CN101426518A - 用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物 - Google Patents
用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101426518A CN101426518A CNA2007800052112A CN200780005211A CN101426518A CN 101426518 A CN101426518 A CN 101426518A CN A2007800052112 A CNA2007800052112 A CN A2007800052112A CN 200780005211 A CN200780005211 A CN 200780005211A CN 101426518 A CN101426518 A CN 101426518A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- described method
- compositions
- treatment
- protein
- albumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明主要涉及用于治疗肺部病症的方法和化合物,并且更具体地涉及hIL-4突变蛋白的吸入施用和应用以治疗哮喘。
Description
发明背景
技术领域
[0001]本发明主要涉及用于治疗肺部病症的方法和化合物,并且更具体地涉及治疗哮喘的hIL-4突变蛋白的使用。
背景技术
[0002]白细胞介素-4(Interleukin-4(IL-4))和白细胞介素-13(Interleukin-13(IL-13))是在几种靶细胞上具有广谱生物学效应的多效细胞因子,其在遗传性过敏和哮喘的发病机理中很重要。IL-4越来越多地被认为是启动“Th2型”炎症反应,形成遗传性过敏和哮喘发展所必须的潜在环境的关键细胞因子。IL-4的效应包括T细胞和B细胞的激活、增殖和分化。在B-淋巴细胞增殖过程中,IL-4通过调节从IgG到IgE的类别转换因而促进过敏反应的发展而作为分化因子起作用。而IL-13现在被认为更可能是下游效应细胞因子。IL-13在包括气道高应答性(airways hyperresponsiveness(AHR))和杯状细胞增生——两者是哮喘的两个主要特征的诱导的效应中起主要作用。然而,在这两种细胞因子的效应中有相当多的冗余。
[0003]与这两种细胞因子的结合和信号有关的效应中的冗余可以通过它们共享共同的受体来解释。IL-4受体α链(IL-4Rα)具有两个能与其结合并传出信号的结合伙伴(binding partner)。IL-4Rα多肽与细胞因子共同受体γ链(γc)结合形成1型IL-4R异二聚体。IL-4Rα多肽也可以与IL-13受体α1链结合形成异二聚体,以产生2型IL-4R(aka IL-13R)。IL-4激活1型和2型受体,而IL-13只激活2型受体异二聚体。两种受体,在被激活时,通过信号转导及转录激活因子6(signal transducer and activator of transcription6(STAT6))的转录因子传出信号。虽然IL-4可以唯一地启动T-辅助细胞(Th2)通路,因为只有1型受体定位于T-淋巴细胞,所以IL-13可能更多并且更有效。因此在由这两种细胞因子的产生所调节和控制的疾病状态中,抑制这两种细胞因子是重要的。
[0004]最近,在人IL-4(hIL-4)突变蛋白中已经观测到某些拮抗和部分拮抗的性质,其中天然存在于野生型的位置120、121、122、123、124、125、126、127或128的一个或多个上的氨基酸(一种或多种)已经被一种或多种天然的氨基酸置换。因此,这些hIL-4突变蛋白被描述为有价值的治疗剂,在治疗超射(overshooting)或不当调节的免疫反应以及自身免疫病中用作药剂。
发明概述
[0005]本发明基于,部分地,基于这样的发现——突变IL-4蛋白在治疗患有哮喘的个体中是有用的。本发明部分地基于这样的发现,具有R121D和Y124D取代的突变IL-4蛋白能够以药物组合物被施用以拮抗野生型hIL-4和野生型hIL-13与受体的结合。
[0006]因此,在一个实施方式中,本发明提供通过施用突变IL-4蛋白治疗哮喘的方法。在一个实施方式中,用于治疗哮喘的方法包括向需要其的个体施用含有治疗有效量的IL-4突变蛋白的药物组合物,该IL-4突变蛋白包含具有按照野生型hIL-4编号的R121D和Y124D取代的野生型hIL-4的氨基酸序列。在一个方面,在施用之前组合物被气溶胶化,并且,因而可以通过吸入法被施用,每天施用一次或两次。每剂量突变IL-4蛋白的典型的量为大于或等于0.5mg喷雾器中的标称剂量。个体可以是哺乳动物,如人类。
