连接的岩藻糖残基。在其他实施方案中，这些重组蛋白具有N连接的聚糖，所述聚糖包含低于25％、低于20％、低于15％、低于10％、低于5％或低于1％的植物宿主(所述植物未被遗传修饰以抑制FucT酶和其同种型的表达)中产生的糖蛋白的各个N连接的聚糖中发生的α1，3-连接的岩藻糖残基。在其他实施方案中，本发明的方法在稳定转化的植物中提供了FucT基因和其任何同种型的完全沉默，这样植物中产生的重组糖蛋白具有不含α1，3-连接的岩藻糖残基的N连接的聚糖。

当使用此处描述的靶向XylT和FucT酶两者和其任何同种型的表达的方法稳定地转化植物宿主时，植物中产生的重组糖蛋白具有N连接的聚糖，所述聚糖包含低于50％、低于40％、低于30％的植物宿主(所述植物宿主未被遗传修饰以抑制XylT和FucT酶及其同种型的表达)中产生的糖蛋白的各个N连接的聚糖中发生的β1，2-连接的木糖残基和α1，3-连接的岩藻糖残基。在其他实施方案中，这些重组蛋白具有N连接的聚糖，所述聚糖包含低于25％、低于20％、低于15％、低于10％、低于5％或低于1％的植物宿主(所述植物未被遗传修饰以抑制XylT和FucT酶和其同种型的表达)中产生的糖蛋白的各个N连接的聚糖中发生的β1，2-连接的木糖残基和α1，3-连接的岩藻糖残基。在其他实施方案中，本发明的方法在稳定转化的植物中提供了XylT和FucT基因和其任何同种型的完全沉默，这样植物中产生的重组糖蛋白具有不含β1，2-连接的木糖残基和α1，3-连接的岩藻糖残基的N连接的聚糖。

在本发明的一些实施方案中，使用此处描述的靶向XylT和FucT酶和其任何同种型的表达的方法稳定地转化的植物宿主能够产生其中N连接的聚糖大体上均一的重组糖蛋白。“大体上均一的”意指糖基化特征谱反映相应于希望的N聚糖种类更特别地G0聚糖种类的单个主峰的存在，其中至少90％的存在于所述糖蛋白上的N聚糖结构是G0聚糖种类。

用于监测糖蛋白的N糖基化模式(也称为糖基化特征谱)的改变的方法在本领域内是熟知的，包括，但不限于，基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱(例如使用本说明书中下面的实施例3中公开的改良的MALDI-TOF测定)、液相色谱质谱(liquidchromatograph mass spectrometry)(LC-MS)、气相色谱、阴离子交换层析、大小排阻层析、高浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳、核磁共振光谱法和毛细管电泳以及毛细管凝胶电泳、通过高效液相色谱(HPLC)和QTOF进行的荧光标记和检测等。通过该方式，可通过将从稳定转化的植物中获得的样品(例如叶组织样品)经历通过MALDI-TOF质谱进行的总的N聚糖分析，然后将结果与从来自对照植物的可比较的样品获得的结果进行比较，来监测由于本发明的稳定转化的植物中的XylT和/或FucT的表达或功能的抑制而导致的N糖基化模式的改变，其中对照植物未进行遗传修饰以抑制XylT和/或FucT的表达或功能。可通过各自的峰的质量(mass)的减少来监测N聚糖中木糖和/或岩藻糖残基的量的减少。参见，例如，Strasser等人(2004)FEBS  Letters561：132-136。

类似地，已使用本领域技术人员熟知的标准技术容易地确定任何给定的重组产生的糖蛋白的糖基化特征谱。参见，例如，由Morelle和Michalski(2005)Curr.Anal.Chem.1：29-57(通过其全文的引用纳入本文)提供的综述。因此，可就附着至其的特定N连接的聚糖结构的比率分析宿主生物(包括植物宿主)中重组产生的糖蛋白。通过该方式，可将包含分离的重组产生的糖蛋白的样品经历酶促或化学反应，以从糖蛋白释放单个的聚糖结构。在该去糖基化步骤后，可使用本说明书中上面描述的分析测定法中的任一种进行糖基化特征谱的分析。

重组产生的糖蛋白的产物通常以不同的糖形群体存在，所述糖形以可变的摩尔量在具有不同的位点占有程度的糖基化位点上携带1至数打不同的聚糖。取决于糖蛋白，不同的糖形可产生不同的功能特征谱。因此，在本发明的一些实施方案中，希望确定具有N聚糖完整形式的糖蛋白的糖基化特征谱。可使用本领域内已知的用于确定完整糖蛋白的糖基化特征谱的任何技术，包括上面和本说明书的下面的实施例中提及的质谱法。

通过以此处所示的方式短暂地或稳定地减少或消除岩藻糖基转移酶和/或木糖基转移酶的表达或功能，可能产生具有产生具有N糖基化特征谱的糖蛋白的能力的转基因高等植物，所述N糖基化特征谱，与当这些酶的表达或功能未进行改变(即，植物具有天然的或野生型糖基化机构)时通常观察到的该植物产生的糖蛋白的N糖基化特征谱相比，具有减少的不均一性。当使用本说明书中上面描述的一种或多种方法稳定地减少或消除这两种酶中的一种或两种的表达或功能时，由转基因植物产生的糖蛋白的N糖基化特征谱的不均一性的减少可在植物的代间得到保持，包括通过无性或有性生殖的传代保持，和可在整个培养条件下及在扩大生产中得到保持。

通过该方式，本发明提供了用于减少高等植物例如双子叶或单子叶植物例如浮萍植物中产生的糖蛋白的N糖基化特征谱的不均一性的方法。方法包括向植物中导入此处描述的核苷酸构建体以使在植物中减少或消除岩藻糖残基转移酶和/或木糖基转移酶的表达或功能。在本发明的一些实施方案中，用于减少高等植物中产生的糖蛋白的N糖基化特征谱的不均一性的方法包括向目的高等植物中导入至少一个本说明书中上面描述的核苷酸构建体，其中核苷酸构建体提供了例如使用本说明书中上面描述的一种或多种方法在植物中抑制岩藻糖残基转移酶和/或木糖基转移酶的表达。

“减少N糖基化特征谱的不均一性”意指N糖基化特征谱的特征在于呈现在特征谱中的不同的N聚糖种类的总数的减少。因此，例如，当由具有天然的或野生型糖基化机构(从而未被遗传修饰而减少或消除岩藻糖残基转移酶和木糖基转移酶的表达)的高等植物产生的糖蛋白产生具有特征在于5个N聚糖种类的混合存在的N糖基化特征谱的糖蛋白时，本发明的方法可用于减少出现在N糖基化特征谱中的N聚糖种类的数目。通过该方式，当以此处所示的方式遗传修饰该高等植物以减少或消除岩藻糖残基转移酶和/或木糖基转移酶的表达或功能时，该糖蛋白的N糖基化特征谱的特征在于出现在特征谱中的N聚糖种类的数目的减少，例如少于5个N聚糖种类例如少于4、3或2个N聚糖种类的混合，或甚至单个N聚糖种类。当减少N糖基化模式的不均一性以使特征在于存在单个主要的N聚糖种类，N糖基化特征谱对于N聚糖种类大体上是均一的。

在一些实施方案中，用于减少高等植物中产生的糖蛋白的N糖基化特征谱的不均一性导致产生的糖蛋白具有为大体上均一的G0聚糖种类的N糖基化特征谱。在这样的实施方案中，用于减少高等植物中产生的糖蛋白的N糖基化特征谱的不均一性的方法导致产生的糖蛋白具有大体上均一的N糖基化特征谱，其中出现在糖蛋白的N糖基化特征谱中的N聚糖种类的总量的至少80％、至少85％、至少90％，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％由G0聚糖种类代表。在这些实施方案中，如本说明书中其他地方所指出的，痕量的前体N聚糖种类可出现在N糖基化特征谱中，其中存在于N糖基化特征谱中的任何给定的前体N聚糖种类以低于5％，优选低于4％，低于3％，低于2％，低于1％和甚至低于0.5％或甚至低于0.1％的出现在特征谱中的N聚糖种类的总量存在。

糖蛋白可以是内源性目的糖蛋白，或可以是由目的高等植物产生的异源性糖蛋白，例如哺乳动物糖蛋白，包括，例如，本说明书中其他地方描述的糖蛋白。在一些实施方案中，糖蛋白是单克隆抗体。在其他实施方案中，糖蛋白选自干扰素、红细胞生成素(EPO)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、纤溶酶原、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和治疗性免疫球蛋白。

通过使用本发明的方法，可能在扩大的生产中保持转基因植物中产生的糖蛋白的N糖基化特征谱中减少的不均一性，从而植物继续产生糖蛋白以使其N糖基化特征谱的特征在于出现在特征谱中的N聚糖种类的数目减少。“扩大的生产”或“生产规模的增大”意指存在于培养系统(即在其中培养植物的培养瓶或培养容器)中的植物生物量的量的增加，所述培养系统用于产生目的蛋白质(在该情况下，是目的糖蛋白)。因此，例如当从适合于研究目的的规模扩大生产至适合于中试生产的规模，和进一步至适合于目的糖蛋白的商业生产的规模时，扩大的生产发生。

在一些实施方案中，转基因高等植物是用作糖蛋白的重组产生的单子叶植物，例如，浮萍植物，重组产生的糖蛋白的N糖基化特征谱的减少的不均一性在生产规模的增大中得到保持，其中生产规模增加为初始起始生物量的至少300倍、至少500倍、至少700倍、至少1，000倍、至少1,500倍或更大倍数。在这些实施方案中的一些中，转基因植物是重组产生目的糖蛋白的浮萍植物，在N糖基化特征谱的减少的不均一性在生产规模的扩大中得到保持，其中生产规模增加为初始起始生物量的至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少6,500倍或更大倍数。在一个这样的实施方案中，高等植物是重组产生目的糖蛋白的浮萍，该糖蛋白的N糖基化特征谱的减少的不均一性在生产规模的扩大中得到保持，其中生产规模增加为初始起始生物量的至少7,000倍、8,000倍、9,000倍、10,000倍、12,500倍，15,000倍、17,500倍、20,000倍、23,000倍、26,000倍或更大倍数。

此外，当通过连续克隆培养保持目的转基因植物时，所得的转基因植物持续产生展示它们的N糖基化特征谱中的减少的不均一性的糖蛋白。使用本领域内已知的任何合适的方法进行持续克隆培养。在一些实施方案中，通过周期性地取出植物培养物的一个或多个次级样本并且将次级样本转移至新配制的培养基中进行进一步培养。因此，例如，在一些实施方案中，通过持续克隆培养保持的转基因植物系是已进行遗传修饰从而减少或消除岩藻糖残基转移酶和/或木糖基转移酶的表达或功能的浮萍转基因植物系。通过该方式，转基因植物系中产生的糖蛋白的N糖基化特征谱的减少的不均一性在转基因植物系的持续克隆培养中保持至少8个月、至少10个月、至少1年、至少1.5年、至少2年、至少2.5年、至少3年、至少3.5年、至少4年、至少4.5年、至少5年或更长时间，和只要转基因植物得到保持就可得到保持。

异源多肽和糖蛋白

高等植物，特别是用作用于药物用途的重组蛋白的表达系统、使用此处公开的方法稳定地转化以产生具有改变的N糖基化模式的糖蛋白的高等植物，可进行遗传修饰以产生任何目的重组蛋白。当重组蛋白是其中可应用翻译后糖基化的蛋白时，本发明的方法有利地提供了产生具有N糖基化模式的这些糖蛋白的方法，所述N糖基化模式更密切地反映哺乳动物宿主的糖基化模式，特别是被“人源化”的糖基化模式。目的重组蛋白的实例包括，但不限于，胰岛素、生长激素、纤溶酶原、α干扰素、β干扰素、β葡糖脑苷脂酶、β-葡糖甘酸酶、视网膜母细胞瘤蛋白、p53蛋白、制管张素、瘦素、单克隆抗体和其片段、细胞因子例如红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、组织纤溶酶原激活物、血液凝血因子例如因子VII、因子VIII、因子IX和激活蛋白C、α1-抗胰蛋白酶、受体、激素、人疫苗、动物疫苗、肽和血清白蛋白。此外，本发明的转基因高等植物能够产生糖蛋白产物，所述糖蛋白产物对于G0聚糖种类具有大体上均一的糖基化特征谱，和特征在于其对于G0糖形的大体上的均一性。这有利地导致植物宿主表达系统，所述植物宿主表达系统具有增加的生产一致性以及与这些糖蛋白组合物的产生相关的减少的化学、制造和控制(CMC)风险。包含药学上可接受的载体的组合物包含按照本发明的方法产生的糖蛋白组合物。这样的组合物用于就疾病或病症(使用糖蛋白的治疗将给所述疾病或病症提供治疗益处)治疗受试者的方法。通过该方式，可对需要其的受试者施用已在按照本发明的方法稳定转化的植物例如浮萍植物中产生的糖蛋白。

本发明的糖蛋白组合物包含主要为G0聚糖结构的N连接的聚糖。通过该方式，本发明提供了具有糖基化特征谱的糖蛋白组合物，所述特征谱是“大体上均一的”或“大体上一致的”或具有本说明书中上面所定义的“大体的均一性”。因此，在一些实施方案中，糖蛋白组合物对于G0聚糖种类大体上是均一的，因而具有大体上均一的糖基化特征谱，其中，出现在组合物的糖基化特征谱中的N聚糖种类的总量的至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％由G0聚糖种类代表，痕量的前体N聚糖种类出现在糖基化特征谱中，即存在于糖基化特征中的任何给定的前体N聚糖种类以低于5％、优选低于4％、低于3％、低于2％、低于1％和甚至低于0.5％或甚至低于0.1％的出现在特征谱中的N聚糖种类的总量存在。对于该组合物，出现在其糖基化特征谱中的代表性N聚糖种类可以是上述的Man3GlcNAc2、MGn(GlcNaclMan3GlcNAc2其中GlcNacl附着至1，3甘露糖臂)和GnM(GlcNaclMan3GlcNAc2，其中GlcNacl附着至1，6甘露糖臂)前体N聚糖种类，其中可以存在任何单个的前体N聚糖种类或这些前体N聚糖种类的任何组合。

通过该方式，本发明提供了“大体上均一的”或“大体上一致的”的糖蛋白组合物或具有本说明书中上面定义的“大体均一性”的糖蛋白组合物。在一些实施方案中，本发明提供了大体上均一的糖蛋白组合物，其中至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的存在于组合物中的糖蛋白由G0糖形表示，其中所有预期的糖基化位点由G0聚糖种类占据，痕量的前体或不希望的糖形存在于组合物中，即，前体糖形代表低于5％、低于4％、低于3％、低于2％、低于1％或甚至低于0.5％或甚至低于0.1％的存在于组合物中的总糖形。在这样的组合物中，代表性前体糖形是其中糖基化位点被占据的糖形，示例性不希望的糖形是具有附着至其糖基化位点的G0聚糖和G0X或G0XF3聚糖种类的混合的糖形。

在本发明的一些实施方案中，植物宿主细胞包含提供抗体的表达的一个或多个多核苷酸，所述抗体特异性结合目的哺乳动物蛋白，特别是目的人蛋白。因此，在一个方面，本发明提供了用于在高等植物中产生单克隆抗体的方法，其中单克隆抗体具有反映N连接的聚糖中的β1，2-连接的木糖残基和α1，3-连接的岩藻糖残基的量减少的N糖基化模式，以及包含使用以此处所示的方式进行遗传修饰的植物宿主产生的重组单克隆抗体的组合物。在一些实施方案中，目的植物宿主是浮萍家族的成员。

单克隆抗体日益用作治疗人疾病(包括但不限于癌症和具有自身免疫或炎症性组分的疾病)的治疗剂。参见，例如，King(1999)Curr.Opin.Drug Discovery Dev.2：110-17；Vaswani和Hamilton(1998)Ann.Allergy Asthma Immunol.81：105-19；以及Hollige和Hoogenboom，Nat.Biotechnology16：1015-16；其各自通过引用纳入本文。尽管这些抗体中的一些具有只由抗原结合引起的治疗效应，例如结合受体或配体以阻止配体-受体相互作用的抗体，其他抗体需要效应子作用例如杀死靶细胞以获得治疗性活性的免疫系统的募集反应。参见，例如，Clynes等人(2000)NatMed.6：443-46；Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.95：652-56，和Anderson等人(1997)Biochem.Soc.Trans.25：705-8；其各自通过引用纳入本文。

抗体的抗原识别活性和效应子作用存在于抗体分子的不同部分。抗体的Fab′部分提供抗原识别活性，而Fc部分提供效应子作用例如副效应细胞(accessory effector cell)包括吞噬细胞(phagocyticcell)(巨噬细胞和嗜中性粒细胞)、天然杀伤细胞和肥大细胞的激活。抗体通过Fc区域结合细胞，抗体Fc区域上的Fc受体位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对于不同类型的抗体是特异性的Fc受体，所述抗体包括IgG(γ受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发了许多重要的各种生物反应，包括抗体包被的颗粒的吞食和破坏、免疫复合物的清除、通过杀伤细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)进行的抗体包被的靶细胞的裂解、补体依赖性细胞毒性(CDC)的引发、炎症介质的释放和免疫球蛋白产量的控制。用于测定抗体的效应子作用的方法在本领域内是熟知的且包括用于CDC、ADCC和细胞凋亡的测定法。参见，例如，Subbramanian等人(2002)J.Clin.Microbiol.40：2141-2146；Ahman等人(1994)J.Immunol.Methods36：243-254；Brezicka等人(2000)Cancer Immunol.Immunother.49：235-242；Gazzano-Santoro等人(1997)J.Immunol.Methods202：163-171；Prang等人(2005)BritishJ.Cancer92：342-349；Shan等人(1998)Blood 92：3756-3771；Ghetie等人(2001)Blood97：1392-1398；和Mathas等人(2000)Cancer Research60：7170-7176；其全部通过引用纳入本文。

本领域内已知，抗体分子的Fc部分的糖基化状态在确定抗体是否具有效应子作用中起着关键作用。参见，例如，Tao和Morrison(1987)J.Immunol.143：2595-601；Wright和Morrison(1997)Trends inBiotech.15：26-32；Wright和Morrison(1998)J.Immunol.160：3393-402；Mimura等人(2000)Mol.Immunol.37：697-706；Jefferis和Lund(2002)Immunol.Lett.82：57-65；Krapp等人(2003)J.Mol.Biol.325：979-89；和Jefferis(2005)Biotechnol.Prog.21：11-16；其各自通过引用纳入本文。取决于所使用的表达系统，重组产生的抗体的糖基化可以变化。参见，例如，Raju等人(2000)Glycobiology10：477-86；Wright和Morrison(1997)Trendsin Biotech.15：26-32。此外，当改变哺乳动物产生的单克隆抗体的N糖基化形式以减少或消除α(1，6)-连接的核心岩藻糖残基时，单克隆抗体展示增加的效应子作用，特别是增加的ADCC活性。参见，例如，美国专利6,946,292。对于一些哺乳动物产生的单克隆抗体，当改变N糖基化形式以减少或消除附着至1，3和/或1，6甘露糖臂的β(1，4)-半乳糖残基时，可减少抗携带抗原的靶细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)的激活而不改变抗体的其他功能活性包括ADCC活性。参见，例如，Boyd等人(1995)Mol.Immunol.32：1311-1318。

可通过高等植物宿主例如浮萍来产生具有抗原识别活性和在一些实施方案中具有提高的效应子作用的抗体，所述浮萍已通过此处所示的方式进行了稳定的转化，从而改变了其糖基化机构。因此，本发明提供了用于产生重组单克隆抗体的方法，所述抗体包括具有提高的效应子作用的单克隆抗体，其中在植物中重组产生抗体，所述植物具有在其中产生的内源性和异源性糖蛋白的改变的N糖基化模式，以使这些糖蛋白展示减少的附着至其N聚糖的植物特异性β1，2-连接的木糖残基和/或α1，3-连接的岩藻糖的量。当抗体具有减少量的附着至其N聚糖的α1，3-连接的岩藻糖残基时，与未进行遗传修饰以抑制FucT的表达或功能的对照植物中产生的抗体相比，抗体具有增加的ADCC活性。