[0007]含有本发明的突变IL-4蛋白的药物组合物典型地包含药学上可接受的载体,如盐水。在其它实施方式中,突变IL-4蛋白与非-蛋白聚合物共轭。在本发明中有用的非-蛋白聚合物包括,但不限于,亲水聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮,以及疏水聚合物,如聚乙二醇。
[0008]本发明进一步涉及监测用于治疗患有哮喘个体的治疗用药法(therapeutic regimen)的方法。在一个实施方式中,监测用于治疗患有哮喘个体的治疗用药法的方法包括确定肺功能的变化,其包括即时和后期哮喘反应、气道高反应性以及在支气管肺泡灌洗(brochoalveolar lavage(BAL))、血清或呼气中发现的炎症标记物。通过检测个体的气道或血液中的炎性细胞和介质的流量上的变化完成监测。在另一实施方式中,监测用于治疗患有哮喘的个体的治疗用药法的方法包括:确定治疗过程中支气管肺泡灌洗(BAL)的嗜酸性粒细胞浓度的变化。治疗过程中支气管肺泡灌洗(BAL)的嗜酸性粒细胞浓度的减少,可表示积极的治疗效果。在进一步的实施方式中,监测方法包括:确定相比于治疗之前呼出的一氧化氮在治疗过程中呼出的一氧化氮的浓度。治疗过程中或治疗后呼出的一氧化氮的浓度的降低,可表示积极的治疗效果。
附图简述
[0010]图1是显示灵长类哮喘模型治疗干涉方案的图示。
[0011]图2A和2B是显示在非-人类灵长类中,用皮下输送IL-4RA对过敏原-诱导的气道高应答性和气道嗜曙红细胞过多进行治疗干涉的结果的图示。
[0012]图3是一幅图示,显示每日皮下施用的IL-4RA对哮喘患者治疗之前(筛选访问2,Screening Visit2)和治疗结束时(第28天)的抗原攻击反应的影响的结果。
[0013]图4是一幅图示,显示每日皮下施用的IL-4RA作用于哮喘患者中需要β激动剂的不良事件(AEs)的结果。
[0014]图5是一幅图示,显示IL-4RA(乳酸盐制剂)在AerogenAeroneb喷雾器中雾化之前和雾化之后的TF-1/IL-4增殖活性分析的生物活性评价。
[0015]图6是一幅图示,显示每日两次输送(BID)的吸入的IL-4RA对非人类灵长类中抗原-诱导的气道高应答性的影响。
[0016]图7是一幅图示,显示每日两次输送(BID)的吸入的IL-4RA对非人类灵长类中抗原-诱导的气道(BAL)嗜曙红细胞过多的影响。
[0017]图8A和8B是显示IL-4RA(乳酸盐制剂)在Pari LC Plus喷雾器中雾化之前和雾化之后的TF-1/IL-4增殖活性分析的生物活性评价的图示。
[0018]图9是一幅图示,显示每日两次吸入的IL-4RA对哮喘患者治疗之前(筛选)和治疗结束时(第27天)的抗原攻击反应的影响。
[0019]图10是一幅图示,显示一氧化氮浓度的对数与在哮喘患者的筛选第2天及第27天的药物治疗。
[0020]图11是显示局部输送吸入的IL-4RA获得的血浆浓度低于在皮下施用IL-4RA的临床试验中获得的血浆浓度的图示。
[0021]图12是一幅图示,显示与在非人类灵长类中的皮下输送相比,在通过吸入输送时,IL-4RA在较低的血浆浓度下更有效。
[0022]图13A和13B分别显示野生型IL-4和突变IL-4的核酸和氨基酸序列。
发明详述
[0023]本发明是基于这样的发现——hIL-4突变蛋白对于治疗哮喘是有用的。因此,本发明公开了用治疗有效量的突变IL-4蛋白治疗哮喘的方法和组合物以及含有该突变蛋白的药物组合物。
[0024]本发明不限于此处描述的具体的方法、步骤、细胞系、载体、试剂等,因为这些可能会发生变化。也应理解此处使用的术语只被用于描述具体的实施方式的目的,并不意图限制本发明的范围。如此处和在所附的权利要求中所使用的,除非上下文另外明确指明,单数形式“一(a)”、“一(a)”和“该(the)”包括复数涵义。
[0025]术语“哮喘”此处被用于一般描述慢性呼吸疾病,其常常由过敏引起,以呼吸困难(labored breathing)、胸部收缩以及咳嗽的突然复发为特征。在典型的哮喘反应中,IgE抗体主要地附着到位于与细支气管和小支气管紧密连接的肺间质组织中的肥大细胞上。进入气道的抗原将因此与肥大细胞-抗体复合物反应,引起几种物质释放,所述物质包括但不限于,白细胞介素细胞因子、趋化因子以及花生四烯酸来源的介质,导致支气管收缩、气道高反应性、过量粘液分泌和气道炎症。因此,在本发明的某些实施方式中,哮喘的治疗可以包括气道高反应性的治疗和/或肺部炎症的治疗。