还包括具有效应子作用(在一些实施方案，提高的效应子作用)的重组单克隆抗体，其中在已进行了遗传修饰从而抑制SEQ ID NO：3的FucT和/或SEQ ID NO：6的XylT和其任何同种型例如，包含SEQ IDNO：21中所示的序列(由SEQ ID NO：20编码)的XylT同种型#2的表达或功能的浮萍表达系统中产生抗体。因此，在一些实施方案中，用作用于单克隆抗体的重组产生的宿主的植物是本说明书中其他地方提及的浮萍科的成员，例如浮萍植物，所述浮萍植物包含例如上面描述的稳定地整合入其基因组的XylTRNAi表达盒和/或FucTRNAi表达盒。通过该方式，本发明提供了用于产生具有糖基化模式和具有提高的效应子作用的重组单克隆抗体，所述N糖基化模式与在哺乳动物表达系统中发现的N糖基化模式更密切相似。其中方法包括在已进行了遗传修饰从而改变糖基化机构的浮萍植物或浮萍细胞或浮萍结节中表达抗体的1条或多条链，以使重组产生的单克隆抗体展示减少的植物β1，2-连接的木糖残基和/或α1，3-连接的岩藻糖残基至其N聚糖的附着，和在适合于单克隆抗体表达的条件下，培养浮萍植物或浮萍细胞或浮萍结节。

因此本发明提供了新的抗体组合物，其中抗体包含主要为G0聚糖结构的N连接的聚糖。通过该方式，本发明提供了具有糖基化特征谱的抗体组合物，例如单克隆抗体组合物，所述特征谱是“大体上均一的”或“大体上一致的”或具有本说明书中上面定义的“大体均一性”。因此，在一些实施方案中，抗体组合物对于G0聚糖种类大体上是均一的，从而具有大体上均一的糖基化特征谱，其中出现在组合物的糖基化特征谱中的N聚糖种类的总量的至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％由G0聚糖种类代表，痕量前体N聚糖出现在糖基化特征谱中，即存在于糖基化特征谱中的任何给定的前体N聚糖种类以低于5％、优选低于4％、低于3％、低于2％、低于1％和甚至低于0.5％或甚至低于0.1％的出现在特征谱上的N聚糖种类的总量存在。对于这样的组合物，出现在其糖基化特征谱中的代表性N聚糖种类可以是例如上述的Man3GlcNAc2、MGn(GlcNaclMan3GlcNAc2，其中GlcNacl附着至1，3甘露糖臂)和GnM(GlcNaclMan3GlcNAc2，其中GlcNacl附着至1，6甘露糖臂)前体N聚糖种类，其中可以存在任何单个的前体N聚糖种类或这些前体N聚糖种类的任何组合。

在一个这样的实施方案中，单克隆抗体组合物具有大体上均一的糖基化特征谱，其中出现在组合物的糖基化特征谱中的N聚糖种类的总量的95.8％由G0聚糖种类(GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)代表，下列前体N聚糖种类出现在糖基化特征谱中的：Man₃GlcNAc₂(0.67％)、GlcNAcMan₃GlcNAc₂(1.6％)、GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(1.2％)、Man₆GlcNAc₂(0.21％)、Man₇GlcNAc₂(0.30％)和Man₈GlcNAc₂(0.28％)。可将这与从“野生型”浮萍植物表达系统(其中表达相同的单克隆抗体但其中浮萍植物的糖基化机构未进行遗修饰以抑制XylT或FucT的表达)获得的单克隆抗体组合物比较。这样的“野生型”来源的单克隆抗体组合物具有更不均一的糖基化特征谱，所述牲特征谱的特征在于两个主要的N聚糖种类即G0XF³和G0X以及以痕量存在的几个前体N聚糖种类。在一个这样的实施方案中，“野生型”来源的单克隆抗体组合物具有特征谱，所述特征谱具有示于其中的下列N聚糖种类：G0(GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂)(8.4％)、G0X(GlcNAc₂[Xyl]Man₃GlcNAc₂)(17.2％)、G0XF³(GlcNAc₂[Xyl]Man₃[Fuc]GlcNAc₂)(67.4％)、Man₃GlcNAc₂(0.26％)、GlcNAcMan₃GlcNAc₂(0.40％)、(Xyl)Man₃(Fuc)GlcNAc₂(0.76％)、GlcNAc₂Man₃(Fuc)GlcNAc₂(2.1％)、GlcNAc(Xyl)Man₃(Fuc)GlcNAc₂(1.4％)、Man₆GlcNAc₂(0.21％)、Man₇GlcNAc₂(0.63％)、

Gal(Fuc)GlcNAc₂(Xyl)Man₃(Fuc)GlcNAc₂(0.26％)、Man₈GlcNAc₂(0.61％)和Man₉GlcNAc₂(0.40％)。

通过该方式，本发明提供了“大体上均一的”或“大体上一致的”的具有本说明中上面定义的“大体均一性”的抗体组合物。在一些实施方案中，本发明提供了大体上均一的抗体组合物，例如单克隆抗体组合物，其中至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的存在于组合物中的抗体由G0糖形代表，其中所有预期的糖基化位点(例如，IgG型抗体的重链的C_H2结构域的Asn-297残基的各残基)都被G0聚糖种类占据，痕量前体聚糖存在于组合物中。在一种这样的组合物中，前体糖形选自具有Fc区域的抗体，其中一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖种类，另一条重链的C_H2结构域未被糖基化；具有Fc区域的抗体，其中一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖种类，另一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的GnM或MGn前体聚糖；和具有Fc区域的抗体，其中各C_H2结构域上的Asn297糖基化位点具有附着的G0聚糖种类，第三G0聚糖种类附着至mAb结构内的另外的糖基化位点；其中存在痕量的这些前体糖形，即前体糖形代表低于5％、低于4％、低于3％、低于2％、低于1％或甚至低于0.5％或低于0.1％的存在于抗体组合物中的总糖形。

本发明的大体上均一的抗体组合物(其中至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的存在于组合物中的抗体由G0糖形代表)代表了“聚糖最优化的抗体”。“聚糖最优化的抗体”意指本发明的抗体在它们的糖基化模式方面已进行了基因工程改造，从而使它们对于G0糖形是大体上均一的，这产生了具有提高的Fc效应子作用的抗体。“提高的Fc效应子作用”意指这些抗体与由于产物加工的原因而具有更多不均一的糖基化特征的相同序列的抗体(即，具有相同氨基酸序列的抗体)相比，具有增加的ADCC活生。因此，例如，哺乳动物宿主表达系统例如CHO细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞或未进行遗传修饰以抑制XylT和FucT表达的其他植物细胞中产生的抗体倾向于具有更不均一的糖基化特征谱，从而具有可影响抗体产物的总体效应子作用的糖形的混合。本发明的抗体组合物的G0糖形有利地提供了具有与岩藻糖残基的不存在相关的增加的ADCC活性的抗体组合物。在一些实施方案中，与具有不均一的糖基化特征(即，多种糖形以主要糖形的形式存在于抗体组合物中)的相同序列的抗体相比，ADCC活性增加为其的25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍、500倍或甚至1000倍。此外，G0糖形缺乏存在于具有G2糖形的抗体中的末端Gal残基。这样，主要具有G0糖形的本发明的这些大体上均一的抗体组合物具有增加的ADCC/CDC比。此外，主要具有G0糖形的本发明的这些大体上均一的抗体组合物具有增加的对FcγRIII例如FcγRIIIa的结合，其中结合亲和力与对于具有不均一的糖基化特征谱(从而具有糖形的混合)的相同序列的抗体组合物所观察到的亲和力相比，增加为其的大约20倍、30倍、40倍、50倍、75倍至100倍。对于肿瘤学和自身免疫性疾病，具有增加的对Fc受体，例如FcγRIII的结合亲和力的治疗性抗体与增加的功效和对治疗的提高的反应强烈相关。

在本发明的一些实施方案中，主要具有G0糖形的本发明的大体上均一的抗体组合物，当与对于具有不均一的糖基化特征谱(从而具有糖形的混合)的相同序列的抗体组合物所观察到的CDC活性相比，具有改变的CDC活性。例如，在一个这样的实施方案中，本发明的大体上均一的抗体组合主要具有G0糖形和当与对于具有不均一的糖基化特征谱(从而具有糖形的混合)的相同序列的抗体组合物所观察到的CDC活性相比，具有减少的CDC活性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了主要具有G0糖形和具有CDC活性(当与具有不均一糖基化特征谱的相同序列的抗体组合物相比时，减少了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至100％)的大体上均一的抗体组合物。在这些实施方案中的一些实施方案中，主要具有G0糖形和减少的CDC活性的大体上均一的抗体组合物的进一步特征在于，当与具有不均一糖基化特征谱的相同序列的抗体组合物相比时具有增加的ADCC活性。

不受任何作用理论或机制的束缚，具有减少的CDC活性和相似的或增加的ADCC活性(以上述方式)的本发明的大体上均一的G0糖形抗体组合物可以有利地提供增加的抗靶细胞的细胞毒性，同时减少潜在的不利的副作用(所述副作用可与其施用后引起的补体激活相关)。通过减少这些不利副作用的概率，可以有利地以更快速的输注速度施用大体上均一的主要具有G0糖形的抗体组合物，从而在任何给定的施用时减少给药时间，和/或如果得到保证，可以以更高的初始浓度剂量给药，减少对引发与补体激活相关的不利副作用的担心。

例如，补体激活在发病机理中对缓和使用嵌合型抗CD20单克隆抗体IDEC-C2B8(IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California；可以商品名

(也称为利妥昔单抗)商购获得)的治疗的严重首次剂量副效应起着中枢作用。参见，例如，van der Kolk等人(2001)British J.Haematol.115：807-811。产品中的利妥昔单抗在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，从而抗体组合物包含不均一的糖基化特征谱(即，糖形的混合)。已显示利妥昔单抗的CDC活性与半乳糖含量相关。通过该方式，随着半乳糖残基的数目从0增加至2摩尔/摩尔重链，CDC活性的水平从对于具有1摩尔半乳糖/摩尔重链的抗体(参见，网址fda.gov/Cder/biologics/review/ritugen112697上的IDEC BLA97-0260，可在互联网上获得)观察到的最大值的80％(β-半乳糖苷酶处理以从附着至重链的C_H2结构域的Asn297的N聚糖的1，3和1，6甘露糖臂除去所有β-(1，4)半乳糖残基)增加至150％(UDP半乳糖基转移酶处理以确保β-(1，4)半乳糖残基附着至附着至Asn297位点的N聚糖的1，3和1，6甘露糖臂)。包含抗CD20抗体(所述抗体具有与利妥昔单抗(rituximab)相同的序列和主要具有G0糖形)的大体上均一的抗CD20抗体组合物有利地具有减少的CDC活性，从而减少，当抗体组合物包含不均一的糖基化特征谱(即，糖形的混合)时，通常与抗体施用后的补体激活相关的不利副作用的可能。

因此，本发明的具有减少的CDC活性和相同的或增加的ADCC活性的大体上均一的G0糖形抗体组合物可有利地用于治疗应用，作为因通常与相同序列的抗体的组合物(所述抗体组合物包含不均一的糖基化特征谱(即，糖形的混合))施用后的补体激活相关的不利副作用而引起的并发症的结果，所述治疗应用对于一个或多个患者群体迄今仍然是不合适的、不可取的或无效。此类副作用包括，但不限于，可与抗体的第一次和/或快速施用相关的中度至严重的副作用，包括，例如发烧和/或受寒、恶心、呼吸困难、潮红等。参见，例如，van der Kolk等人(2001)British J.Haematol.115：807-811和其中引用的参考文献；Winkler等人(1999)Blood 94：2217-2224)。通过该方式，本发明提供了减少一种或多种与抗体例如单克隆抗体施用后的补体激活相关的不利副作用的方法，方法包括施用本说明书中上面定义的大体上均一的抗体组合物，从而至少80％、至少85％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的存在于组合物中的抗体由G0糖形代表，痕量的前体糖形存在于组合物中。在一些实施方案中，至少90％、至少95％或至少99％的存在于组合物中的抗体由G0糖形代表，痕量的前体糖形存在于组合物中。

作为它们的增加的Fc效应子作用的结果，本发明的大体上均一的主要具有G0糖型的抗体组合物提供了新的和改进的给药途径的机会，例如，将已知的治疗性抗体的可能的给药途径扩展至除了输注和静脉内给药外的其他给药途径，例如扩展至皮下给药。此外，作为它们的增加的潜能的结果，本发明的抗体组合物可以以更低的剂量给药，或以更小的体积给药，和以更低的频率给药。施用的抗体组合物的体积的减少在其中由与单克隆抗体的输液反应引起的不利事件是体积相关的情况下是特别有利的。本发明的抗体的增加的效率也为现有的mAb靶(所述靶可以不对使用更不均一的糖形抗体组合物的抗体治疗产生反应)打开了新临床适应症，和提供了重访之前未开发的mAb靶的能力。

按照本发明的方法产生的单克隆抗体可包含在含有药学上可接受的载体的组合物中。这样的组合物用于治疗需要抗体(所述抗体具有效应子作用和在一些实施方案中提高的效应子作用)的受试者的方法，其中FucT的表达被靶向抑制。通过该方式，可以对需要其的受试者施用按照本发明的方法稳定转化的植物例如浮萍植物中产生的单克隆抗体。

可按照本发明的方法在经遗传修饰的植物宿主内产生任何抗体。在一个实施方案中，抗体是治疗性抗体。已批准抗体用于治疗许多病症，许多另外的治疗性抗体正在开发中。参见，Brekke和Sandlie(2003)Nat.ReV.Drug.Discov.2(3)：240，通过引用纳入本文。可通过本发明的方法表达的治疗性抗体的实例包括，但不限于，靶向CD3抗原的抗CD3抗体(例如，

；抗血小板gpIIb/IIIa抗体(例如阿昔单抗(之前称为c7E3Fab)，以

配销)；抗EpCAM抗体(例如，

靶向CD20抗原的抗CD20抗体(例如利妥昔单抗，以

配销；参见美国专利5,736,137，通过引用纳入本文)；抗IL-2受体(例如

；抗ERBB2(例如曲妥单抗，以

配销；参见美国专利6,165,464，通过引用纳入本文)；抗TNF-α(例如，英夫利昔单抗，以

配销)、抗F蛋白(例如

；靶向CD30抗原的抗CD30抗体(参见，例如，Borchmann等人(2003)Blood102：3737-3742和本说明书中下面描述的实施例6中描述的5F11抗体，也参见WO03/059282和美国专利申请公开号2004/0006215，通过引用纳入本文；Wah1等人(2002)Cancer Res.61：3736-3742中描述的SGN-30抗体，AC10抗CD30抗体的嵌合形式，也参见美国专利申请公开号20040018194和美国专利7,090,843，通过引用纳入本文)；靶向抗CD33抗原的CD33抗体(例如

参见美国专利5,733,001，通过引用纳入本文)；靶向抗CD25抗原的抗CD52抗体(例如，阿仑单抗，以

配销；参见美国专利5,846,534，通过引用纳入本文)；抗CD20(例如，

抗IgEFc(例如，omalizumab，在

下销售)；抗VEGF(例如，贝伐单抗，以

配销；参见，Presta等人.(1997)Cancer Res.57：4593-9；通过引用纳入本文)；抗EGF-R(例如，西妥昔单抗，以

配销)；抗CD1la(例如efalizumab，在

下销售)，抗IL-8；抗C5；抗TNF-α(例如阿达木单抗，以配销)；抗TGF-β2；抗IL2受体(例如达(克)珠单抗(赛尼哌)和巴利昔单抗(Simulect))；抗α-4-整联蛋白；抗CD4；抗CD2；抗CD19(例如MT103，双特异性抗体)；靶向CD22抗原的抗CD22抗体(例如单克隆抗体BL-22)；靶向恶性B细胞上的CD23抗原的抗CD23抗体(例如IDEC-152)；靶向CD80抗原的抗CD80抗体(例如IDEC-114)；靶向恶性B细胞上的CD38抗原的抗CD38抗体；靶向巨噬细胞集落刺激因子的α-M-CSF抗体；靶向在多发性骨髓瘤中过度表达的核因子-κB的受体激活物(RANK)和其配体(RANKL)的抗体；靶向抗恶性B细胞上的CD40抗原的CD40抗体(例如SGN-40)；靶向肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导的配体受体1(TRAIL-R1)的抗体(例如拮抗人单克隆抗体HGS-ETR1)和在许多实体瘤和造血源的肿瘤上表达的TRAIL-R2)抗HBV抗体；或抗MHC类型II抗体。已知这些抗体中的许多抗体需要效应子活性以进行CDC和/或ADCC功能，例如

和

在一些实施方案中，以此处所示方式进行遗传修饰从而改变基糖基化机构的植物宿主例如浮萍可表达生物活性α-2b干扰素，例如人α-2b-干扰素前体(NCBI蛋白质登录号AAB59402)或成熟人α-2b-干扰素(NCBI蛋白质登录号AAB9402的氨基酸24-188)或其生物活性变体。人α-2b-干扰素的生物活性变体的实例在本领域内是已知的。参见，例如，WO2005/035767，公开了α-2b-干扰素的截短的形式；欧洲专利EP211148B1；和美国专利4,748,233、4,801,685、4,816,566、4,973,479、4,975,276、5,089,400、5,098,703、5,231,176和5,869,293；通过引用纳入本文。在其他实施方案中，植物宿主例如浮萍可表达具有或不具有其伴随信号肽的生物活性成熟人生长激素。植物宿主也可表达人生长激素的生物活性变体。参见，例如，WO02/10414，涉及使用浮萍表达系统表达生物活性多肽。

在其他实施方案中，植物宿主例如浮萍可表达纤溶酶原、微小纤溶酶原或其生物活性变体。有待植物宿主中表达的纤溶酶原、微小纤溶酶原可来自任何哺乳动物来源。在一些实施方案中，纤溶酶原、微小纤溶酶原是人或猪的。参见，例如，WO2005/078109，涉及使用浮萍表达系统表达这些蛋白质。

这些异源性多肽的“生物活性变体”意指通过对天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(所谓的截断)或添加1个或多个氨基酸；通过在天然蛋白质的1个或多个位点缺失或添加1个或多个氨基酸；或通过在天然蛋白质的1个或多个位点置换1个或多个氨基酸来从天然多肽产生的多肽。本发明包括的异源性多肽的变体保持天然多肽的生物活性。

例如，α-2b-干扰素的生物活性变体持续具有天然α-2b-干扰素的希望的生物活性，包括增加对病毒感染的抗性的能力，或调控α-2b-干扰素调控的基因靶的转录的能力。这样的生物活性变体可由例如遗传多态性或人工操作产生。目的异源性蛋白的生物活性变体具有与目的异源性蛋白的氨基酸序列至少大约50％、60％、65％、70％、通常至少大约75％、80％、85％，优选至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，和更优选至少大约98％、99％或更大的序列同一性。因此，例如，天然α-2b-干扰素的生物活性变体具有与人α-2b-干扰素前体(NCBI蛋白质登录号AAB59402)或成熟人α-2b-干扰素(NCBI蛋白质登录号AAB9402的氨基酸24-188)的氨基酸序列至少大约50％，60％，65％，70％，通常至少大约75％，80％，85％，优选至少大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，和更优选至少大约98％，99％或更大的序列同一性，其中使用本说明书中上面鉴定的参数确定序列同一性。因此，目的天然异源性蛋白南的生物活性变体可以与该蛋白相异少至1-15个氨基酸残在，少至1至10个，例如6至10个，少至5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。

在一个实施方案中，已以此处所示的方式进行遗传修饰从而改变其糖基化机构的植物宿主是表达生物活性多肽的稳定地转化的浮萍植物或浮萍细胞或浮萍结节，因为成本或物流限制或两者，不能通过现有的基因表达系统有效地商业化生产所述多肽。例如，因为蛋白质干扰细胞的生活力、细胞增殖、细胞分化或哺乳动物细胞中的蛋白质装配，因而一些蛋白质不能在哺乳动物系统中表达。这样的蛋白质包括，但不限于，视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein)、p53、制管张素和瘦素。本发明可有利地用于产生哺乳动物调控蛋白；不可能假定高等植物和哺乳动物之间存在巨大的进化距离，因为这些蛋白质将在浮萍中干扰调控过程。转基因浮萍还可用于生产大量蛋白质例如挑战现有表达系统的生产能力的血清白蛋白(特别地，人血清白蛋白)、血红蛋白和胶原蛋白。