[0026]此处所用的术语“抗原”指在进入到体内时刺激抗体产生的任何物质。抗原包括昆虫、动物和植物蛋白、毒素、细菌、外源血细胞以及移植器官的细胞。“过敏原”指在个体中引起过敏性免疫反应的任何物质。典型地,过敏原来自食物、植物、昆虫或动物,其使气道发炎并且引起粘液产生以及支气管收缩。
[0027]此处所用的术语“个体”指所述方法实施的任何个体或患者。一般地,所述个体是人,虽然如本领域技术人员将理解的,所述个体可以是动物。因此,其它的动物,包括哺乳动物如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔,农场动物包括奶牛、马、山羊、绵羊、猪等,以及非人类灵长类(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)被包括在个体的定义内。
[0028]如此处所用的,术语“突变的人IL-4蛋白(mutant human IL-4protein)”、“修饰的人IL-4受体拮抗剂”、“mhIL-4”、“IL-4突变蛋白”、“IL-4拮抗剂”、和其等价物可互换使用,并在发明的范围之内。这些多肽和其功能片段是指其中已经对成熟人IL-4蛋白进行特定氨基酸取代的多肽。这些多肽包括本发明的mIL-4组合物,其被施用给需要治疗哮喘的个体。尤其是,本发明的mhIL-4至少包括R121D/Y124D取代对(“IL-4RA”)(图13B)。
[0029]如此处所用的,“功能片段”是具有IL-4拮抗活性的多肽,包括更小的肽。具有hIL-4修饰的mhIL-4的这些和其他方面在美国专利编号第6,335,426;6,313,272;和6,028,176,号中被描述,其全部内容通过引用于此。
[0030]如此处所用的,“野生型IL-4(wild type IL-4)”或“wtIL-4”和其等价物可互换使用,意即人白细胞介素-4——天然的或重组的,具有129个通常出现的天然人IL-4氨基酸序列,如在美国专利第5,017,691号中所公开的,在此通过引用并入。进一步,此处描述的被修饰的人IL-4受体拮抗剂可以具有各种插入和/或删除和/或与非蛋白质聚合物偶联,并且按照wtIL-4进行编号,意即所选择的具体氨基酸是在wtIL-4中通常存在的相同氨基酸。因此,本领域普通技术人员将会理解,在位点,例如第121位(精氨酸)、第124位(酪氨酸)和/或第125位(丝氨酸)上通常出现的氨基酸,可以在突变蛋白中被移动。因而,半胱氨酸残基在氨基酸位点如第38位、第102位和/或第104位上的插入可以在突变蛋白上移动。然而,被移动的丝氨酸(S)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)或插入的半胱氨酸(C)的位置可以通过检查和关联这些侧翼氨基酸与wtIL-4中那些在丝氨酸、精氨酸、酪氨酸或半胱氨酸侧翼的氨基酸确定。
[0031]进一步,编码人IL-4的DNA序列可以包括或不包括编码信号序列的DNA序列。这种信号序列,如果存在,应该是被选择用于表达IL-4突变蛋白的细胞所识别的信号序列。其可以是原核的、真核的或是两者组合。其也可以是天然IL-4的信号序列。信号序列的包含取决于是否期望从制备IL-4突变蛋白的重组细胞中分泌出IL-4突变蛋白。如果所选择的细胞是原核的,一般优选不编码信号序列但包括N-末端甲硫氨酸的DNA序列以指导表达。如果所选的细胞是真核的,一般优选编码的信号序列,并且最优选被使用的是野生型IL-4信号序列,如在美国专利第6,028,176号中所公开的,在此通过引用并入。在一个说明性的例子中,本发明的突变人IL-4蛋白包括具有修饰的野生型hIL-4的氨基酸序列,其中第一修饰是:在野生型的人白细胞介素-4蛋白的第121位、第124位或第125位发生的氨基酸中的一个或多个与另一天然氨基酸的置换,并且本发明的突变人IL-4蛋白进一步任选地包含N-末端甲硫氨酸。在另一个例子中,突变蛋白进一步包括选自下列的第二修饰:
i)其中C-末端的修饰;
ii)其中潜在糖基化位点的删除;
iii)该蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联,以及其任意组合。
在另一个例子中,突变蛋白包括含有按照野生型hIL-4编号的R121D和Y124D取代的蛋白质的第一修饰。
[0032]如此处所用的,“突变蛋白(mutein)”指作为天然突变或由本领域技术人员创造的对任何蛋白质进行定点氨基酸取代的结果而出现的任何蛋白质。“糖基化(glycosylation)”指将糖基添加到蛋白质,以形成糖蛋白。如此,该术语包括天然存在的糖基化和合成的糖基化,如碳水化合物骨架与天冬酰胺残基的侧链的连接(N-糖基化)或糖——优选的N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖与丝氨酸、苏氨酸、4-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的偶联(O-糖基化)。
[0033]因此,本发明涉及包含一种或多种hIL-4突变蛋白的组合物,其是人白细胞介素-4和/或人白细胞介素-13的拮抗剂,干扰这两种白细胞介素与1型和2型IL-4R的结合。这种组合物对于治疗患有哮喘或哮喘相关的症状的个体有用。hIL-4突变蛋白可以进一步包括除了第121、124或125位的替换(一种或多种)之外的修饰。为了提高hIL-4突变蛋白的稳定性、为了延长生物半衰期或为了方便制备和纯化过程,进行这些修饰。如此处所使用的,术语“激动剂(agonist)”指可有效结合到受体,并且模拟其生物学活性的物质或类似物。术语“拮抗剂(antagonist)”指可结合到受体但不引起正常的生物学反应,并且阻断或部分阻断激动剂的活性的物质。
[0034]已经在文献中报道了IL-4的拮抗剂。作为拮抗剂起作用的IL-4的突变体包括IL-4拮抗剂突变蛋白IL-4/Y124D(Kruse,N.,Tony,H.P.,Sebald,W.,Conversion of human interleukin-4 into a high affinityantagonist by a single amino acid replacement,Embo J.11:3237-44,1992))和双突变蛋白IL-4[R121D/Y124D](Tony,H.等,Design ofHuman Interleukin-4 Antagonists in Inhibiting Interleukin-4-dependent andInterleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with highefficiency,Eur.J.Biochem.225:659-664(1994))。单一突变蛋白是在D-螺旋中第124位由天冬氨酸取代酪氨酸。双突变蛋白是在D-螺旋中第124位由天冬氨酸取代精氨酸,并且在第124位由天冬氨酸取代酪氨酸,如在美国专利第6,313,272和第6,028,176号中所公开的,在此通过引用并入。在D-螺旋的这部分中的变化与在IL-4RA链的第二结合区域的相互作用中的改变正相关。
[0035]在一个实施方式中,突变蛋白在各种氨基酸残基位置,特别是在第28、36、37、38、102、104、105或106位上偶联到非蛋白聚合物上。氨基酸位置按照野生型IL-4(即人白细胞介素-4)氨基酸序列(见美国专利第5,017,691,在此通过引用并入)进行编号。非-蛋白聚合物包括,例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯,如在美国专利第4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4,791,192或4,179,337中所公开的,其全部内容通过引用并入于此。
[0036]因此,利用熟知技术,本领域技术人员将能够确定如此处列出的多肽和其功能片段的合适突变体。同样地,熟练的技术人员可以确定(1)可以通过定向于被认为是对活性不重要的区域而可以改变的多肽合适区域,而不破坏活性(见Kreitman等,(1994)Biochemistry33:11637-11644,通过引用并入在此);(2)在相似的多肽中保守的多肽残基和部分;和(3)对于生物学活性或对于结构可能是重要的区域,其可能更容易被保守氨基酸取代而不破坏生物学活性或没有不利地影响多肽结构。
[0037]此外,本领域普通技术人员能回顾结构-功能研究,识别类似多肽中对活性或结构重要的残基。鉴于这样的比较,普通技术人员能够预测蛋白中相对应于类似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基之氨基酸残基的重要性。对于这种预测的重要氨基酸残基,本领域普通技术人员能选择出(opt for)化学上相似的氨基酸取代。
[0038]本领域普通技术人员也能分析相似多肽中的三维结构和与该结构相关的氨基酸序列。根据这样的信息,本领域普通技术人员能预测与其三维结构相关的多肽的氨基酸残基排列。在某些实施方式中,本领域普通技术人员可选择不要对预测将处于蛋白表面上的氨基酸残基进行基团变化,因为这样的残基可能参与和其它分子的重要相互作用。而且,本领域普通技术人员可制备出在每个被需要的氨基酸残基上含有单个氨基酸取代的待测变异体。然后,应用本领域已知的活性分析方法筛选变异体。这样的变异体能被用于收集关于合适的变异体的信息。举例,如果某人发现一个特定的氨基酸的改变导致受到破坏的、被不期望降低的、或不适合的活性,那么具有这种改变的变异体将被避免。换言之,基于从这类常规实验中收集的信息,本领域普通技术人员能容易地确定这样的氨基酸,在那里进一步的取代应被避免,或者是在单独情况下或与其它突变一起组合起来时被避免。