最后，高等植物系统可进行基因工程改造以能够远比哺乳动物系统更容易地产生生物活性多聚体蛋白(例如单克隆抗体、血红蛋白、P450氧化酶和胶原等)。用于在浮萍中生产生物活性多聚体蛋白的一个示例性方法使用包含编码所有多肽亚基的表达载体。参见，例如During等人(1990)Plant Mol.Biol.15：281和van Engelen等人(1994)Plan tMol.Biol.26：1701。可将包含XylT和/或FucT抑制性多核苷酸的表达盒导入这样的载体。然后使用任何已知的方法例如基因枪轰击或农杆菌介导的转化将该载体导入浮萍细胞。该方法导致产生表达装配多聚体蛋白所必需的所有多肽以及改变糖蛋白的N聚糖的糖基化模式的XylT和/或FucT抑制性序列的克隆性细胞系。因此，在一些实施方案，转化的浮萍包含1个或多个编码单克隆抗体或Fab′抗体片段的重链和轻链的表达载体，和包含XylT和/或FucT抑制性多核苷酸的表达载体，在浮萍中从表达的重链和轻链装配单克隆抗体或抗体片段。

关于该方法的变型是产生单基因构建体，将来自这些构建体的DNA混合在一起，然后使用基因枪轰击或农杆菌介导的转化将该DNA混合物递送入植物细胞。作为进一步的变型，一些或所有的载体可编码多聚休蛋白的多于1个的亚基(即，以使存在比多聚体蛋白中的亚基数目更少的浮萍克隆杂交)。在可选择的实施方案，各浮萍克隆已进行了遗传修饰，从而改变其糖基化机构和表达多聚体蛋白的至少1个亚基，将分泌各亚基的浮萍克隆在一起培养，从而在培养基中从不同的分泌亚基装配多聚体蛋白。在一些情况下，可以希望在转化的浮萍植物或浮萍结节培养物中产生少于多聚体蛋白的所有亚基，或甚至单个蛋白质亚基，例如以进行工业或化学加工或用于诊断、治疗或接种目的。

在本发明的一些实施方案中，目的转基因植物宿主是此处描述的糖蛋白的“高表达子”，包括，例如，包含主要为G0聚糖结构的N连接的聚糖的糖蛋白。“高表达子”意指已进行基因工程改造从而产生此处描述的糖蛋白的转基因植物宿主能够以这样的水平(即以使目的糖蛋白代表至少5％或更多的转基因植物宿主中产生的总的可溶性蛋白的水平)产生目的糖蛋白。在一些实施方案中，“高表达子”是已进行基因工程改造从而产生此处描述的糖蛋白以使目的糖蛋白代表至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多的转基因植物宿主中产生的总的可溶性蛋白。因此，例如，在一个实施方案，转基因植物宿主是已进行基因工程改造从而抑制XylT和FucT的表达的转基因浮萍，转基因浮萍是此处描述的糖蛋白的高表达子。在这些实施方案中的一些实施方案中，转基因浮萍是主要具有本说明书中上面描述的G0糖形的聚糖最优化的单克隆抗体的高表达子。在其他实施方案，转基因浮萍表达聚糖最优化的单克隆抗体以使该糖蛋白代表大约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多的总的可溶性蛋白。

糖蛋白的进一步人源化

在一些实施方案，可以希望本发明的糖蛋白包含具有附着至1，3和/或1，6甘露糖臂的末端β(1，4)-半乳糖残基的复杂N聚糖。不受理论束缚，这些末端半乳糖残基可促成糖蛋白的治疗性功能和/或药物代谢动力学活性。要认识到，可将本发明的方法与本领域内已知的其他方法配对以进一步修饰本发明的糖蛋白，以使附着至其的1个或多个N聚糖包含1个或多人末端半乳糖残基，即，其中N聚糖的1个或多个由G1或G2聚糖种类代表。通过该方式，可以例如使用糖基转移酶酶促修饰本发明的糖蛋白组合物，包括此处描述的单克隆抗体以获得具有对于G1，优选G2聚糖种类大体上均一的糖基化特征谱的糖蛋白。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0191256，通过以其全文引用纳入本文，其教导通过糖基化转移酶修饰底物糖蛋白(subs trateglycoprotein)以获得其中基本上所有N连接的聚糖种类为G2形式的糖蛋白。通过该方式，目的糖蛋白可以在半乳糖基转移酶和金属盐存在的情况下与活化的半乳糖反应。半乳糖基转移酶可以是哺乳动物β1，4半乳糖基转移酶(GalT)，例如人GalT，活化的半乳糖可以是例如UDP半乳糖。

可选择地，可就它们的糖基化机构进一步修饰具有以此处所示的方式沉默的FucT和XylT的表达的本发明的转基因植物，以使它们表达半乳糖基转移酶和有效地将末端半乳糖残基附着至其中产生的内源性和异源性糖蛋白的N聚糖。通过该方式，可通过导入提供半乳糖基转移酶的表达的核苷酸构建体例如表达盒来进一步修饰本发明的转基因植物。半乳糖基转移酶可以是哺乳动物β1，4半乳糖基转移酶(GalT)，例如，人GalT(参见，例如，美国专利6,998,267，通过引用其全文纳入本文)或杂交体GalT(参见，例如，WO03/078637，通过引用其全文纳入本文)，其包含至少部分第一糖基化转移酶(例如植物糖基化转移酶例如木糖基转移酶、N乙酰氨基葡萄糖转移酶或岩藻糖基转移酶)的细胞质尾-跨膜区-茎区域和至少部分第二糖基转移酶(例如哺乳动物糖基转移酶，例如人GalT)的催化区域。通过在植物例如浮萍中沉默XylT和FucT的表达，和在植物例如浮萍中提供GalT的表达，例如人GalT或包含GalT例如人GalT的催化结构域的部分的杂交酶的表达，可能获得产生具有改变的糖基化模式的内源性和异源性糖蛋白的转基因植物，其中附着至其的N连接的聚糖具有减少的植物特异性木糖或植物特异性岩藻糖残基的附着，并包含末端半乳糖残基(即，G2聚糖种类)。通过该方式，可从本发明的转基因植物获得对于G2聚糖种类具有大体上均一的特征谱和/或对G2糖形大体上均一的糖蛋白。

在其他实施方案，可以希望进一步修饰本发明的糖蛋白的糖基化模式，其中附着至其的N连接的聚糖进一步包含附着至一个或两个半乳糖残基(该残基附着至1，3和1，6甘露糖臂)的末端唾液酸残基。末端唾液酸残基的加入可以是一些治疗性蛋白的持续稳定性和在一些情况下发挥功能所必需的。

取决于转基因植物系统，糖蛋白的天然唾液酸化可发生。因此，文献中已报导培养的拟南芥、烟草和苜蓿属培养细胞合成唾液酸化的糖蛋白(Shah等人(2003)Nat.Biotech.21(12)：1470-1471；Joshi和Lopez(2005)Curr.Opin.Plant Biol.8(2)：223-226)。更特别地，报导了日本水稻表达活性唾液酸转移酶样蛋白(Takashima等人(2006)J.Biochem.(Tokyo)139(2)：279-287)。因此，现有正交报导，植物具有唾液酸化糖蛋白所必需的机构。

当希望进一步修饰本发明的糖蛋白糖基化模式时，其中附着至其的N连接的聚糖进一步包含附至1个或2个半乳糖残基(所述半乳糖残基附着至1，3和1，6甘露糖臂)的末端唾液酸残基，本发明的转基因植物可进行改变以表达β-1，4半乳糖基转移酶，例如，人β-1，4半乳糖基转移酶，和表达或过量表达唾液酸转移酶。因此，例如，转基因植物可进一步进行改变以表达唾液酸转移酶例如α-2，3-和/或α-2，6-唾液酸转移酶。参见，例如WO2004/071177；和Wee等人(1998)Plant Cell 10：1759-1768；通过引用其全文纳入本文。可选择地，本发明的转基因植物可进行改变以表达β-1，4半乳糖转移酶，例如，人β-1，4半乳糖转移酶，和表达植物宿主的唾液酸途径中缺乏的任何其他酶。可在初步观察特定植物宿主例如浮萍是否表达天然或重组产生的糖蛋白上的包含唾液酸的N聚糖后，确定所使用的策略。例如，如果没有关于转基因植物宿主特别是经基因工程改造表达β-1，4半乳糖基转移酶的转基因植物宿主内产生的糖蛋白的N聚糖上存在末端唾液酸残基的证据，那么可使用这两种策略中的1个或2个来获得目的转基因植物宿主内产生的糖蛋白的N聚糖的末端唾液酸化。

可选择地，可通过体外酶的加工来修饰对于G2聚糖种类或G2糖形大体上均一的本发明的糖蛋白组合物；参见，例如，美国专利申请公开号20030040037；通过引用其全文纳入本文。

也认识到，对于本发明的转基因植物中产生的一些糖蛋白，可以希望使哺乳动物α1-6岩藻糖残基附着至N聚糖种类(所述聚糖附着至所述糖蛋白)的三甘露糖核心结构(Man₃GlcNAc₂)。在这样的实施方案，可使用本领域内已知的糖基化工程方法进步修饰本发明的转基因植物以表达α1-6岩藻糖基转移酶，例如，人α1-6岩藻糖基转移酶。

认识到，可通过对目的宿主细胞(包括此处举例的和描述的植物宿主细胞)进行基因工程改造来产生本发明的糖蛋白组合物。通过该方式，除了植物宿主外的其他蛋白质表达宿主系统，包括动物、昆虫、细菌细胞等，可用于产生本发明的糖蛋白组合物。可对此类蛋白质表达宿主系统进行基因工程改造或选择所述蛋白质表达宿主系统以表达主要的糖形或可选择地可天然产生具有主要聚糖结构的糖蛋白。产生具有主要糖形的糖蛋白的经基因工程改造的蛋白质表达宿主系统的实例包括基因敲除/突变(Shields等人(2002)JBC277：26733-26740)；基因工程(Umana等人(1999)Nature Biotech.17：176-180)；或两者的组合。可选择地，某些细胞天然表达主要的糖形，例如，鸡、人和牛(Ra ju等人(2000)Glycobiology10：477-486)。因此，可由本领域技术人员通过选择许多表达宿主系统中的至少一种来获得糖蛋白(包括免疫球蛋白例如单克隆抗体)的表达或主要具有一种本发明的特定聚糖结构的组合物。本领域中发现的用于产生糖蛋白的其他表达宿主系统包括：CHO细胞(参见，例如，WO9922764A1和WO03/035835A1)、杂交瘤细胞(Trebak等人(1999)J.Immunol.Methods230：59-70)、昆虫细胞(Hsu等人(1997)JBC 272：9062-970)。关于另外的植物宿主系统，也参见，WO04/074499A2。

可从其中重组产生它们以以它们的分离的或纯化的形式获得它们的宿主细胞收获按照本发明的方法产生的糖蛋白。通过该方式，使用本领域已知的任何常规方法从宿主细胞分离本发明的重组产生的糖蛋白和例如通过层析、电泳、透析、溶剂-溶剂提取(solvent-solventextraction)等纯化所述糖蛋白。因此，本发明还提供了纯化的糖蛋白，包括单克隆抗体组合物，其中糖蛋白具有大体上均一的糖基化特征谱，且对于G0糖形大本上是均一的。这些纯化的糖蛋白基本上不含宿主细胞的材料，但包括具有，如本说明书中上面指出的，低于大约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的污染蛋白的糖蛋白制剂。在一些实施方案中，这些纯化的糖蛋白可包含至少0.001％、0.005％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、15％、20％、25％或达到大约30％(按干重计算)的污染蛋白。此外，对于本发明的重组产生的纯化的糖蛋白，最佳培养基代表低于大约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的纯化的糖蛋白制剂中的化学前体或非目的蛋白化学物质，如本说明书中上面所指出的。因此，在一些实施方案中，这些纯化的糖蛋白中的细胞培养基组分可代表至少0.001％、0.005％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、15％、20％、25％或达到30％(按干重计算)的纯化的糖蛋白制剂中的化学前体或非目的蛋白化学物质。在一些实施方案中，分离和纯化导致不含污染性宿主蛋白、不含培养基组分和/或不含污染性宿主蛋白和培养基组分两者的纯化的糖蛋白的回收。

因此，在一些实施方案中，蛋白质表达宿主系统是植物，例如浮萍，从植物宿主获得的纯化的糖蛋白基本上不含植物细胞材料，包括其中糖蛋白的制剂具有低于30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的污染性植物蛋白的实施方案。在其他实施方案中，植物培养基代表低于大约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的纯化的糖蛋白中的化学前体或非目的蛋白化学物质。

在一些实施方案中，获自植物宿主的这些纯化的糖蛋白可包含至少0.001％、0.005％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、15％、20％、25％或达到大约30％(按干重计算)的污染性植物蛋白。在其他实施方案中，这些纯化的糖蛋白中的植物培养基组分可代表至少0.001％、0.005％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、15％、20％、25％或达到大约30％(按干重计算)的纯化的糖蛋白中的化学前体或非目的蛋白化学物质。在一些实施方案中，从植物宿主分离和纯化导致不含污染性植物蛋白、不含植物培养基组分和/或不含污染性植物蛋白和植物培养基组分两者的纯化的糖蛋白的回收。

表达盒

根据本发明，通过使用表达盒内包含的目的多核苷酸转化来获得稳定转化的高等植物例如稳定转化的浮萍。取决于目的，目的多核苷酸可以是编码目的FucT或XylT多肽，例如编码SEQ ID NO：3(FucT)或SEQ ID NO：6或21(XylT)中所示的多肽或其变体的多核苷酸，从而提供这些多肽在细胞例如植物细胞中的表达，或可以是当被稳定地导入细胞例如目的植物细胞时，能够抑制FucT或XylT多肽的表达或功能的FucT或XylT抑制性多核苷酸。

因此，在一些实施方案中，本发明的FucT和/或XylT多核苷酸，包括SEQ ID NO：1和2(FucT)以及SEQ ID NO：4、5、19和20(XylT)中所示的多核苷酸和其片段及变体，用于构建包含本说明书中上面定义的FucT和/或XylT抑制性多核苷酸的表达盒。将这样的表达盒稳定地导入目的植物或植物细胞可提供对本发明的FucT和/或XylT多肽(包括SEQ ID NO：3(FucT)和SEQ ID NO：6或21(XylT)中所示的多肽和其变体)的表达或功能的抑制，从而改变使用表达盒稳定转化的植物或植物细胞中的内源性和异源性糖蛋白的N聚糖的糖基化模式。

在一些实施方案中，还用提供目的异源性多肽例如目的哺乳动物蛋白(包括本说明书中上面指出的药用目的的哺乳动物蛋白)的表达的表达盒稳定地转化用包含FucT和/或XylT抑制性多核苷酸的表达盒稳定转化的植物或植物细胞。可在用于导入植物的相同的多核苷酸上(例如，在相同的转化载体上)提供提供目的异源性多肽的表达的表达盒，或在用于在同时或不同时间通过相同的或不同的导入方法(例如，通过相同的或不同的转化方法)导入目的植物或植物细胞的不同多核苷酸上(例如，在不同的转化载体上)提供所述表达盒。

本发明的表达盒包含至少包含与目的多核苷酸(即，编码本发明的FucT或XylT多肽的多核苷酸、FucT和/或XylT抑制性多核苷酸或编码目的异源性多肽例如哺乳动物蛋白质的多核苷酸)连接的转录起始区(例如启动子)的表达控制元件。这样的表达盒拥有多个用于插入多核苷酸或目的多核苷酸(例如1个目的多核苷酸，2个目的多核苷酸等)使之处于启动子和其他表达控制元件的转录调控之下的限制性位点。在本发明的特定的实施方案中，待转移的多核苷酸包含2个或多个表达盒，其各自编码至少一个目的多核苷酸。

“表达控制元件”意指DNA的调控区，其通常包含TATA盒，能够指导RNA聚合酶II或在一些实施方案中指导RNA聚合酶III在特定的编码序列的合适的转录起始位点起始RNA合成。表达控制元件可额外地包含通常置于TATA盒的上游或5′的其他识别序列，所述识别序列影响(例如增强)转录起始率。此外，表达控制元件可额外地包含通常置于TATA盒的下游或3′的序列，所述序列影响(例如增强)转录起始率。

转录起始区(例如启动子)对于宿主可以是天然的或同源的或外来的或异源的，或可以是天然序列或合成的序列。关于外来的，其意指转录起始区未发现于向其中导入转录起始区的野生型宿主中。“功能性启动子”意指启动子，当与编码目的蛋白的序列有效连接时，能够驱编码的蛋白的表达(即，转录和翻译)，或当与编码抑制性核苷酸分子(例如，发夹结构RNA、双链RNA、miRNA多核苷酸等)的抑制性序列有效连接时，启动子能够起始有效连接的抑制性序列的转录，从而表达抑制性核苷酸分子。可基于希望的结果选择启动子。因此，本发明的表达盒可包含组成型、组织优先型启动子或用于在植物中表达的其他启动子。

如此处所使用的，嵌合基因包含与对于编码序列是异源性的转录起始区有效连接的编码序列。

根据本发明可使用本领域内已知的任何合适的启动子，包括细菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳动物和植物的启动子。例如，可使用植物启动子，包括浮萍启动子。示例性启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒35S启动子、冠瘿碱合成酶启动子(例如nos、mas、ocs等)、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸(RubP)羧化酶小亚基启动子和乙醇脱氢酶启动子。浮萍RubP羧化酶小亚基启动子在本领域内是已知的(Silverthorne等人(1990)Plant Mol.Biol.15：49)。来自感染植物优选浮萍的病毒的其他启动子也是合适的，包括但不限于，从芋花叶病毒、小球藻病毒(例如小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶启动子；Mitra等人(1994)Plant Mol.Biol.26：85)、番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus)、烟草坏死病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、黄瓜花叶病病毒、花生stump virus、苜蓿花叶病毒、甘蔗杆状DNA病毒(sugarcane baciliform badnavirus)等分离的启动子。

其他合适的表达控制元件公开于2006年1月17日提交的被赋予美国专利申请60/759,308，Attorney DocketNo.040989/243656的标题为“Expression Control Elements from the Lemnaceae Family”的共同拥有和共同未决的临时申请，通过引用其全文纳入本文。从浮萍家族的几个成员的泛素基因分离该共同未决的申请中公开的表达控制元件，从而所述表达控制元件称为“浮萍泛素表达控制元件”。本申请的SEQ ID NO：7显示了全长浮萍泛素表达控制元件，包括启动子及5′UTR(核苷酸1-1625)和内含子(核苷酸1626-2160)。SEQ ID NO：8显示了全长紫萍泛素表达控制元件，包括启动子及5′UTR(核苷酸1-1041)和内含子(核苷酸1042-2021)。SEQ ID NO：9显示全长稀脉萍泛素表达控制元件，包括启动子及5′UTR(核苷酸1-964)和内含子(核苷酸965-2068)。SEQ ID NO：10显示浮萍泛素表达控制元件的启动子及5′UTR部分(此处命名为“LmUbq启动子”)。SEQ ID NO：11显示紫萍泛素表达控制元件的启动子及5′UTR部分(此处命名为“SpUbq启动子”)。SEQ ID NO：12显示稀脉萍泛素表达控制元件的启动子及5′UTR部分(此处命名为“LaUbq启动子”)。SEQ ID NO：13显示浮萍泛素表达控制元件的内含子部分(此处命名为“LmUbq内含子”)。SEQ ID NO：14显示紫萍泛素表达控制元件的内含子部分(此处命名为“SpUbq内含子”)。SEQ ID NO：15显示稀脉萍泛素表达控制元件的内含子部分(此处命名为“LaUbq内含子”)。认识到，SEQ IDNOs：10-12中所示的单独的启动子及5′UTR序列和其生物活性变体及片段可用于调控有效连接的目的核苷酸序列在植物中的转录。类似地，SEQ ID NOs：13-15中所示的1个或多个内含子序列和其生物活性变体及片段可与目的启动子(包括SEQ ID NO：10、11或12中所示的启动子)有效连接，以增强与该启动子有效连接的核苷酸序列的表达。

还可在表达盒中使用公开的表达控制元件的片段和变体以驱动有效连接的目的多核苷酸的表达。“表达控制元件的片段”意指全长表达控制元件的部分，例如SEQ ID NO：7-9中所示的表达控制元件中的任一个的部分。表达控制元件的片段保持生物活性，从而包括能够起始或增强有效连接的目的多核苷酸的表达的片段。因此，例如，可使用于少于此处公开的整个表达控制元件的部分驱动有效连接的目的多核苷酸表达。此类表达控制元件的片段的特定的、非限定性的实例包括SEQ ID NO：10-12(如本说明书中上面描述的)中的任一个所示的核苷酸序列，以及浮萍泛素的表达控制元件(SEQ ID NO：7)的5′截短体，例如SEQ ID NO：7的核苷酸1288-2160(LmUbq截短的启动子No.1)和SEQ ID NO：1的核苷酸1132-2160(LmUbq截短的启动子2)。参见赋予美国专利申请60/759,308的共同未决的临时申请，通过引用其全文纳入本文。