[0039]大量的科学出版物致力于二级结构的预测。见Moult,1996,Curr.Op.in Biotech.7:422-427;Chou等,1974,Biochemis try13:222-245;Chou et al.1974,Biochemistry 113:211-222;Chou等,1978,Adv.Enzymol Relat.Areas Mol.Biol47:45-148;Chou等,1979,Ann.Rev.Biochem.47:251-276;和Chou等,1979,Biophys.J.26:367-384。而且,目前,计算机软件可用于辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法是基于同源性模型。举例,序列同一性在约30%以上或者序列相似性在40%以上的两个多肽或蛋白质,常常具有相似的结构拓扑学。最近增大的蛋白质结构数据库增强了二级结构的预测能力,包括处于多肽的或蛋白质的结构内的潜在折叠数目。见Holm等,1999,Nucl.Acid.Res.27:244-247。据认为(Brenner等,1997,Curr.Op.Struct.Biol.7:369-376),一个给定的多肽或蛋白质具有有限数目的折叠,并且一旦解析了临界数——5个结构,结构预测将会变得显著地更为精确。
[0040]在一个实施方式中,本发明提供了可用作哮喘治疗方案一部分的方法。所述方法包括施用含治疗有效量的本发明的突变蛋白的药物组合物,其中氨基酸121(精氨酸)和氨基酸124(酪氨酸)被天冬氨酸取代(IL-4RA,见图2)。如此处提供的,突变蛋白的进一步修饰可以包括下列的一种或多种:分子的N末端和/或C末端被修饰、一个或多个聚乙二醇分子被共价键合到所述分子,所述分子中存在的糖基化位点被部分地或全部地删除。
[0041]术语“施用(administration)”或“进行施用(administering)”被定义为包括给需要治疗的个体提供本发明的化合物或药物组合物的行为。术语“治疗有效量(therapeutically effective amount)”或“有效量(effective amount)”表示将引起组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的化合物或药物组合物的量,该反应是研究者、兽医、医生或其他的临床医生所追求的。
[0042]在一个实施方式中,药物组合物包括具有在+2氨基酸位置上插入氨基酸的N-末端修饰的突变蛋白。在另一实施方式中,突变蛋白具有C-末端的修饰,其是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个和至少5个氨基酸的删除。然而,从C-末端删除5个以上氨基酸可能影响突变蛋白的活性。来自上面和本文提到的任何修饰的突变蛋白的活性,可用相关申请和/或专利中以前描述的任何方法和本文描述的方法(如,在美国申请第10/820,559号中描述的生物分子相互作用分析(Biomolecular Interaction Analysis,BIA)和增殖分析)来确定;在此通过引用引入其全部内容。
[0043]在本发明的方法中有用的突变蛋白可以进一步包括糖基化变异体,其中糖基化位点的数目和/或类型与亲本多肽的氨基酸序列相比已经发生改变。在某些实施方式中,蛋白质变异体包括比天然蛋白更多或更少数目的N-联接糖基化位点。N-糖基化位点以序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr为特征,其中指定为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸残基。氨基酸残基取代产生的这种序列为添加N-联接糖链提供了一个新的潜在位点。可选地,消除此序列的取代将会去除已经存在的N-联接糖链。也提供了N-联接糖链的重排,其中一个或多个N-联接糖基化位点(通常它们是天然存在的)被消除,而一个或多个新的N-联接位点产生。
[0044]额外的变异体包括半胱氨酸变异体,其中,与亲本氨基酸序列相比,一个或多个半胱氨酸残基被加入、被删除或取代另外的氨基酸(如丝氨酸)。当蛋白质必须重新折叠成生物活性的构象时,如不溶性的包含体分离后,半胱氨酸变异体可能是有用的。在一个实施方式中,半胱氨酸变异体将会具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基,以及具有偶数个半胱氨酸,以便使由未配对半胱氨酸所引起的相互作用最小化。在另一实施方式中,半胱氨酸变异体将允许至少一个非-蛋白质聚合物,如聚乙二醇(PEG)分子,被位点-特异性地偶联到突变蛋白上。