此类片段的核苷酸将通常包含特定表达控制元件的TATA识别序列。可通过使用限制性内切酶切割此处公开的天然存在的表达控制元件，通过从表达控制元件DNA序列的天然发生的序列合成核苷酸序列获得此类片段，或可通过使用聚合酶链式反应(PCR)技术获得此类片段。特别地参见，Mullis等人(1987)Methods Enzymol.155：335-350，和Erlich，ed.(1989)PCR Technology(Stockton Press，New York)。

表达控制元件的变体，例如由定点诱变产生的变体，还可用于本发明的表达盒以提供有效连接的目的多核苷酸的表达。“表达控制元件的变体”意指具有与此处公开的表达控制元件(例如，SEQ ID NO：7、9或9中所示的表达控制元件)或与其片段(例如，SEQ ID NO：10-15中所示的各序列)充分的相似性的序列。可通过使用熟知的分子生物学技术例如使用上面概述的PCR和杂交技术鉴定表达控制元件的天然存在的变体。变体的表达控制元件还包括合成产生的核苷酸序列，例如通过使用例如定点诱变产生的核苷酸序列。通常，此处公开的特定表达控制元件的变体，包括SEQ ID NO：7-15的变体，如由本说明书中上面描述的序列比对程序(使用缺省参数)所确定的，将具有与该特定核苷酸序列至少40％、50％、60％、65％、70％、通常至少75％、80％、85％、优选大约90％、91％、92％、93％、94％至95％、96％、97％和更优选大约98％、99％或更大的序列同一性。

可选择表达控制元件(包括启动子)以产生希望的调控水平。例如，在一些情况下，可以有利地使用赋予组成型表达的启动子(例如，来自根癌农杆菌的甘露碱合酶启动子)。可选择地，在其他情况下，例如，当考虑异源多性肽的表达时，可有利地使用响应特定的环境刺激而被激活的启动子(例如热激基因启动子、干旱诱导型基因启动子、病原体诱导型基因启动子、创伤诱导型基因启动子和光/黑暗诱导型基因启动子)或植物生长调节子(例如来自由脱落酸、生长素、细胞分裂素和赤霉酸诱导的基因的启动子)。作为另一种选择，可选择产生组织特异性表达的启动子(例如根、叶和花特异性启动子)。

可通过顺式作用核苷酸序列例如上游激活序列的组合和空间组构影响给定的启动子的总体强度。例如，来源于根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的激活核苷酸序列可增强通过根癌农杆菌章鱼碱合酶启动子的转录(参见属于Gelvin等人的美国专利5,955,646)。在本发明中，表达盒可包含插入启动子序列的上游以增强目的核苷酸序列的表达的激活核苷酸序列。在一个实施方案中，表达盒包含3个与来源于根癌农杆菌甘露碱合成酶基因的启动子有效连接的来源于根癌农杆菌章鱼碱合酶基因的上游激活序列(参见美国专利5,955,646，通过引用纳入本文)。

当使用表达控制元件驱动有效连接的编码小hpRNA分子(例如，本说明书中上面描述的RNAi表达盒内的)的DNA序列的表达时，有利地使用包含由DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子的表达控制元件。如此处所使用的，“由DNA依赖性RNA聚合酶III识别的启动子”是通过RNA聚合酶III的聚合酶作用指导结合的DNA区域的转录的启动子。这些包括编码5SRNA、tRNA、7SLRNA、U6 snRNA和少数其他小的稳定的RNA的基因，许多参与RNA加工。大部分由Pol III使用的启动子需要转录区内的+1下游的序列元件。然而少数pol III模板缺少对基因内启动子元件的需要。这些启动子称为类型3启动子。“类型3PoIII启动子”意指由RNA聚合酶III识别的且包含所有顺式作用元件的启动子，所述启动子在通常由RNA聚合酶III转录的区域的上游与RNA聚合酶III相互作用。这样的类型3PolIII启动子可在本发明的RNAi表达盒内装配，从而驱动有效连接的编码小hpRNA分子的DNA序列的表达。

通常，类型3PolIII启动子包含TATA盒(位于人U6snRNA基因的-25和-30之间)和近侧序列元件(PSE；位于人U6snRNA中的-47和-66之间)。它们还可包含远侧序列元件(DSE；位于人U6snRNA中的-214和-244之间)。可发现类型3PolIII启动子例如与编码7SLRNA、U3snRNA和U6snRNA的基因结合。已从拟南芥、水稻和番茄分离了此类序列。参见，例如，美国专利申请公开号20040231016的SEQIDNO：1-8。

可在7SL RNA的拟南芥(A.thaliana)基因AT7SL-1(X72228)、7SLRNA的拟南芥基因AT7SL-2(X72229)、7SLRNA的拟南芥基因AT7SL-3(AJ290403)、啤酒花(Humulus lupulus)H17SL-1基因(AJ236706)、啤酒花H17SL-2基因(AJ236704)、啤酒花H17SL-3基因(AJ236705)、啤酒花H17SL-4基因(AJ236703)、拟南芥U6-1snRNA基因(X52527)、拟南芥U6-26snRNA基因(X52528)、拟南芥U6-29snRNA基因(X52529)、拟南芥U6-1snRNA基因(X52527)、玉米(Zea mays)U3snRNA基因(Z29641)、马铃薯(Solanum tuberosum)U6snRNA基因(Z17301；X60506；S83742)、番茄U6核RNA基因(X51447)、拟南芥U3C snRNA基因(X52630)、拟南芥U3B snRNA基因(X52629)、水稻(Oryza sativa)U3snRNA启动子(X79685)、番茄U3小核RNA基因(X14411)、小麦(Triticum aestivum)U3snRNA基因(X63065)和小麦U6s nRNA基因(X63066)的词目(entry)下在核苷酸序列数据库中发现用于类型3PolIII启动子的其他核苷酸序列。

可使用本领域内熟知的方法从其他品种的番茄、水稻或拟南芥或从其他植物种分离其他类型3PolIII启动子。例如，可使用U6s nRNA、U3snRNA或7SL RNA的编码序列(例如通过它们的登录号鉴定的上述序列的任一个的编码序列和额外地蚕豆(Vicia faba)的U6snRNA编码序列(X04788)、U6snRNA的玉米DNA(X52315)或7SL RNA的玉米DNA(X14661))作为探针来分离来自此类植物的基因组克隆的文库，可分离上游序列，优选转录区的上游大约300至400bp，并且将其用作类型3PolIII启动子。可选择地，基于PCR的技术例如反向PCR或TAIL^TM-PCR可用于分离基因组序列，包括与已知的转录区邻近的启动子序列。此外，通过它们的登录号和SEQ ID NO鉴定的此处描述的类型3PolIII启动子的任何一个可在严格杂交条件下用作探针或用作信息源，以产生用于从其他品种的植物种分离的相应的启动子序列的PCR引物。

尽管类型3PolIII启动子不需要位于转录区的顺式作用元件，但清楚的是，通常位于转录起始位点下游的序列仍然可包含在本发明的RNAi表达盒中。此外，尽管最初从单子叶植物分离的类型3PolIII启动子可有效地用于RNAi表达盒以在双子叶和单子叶植物细胞和植物中抑制靶基因的表达，但最初从双子叶植物分离的类型3PolIII启动子据报导只能有效地用于双子叶植物细胞和植物。此外，据报导，当设计RNAi表达盒以使之包含来源于相同或密切相关的物种的类型3PolIII启动子时，获得最有效的基因沉默。参见，例如，美国专利申请公开号20040231016。因此，当目的植物是单子叶植物，且小hpRNA干扰是选择用于抑制FucT和/或XylT的表达的方法时，类型3PolIII启动子优选来自另一种单子叶植物，包括对于其将改变目的糖蛋白的N连接的聚糖的糖基化模式的植物种类。

因此本发明的表达盒以转录的5′-3′方向包含含有转录和翻译起始区的表达控制元件、目的多核苷酸(例如编码目的异源性蛋白质的序列或编码FucT或XylT抑制性序列的序列(当所述序列表达时，能够抑制FucT和/或XylT的表达或功能))和在植物细胞中具有功能的转录和翻译终止区。可按照本发明使用本领域已知的任何合适的终止序列。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于目的核苷酸序列可以是天然的，或可来源于另一个来源。常规终止区可从根癌农杆菌的Ti质粒获得，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol Gen.Genet.262：141；Proudfoot(1991)Cell64：671；Sanfacon等人(1991)GenesDev.5：141；Mogen等人(1990)Plant Cell2：1261；Munroe等人(1990)Gene91：151；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891；和Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.15：9627。另外的示例性终止序列是豌豆RubP羧化酶小亚基终止序列和花椰菜花叶病毒35S终止序列。其他合适的终止序列对于本领域技术人员来说是显然的，包括本说明书中上面公开的与类型3Pol III启动子一起使用，从而驱动形成小hpRNA结构的FucT和/或XlyT抑制性多核苷酸的表达的寡聚dT片段。

可选择地，可在本领域已知的任何其他合适的表达盒上提供目的多核苷酸。

通常，表达盒将包含用于选择转化的细胞或组织的选择标记基因。选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因以及赋予对除草剂化合物的抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对除草剂不敏感的被改变的靶蛋白或编码酶，所述酶在除草剂可发挥作用前在植物中降解或解除其毒性。参见DeBlock等人(1987)EMBO J.6：2513；DeBlock等人(1989)Plant Physiol.91：691；Fromm等人(1990)BioTechnology 8：833；Gordon-Kamm等人(1990)Plant Cell2：603。例如，已使用编码突变的靶酶5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因获得对草甘膦(glyphosphate)或磺酰脲类除草剂的抗性。通过使用编码膦丝菌素乙酰转移酶、腈水解酶或2，4-二氯苯氧乙酸单加氧酶(所述酶解除各自除草剂的毒性)的细菌基因获得对草铵膦、溴苯腈(boromoxynil)和2，4-二氯苯氧乙酸盐(2，4-D)的抗性。

为了本发明的目的，选择标记基因包括但不限于编码新霉素磷酸转移酶II(Fraley等人(1986)CRC Critical Reviews in PlantScience4：1)、氰酰胺水合酶(Maier-Greiner等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：4250)、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶(Perl等人(1993)BioTechnology11：715)、bar基因(Toki等人(1992)Plant Physiol.100：1503、Meagher等人(1996)Crop Sci36：1367)、色氨酸脱羧酶(Goddi jn等人(1993)Plant Mol.Biol.22：907)、新霉素磷酸转移酶(NEO、Southern等人(1982)J.Mol.Appl.Gen.1：327)、潮霉磷酸转移酶(HPT or HYG、Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.6：1074)、二氢叶酸还原酶(DHFR、Kwok等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci USA83：4552)、膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock等人(1987)EMBOJ.6：2513)、2，2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron等人(1989)J.Cell.Biochem.13D：330)、乙酰羟酸合酶(属于Anderson等人的美国专利4,761,373、Haughn等人(1988)Mol.Gen.Genet.221：266)、5-烯醇丙酮酰莽草酸磷酸合酶(5-enolpyruvyl-shikimate-phosphate synthase)(aroA、Comai等人(1985)Nature317：741)、haloarylnitrilase(属于Stalker等人的WO87/04181)、乙酰辅酶A羧化酶(Parker等人(1990)Plant Physiol.92：1220)、二氢蝶酸合酶(sulI、Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15：127)、和32kDa光系统II多肽(psbA、Hirschberg等人(1983)Science 222：1346(1983)的基因。

还包括编码对抗生素的抗性的基因，所述抗生素是：庆大霉素(例如aacCl，Wohlleben等人(1989)Mol.Gen.Genet.217：202-208)、氯霉素(Herrera-Estrella等人(1983)EMBOJ.2：987)、氨甲蝶呤(Herrera-Estrella等人(1983)Nature303：209、Meijer等人(1991)Plant Mol.Biol.16：807)、潮霉素(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.5：103、Zhijian等人(1995)Plant Science108：219、Meijer等人(1991)Plant Mol.Bio.16：807)、链霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.210：86)、壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.5：131)、博来霉素(Hille等人(1986)Plant Mol.Biol.7：171)、磺酰胺(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Bio.15：127)、溴草腈(Stalker等人(1988)Science242：419)、2，4-D(Streber等人(1989)BioTechnology7：811)、膦丝菌素(DeBlock等人(1987)EMBOJ.6：2513)、壮观霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research5：131)。

bar基因赋予对草铵膦类除草剂例如膦丝菌素(PPT)或双丙氨磷等的除草剂抗性。如上面所指出的，可用于载体构建体的其他选择标记包括，但不限于pat基因(也针对双丙氨磷和膦丝菌素的抗性)、ALS基因(对于咪唑啉酮抗性)、HPH或HYG基因(对于潮霉素抗性)、EPSP合酶基因(对于草甘磷抗性)、Hml基因(对于Hc-毒素抗性)，和常规使用且对于本领域技术人员来说是已和的其他选择标记。参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506；Chistopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA89：6314；Yao等人(1992)Cell71：63；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419；Barkley等人(1980)The Operon177-220；Hu等人(1987)Cell48：555；Brown等人(1987)Cell49：603；Figge等人(1988)Cell52：713；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：2549；Deuschle等人(1990)Science248：480；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA89：3952；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA88：5072；Wyborski等人(1991)Nuc.Acids Res.19：4647；Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10：143；Degenklb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry27：1094；Gatz等人(1992)PlantJ.2：397；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA89：5547；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology78；和Gill等人(1988)Nature334：721。这些公开内容通过引用纳入本文。

上面选择标记基因的列表不意味着是限定性的。可在本发明中使用任何选择标记。

用于植物宿主中增强的表达的核苷酸序列的修饰

当通常也遗传修饰目的植物以表达目的异源性蛋白，例如，转基因植物宿主用作异源性蛋白质的重组产生的表达系统时，本发明提供了表达的编码目的异源性蛋白质的多核苷酸序列的修饰以增强其在宿主植物中的表达。因此，当适当时，可就转化的植物中的增加的表达最优化多核苷酸。即，可使用植物偏爱性密码子(plant-preferredcodon)合成多核苷酸以提高表达。关于宿主偏爱性密码子选择的讨论，参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。用于使用植物偏爱性密码子合成核苷酸序列的方法在本领域中是可获得的。参见，例如美国专利5,380,831和5,436,391；Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA15：3324；Iannacome等人(1997)Plant Mol.Biol.34：485；和Murray等人，(1989)Nucleic Acids.Res.17-477，通过引用纳入本文。

在本发明的一些实施方案，植物宿主是浮萍家族的成员，就编码的异源性多肽的增强的表达修饰编码目的异源性多肽例如哺乳动物多肽的多核苷酸。通过该方式，1个这样的修饰是使用浮萍偏爱性密码子合成编码目的异源性多肽的多核苷酸，其中可使用本领域技术人员已知的任何方法进行合成。可根据浮萍中表达的蛋白质中的最高频率的密码子来确定偏爱性密码子。例如，用于膨胀浮萍的密码选择的频率见于网页：http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species ＝Lemna+gibba+[gbpln]，用于浮萍的密码子选择的频率见于网页：http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi？species＝Lemna+minor+[gbpln]和见于表1中。认识到，已被最优化用于在浮萍和其他单子叶植物以及其他双子叶植物中表达的异源性基因可用于本发明的方法。参见，例如EP0 359 472、EP0 385 962、WO91/16432；Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：3324；Iannacome等人(1997)Plant MoL Biol.34：485；和Murray等人(1989)Nuc.Acids Res.17：477等，通过引用纳入本文。进一步认识到，编码目的异源性多肽的多核苷酸的全部或任何部分可以是最优化或合成的。换句话说，也可使用完全最优化的或部分最优化的序列。例如，40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子可以是浮萍偏爱性密码子。在一个实施方案中，90％至96％的密码子是浮萍偏爱性密码子。编码目的异源性多肽的多核苷酸序列的编码序列可包含以至少17％的频率用于膨胀浮萍中的密码子。在一个实施方案中，经修饰的核苷酸序列是示于SEQ ID NO：16的人α-2B-干扰素编码核苷酸序列，其包含93％浮萍偏爱性密码子。

表1：来自GenBank Release113的膨胀浮萍偏爱性密码子

UUU2.2   (4)       UCU0.5     (1)      UAU2.2      (4)        UGU0.0       (0)

UUC50.5  (92)      UCC31.9    (58)     UAC40.1     (73)       UGC17.6      (32)

UUA0.0   (0)U      CA0.5      (1)      UAA3.8      (7)        UGA1.6       (3)

UUG2.7   (5)U      CG15.4     (28)     UAG0.0      (0)        UGG24.2      (44)

CUU0.5   (1)       CCU6.6     (12)     CAU0.5      (1)        CGU1.1       (2)

CUC39.0  (71)      CCC43.4    (79)     CAC6.6      (12)       CGC26.9      (49)

CUA1.1   (2)       CCA2.2     (4)      CAA4.4      (8)        CGA1.1       (2)

CUG22.5  (41)      CCG20.9    (38)     CAG26.9     (49)       CGG7.7       (14)

AUU0.0   (0)       ACU3.3     (6)      AAU1.1      (2)        AGU0.0       (0)

AUC33.5  (61)      ACC26.4    (48)     AAC37.9     (69)       AGC22.0      (40)

AUA0.0   (0)       ACA0.5     (1)      AAA0.0      (0)        AGA4.9       (9)

AUG33.5  (61)      ACG9.3     (17)     AAG57.1     (104)      AGG6.0       (11)

GUU9.3   (17)      GCU7.1     (13)     GAU1.6      (3)        GGU1.1       (2)

GUC28.0  (51)      GCC73.6    (134)    GAC38.4     (70)       GGC46.7      (85)

GUA0.0   (0)       GCA5.5     (10)     GAA2.2      (4)        GGA1.1       (2)

GUG34.0  (62)      GCG20.9    (38)     GAG62.6     (114)      GGG27.5      (50)

还可对编码目的异源性多肽的多核苷酸进行其他修饰以增强其在目的植物宿主包括浮萍中的表达。这些修饰包括，但不限于，消除编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列和其他这样充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整至给定的细胞宿主的平均水平，如通过参考在宿主中表达的已知基因所计算的。当可能时，可修饰编码目的异源性多肽的多核苷酸以避免预测的发夹结构二级mRNA结构。

动物和植物中用于翻译起始密码子的最佳翻译起始上下文核苷酸序列之间存在已知差异，这些翻译起始上下文核苷酸序列的组成可影响翻译起始的功效。参见，例如，Lukaszewicz等人(2000)PlantScience154：89-98；和Joshi等人(1997)；Plant Mol.Biol.35：993-1001。在本发明中，可修饰目的多核苷酸例如编码目的异源性多肽的多核苷酸的翻译起始密码子的翻译起始上下文核苷酸序列以在浮萍中增强表达。在一个实施方案，修饰核苷酸序列以使紧接目的核苷酸序列的翻译起始密码子的上游的3个核苷酸是“ACC”。在第二实施方案中，这些核苷酸是“ACA”。

还可通过使用5′前导序列增强转基因在宿主植物包括浮萍中的表达。此类前导序列可用于增强翻译。翻译前导序列在本领域内是已知的，包括，但不限于，小RNA病毒(picornavirus)前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区；Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA86：6126)；马铃薯y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀斑病毒；Allison等人(1986)Virology154：9)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP；Macajak和Sarnow(1991)Nature353：90)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMVRNA4；Jobling和Gehrke(1987)Nature325：622)；烟草花叶病毒前导序列(TMV；Gallie(1989)Molecular Biology of RNA，23：56)；马铃薯蚀刻病毒前导序列(Toma shevskaya等人(1993)J.Gen.Virol.74：2717-2724)；Fed-15′非翻译区(Dickey(1992)EMBO J.11：2311-2317)；RbcS5′非翻译区(Silverthorne等人(1990)J.Plant.Mol.Biol.15：49-58)；和玉米褪绿斑点病毒(chloroticmottle virus)前导序列(MCMV；Lommel等人(1991)Virology81：382)。也参见，Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiology84：965。也显示包含植物内含子序列(包括来自玉米乙醇脱氢酶1(ADH1)基因、蓖麻子过氧化氢酶基因或拟南芥色氨酸途径基因PAT1的内含子序列)的前导序列在植物中增加翻译效率(Callis等人(1987)Genes Dev.1：1183-1200；Mascarenhas等人(1990)Plant Mol.Biol.15：913-920)。也参见共同未决的临时申请美国专利申请60/759,308，其中包含选自在SEQ ID NO：13-15中所示的内含子的浮萍内含子序列的前导序列在浮萍中提供了增加的翻译效率。