[0045]更进一步地,变异体包括,但不限于,突变,例如取代、添加、剔除或其任何组合;并且,其通常根据本文描述的方法以及本领域已知的方法(见,举例,Sambrook等,分子克隆:实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL),第三版,2001,冷泉港实验室,N.Y;以及Berger和Kimmel,酶学方法(METHODS IN EMZYMOLOGY),152卷,分子克隆技术指南(Guide to molecular Cloning Techniques),1987,Academic Press,Inc.,San Diego,CA.,通过引用在此引入),应用一种或多种诱变寡核苷酸(一种或多种),通过定点突变产生。
[0046]本发明的氨基酸取代包括这些取代:(1)降低对蛋白水解的易感性,(2)降低对氧化的易感性,(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性,(4)改变结合亲和性,和/或(5)对这类多肽赋予或改变其它理化或功能性质。根据某些实施方式,一个或多个氨基酸取代(并且在某些情况下,保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中(如在多肽的形成分子间接触的结构域(一个或多个)之外的部分中)进行。
[0047]因此,保守氨基酸取代典型地基本上不改变核苷酸序列的结构特征(例如,氨基酸置换将不倾向于打破核苷酸序列中出现的螺旋,或者破坏表征核苷酸序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和四级结构的实例在蛋白质、结构和分子原理(PROTEINS,STRUCTURES AND MOLECULAR PRICIPLES)(Creighton,Ed.),1984,W.H.Freeman and Company,New York;蛋白质结构概论(INTRODUCTION TO PROTEIN STUCTURE,C.Branden和J.Tooze,eds.),1991,Garland publishing,New York,N.Y.;以及Thornton等,1991,Nature 354:105中进行了描述,在此通过引用引入其每一个。
[0048]肽类似物(peptide analogs)通常作为具有类似于模板肽的性质的非肽类药物,被用在制药工业上。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物(peptide mimetics)”或者“模拟肽(peptidomimetic)”。见Fauchere,1986,Adv.drug Res.15:29;Veber & Freidinger,1985,TINSp.392;和Evans等.,1987,J.Med.Chem.30:1229,在此通过引用将其引入。这样的化合物通常在计算机分子建模的辅助下被开发出来。与有治疗有用的肽结构上相似的肽模拟物,可被用于产生相似的治疗或预防效果。通常,模拟肽与范例多肽(即,具有生化性质或药理学活性的多肽)——如人抗体——结构类似,但是具有一个或以上的肽键:被通过本领域内熟知的方法,任选地由选自:-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-的键所置换。在某些实施方式中,为产生更稳定的肽,可以使用相同类型的D-氨基酸系统性取代共有序列的一个或者以上氨基酸(如,D-赖氨酸代替L-赖氨酸)。此外,包含有共有序列或者基本相同的共有序列变异的受限肽(constrained peptide)可通过本领域内已知的方法制备(Rizo & Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem.61:387,在此通过引用加以引入);例如,通过添加能形成使肽环化的分子内二硫键桥的内部半胱氨酸残基进行制备。
[0049]在另一实施方式中,药物组合物包括具有另外的氨基酸取代的突变蛋白(如,IL-4RA),包括那些能使至少一种非-蛋白聚合物,如聚丙烯乙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇(PEG)分子位点-特异性偶联到突变蛋白的取代。PEG的位点特异性偶联,例如,使具有聚乙二醇化(PEG化)分子的益处的修饰突变蛋白产生,即增加了血浆半衰期(例如,至少比未被修饰的IL-4RA多2到10倍,或者10到100倍),同时相对于非特异性聚乙二醇化策略,如N-末端和赖氨酸侧链聚乙二醇化,保持更大的效力。提供有效聚乙二醇化的方法在美国申请第10/820,559号中被描述,在此通过引用加以引入。IL-4突变蛋白必须被适当地纯化以使其有效的PEG化。纯化方法在美国申请第10/820,559号中被描述(见实施例2)。