在本发明的一些实施方案中，将相应于玉米乙醇脱氢酶1基因(ADH1；GenBank登录号X04049)的核苷酸1222-1775的核苷酸序列或相应于SEQ ID NO：13、14或15中所示的内含子的核苷酸序列插入编码目的异源性多肽的多核苷酸或FucT和/或XylT抑制性多核苷酸的上游以增强其翻译的效率。在另一个实施方案中，表达盒包含来自膨胀浮萍核酮糖二磷酸羧化酶小亚基5B基因的前导序列(RbcS前导序列；参见Buzby等人(1990)Plant Cell 2：805-814；也参见本发明的SEQID NO：16、17或18)。

也参见，仅仅以示例的方式，此处的图中公开的表达载体，其中RbcS前导序列和ADH1内含子作为上游调控序列包含在含有FucT抑制性多核苷酸(图8)、XylT抑制性多核苷酸(图9和11)的表达盒中或含有嵌合FucT/XylT抑制性分子(图10)的表达盒中或含有异源性多肽、单克隆抗体的IgG1重链(图12、13和14)或单克隆抗体的轻链(图14)的编码序列的表达盒中；其中LmUbq启动子和LmUbq内含子作为上游调控序列包含在含有FucT抑制性多核苷酸(图11)的表达盒中或含有异源性多肽、单克隆的抗体的IgF1轻链(图13)的编码序列的表达盒中；其中SpUbq启动子和SpUbq内含子作为上游调控序列包含在含有FucT抑制性多核苷酸(图13)的表达盒中或含有嵌合的FucT/XylT抑制性多核苷酸(图12)的表达盒中；和其中LaUbq启动子和LaUbq启动子作为上游调控序列包含在含有XylT抑制性多核苷酸(图13)的表达盒中。

认识到，上述的任何增强表达的核苷酸序列修饰可用于本发明，包括任何单个修饰或修饰的任何可能的组合。术语在植物例如浮萍植物中“进行修饰以增强表达”，如此处所使用的，是指包含这些修饰的任一个或任何组合的多核苷酸序列。

信号肽

认识到，目的异源性多肽可以是通常或有利地表达为分泌蛋白的多肽。分泌性蛋白通常从包含“信号肽”的前体多肽转变而来，所述“信号肽”与内质网(ER)的膜上的受体蛋白相互作用以指导正在生长的多肽链迁移穿过膜并且进入内质网以从细胞分泌。通常从前体多肽切除该信号肽以产生缺乏信号肽的“成熟”多肽。在本发明的一个实施方案中，在目的植物宿主例如浮萍或其他高等植物中，从与编码指导多肽分泌入培养基的信号肽的核苷酸序列有效连接的多核苷酸序列表达生物活性多肽。将靶蛋白迁移至内质网(以分泌至细胞外部)的植物信号肽在本领域内是已知的。参见，例如，属于Lee等人的美国专利6,020,169。在本发明中，任何植物信号肽可用于将表达的多肽靶向ER。

在一些实施方案中，信号肽是拟南芥碱性内切壳多糖酶信号肽(NCBI蛋白质登录号BAA82823的氨基酸14-34)、伸展蛋白信号肽(Stiefel等人(1990)Plan tCell2：785-793)、水稻α-淀粉酶信号肽(NCBI蛋白质登录号AAA33885的氨基酸1-31)或经修饰的水稻α-淀粉酶信号肽(SEQ ID NO：17)。在另一个实施方案，信号肽相应于分泌性浮萍蛋白的信号肽。

可选择地，哺乳动物信号肽可用于将本发明的经遗传工程改造的植物例如浮萍或其他目的高等植物中表达的重组多肽靶向分泌。已证明植物细胞识别靶向内质网的哺乳动物信号肽和证明这些信号肽可指导多肽不仅通过质膜而且通过植物细胞壁的分泌。参见属于Hiatt等人的美国专利5,202,422和5,639,947。在本发明的一个实施方案中，将多肽靶向分泌的哺乳动物信号肽是人α-2b-干扰素信号肽(NCBI蛋白质登录号AAB59402的氨基酸1-23)。

在一个实施方案中，使用上面公开的用于目的多核苷酸序列的任何修饰或修饰的组合就在目的植物宿主，例如浮萍或其他高等植物中的增强表达修饰编码信号肽的核苷酸序列。

可通过本领域内已知的任何常规方法从培养基中收获分泌的生物活性多肽，然后通过层析、电泳、透析、溶剂-溶剂提取等对其进行纯化。这样，可从培养基中获得如上定义的纯化的多肽。

因此，在一些实施方案中，蛋白质表达宿主系统是植物例如浮萍或其他高等植物，分泌的生物活性多肽是本发明的糖蛋白，其中糖蛋白具有大体上均一的糖基化特征谱，且对于G0糖形大体上是均一的。在这样的实施方案中，任选地可如上所述，分离和纯化可保留在植物材料中的任何这样的糖蛋白。可从植物培养基获得分泌性糖蛋白和使用上面指出的本领域内的任何常规方法对其进行纯化。这样，获自植物材料的纯化的糖蛋白基本上不含植物细胞材料，且包括其中糖蛋白的制剂具有低于大约30％、20％、10％、5％或1％(按干重计算)的污染性植物蛋白的实施方案。当从植物培养基获得纯化的糖蛋白时，植物培养基代表低于大约30％，20％，10％，5％，或1％(按干重计算)的纯化的糖蛋白制剂中的化学前体或非目的蛋白化学物质。

在一些实施方案中，获自植物宿主的这些纯化的糖蛋白可包含至少0.001％、0.005％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、15％、20％、25％或达到大约30％(按干重计算)的污染性植物蛋白。在其他实施方案中，当从植物培养基中收集糖蛋白时，这些纯化的糖蛋白中的植物培养基可包含至少0.001％、0.005％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、15％、20％、25％或达到大约30％(按干重计算)的纯化的糖蛋白制剂中的化学前体或非目的蛋白化学物质。在一些实施方案中，从植物宿主和当分泌时从培养基进行的分离和纯化导致纯化的糖蛋白的回收，所述纯化的糖蛋白不含污染性植物蛋白、不含植物培养基组分和/或不含污染性植物蛋白和植物培养基组分。

转化的植物和转化的浮萍植物和浮萍结节培养物

取决于植物或植物细胞或结节的类型(即被靶向以进行转化的单子叶植物或双子叶植物)，转化方案和用于将核苷酸序列导入植物的方案可以变化。用于将核苷酸序列导入植物或植物细胞或结节的合适的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci USA83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840，其两者通过引用纳入本文)、直接的基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.3：2717-2722)、弹道粒子加速(ballisticparticle acceleration)(参见，例如美国专利4,945,050、5,879,918、5,886,244和5,932,782(其各自通过引用纳入本文)；和Tomes等人(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment，″in Plan t Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人(1988)Biotechnology6：923-926)。可按照常规方法将已转化的细胞培养成植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5：81-84。

可通过本领域内已知的任何方法获得用于本发明的稳定转化的浮萍。在一个实施方案中，通过属于Stomp等人的美国专利6,040,498(通过引用纳入本文)中公开的基因转移方法中的一个方法获得稳定转化的浮萍。这些方法包括通过使用用包含目的核苷酸序列的核酸包被的微粒进行的基因枪轰击而进行的基因转移、通过电穿孔进行的基因转移和通过包含含有目的核苷酸序列的载体的农杆菌介导的基因转移。在一个实施方案，通过属于Stomp等人的美国专利6,040,498中公开的农杆菌介导的方法的任一个方法获得稳定转化的浮萍。所使用的农杆菌是根癌农杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)。

优选用于这些方法的稳定转化的浮萍植物展示正常的形态学和能通过有性繁殖进行增殖。优选，本发明的转化植物包含单拷贝的转移的核酸，转移的核酸在其中没有明显的重排。其中转移的核酸以低拷贝数目(即，每转化的细胞不超过5个拷贝，可选择地，不超过3个拷贝，作为其他选择，少于3个拷贝的核酸)存在的浮萍植物也是优选的。

以举例说明的方式而非限定的方式提供下列实施例。

实验

浮萍，小型水生植物，是用于制造不含人病原体治疗性蛋白的大小可变的和经济上吸引人的表达平台(其即将通过法规批准)。浮萍表达系统(LEX系统^SM)使得能够进行可与哺乳动物培养系统例如CHO细胞相当的转基因植物的快速克隆性扩增、转基因蛋白质的分泌、高蛋白产量、污染物的去除，并且具有较低的操作和资本成本的额外有利方面(Gasdaska等人(2003)Bioprocessing J.50-56).此外，该植物表达系统提供了高蛋白质产量(在总的可溶性蛋白质(TSP)的6-8％的范围内)的有利方面。这些表达水平与浮萍的高蛋白质含量和快速生长速度(36小时的倍增时间)一起使得能够以强有力和受到良好控制的形式产生每kg生物量大于1g的mAb。

下列实施例显示通过将mAb与靶向α1，3-岩藻糖基转移酶和β1，2-木糖基转移酶基因的内源性表达的干扰RNA(RNAi)构建体共表达来进行mAb的糖基化特征的人源化的方法。所得的mAb包含不含植物特异性α-1，3-连接的岩藻糖和β-1，2-连接的木糖糖类的单一主要的N聚糖种类(>95％)。在受体结合测定中，该聚糖最优化的mAb，当与具有天然的糖基化机构的野生型浮萍中产生的mAb和CHO细胞中产生的mAb相比时，展示增强的效应细胞受体结合活性。

实施例

实施例1：参与蛋白质的N糖基化的浮萍蛋白质的分离

为了产生具有改变的N聚糖的重组蛋白质，选择α1-3岩藻糖基转移酶和β1-2木糖基转移酶作为浮萍中RNAi基因沉默的靶标。来自cDNA测序工作的初步结果表明对于各靶基因存在2个或多个同种型。同种型之间的序列同源性确定为90％和95％之间。重新获得两个靶基因的全长cDNA序列并且对其进行表征。浮萍α1-3岩藻糖基转移酶(FucT)的全长cDNA序列(包括5′-和3′-UTR)示于图1；也参见SEQID NO：1(SEQ ID NO：2中所示的开放阅读框)。预测的由其编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3。编码的蛋白质与来自其他高等植物的其他FucT共有一定的相似性。参见图2。例如，浮萍FucT序列与图2中显示的拟南芥FucT共有大约50.1％的序列同一性。

浮萍β1-2木糖基转移酶(XylT)(同种型#1)的全长cDNA序列(包括5′-和3′-UTR)示于图3；也参见SEQ ID NO：4(SEQ ID NO：5中所示的ORF)。预测的由其编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：6。编码的蛋白质与来自其他高等植物的其他XylT共有一定的相似性。参见图4。例如，浮萍XylT与图4中显示的拟南芥XylT共有大约56.4％的序列同一性。浮萍β1-2木糖基转移酶(XylT)(同种型#2)的部分长度的cDNA序列(包括3′-UTR)示于图31；也参见SEQ ID NO：19(SEQID NO：20中所示的ORF)。预测的由其编码的氨基酸序列示于SEQ IDNO：21。部分长度的XylT同种型#2与全长XylT同种型#1的相应区域共有高度的序列同一性，这可从图32中显示的比对中看到。

实施例2：浮萍FucT和XylT的表达的RNAi抑制

采用几种RNAi策略抑制浮萍FucT和XylT同种型的表达。图5-7、33和34概述了这些策略。图8-13显示制备用以获得希望的这两种基因的表达的敲除的不同构建体的图谱。使用本说明书中上面描述的标准转化方案产生包含不同敲除RNAi构建体的许多转基因系。

在具有天然糖基化机构的野生型浮萍中和表达设计用以抑制浮萍XylT和FucT同种型的表达的RNAi构建体的转基因浮萍系中表达受试抗体，此处命名为mAbI。通常，构建用于在浮萍系统中表达mAbI的3个二元载体。表达载体mAbI01包含编码mAbI的重(H)链和轻(L)链的密码子最优化的基因；载体mAbI04包含编码mAbIH和L链的密码子最优化的基因以及靶向XylT和FucT同种型的表达的嵌合RNAi构建体；和载体mAbI05包含编码mAbIH和L链的密码子最优化的基因、靶向FucT基因表达的单基因RNAi构建体和靶向XylT基因表达的单基因RNAi构建体。就mABI01、mAbI04和mAbI05表达载体产生独立的转基因系。

设计mAbIH和L链的最优化的基因以使之具有浮萍偏爱性密码子选择(63％-67％的GC含量)和包含融合至它们的编码序列的5′末端的水稻α-淀粉酶信号序列(GenBank M24286)。加入限制性内切核酸酶位点以用于克隆入农杆菌二元载体(EcoRI(5′)/SacI(3′)，H链)和(SalI(5′)/HindIII(3′)，L链)。

对于在本说明书中下面描述的、图15-17中所示的XF02数据和图22-24和26中所示的mAbI04数据，用于抑制浮萍FucT和XylT同种型的表达的RNAi策略使用图34中显示的嵌合RNAi设计。对于图27中显示的本说明书中下面描述的mAbI05数据，用于抑制浮萍FucT和XylT同种型的表达的RNAi策略使用利用图5(FucT RNAi设计)和图33(XylT RNAi设计)中显示的单基因RNAi设计的组合进行的这两个基因的双敲除。

就最优化的mAbIH和L链以及单基因RNAi或嵌合RNAi产生包含启动子、目的基因和Nos终止子的独立的表达盒RNAi。将表达盒克隆入用合适的限制性位点修饰的农杆菌二元载体pBMSP3(获自Dr.Stan Gelvin，Purdue University)。取决于表达盒，将L链融合至具有膨胀浮萍5′RbcS前导序列的经修饰的嵌合型章鱼碱和甘露碱合酶启动子(mAbI01，图14)或高表达的、组成型浮萍聚泛素(polyubiquitin)启动子(LmUbq)(mAbI04，图12；mAbI05；图13)。将重链融合至具有膨胀浮萍5′RbcS前导序列的经修饰的嵌合型章鱼碱和甘露碱合酶启动子(mAbI04、mAbI05和mAbI01)。将取自T7-4中的质粒XF02的嵌合型RNAi盒融合至高表达的、组成型紫萍聚泛素启动子(SpUbq)。通过SpUbq启动子驱动用于表达FucT抑制性序列的表达的单基因RNAi盒；和通过有效连接的包含稀脉萍泛素启动子及5′UTR(LaUbq启动子)的表达控制元件驱动用于表达XylT抑制性序列的单基因RNAi盒。将H、L和嵌合型RNAi表达盒以串联方向克隆入经修饰的pBMSP3二元载体，从而产生质粒mAbI04。将H、L和靶向FucT和XylT表达的单基因RNAi表达盒克隆入经修饰的pBMSP3二元载体，从而产生质粒mAbI05。将H和L表达盒克隆入经修饰的pBMSP3二元载体，从而产生质粒mAbI01。

虽然可如本说明书中上面所指出的，可使用任何转化方案，在一些情况下，转化方案如下。通过使用根癌农杆菌C58Z707无害的广宿主范围(broad host range)C58株系(Hepburn等人(1985)J.Gen.Microbiol.131：2961-2969)，按照Yamamoto等人(2001)InVitro

Cell DeV.Biol.Plant 37：349-353的方法从快速生长的浮萍结节产生代表单个克隆系的转基因植物。为进行转基因筛选，在装有不含蔗糖的SH培养基(Schenk和Hildebrandt(1972)Can.J.Botany50：199-204)的通风植物培养瓶中在150至200μmolm^-2s^-2下预处理单个的克隆系1周。然后将15至20个预处理的植物体置于装有新配制的SH培养基的通风容器中，让其生长两周。将来自各系的组织和培养基样品冷冻并且在-70℃下贮存。

发展了MALDI-TOF测定法以测量浮萍β-1，2-木糖基转移酶(XylT)和α-1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)活性(下面的实施例3)。

图15-17显示了使用上述测定法获得的XF02、mAbII04和mAbI05植物系的初步筛选数据。在该测定中，WT(野生型)代表野生型植物中的FucT和XylT活性，而BWT(煮沸的野生型)代表它们在煮沸的植物提取物中的活性。煮沸的野生型(BWT)植物提取物表示其中已使FucT和XylT活性失活的植物材料。该数据组显示来自各构建体的几个植物系具有与野生型植物系(WT)相比减少的FucT和XylT活性水平和与煮沸的野生型样品(BWT)相当的活性水平。

特别地，包含图10的XF02构建体的转基因RNAi浮萍植物系的初步筛选数据示于图15和16中。XF02构建体表达了靶向浮萍FucT和XylT蛋白质(包括各蛋白的不同同种型)的表达的嵌合型RNAi分子。

图17显示了包含图12的mAbI04构建体和图13的mAbI05构建体的转基因RNAi浮萍植物的初步筛选数据。

实施例3：N聚糖β-1，2-木糖基转移酶(XylT)和α-1.3-岩藻 糖基转移酶(FucT)活性的MALDI-TOF测定

使用下列改进的MALDI-TOF测定法确定上面实施例2中描述的转基因植物中的XylT和FucT活性。

材料

匀浆缓冲液：50mM HEPES，pH7.5，0.25M蔗糖，2mMEDTA，1mM DTT。

反应缓冲液：0.1M Mes，pH7.0，10mM MnCl₂，0.1％(v/v)TritonX-100。

尿苷-5′-二磷酸-_D-木糖(UDP-Xl)

鸟苷-5′-二磷酸-_L-岩藻糖(GDP-FuC)

N-乙酰葡糖胺

聚乙二醇(PEG)混合物1000-3000(以4：1与2mg/mL碘化钠混合的10mg/mL PEG1000，2000和3000(4：5：6的比例))。

[Giu¹]-血纤肽B(GFP)，人(1pmol/μL于水中)

DABSYLATED、四肽、N聚糖接纳体(EMD Biosciences)CHCA(α-氰-4-羟基桂皮酸)基质(10mg于50％[v/v]乙腈，0.05％[v/v]三氟乙酸中)。

微粒体的制备

在珠磨机以5x速度将浮萍组织(100mg)在1mL冷的匀浆缓冲液中碾磨40秒。将匀浆在4℃下以1,000g离心5分钟。除去上清液，在4℃下以18,000g离心2小时。然后弃去上清液。将沉淀重悬浮于20μL冷的反应缓冲液中并且保持在冰上或在-80℃下贮存直至使用。

反应条件

反应混合物包含125mMN-乙酰葡糖胺、6.25mM UDP-Xyl、6.25mM GDP-Fuc、12.5mM MnCl₂和1.5nmol DABSYLATED、四肽、N聚糖接纳体。向反应混合物中加入微粒体(4μL)以起始反应。在室温下温育反应物30分钟，然后在37℃下温育90分钟。通过以18,000g离心1分钟和在4℃下温育来终止反应。

MALDI-TOF分析

将来自各反应的上清液的一部分(0.5μL)与0.5μL CHCA基质在MALDI靶板上混合并且让其干燥。将MALDI仪设置为反射阳离子模式和用PEG1000-3000进行校准。使用0.5pmol GFP作为锁定质量(lock mass)，组合的MS波谱(-200shots)采自1500-2500Da。参照峰(m/z＝2222.865)的离子计数应当高于400。将XylT和FucT产物(分别为m/z＝2192.854和2206.870)的离子计数根据参照峰和微粒体级分的蛋白质浓度进行标准化。

实施例4：浮萍FucT和XylT的表达的RNAi抑制对单克隆抗体 的糖基化特征谱的影响

就它们的N糖基化特征谱分析由包含mAbI01构建体(参见图14)野生型(即，FucT和XylT的表达未被沉默)浮萍和为mAbI04构建体(参见图12)或mAbI05构建体(参见图13)转基因的浮萍系产生的单克隆抗体。使用下列方法。

来自浮萍的mAb的纯化

使用Silverson High Shear Mixer以1：8的组织：缓冲液比例用50mM磷酸钠、0.3M氯化钠和10mM EDTA在pH7.2下匀浆植物组织。用1M柠檬酸将匀浆酸化至pH4.5，然后在4℃下以7,500xg离心30分钟。将上清液过滤通过0.22μm过滤器，然后直接装载至用包含50mM磷酸钠、0.3M氯化钠和10mM EDTA，pH7.2的溶液平衡的mAbSelect SuRe树脂(GE Healthcare)上。装载后，用平衡缓冲液将柱子洗涤至基线，然后用5倍柱体积的0.1M醋酸钠，pH5.0过渡洗涤(intermediate wash)，最后，用10倍柱体积的0.1M醋酸钠，pH3.0洗脱结合的抗体。立即用2M Tris碱中和洗脱物。

N连接的聚糖的纯化

充分地对水透析蛋白A纯化的来自野生型和RNAi浮萍植物系的单克隆抗体(1mg)，并将其冷冻干燥至干燥状态。将样品重悬浮于100μL5％(v/v)的甲酸，加入0.05mg/mL胃蛋白酶，然后在37℃下温育过夜。将样品在95℃下加热失活，进行10分钟并且进行干燥。将胃蛋白酶消化物重悬浮于100μL100mM醋酸钠，pH5.0中，且与1mUN-糖苷酶A在一起在37℃下温育过夜。按照Packer等人(1998)Glycoconj.J.15：737-747使用4cc Carbograph SPE柱分离释放的N聚糖，并对其进行干燥。

使用1cc Waters Oasis MCX药筒进一步纯化干燥的N聚糖。通过用3倍柱体积的甲醇，然后用3倍柱体积的5％(v/v)的甲酸洗涤来制备柱子。将重悬浮于1mL的5％(v/v)的甲酸的N聚糖装至制备的柱子上。收集、汇合和干燥未结合的级分以及2倍额外的柱体积的5％(v/v)甲酸的洗涤液。

使用2-氨基苯甲酸(2-AA)对寡糖的衍生

用2-AA标记纯化的N聚糖或麦芽寡糖，然后按照Anumula和Dhume(1998)Glycobiology8：685-694使用1cc Waters Oasis HLB药筒进行纯化。将标记的N聚糖和麦芽寡糖重悬浮于50μL水中，然后用MALDI-TOF MS和正相(NP)HPLC-QTOF MS进行分析。

MALDI-TOF质谱法。

使用Waters MALDI Micro MX(Millford，MA)进行MALDI-TOF MS。用水适当地稀释2-AA标记的N聚糖(0.5μL)，将其与0.5μL10mg/mL的溶于70％(v/v)乙腈中的DHB基质混合，然后点在靶板上，以阴性反射模式进行分析。

2-AA标记的N聚糖的NP-HPLC-Q-TOF MS分析。

将2-AA标记的N聚糖或麦芽寡糖加入80％(v/v)乙腈中，然后在适配TSK-Gel Amide-80(2mmx25cm，5μm)柱(TosohBiosciences，Montgomeryville，PA)的Waters2695HPLC系统上进行分离。使用Waters2475荧光检测器和联机适配HPLC系统的WatersQ-TOF API US四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪(Millford，MA)通过荧光(230nm激发，425nm发射)检测和分析2-AA标记的碳水化合物。

在40℃下以0.2mL/分钟使用10mM醋酸铵，pH7.3(溶剂A)和10mM醋酸铵，pH7.3，80％(v/v)乙腈(溶剂B)进行分离。在0％的A的等强度下进行5分钟，然后在第8分钟线性增加至10％的A，和在第48分钟线性增加至30％的A下进行样品洗脱。用100％的A洗涤柱，进行15分钟，在下一步注射之前在0％的A下平衡柱子，进行15分钟。

在阴离子模式中分别用100℃和300℃的源和去溶剂化温度和分别用2,100和30V的毛细管电压和进样锥电压(cone voltage)进行Q-TOF分析。显示的质谱是组合大于50个单个扫描每标记的N聚糖的结果。

完整IgG的RP-HPLC-Q-TOF MS分析

使用适配Poros R1-10柱(2mmx30mm；Applied Biosystems)的Waters2695HPLC系统除去蛋白A纯化的IgG(50μg)的盐分。使用Waters2487双波长UV检测器(280nm)和Waters Q-TOF API US检测和分析IgG。在60℃下，以0.15mL/分钟使用0.05％(v/v)三氟乙酸(TFA；溶剂A)和0.05％(v/v)TFA、80％(v/v)乙腈(溶剂B)进行分离。使用5分钟内从30％线性增加至50％的B，在5分钟内增加至80％的B进行样品洗脱。将溶剂比保持在80％的B上进行另外4分钟，然后用100％的B洗涤1分钟，在下一轮之前用30％的B平衡柱子15分钟。

在阳离子模式中分别用100℃和300℃的源温度和去溶剂化温度以及分别用3.0和60V的毛细管电压和进样锥电压进行Q-TOF分析。数据是通过使用MaxEnt1将大于等于100个单个的扫描和反卷积(deconvolution)组合成亲本质谱(parent mass spectrum)的结果。

也参见Triguero等人(2005)Plant Biotechnol.J.3：449-457；Takahashi等人(1998)Anal.Biochem.255：183-187；Dillon等人(2004)J.Chromatogr.A.1053：299-305。

结果

图18显示衍生的野生型浮萍单克隆抗体N聚糖的结构和分子量。

图19显示在浮萍中提供mAbI单克隆IgG1抗体的表达、无浮萍FucT和XylT的RNAi抑制的野生型mAbI01构建体(示于图15)产生具有3种主要的N聚糖种类(包括具有β1，2-连接的木糖的一个种类和具有β1，2-连接的木糖和核心α1，3-连接的岩藻糖残基的一个种类)的N糖基化特征谱；使用液相色谱质谱(LC-MS)(图20)和MALDI(图21)分析验证该特征谱。

图22显示包含mAbI01构建体(无FucT或XylT的表达)的野生型浮萍系和包含图12的mAbI04构建体的两个转基因浮萍系中产生的mAbI的不同N聚糖种类的相对量的覆盖图(overlay)。注意GnGn(即，G0)聚糖种类的富集，无β1，2-连接的木糖或核心α1，3-连接的岩藻糖残基附着，不存在具有β1，2-连接的木糖或β1，2-连接的木糖和核心α1，3-连接的岩藻糖残基的种类。使用质谱(LC-MS)(图23)和MALDI(图24)分析验证该特征谱。

图25显示包含mAbI01构建体的野生型浮萍(系20)中产生的mAbI组合物的完整的质量分析。当XylT和FucT表达在浮萍中不被抑制时，重组产生的mAbI组合物是异源性的，包含至少9个不同的糖形，G0XF³糖形是存在的主要种类。注意非常小的峰代表G0糖形。

图26显示在包含图12的mAbI04构建体的转基因浮萍(系15)中产生的mAbI组合物的完整的质量分析。当在浮萍中使用该嵌合型RNAi构建体抑制XylT和FucT的表达时，完整的mAbI组合物对于G0N聚糖大体上是均一的，只存在痕量的前体N聚糖(由GnM和MGn前体聚糖种类代表)。此外，mAbI组合物对于G0糖形大体上是均一的，其中两个糖基化位点由G0N聚糖种类占据，3个小峰反映痕量的前体糖形(一个峰显示具有Fc区域的mAbI，其中一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖种类，另1条重链的C_H2结构域未被糖基化；另一个峰显示具有Fc区域的mAbI，其中一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖种类，另一条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的GnM或MGn前体聚糖；另一个峰显示具有Fc区域的mAbI，其中各C_H2结构域上的Asn297糖基化位点具有附着的G0聚糖种类，第三个G0聚糖种类附着至mAbI结构内的另外的糖基化位点)。

图27显示包含图13的mAbI05构建体的转基因浮萍(系72)中产生mAbI组合物的完整质量分析。当在浮萍中使用该构建体抑制XylT和FucT的表达时，完整的mAbI组合物对于G0N聚糖大体上是均一的，只存在痕量前体N聚糖(由GnM和MGn前体聚糖种类代表)。此外，mAbI组合物对于G0糖形是大体上均一的(至少90％)，同样3个小峰反映如使用mAbI04构建体获得的前体糖形。

将在包含mAbI01构建体(即，无XylT和FucT的表达的抑制)的野生型浮萍系和包含mAbI04或mAbI05构建体(即，XylT和FucT的表达被抑制)的转基因浮萍系中产生的mAbI的受体结合活性与哺乳动物细胞系(CHO和SP2/0)中产生的mAbI的受体结合活性比较。

就不同的mAbI产物评估对新分离的人NK细胞上的FcFcγRIIIa的结合。针对CHO来源的mAbI和SP2/0来源的mAbI收集的对照数据示于图35中。针对野生型浮萍产生的具有正常植物N聚糖特征谱的mAbI收集的受试数据命名为mAbI01-15和mabI01-20，其中mAbI产物具有包含α(1，3)-木糖残基(参见图36和37)的N连接的聚糖。针对使用基因沉默RNAi构建体(所述构建体靶向α1，3-岩藻糖基转移酶)获得的具有最优化N聚糖特征谱(OPT)的转基因浮萍来源的mAbI收集的测试数据命名为mAbI05-72、mAbI05-74、mAbI04-24和mAbI04-15(参见图36和37)，其中mAbI产物具有不含α(1，3)-岩藻糖残基的N连接的聚糖。比较mAbI01-15、mAbI01-20、mAbI SP2/0、mAbI04-15、mAbI04-24、mAbI05-72和mAbI05-74与重组小鼠FcγRIV(对IgG岩藻糖水平敏感的且用作人FcγRIIIa的代用品的受体)的结合效率的数据示于图38。

这些数据表明，与野生型浮萍来源的mAbI产物相比，具有最优化聚糖特征谱(OPT)的转基因浮萍来源的mAbI产物显示增强的对新分离的人NK细胞上的FcγRIIIa的结合(增强大约20至50倍)以及增强的对重组小鼠FcγRIV的结合(增强大约10倍)。

实施例6：具有提高的受体结合和增加的ADCC活性的抗CD30单 克隆抗体的产生

本实施例概述了人抗CD30mAbs在浮萍中的表达。通过以与上面的实施例中关于mAbI所指出的方式类似的方式通过与靶向α-1，3-岩藻糖基转移酶(FucT)和β-1，2-木糖基转移酶(XylT)基因的内源性表达的RNAi构件体共表达来进行抗CD30mAb糖基化的最优化。使其天然糖基化机构经遗传工程改造以抑制FucT和XylT的表达的浮萍中产生的所得的抗CD30mAb包含单一的主要的N聚糖种类而无任何痕量的植物特异性N聚糖。除了N聚糖均一性外，也显示糖最优化的抗CD30mAb，当与CHO表达的抗CD30mAb相比，具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和效应细胞受体结合活性。

方法

株系和试剂

将Novablue感受态大肠杆菌(Escherichia coli)细胞用于所有重组DNA工作(EMDBiosciences，San Diego，CA)。从New EnglandBiolabs(Ipswich，MA)获得限制性内切核酸酶和DNA修饰酶。从Integrated DNA technologies(Coralville，IA)获得寡核苷酸。Waters Oasis HLB和MCX柱子(1cc)，2，5-二羟苯甲酸(DHB)和α-氰-4-羟基桂皮酸(CHCA)来自Waters Corporation(Milford，MA)。纯化的DABSYLATED、四肽、GnGn N聚糖接纳体(GnGn-DABSYL-肽)和N-糖苷酶A来自EMD Biosciences。Carbograph SPE柱子(4cc)来自Grace Davidson Discovery Sciences(Deerfield，IL)。尿苷-5′-二磷酸-D-木糖(UDP-Xyl)购自Carbosource Services(Athens，GA)。乙腈(Optima级)来自Fisher Scientific(Summerville，NY)。醋酸铵来自MPBi ochemicals(Irvine，CA)。麦芽寡糖(MD6-1)来自V-LabsInc.(Covington，CA)。单糖标准来自Dionex(Sunnyvale，CA)。BATDA(双(乙酰氧基甲基)2，2′：6′，2＂-三联吡啶-6，6＂-二羧酸盐)和铕溶液来自Perkin-Elmer(Wellesley，MA)。鸟苷-5′-二磷酸-L-木糖(GDP-Fuc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、2-氨基苯甲酸(2-AA)和所有其他材料来自Sigma(St.Louis，MO)。

mAb和RNAi表达载体的构建

使用标准技术，确定来源于转基因MedarexHuMAb-Mouse

(Borchmann等人(2003)Blood102：3737-3742)的全长人mAbI κ抗体MDX-060的重链(H)和轻链(L)可变区cDNA序列并通过中国仓鼠卵巢细胞系CHO DG44(Urlaub等人(1986)CellMol.Genet.12：555-566)重组产生全长MPX-060人mAbI κ抗体。设计H和L链的最优化的基因以使之具有浮萍偏爱性密码子选择(63％-67％的GC含量)并包含融合至它们的编码序列的5′末端的水稻α-淀粉酶信号序列(GenBankM24286)。加入限制性内切核酸酶位点以克隆入农杆菌二元载体(EcoRI(5′)/SacI(3′)，H链)和(SalI(5′)/HindIII(3′)，L链)。由Picoscript(Houston，TX)构建和提供合成的基因。

设计嵌合型发夹结构RNA(参见图34)以使之靶向沉默编码α-1，3-岩藻糖基转移酶(基于SEQ ID NO：2中所示的浮萍FucT同种型#1的编码序列；也参见GenBank DQ789145)和β-1，2-木糖基转移酶(基于浮萍XylT同种型#2的编码序列，SEQ ID NO：19的nt1-1275；示于SEQ ID NO：20；也参见GenBank DQ789146)的内源性浮萍基因。设计嵌合形FucT+XylT发夹结构RNA以使之具有602bp的双链FucT序列、626bp的双链XylT序列和500bp的间隔区序列。发夹结构RNA表达盒的有义链部分包括FucT正向片段(SEQ ID NO：2的nt12-613；相当于SEQ ID NO：1的nt254-855)和XylT正向片段(SEQ ID NO：19的nt1-626)、间隔区序列(SEQ ID NO：19的nt627-1126)。发夹结构RNA表达盒的反义链部分包括XylT反向片段(SEQ ID NO：19的nt1-626的反义版本；相当于SEQ ID NO：1的nt254-855)和FucT反向片段(SEQ ID NO：2的nt12-613或SEQ ID NO：1的nt254-855的反义版本)。通过PCR从浮萍(8627)cDNA扩增FucT和XylT正向和反向基因片段，然后将它们克隆入pT7blue(EMD Biosciences)，从而在T7-4中产生质粒XF02来构建嵌合型发夹结构RNA。使用DNA引物BLX686(5′-ATGGTCGACTGCTGCTGGTGCTCTCAAC-3′)(SEQ ID NO：22)和BLX690(5′-ATGTCTAGAATG CAGCAGCAAGTGCACC-3′)(SEQ ID NO：23)扩增FucT正向基因片段，从而产生具有末端SalI(5′)和XbaI(3′)克隆位点的620bp的产物。使用DNA引物BLX700(5′-ATGACTAGTTGCGAAGCCTACTTCGGCAACAGC3′)(SEQIDNO：24)和BLX694(5′-ATGGGATCCGAATCTCAAGA ACAACTGTCG-3′)(SEQ ID NO：25)扩增XylT正向基因片段，从而产生具有末端SpeI(5′)和BamHI(3′)克隆位点的1144bp的产物。使用DNA引物BLX695(5′-ATGGGTACCTGCGAAGCCTACTTCGGCAA CAGC-3′)(SEQ ID NO：26)和BLX696(5′-ATGGGA TCCACTGGCTGGGAGAAGTTCTT-3′)(SEQ ID NO：27)扩增XylT反向基因片段，从而产生具有末端BamHI(5′)和KpnI(3′)克隆位点的644bp的产物。使用DNA引物BLX691(5′-ATGGAGCTCTGCTGCTGGTGCT CTCAAC-3′)(SEQ ID NO：28)和BLX692(5′-ATGGGTACCATGCAGCAGCAAGTGCACC-3′)(SEQ ID NO：29)扩增FucT反向基因片段，从而产生具有末端KpnI(5′)和SacI(3′)克隆位点的620bp的产物。

就最优化的MDX-060H和L链以及嵌合型RNAi产生包含启动子、目的基因和Nos终止子的独立的表达盒。将表达盒克隆入具有合适的限制性位点的经修饰的农杆菌二元载体pBMSP3(获自Dr.Stan Gelvin，Purdue University)。将H链融合至经修饰的具有膨胀浮萍5′RbcS前导序列的嵌合型章鱼碱和甘露碱合酶启动子(Gasdaska等人(2003)Bioprocessing50-56)。将L链融合至高表达的、组成型浮萍聚泛素启动子(LmUbq)。将采自T7-4中的质粒XF02的嵌合型RNAi盒融合至高表达的、组成型Spirodela polyrhiza聚泛素启动子(SpUbq)。将3个表达盒以串联方向克隆入经修饰的pBMSP3二元载体，从而产生质粒MDXA04。

转移和植物系的筛选。

通过使用根癌农杆菌C58Z707(Hepburn等人(1985)J.Gen.Microbiol.131：2961-2969)，按照Yamamoto等人(Yamamoto等人(2001)In vitro Cell.DeV.Biol.37)的方法从快速生长的浮萍结节产生代表单个克隆系的转基因植物。为了进行转基因筛选，在装有不含蔗糖的SH培养基(Schenk和Hildebrandt(1972)Can.J.Botany50：199-204)的通风植物培养瓶中在150至200molm^-2s^-2下预处理单个的克隆系1周。然后将15至20个预处理的植物体置于装有新配制的SH培养基的通风容器中，让其生长两周。将来自各系的组织和培养基样品冷冻并且在-70℃下贮存。

浮萍中产生的mAb的ELISA分析。

使用FastPrep FP120珠磨机(Thermo Electron Corporation)匀浆浮萍组织(100mg)。将上清液稀释至1μg/mL并且使用IgGQuantitation ELISA试剂盒(Bethyl LaboratoTies)进行测定。关于测定，以10μg/mL的浓度用山羊抗人IgG包被微量滴定板，使用以1：100,000稀释的缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG检测mAb。使用ELISA试剂盒提供的人参照IgG产生标准曲线。ELISA的灵敏度是7.8ng/mL。所有样品以一式两份进行分析。

浮萍微粒体膜的制备和核心β-1，2-木糖基转移酶及α-1，3-岩藻糖基转移酶活性的测定。

在FastPrep FP120珠磨机(Thermo Electron Corporation，Waltham，MA)中，在1mL的冷的匀浆缓冲液(50mM4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙烷磺酸[HEPES]，pH7.5、0.25M蔗糖、2mM乙二胺四乙酸[EDTA]、1mM1，4-二硫苏糖醇[DTT])匀浆来自各系的浮萍组织(100mg)40秒。将匀浆在4℃下以1,000g离心5分钟。除去上清液，在4℃下以18,000g离心90分钟。将所得沉淀重悬浮于20μL的冷的反应缓冲液(0.1M2-[4-吗啉代]甲磺酸[Mes]、pH7.0、0.1％[v/v]Triton X-100、10mM MnCl₂)中，将其保持在冰上或在-80℃下贮存直至使用。

如之前所述(Leiter等人(1999)J.Biol.Chem.274：21830-21839)，通过与125mMGlcNAc、6.25mM UDP-Xyl、6.25mM GDP-Fuc、12.5mM MnCl₂和1.5nmol GnGn-DABSYL-肽接纳体在37℃下温育2小时，在从各RNAi系制备的4μL微粒体膜中同时测量核心β-1，2-木糖基转移酶和α-1，3-岩藻糖基转移酶活性。通过短暂离心和在4℃下进行温育来终止反应，通过阳性反射模式MALDI-TOF MS分析产物。

MDX-060LEX和LEX^0ptmAb的纯化。

使用Silverson High Shear Mixer用50mM磷酸钠、0.3M氯化钠和10mM EDTA，pH7.2匀浆植物组织。用1M柠檬酸将匀浆酸化至pH4.5，然后在4℃下以7,500xg离心30分钟。在使用0.22μm过滤器过滤之前，用2MTris将上清液的pH调节至pH7.2。直接将材料装载在用包含50mM磷酸钠、0.3M氯化钠和10mM EDTA，pH7.2的溶液平衡的mAbSelect SuRe蛋白A树脂(GE Healthcare)上。装载后，用平衡缓冲液将柱子洗涤至基线，然后用5倍柱体积的0.1M醋酸钠，pH5.0过渡洗涤。用10倍柱体积的0.1M醋酸钠，pH3.0洗脱结合的抗体。立即用2M2-氨基-2-[羟甲基]-1，3-丙二醇(Tris)中和蛋白A洗脱物。为了进行聚集体清除(aggregate removal)，将蛋白A洗脱物调节至pH5.5，然后用于用25mM磷酸钠，pH5.5平衡的陶瓷羟基磷灰石类型(Bio-Rad)柱子。在用5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤后，使用0.25M磷酸钠，pH5.5在单步骤洗脱中洗脱抗体。汇合根据A₂₈₀的包含抗体的级分，在-80℃下贮存。

通过加入2x SDS样品缓冲液±5％[v/v]2-巯基乙醇，在还原和非还原条件下制备用于SDS-PAGE的组织提取物和流经蛋白A样品。将蛋白A洗脱物和羟基磷灰石洗脱物稀释至0.5mg/mL的蛋白质浓度，然后加入2x SDS样品缓冲液±5％[v/v]2-巯基乙醇。在使用4-20％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行电泳之前，将样品在95℃下温育2分钟。凝胶上包括Mark12分子量标记(Invitrogen)和MDX-060参照标准品。用胶体蓝染料对凝胶进行染色。

N连接的聚糖的纯化。

将蛋白A纯化的来自野生型和RNAi浮萍植物系的单克隆抗体(1mg)对水充分透析，然后进行冷冻干燥至干燥状态。将样品重悬浮于100μL5％(v/v)甲酸，加入至0.05mg/ml胃蛋白酶，在37℃下温育过夜。将样品在95℃下加热失活15分钟，然后进行干燥。将胃蛋白酶消化物重悬浮于100μL100mM醋酸钠，pH5.0中，且与1mUN-糖苷酶A一起在37℃下温育过夜。使用4cc Carbograph SPE柱(Packer等人(1998)Glycoconj.J.19：737-747)分离释放的N聚糖，并对其进行干燥。

使用1cc Waters Oasis MCX药筒进一步纯化干燥的N聚糖。通过用3倍柱体积的甲醇，然后用3倍柱体积的5％(v/v)的甲酸洗涤来制备柱子。将重悬浮于1mL的5％(v/v)的甲酸的N聚糖装载至制备的柱子上。收集、汇合和干燥未结合的级分以及2倍额外的柱体积的5％(v/v)甲酸的洗涤液。

使用2-氨基苯甲酸(2-AA)对寡糖的衍生。

用2-AA标记纯化的N聚糖或麦芽寡糖，然后按照Anumula和Dhume(1998)(Anumula and Dhume(1998)Glycobiology8：685-694)使用1cc Waters OasisHLB药筒对其进行纯化。将标记的N聚糖和麦芽寡糖重悬浮于50μL水中，然后用阴性模式MALDI-TOF MS和正相NP-HPLC-QTOF MS进行分析。

MALDI-TOF质谱。

使用WatersMALDI Micro MX(Millford，MA)进行MALDI-TOFMS。通过将0.5μL的各反应上清液与0.5μL的10mg/mL的溶于0.05％(v/v)TFA、50％(v/v)乙腈中的CHCA在靶板上混合来进行β-1，2-木糖基转移酶/α-1，3-岩藻糖基转移酶反应产物的分析。在阳性反射模式中检测木糖基化的([M+H]⁺＝2192.85Da)或岩藻糖基化的([M+H]⁺＝2206.87Da)GnGn-DABSYLATED-肽产物。将来自各样品的200个组合波谱的离子计数针对在来自EMD Biosciences的初始的GnGn-DABSYL-肽混合物中作为污染物(<5％)存在的β-1，4-半乳糖基化的GnGn-DABSYL-肽([M+H]⁺＝2222.87Da)的离子计数进行标准化。

用水稀释2-AA标记的N聚糖或麦芽寡糖(0.5μL)，将其与0.5μL的10mg/ml的溶于70％(v/v)乙腈中的DHB基质混合，然后将其点在靶板上，在阴性反射模式中进行分析。

2-AA标记的N聚糖的NP-HPLC-Q-TOF MS分析。

将2-AA标记的N聚糖或麦芽寡糖加入至80％(v/v)乙腈中，然后在适配TSK-Gel Amide-80(2mmx25cm，5μm)柱(TosohBiosciences，Montgomeryville，PA)的Waters2695HPLC系统上进行分离。使用Waters2475荧光检测器(230nm激发，425nm发射)和联机适配HPLC系统的WatersQ-TOF API US四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪检测和分析2-AA标记的碳水化合物。

在40℃下以0.2mL/分钟使用10mM醋酸铵，pH7.3(溶剂A)和10mM醋酸铵，pH7.3，80％(v/v)乙腈(溶剂B)进行分离。在0％的A的等强度下进行5分钟，然后在第8分钟线性增加至10％的A，和在第48分钟线性增加至30％的A下进行样品洗脱。用100％的A洗涤柱子，进行15分钟，在下一步注射之前在0％的A下平衡柱子，进行15分钟。

在阴离子模式中分别用100℃和300℃的源和去溶剂化温度和分别用2,100和30V的毛细管电压和进样锥电压进行QTOF分析。显示的质谱是组合每标记的N聚糖大于等于40个单个扫描的结果。

通过HPAEC-PAD进行的单糖分析。

将mAb样品(200μg)在100℃下经历使用2N TFA的酸水解，进行3小时。通过在环境温度下进行真空离心来干燥样品，在使用HPAE-PAD(Dionex)分析之前将其在150μL水中重建。将重建的样品的等分(25μL)用于具有前置柱Amino Trap(Dionex)的CarboPacPalo柱子(4x250mm)。通过使用EG40洗脱剂产生器(EG40eluentgenerator)，用3.5mM KOH的流动相进行单糖的分离。使用单糖标准确定单糖峰鉴定(peak identity)和相对丰度。

mAb的热稳定性。

使用MicroCal(Northampton，MA)VP-Capillary差示扫描量热术(DSC)仪确定糖基最优化的和野生型mAb的热稳定性。将纯化的mAb样品在20mM NaH₂PO₄，pH7.4、150mM NaCl(PBS)中透析过夜。使用PBS作为参照缓冲液，通过将浓度为300μg/mL的样品从35℃加热至95℃，以1℃/分钟的扫描速率收集热变性数据。将反馈(feedback)和增益(gain)设置至低水平。通过使用Origin v7.0软件，基线修正的和标准化的数据与非-2-状态模型(non-2-statemodel)拟合。

mAb的FcR结合活性。

通过使用表面等离子共振技术，用BIACORE(Biacore AB，Uppsala，Sweden)仪进行实验。将mAbs(2μg/mL)捕获在抗原包被的表面(重组人CD30)。将始于6μM的几个浓度的FcRγIIIa的Val¹⁵⁸和Phe¹⁵⁸同种异型流过捕获的抗体上方，进行3分钟。通过使用GraphPad Prism(v4.01)软件使作为FcRγIIIa的函数的结合信号与单位点结合模型拟合，从而获得K_D值。在整个实验中使用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.005％(v/v)P20，pH7.4)。mAb对缓冲剂的结合或FcRγIIIa对空表面的结合用作阴性对照。

抗原结合亲和力的测定。

将表达CD30的L540细胞(DSMZ Cell Culture Collection#ACC72)用作进行结合测定的抗原阳性细胞。将2x10⁵个细胞/小孔的等分在4℃与100μL指定浓度的一抗一起温育30分钟。在加入山羊抗人mAb(FITC标记的二抗(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)以1：500的稀释度在100μL/孔中在4℃温育30分钟)之前，用具有2％(v/v)的胎牛血清(FBS)的PBS中洗涤细胞2次。在具有2％(v/v)FBS的PBS中洗涤细胞2次，使用FACS Calibur仪(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)通过流式细胞术对其进行测定。使用GraphPad Prism3.0软件，根据结合曲线确定MDX-060CHO、LEX和LEX^OptmAb与L540细胞上的CD30结合的EC₅₀值。

ADCC测定。

通过标准的Ficoll-Paque分离术从肝素化的全血纯化人外周血单核效应细胞。在PBS中洗涤细胞(2x10⁶)，然后将其用于基因分型。然后将剩下的效应细胞以1x10⁶个细胞/mL重悬浮于包含10％(v/v)的FBS和50U/mL的人IL-2(Research Diagnostics，Concord，MA)的RPMI1640培养基中，并且在37℃下温育过夜。在培养基中洗涤效应细胞一次，然后在使用前其以1x10⁷个细胞/mL重悬浮。用20μMBATDA(双(乙酰氧基甲基)2，2′：6′，2″-三联吡啶-6，6″-二羧酸盐)在37℃下标记1x10⁶个细胞/mL RPMI1640培养基(包含10％(v/v)FBS和5mM丙磺舒)的L540靶细胞。在补充以20mM HEPES和5mM丙磺舒的PBS中洗涤靶细胞3次，然后以1x10⁵个细胞/mL重悬浮，将其以1：50的终靶细胞对效应细胞比例加入至96孔板中的效应细胞(1x10⁴个靶细胞和5x10⁵个效应细胞/小孔)。通过在3％(v/v)来苏儿中温育靶细胞来获得最大释放和通过在单独的细胞培养基中温育获得自发释放。在37℃下温育1小时后，从各小孔中收获20μL上清液，然后将其加入装有180μL铕溶液的小孔中。用Perkin Elmer Fusion AlphaTRF读出器(使用400微秒的延迟和分别330/80、620/10的激发和发射滤光片)读取反应。将每秒计数作为抗体浓度的函数作图，使用GraphPad Prism3.0软件，通过非线性回归，S形(sigmoldal)剂量响应(可变斜率)分析数据。百分数特异性裂解计算为：(实验性释放-自发性释放)/(最大释放自发性释放)x100。在所有研究中，包括人mAbI同型对照，并且将其与MDX-060CHO、LEX和LEX^OptmAb比较。其他对照包括不具有mAb的靶细胞和效应细胞、不具有效应细胞的靶细胞和在3％(v/v)来苏儿存在的情况下的靶细胞和效应细胞。

结果

LEX系统中的MDX-060mAb的表达。

MDX-060是开发用于治疗何杰金淋巴瘤(Hodgkinsl ymphoma)和间变性大细胞淋巴瘤(Borchmann等人(2003)Blood102：3737-3742)的抗CD30抗体(正式称为5F11)。构建二元载体以用于在LEX系统中表达MDX-060。表达载体MDXA01包含编码MDX-060的重(H)和轻(L)链的密码子最优化的基因，而载体MDXA04除了嵌合型FucT/XylTRNAi基因外还包含编码H和L链的基因(图39)。就MDXA01(165系)和MDXA04(195系)表达载体产生独立的转基因系。为简单起见，MDXA01来源的mAb(野生型N糖基化)和MDXA04来源的mAb(包含FucT/XylT RNAi构建体)在下面的描述中将分别称为MDX-060LEX和MDX-060LEX^Opt。

使用IgG ELISA就mAb的表达第一次筛选转基因植物系。进一步就FucT和XylT的活性测定具有高水平的mAb表达的LEX^Opt系。大多数高表达MDX-060LEX^Opt的系中的转移酶活性减少至阴性对照的水平，这表明在大多数测定的系中存在有效的沉默(图40)。与野生型浮萍植物(数据未显示)相比，MDX-060LEX^Opt系不展示任何形态学或生长差异。

使用差示扫描热量法(DSC)确定MDX-060CHO、LEX和LEX^OptmAb的热稳定性。所有三种mAb都展示相似的熔解曲线动力学(meltingcurve kinetics)(数据未显示)和熔解转换点温度(meltingtransition pointtemperature)(下面的表2)，进一步证明与MDX-060CHO mAb相比，浮萍产生的MDX-060LEX和LEX^Opt的结构完整性。在非还原(图41A)和还原条件(图41B)下的SDS-PAGE分析显示来自MDX-060LEX^Opt和MDX-060CHO系的mAb具有与表现为蛋白质提取物中的主要组分的mAb相似的蛋白质特征谱。

表2.通过差示扫描热量法(DSC)进行的MDX-060CHO、MDX-060LEX和糖基最优化的MDX-060LEX^OptmAb的热稳定性的比较。

MDX-060CHO，LEX和LEX^0ptmAb的N聚糖结构

通过阴性反射模式MALDI-TOF MS和正相(NP)HPLC-QTOF MS确定重组MDX-060CHO、MDX-060LEX和MDX-060LEX^Opt来源的mAb的N聚糖的特征谱。下面描述中提及的N聚糖的结构示于图53中。

来自MDX-060CHO系的N聚糖的MALDI-TOF MS分析表明存在具有相应于2-AA标记的GnGnF⁶(命名法来源于http://www.proglycan.com)、Man5、GnA_isoF⁶和AAF⁶(图42)的m/z值的四种主要N聚糖。NP-HPLC将GnA_isoF⁶N聚糖分成其的两个同种型(附着至α-1，6-Man或α-1，3-Man臂的Gal)，所述同种型使MDX-060CHO上发现的主要N聚糖的总数达到5个(图43)。未进行确认各同种型的鉴定的峰的MS/MS断裂；然而，早期峰的更高的丰度暗示着Gal附着至该N聚糖的α-1，6-Man臂(Shinkawa等人(2003)J.Biol.Chem.278：3466-3473；Zhu等人(2005)Nat.Biotechnol.23：1159-1169)。在线阴性模式QTOF MS分析给出了相应于带双电荷的GnGnF⁶、Man5、GnA_isoF⁶(两种亚型)和AAF⁶的m/z值，从而验证了MALDI-TOF MS的结果(下面的表3)。荧光示踪(fluorescent trace)的峰值积分(Peakintegration)显示GnGnF⁶、Man5、AGnF⁶、GnAF⁶和AAF⁶分别构成来自MDX-060CHO的总N聚糖结构的50.8、2.5、26.1、10.7和6.8％。剩余的3.1％的N聚糖经发现为GnGn、GnM_isoF⁶、GnM_iso和MM(没有高于总N聚糖的1.2％的结构)的混合(数据未显示)。

表3.来自由CHO细胞(CHO)、野生型浮萍(LEX)或表达RNAi构建体的糖基最优化的浮萍系(LEX^Opt)产生的MDXA-060mAb的主要的2-AA标记的N聚糖的观察到的MALDI-TOF和QTOFMS质量的概述.

^aN聚糖名称基于Proglycan(http://www.proglycan.com)命名法。

2AA，2-氨基苯甲酸。

^b提及的N聚糖结构的标志如下：

N-乙酰葡糖胺；

甘露糖；

半乳糖；

木糖；

α-1，3-岩藻糖；

，α-1，6-岩藻糖、

2-氨基苯甲酸。

^c各N聚糖结构m/z值和％峰面积获自图2。

野生型MDX-060LEX mAb的MALDI-TOF MS显示存在具有相应于GnGnXF³、GnGnX和GnGn的m/z值的三种主要种类(图42)。NP-HPLC-QTOF MS分析显示具有相应于带双电荷的GnGnXF³、GnGnX和GnGn的m/z值的三个主要荧光峰，再次验证了MALDI-TOF MS的结果(图43；表3)。荧光峰的积分表明GnGnXF³、GnGnX和GnGn分别构成了来源于MDX-060LEX mAb的总N聚糖的67.4、17.2和8.4％。剩余的7％的N聚糖确定为MM、GnM_iso、MMXF³、GnGnF³、GnM_isoXF³、Man6、Man7、Gn(FA)_isoXF³、Man8和Man9(没有过总的N聚糖的2％的N聚糖)的混合。对从两个独立地转化的MDX-060LEX系分离的mAb观察到相似的结果(数据未显示)。此处显示的LEX mAb上的N聚糖的简单排列提供了易于控制的用于糖基最优化的起始点。

与MDX-060LEX mAb相反，通过MALD-TOF MS和NP-HPLC-QTOF MS分析(图42和43；表3)显示，来自MDX-060LEX^OptmAb的N聚糖具有GnGn作为主要的N聚糖种类。GnGn组成了95.8％的总N聚糖，剩余的4.2％的N聚糖确定为MM、GnM_iso、GnA_iso、Man6、Man7、Man8，没有一种结构超过总N聚糖的1.2％。LEX^OptN聚糖中没有一种包含岩藻糖(Fuc)或木糖(Xyl)。这些结果证明靶向浮萍FucT和XylT的RNAi构建体的共表达导致从MDX-060LEX^OptmAb完全消除包含Fuc和Xyl的N聚糖和产生高度均一的mAb糖形。对于从处于不同的培养规模(转基因系225的300g组织对转基因系52的1g组织，所述转基因系产生具有图42和43中显示的N聚糖特征谱的MDX-060LEX^OptmAb)的包含MDXA04表达载体的独立地转基因系(系225)收获的MDX-060LEX^OptmAb获得以相同的结果。与其中N聚糖的不均一性可随培养条件、培养规模和生长期的变化而变化的哺乳动物细胞培养系统(Kanda等人(2006)Biotechnol.Bioeng.94：680-688)不同，对于LEX^OptmAb观察到的聚糖均一性显示与在不同培养条件和规模下保持恒定。

通过单糖分析进一步验证了MDX-060LEX^OptmAbN聚糖上的Fuc或Xyl的不存在(下面的表4)。通过酸水解从MDX-060CHO、LEX和LEX^OptmAb释放单糖，然后通过与脉冲安培检测(pulsed amperometricdetection)(PAD)偶联的高效阴离子交换层析(HPAEC)对所述单糖进行分析。CHO和野生型LEX mAb的Man和GlcNAc残基的单糖比率相似且与预期的值密切相关。当与CHO来源的mAb相比时，LEX mAb的Gal和Fuc含量显著减少，但具有显著增加的Xyl。浮萍来源的mAb的单糖分析显示虽然Fuc和Xyl存在于野生型LEXN聚糖上，但在LEX^OptmAb上未检测到它们。综合起来，这些结果证明靶向浮萍XylT和FucT的RNAi构建体的共表达导致包含Fuc和Xyl的N聚糖从MDX-060LEX^OptmAb上消除并且产生高度均一的mAb糖形。已用多个表达MDX-060LEX^OptmAb的独立植物系以及在LEX系统中表达的其他mAb(例如本说明书中上面的实施例中所述的mAbI单克隆抗体)验证了该糖基最优化策略的可靠性。在这些随后的转化中，已获得达到总的可溶性蛋白(TSP)的6％的糖基最优化的mAb的表达水平。

表4.通过酸水解从MDX-060CHO、LEX和LEX^OptmAb释放单糖并且通过HPAEC-PAD分析所述单糖。通过对碳水化合物对照进行标准化来确定来自各mAb的单糖含量。

MDX-060CHO、LEX和LEX^OptmAb的功能活性

使用表达CD30的L540细胞确定MDX-060CHO、MDX-060LEX和MDX-060LEX^OptmAb的抗原结合性质。所有三种mAb具有几乎相同的结合曲线(图43)。MDX-060CHO、LEX和LEX^Opt的EC₅₀浓度分别确定为0.180μg/mL、0.227g/mL和0.196μg/mL(图44)，这表明所有三种mAb的抗原结合相似。

已显示Fc-受体介导的效应细胞功能对于许多治疗性mAb的体内活性是非常重要的。因为负责ADCC活性的NK细胞和巨噬细胞上表达的FcR是FcγRIIIa，因此比较不同mAb对该受体的结合。通过mAb与表达两种不同人FcRγIIIa同种异型(Phe¹⁵⁸或Val¹⁵⁸)的效应细胞的平衡结合来确定CHO、LEX和LEX^OptmAb的FcR结合。与CHO来源的mAb相比，MDX-060LEX对于FcRγIIIaPhe¹⁵⁸的结合具有1.7倍的增加，对于在FcRγIIIaVal¹⁵⁸的结合具有0.4倍的减少，这证明对于CHO和LEX，mAb的受体结合是相似的。相反地，LEX^OptmAb对于FcRγIIIaPhe¹⁵⁸和FcRγIIIaVal¹⁵⁸的亲和力分别比CHO mAb高27和15倍(图45)。这些结果表明LEX^Opt系中浮萍FucT和XylT活性的RNAi沉默产生具有增强的FcR结合的mAb。

通过将mAb与纯合的(FcRγIIIaPhe¹⁵⁸)或杂合的(FcRγIIIaPhelVal¹⁵⁸)人效应细胞和BATDA(双(乙酰氧基甲基)2，2′：6′，2″-三联吡啶-6，6″-二羧酸盐)标记的L540靶细胞一起温育来确定CHO、LEX和LEX^OptmAbADCC活性(图45)。使用杂合的FcRγIIIaPhe/Val¹⁵⁸人效应细胞(图46)表明，MDX-060LEX mAb(31％)具有与CHO mAb(31％)相同的最大百分比细胞裂解，EC₅₀值相似。使用纯合的FcγRIIIaPhe/Phe¹⁵⁸效应细胞表明，与CHO mAb(15％)相比，LEX mAb(27％)的最大百分数的细胞裂解略微增加。重要地，与MDX-060CHO和LEX mAb相比，无论供体基因型如何，LEX^OptmAb都具有显著增加的ADCC活性。这可通过效力和效率的增加来估计。对于两个实验，MDX-060Lex^Opt的最大百分比裂解都是45％，而对于FcγRIIIa Val/Phe¹⁵⁸效应细胞，其EC₅₀值分别比MDX-060LEX和MDX-060CHO mAb低3至5倍，对于FcγRIIIa Phe/Phe¹⁵⁸效应细胞，低2至3倍。这些结果证明从MDX-060LEX^OptmAb除去包含Fuc和Xyl的N聚糖引起ADCC活性的增强，从而可提高它们的治疗潜能。

对于MDX-060LEX和MDX-060LEX^Opt的完整IgG的RP-HPLC-Q-TOFMS分析

使用适配有Poros R1-10柱子(2mmx30mm；AppliedBiosystems)的Waters2695HPLC系统除去蛋白A纯化的IgG(50μg)的盐分。使用Waters2487双波长UV检测器(280nm)和WatersQ-TOFAPI US检测和分析IgG。使用0.05％(v/v)三氟乙酸(TFA；溶剂A)和0.05％(v/v)TFA，80％(v/v)乙腈(溶剂B)以0.15mL/分钟在60℃下进行分离。使用在5分钟内从30％线性增加至50％的B，在5分钟内增加至80％的B来进行样品洗脱。溶剂比率保持在80％的B，进行另外4分钟，然后用100％的B洗涤1分钟，在下一轮之前用30％的B平衡柱子15分钟。

在阳离子模式中分别使用100℃和300℃的源和去溶剂化温度以及分别为3.0和60V的毛细管和进样锥电压来进行Q-TOF。数据是通过使用MaxEnt1将大于等于100个单个的扫描和反卷积组合成亲本质谱的结果。

也参见Triguero等人(2005)Plant BiotechnolJ.3：449-457；Takahashi等人(1998)Anal.Biochem.255：183-187；Dillon等人(2004)J.Chromatogr.A.1053：299-305。

图47显示在包含MDXA01构建体的野生型浮萍中产生的MDX-060LEX mAb组合物的完整质量分析。当在浮萍中不抑制XylT和FucT的表达时，重组产生的MDX-060LEX mAb组合物包含至少7种不同的糖形，G0XF³糖形为存在的主要种类。注意代表G0糖形的峰不存在。

图48显示在包含MDXA01构建体的野生型浮萍中产生的MDX-060LEX mAb的重链的聚糖质量分析。当在浮萍中不抑制XylT和FucT的表达时，存在的主要的N聚糖的种类是G0XF³，另外的主峰反映G0X种类。注意存在少量G0聚糖种类。

图49显示在包含MDXA04构建体的转基因浮萍中产生的MDX-060LEX^OptmAb组合物的完整质量分析。当在浮萍中抑制XylT和FucT的表达时，完整的mAb组合物只包含G0N聚糖。此外，组合物对于G0糖形(峰2)是大体上均一的，其中两个糖基化位点都由G0N聚糖种类占据，两个小峰反映痕量的前体糖形(峰1，显示具有Fc区域的mAb，其中，1条重链的C_H2结构域具有附着至Asn297的G0聚糖种类，另1条重链的C_H2结构域未被糖基化；峰3，显示具有Fc区域的mAb，其中，各C_H2结构域上的Asn297糖基化位点具有附着的G0聚糖种类，第三G0聚糖种类且附着至mAb结构内的另外的糖基化位点)。

图50显示在包含MDXA04构建体的转基因浮萍中产生的MDX-060LEX^OptmAb的重链的聚糖质量分析。当在浮萍中抑制XylT和FucT的表达时，附着至重链的C_H2结构域内的Asn297糖基化位点的唯一可易于检测的N聚糖种类是G0。

讨论

通过与目的在于沉默内源性浮萍FucT和XylT基因的RNAi盒共表达来进行MDX-060的糖基最优化。使用单个RNAi转录物获得该FucT和XylT基因的同时沉默。通过从MDX-060LEX^OptmAb纯化的N聚糖的MALDI-TOF、NP-HPLC-QTOF MS和单糖分析来验证LEX^OptmAb上不存在Fuc和Xyl。这些分析确证了微粒体膜中观察到的转移酶活性的不存在。重要地，大于95％的从LEX^OptmAb释放的N聚糖是单一结构GnGn，这表明该策略具有产生具有均一的N聚糖特征谱的mAb的额外的益处。发现，与MDX-060CHO相比，MDX-060LEX和LEX^OptmAb在热稳定性和抗原结合方面是不可区分的。还发现对于所有三种mAb，电泳分析是相似的。事实上，检测到的唯一的结构差异在于mAb N聚糖的特征谱。

不受理论束缚，MDX-060LEX^Opt系产生具有单一的主要的N聚糖种类的mAb的能力可基于在野生型浮萍中发现的更均一的mAb糖形分布。从于野生型烟草(Fujiyama等人(2006)J.Biosci.Bioeng.101：212-218；Elbers等人(2001)Plant Physiol.126：1314-1322；Bakker等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci98：2899-2904)、苜蓿(Bardor等人(2003)Plant Biotechnol.J.1：451-462)和苔藓(Koprivova等人(2003)Plant Bio.5：582-591)中纯化的mAb释放的N聚糖显示具有野生型N糖基化的植物中的mAb糖形不均一性可在5种(苜蓿)(Bardor等人(2003)Plant Biotechnol.J.1：451-462)至8种(烟草)(Fujiyama等人(2006)J.Biosci.Bioeng.101：212-218)不同的主要结构范围内变化。MDX-060LEX只具有3种主要的N聚糖结构(GnGn、GnGnX和GnGnXF³)。由野生型浮萍产生的mAb上的N聚糖的简单排列可提供用于导致比在其他系统中观察到的更大的均一性的糖基最优化的更易控制的起始点。

已显示Fc-受体介导的效应细胞功能对于许多治疗性mAb的体内活性是非常重要的。在本研究中，比较MDX-060CHO、MDX-060LEX和MDX-060LEX^OptmAb的ADCC活性。因为负责ADCC活性的NK细胞和巨噬细胞上表达的FcR是FcγRIIIa，因此也比较不同mAb对该受体的结合。上述结果显示，与MDX-060CHO、MDX-060LEX mAb相比，MDX-060LEX^OptmAb具有增加的对FcγRIIIa的结合亲和力(15-25倍)和最大结合(4-5倍)以及增加的ADCC活性。之前已显示从在其他表达系统中产生的不同mAb除去α-1，6-连接的Fuc增加FcR结合和增强ADCC功能(Shinkawa等人(2003)Biol.Chem.278：3466-3473；Shields等人(2002)Biol.Chem.277：26733-26740；Niwa等人(2004)Clin.CancerRes.10：6248-6255)。此处提供的结果表明从MDX-060LEX^OptmAb上除去α-1，3-连接的Fuc对mAb的功能具有与除去α-1，6-连接的Fuc相同的影响。

在本研究中，评估在残基158⁴¹、Val¹⁵⁸和Phe⁵¹⁸上天然存在的两种FcγRIIIa的多态性同种型。如使用其他IgG1 mAb已观察到的，与FcγRIIIa-Phe¹⁵⁸相比，MDX-060LEX^Opt显示对FcγRIIIa-Val¹⁵⁸的更高的结合亲和和(Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。对于两种同种型都观察到与MDX-060LEX^Opt的结合增加的事实是非常重要的，因为发现对Val¹⁵⁸和Phe¹⁵⁸的不同结合预示着接受抗CD20治疗的某些患者群的临床和免疫反应(Cartron等人(2002)Blood99：754-758；Weng等人(2003)J.Clin.Oncol.21：3940-3947；Weng等人(2004)J.Clin.Oncol.22：4717-4724)。已假定该结合的增加导致更高百分比的响应需要Fc功能性的治疗的患者。

还观察到相似的ADCC活性的增加。在本研究中，当与MDX-060CHO比较时，MDX-060LEX^OptmAb显示增加的细胞裂解和减少的EC₅₀值，这导致效率和效力的增加。如通过获得MDX-060CHO的最大百分比裂解和计算产生相同百分比细胞裂解的MDX-060LEX^OptmAb的浓度所确定的，这相应于20倍的活性的增加。关于FcγRIIIa结合研究，对于纯合的FcγRIIIaPhe/Phe¹⁵⁸和杂合的FcγRIIIaPhe/Val¹⁵⁸效应细胞供体，都观察到ADCC活性的增加。此处提供的结果表明从MDX-060LEX^OptmAb除去α-1，3-连接的Fuc对于mAb的功能具有与除去α-1，6-连接的Fuc相同的影响。

已用多个表达MDX-060LEX^OptmAb的独立浮萍植物系以及在浮萍系统中表达的其他mAb(参见，例如，上面实施例2-4)证明了该糖基最优化策略的可靠性。此外，与野生型浮萍植物相比，在植物表型或生长速度上没有显著的差异。与其中N聚糖的不均一性可随培养条件、培养规模和生长周期⁸的变化而变化的哺乳动物细胞培养系统不同，对于LEX^OptmAb观察到的聚糖均一性显示在不同培养条件和规模下保持恒定(数据未显示)。

总之，使用RNAi策略在浮萍表达系统中产生糖基最优化抗CD30抗体。所得的mAb由单一的主要的N聚糖结构组成，无植物特异性Fuc和Xyl残基的任何证据。此外，与CHO来源的mAb相比，所得的最优化的mAb具有增加的ADCC活性和FcγRIIIa结合活性。在具有该FucT+XylT基因敲除策略的浮萍表达系统中产生的mAb上获得的均一的糖基化特征谱使得可能表达具有增加的产物一致性的这些mAb。

实施例7：浮萍中聚糖最优化mAbI的扩大生产

以与上述方式类似的方式产生包含图12的mAbI04构建体(提供FucT和XylT的抑制)的浮萍转基因系24。在其产生之后，通过克隆性培养持续保持转基因系24，其中周期性地将植物培养物的子样本转移至新鲜的培养基中以进行进一步培养。就重组产生的mAbI抗体的N糖基化模式分析该转基因系，随后从1g组织扩大至300g(0.3kg)组织的扩大生产和进一步至6.5kg组织的扩大生产。扩大生产至6.5kg组织的过程在产生转基因系24后大约8个月发生。结果示于图51A(N聚糖的MALDI-TOF分析)和51B(N聚糖的HPLC荧光分析)。

由包含mAbI04构建体的转基因系24产生的mAbI抗体的糖基化特征谱对于从1g组织至0.3kg组织的扩大生产，和进一步地至6.5kg组织的扩大生产仍然保持均一，从而其特征在于相应于GnGn(即，G0)聚糖种类的单一的主要的峰的存在。因此，包含mAbI04构建体的转基因浮萍中的糖基化特征谱的均一性对于生产规模大约6,500倍的增加(即1g增加至6.5kg)仍然保持一致。此外，糖基化特征谱的均一性在其产生后8个月在该转基因系中仍然保持一致

这些数据证明包含mAbI04构建体的转基因浮萍中的糖基化特征谱的均一性对于生产规模至少6,500倍的增加仍然保持一致。此外，包含mAbI04构建体的转基因浮萍中的糖基化特征谱的均一性在转基因系产生后至少8个月仍然得到保持。糖基化特征谱的均一性预期以于生产规模的进一步增加仍得到保持，因而，例如，如果生产规模增加为6.5kg的4倍(例如，从6.5kg扩大至26kg)，预期糖基化特征谱的均一性仍得到保持。也预期在转基因系产生后远超过8个月，糖基化特征谱的均一性对于转基因系的连续克隆性培养仍然得到保持。

实施例8：浮萍的mAbI04RNAi构建体转基因系中的内源性糖蛋白 的糖基化模式

L40蛋白酶是浮萍中产生的代表性内源性糖蛋白。为了估计mAbI04RNAi构建体(图12)对内源性蛋白质的糖基化的影响，使用苄脒亲和层析从浮萍的mAbI04RNAi构建体转基因系分离L40蛋白。以上述方式使用MALDI-TOF分析法分析分离的L40蛋白的N糖基化模式。结果示于图52。

如可从该分析看到的，使用嵌合型RNAi mAbI04构建体对FucT和XylT的表达的抑制导致具有与对于重组糖蛋白观察到的糖基化模式一致的均一的糖基化模式的内源性糖蛋白。因此，从具有野生型糖基化机构的浮萍中分离的L40糖蛋白的异源性N聚糖特征谱由具有附着的β1，2-连接的木聚糖残基或β1，2-连接的木聚糖和核心α1，3-连接的木糖残基的N聚糖的混合的代表。相反地，从浮萍的mAbI04RNAi构建体转基因系分离的L40的均一的N聚糖的特征谱由相应于G0聚糖种类的单个主要的峰代表，其特征在于不存在具有附着的β1，2-连接的木聚糖或β1，2-连接的木聚糖和核心α1，3-连接的木糖残基的N聚糖种类。

实施例9：具有增加的ADCC活性的抗CD20和抗HER2单克隆抗体 的产生

IDEC-C2B8(IDEC Pharmaceutical sCorp.，San Diego，California；可在商品名

(也称为利妥昔单抗)下商购获得；参见美国专利5,736,137，通过引用纳入本文)是包含人IgG1和K恒定区与从小鼠抗CD20单克隆抗体IDEC-2B8(Reff等人(1994)Blood83：435-445)分离的鼠类可变区的嵌合型抗CD20单克隆抗体。利妥昔单抗被许可用于治疗复发性B细胞低度或滤泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。在CHO细胞中重组产生以利妥昔单抗

销售的抗CD20抗体。该CHO表达的抗CD20抗体的糖基化模式显示了糖形的不均一性混合。

人源化抗ERBB2抗体可在商品名

(Genentech，Inc.，San Francisco，California)(参见美国专利6,165,464，通过引用纳入本文)下商购获得。该重组人源化单克隆抗体具有对于p185HER2的高亲和力。对具有广泛转移的乳腺癌的患者的早期临床试验证明该单克隆抗体抑制过度表达HER2的乳腺癌细胞的生长的能力(Baselga等到.(1996)J.Clin.Oncol14(3)：737-744)。

使用上述mAbI01构建体在具有野生型糖基化模式的浮萍中，和使用mAbI04嵌合型RNAi构建体(用利妥昔单抗或抗ERBB2重链和轻链编码序列取代这些构建体中的各构建体的mAbI的编码序列)在经遗传修饰从而抑制FucT和XylT表达的浮萍中产生利妥昔单抗序列(rituximab-sequence)抗体和

抗ERBB2-序列的抗体。任意地用浮萍偏爱性密码子对编码重链和轻链的序列进行密码子最优化。如上面实施例1中所述，就糖基化模式分析分泌的利妥昔单抗-序列mAb(即，具有利妥昔单抗抗体的氨基酸序列)和抗ERBB2-序列mAb(即，具有

抗ERBB2mAb的氨基酸序列)。

包含mAbI01样构建体的野生型浮萍中产生的完整利妥昔单抗-序列mAb或抗ERBB2-序列mAb的糖基化模式显示具有相应于多种糖形的许多峰的不均一的特征谱。相反地，包含mAbI04样构建体的转基因浮萍中产生的完整利妥昔单抗-序列mAb或抗ERBB2-序列mAb的糖基化模式显示大体上均一的糖蛋白组合物，具有3个糖形的峰，其中最大的峰相应于G0糖形，两个非常小的峰相应于痕量的前体糖形，其中没有附着木糖和岩藻糖残基。

就ADCC活性和新分离的人NK细胞上的Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)结合检测具有对于G0糖形是大体上均一的糖基化特征谱的利妥昔单抗-序列和抗ERBB2-序列单克隆抗体组合物。与对于从具有野生型糖基化机构(即，无FucT或XylT的沉默)的浮萍系产生的利妥昔单抗-序列和抗ERBB2-序列mAb观察到的结合相比，从用MAbI04样构建体进行基因工程改造的浮萍系产生的利妥昔单抗-序列和抗ERBB2-序列mAb展示预期的增加的结合(根据任何木糖残基的不存在)。此外，结合亲和力至少与对于CHO细胞系中产生的相应的mAb的一样强。

通过使用纯化的人外周血单核细胞作为效应细胞来测定用mAbI04样构建体进行基因工程改造的浮萍系中产生的利妥昔单抗-序列mAb和抗ERBB2-序列mAb的大体上均一的G0糖形的ADCC活性(参见，例如，Shinkawa等人(2003)J.Biol.Chem.278(5)：3466-3473；通过引用其全文纳入本文)。G0糖形利妥昔单抗-序列和抗ERBB2-序列mAb组合物的活性比具有野生型糖基化机构的浮萍中产生的或CHO细胞中产生的各利妥昔单抗-序列mAb或抗ERBB2序列mAb展示的活生提高50至1000倍。

使用本领域内已知的标准测定方法(参见，例如，美国专利申请2004/0167319中描述的补体激活测定法，通过引用其全文纳入本文)测定用mAbI04样RNAi构建体进行基因工程改造的浮萍系中产生的利妥昔单抗-序列mAb的大体上均一的G0糖形的CDC活性，并且将其与对于利妥昔单抗所观察到的CDC活性比较。非相关抗体用作阴性对照。在一个这样的测定中，使用碘化丙啶(PI)排除测定法，用来自健康志愿者的血清作为补体源，通过估计提高的膜通透性来测量不同抗体抗靶Daudi细胞的CDC活性。通过从健康志愿者抽取血液注入autosep凝胶和clot activator vacutainer管(BDBiosciences，Rutherford，New Jersey)来制备用于补体裂解的血清，将所述血清在室温下保持30至60分钟，然后以3000rpm离心5分钟。收获血清并且在-80℃下贮存。

简而言之，对于该CDC活性测定，洗涤Daudi细胞，然后以1X10⁶/ml将其重悬浮于RPMI-1％BSA中。向Daudi细胞中加入将不同浓度的G0糖形大体上均一的利妥昔单抗-序列mAb、利妥昔单抗和阴性对照mAb并且让其在室温下结合，进行10至15分钟。此后，加入作为补体源的血清至20％(v/v)的终浓度，在37℃下温育混合物45分钟。然后将细胞保持在4℃下直至进行分析。然后向FACS管中的10

μlPI溶液(10μg/ml于PBS中)中加入各样品(150μl)。立即使用FACScalibur流式细胞仪就细胞裂解(PI阳性的细胞的数目)估量混合物，使用CellQuest软件(BDBiosciences，Mountain View，California)进行分析。收集至少5000个事件以用于对通过调整前侧向散射(forward sideward scatter)(FCS)阈值而排除的细胞碎片进行分析。与由利妥昔单抗展示的CDC活性相比，大体上均一的G0糖形利妥昔单抗-序列mAb的CDC活性减少。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明属于的领域内的技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用纳入本文，其引用的程度就如同将每一个别出版物、专利申请特定且个别地引用的方式并入。

Claims (11)

1.包含大体上均一的N糖基化特征谱的免疫球蛋白组合物，其中至少95％的存在于所述特征谱中的N聚糖种类是GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(G0)，其中至少95％的存在于所述组合物中的免疫球蛋白由G0糖形代表，其中在所述免疫球蛋白上所有预期的糖基化位点由G0 N-聚糖占据，所述特征谱包含痕量的前体N聚糖种类，且所述组合物包含痕量的前体糖形。

2.权利要求1的免疫球蛋白组合物，其中所述免疫球蛋白包含选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4区域的Fc区域。

3.权利要求1的免疫球蛋白组合物，其中所述免疫球蛋白是单克隆抗体。

4.权利要求3的免疫球蛋白组合物，其中所述单克隆抗体结合选自CD20和ERBB2(HER2)的抗原。

5.权利要求1至4任一项的免疫球蛋白组合物，其中所述免疫球蛋白展示增加的对于FcγRIII的结合亲和力。

6.权利要求1至5任一项的免疫球蛋白组合物，其中所述免疫球蛋白展示增加的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。

7.权利要求1至6任一项的免疫球蛋白组合物，其中所述免疫球蛋白展示减少的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。

8.权利要求7所述的免疫球蛋白组合物在制备用于减少与因抗体的施用而引起的补体激活相关的一种或多种不利副作用的药物中的用途。

9.包含权利要求1至7任一项的免疫球蛋白组合物的药物组合物。

10.包含权利要求1至7任一项的免疫球蛋白组合物的植物宿主细胞，其中所述植物是浮萍。

11.权利要求1至7任一项所述的免疫球蛋白组合物，其中所述组合物由包含如下步骤的方法产生：

(a)在适合于所述免疫球蛋白表达的条件下在培养基中培养浮萍植物或浮萍植物细胞或结节，其中所述植物、植物细胞或结节能够表达所述免疫球蛋白；

(b)从所述浮萍植物、植物细胞或结节或所述培养基收获所述免疫球蛋白；

进而产生所述免疫球蛋白组合物；其中所述浮萍植物或浮萍植物细胞或结节包含至少一种重组核苷酸构建体，所述核苷酸构建体在所述植物、植物细胞或结节中抑制α1，3-岩藻糖基转移酶和β1，2-木糖基转移酶的表达。

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