[0050]可以使用本领域内已知的任何方法分析被修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂与IL-4受体的Ki,包括美国申请第10/820,559号中描述的实时双分子相互作用分析(Bimolecular Interaction Analysis(BIA))技术(见实施例4)。应用美国申请第10/820,559号中描述的增殖分析方法能够分析修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂抑制免疫细胞增殖反应的能力。
[0051]通过上面的分析方法筛选侯选物,许多具有上述特征的被修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂在美国申请第10/820,559号中被确定。在一种实施方式中,非蛋白聚合物(如聚乙二醇)至少连接到氨基酸残基位置第38、102和/或104位上。
[0052]在另一实施方式中,本发明提供选择能使多肽表达后正确折叠的hIL-4氨基酸取代的特异性位点的方法。相对于未修饰IL-4RA与IL-4和IL-13结合的亲和力降低,被修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂与IL-4和IL-13结合的亲和力降低不大于100倍。相对于未修饰IL-4RA抑制IL-4和IL-13介导的活性的效价损失,被修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂抑制IL-4和IL-13介导的活性的效价损失不超过10倍。此外,被修饰的IL-4突变蛋白受体拮抗剂具有比未修饰IL-4RA至少长2至10倍的血浆半衰期。
[0053]上面的多肽变异体是举例说明在本文所要求保护的方法中所使用的被修饰的人IL-4多肽的类型,但不是穷尽列举本发明体现的所要求保护的发明的变异体类型。符合权利要求的标准的上述多肽的衍生物也应该被考虑。遵从此处和实例中所教导的方法,能够根据功效筛选所有多肽和其功能片段。
[0054]通过遗传操作,例如在大肠杆菌中,hIL-4可以作为重组蛋白(rhIL-4)被制备。适合重组产生rhIL-4的宿主细胞是本领域普通技术人员已知的,包括原核细胞,比如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)和假单孢杆菌属(Pseudomonas)的菌株(Kung,H.-F,M.Boublik,V.Manne,S.Yamazaki和E.Gaarcia,Curr.Topics in Cell.Reg.26:531-542,1995)或者单细胞真核细胞如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Bemis,L.T,F.J.Geske和R.Strange,methods Cell Biol.,46:139-151,1995)。用于重组产生的宿主细胞也可以来源于多细胞真核生物,包括无脊椎动物如昆虫(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞)(Altmann F.,E.Staudacher,IB Wilson,和L Marz,Glycocnj J.,16:109-23,1999)和脊椎动物细胞,包括许多哺乳动物细胞系,包括小鼠成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO/-DHFR)(Urlaub andChasin,Proc Nat Acad Sci 77:4216,1980)、仓鼠乳鼠肾细胞系(9BHK,ATCC CC10);由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL1651)和人胚肾细胞系293(Tartaglia等,Proc Nat Acad Sci88:9292-9296,1991和Pennica等,J.Biol.Chem.267:21172-21178,1992)。
[0055]任何合适的宿主可以被用于产生本发明的IL-4突变蛋白,所述宿主包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系,以及转基因动物或植物。同样地,这些宿主细胞可以包括熟知的真核和原核宿主,如大肠杆菌、假单孢杆菌属、芽孢杆菌、霉菌的菌株,真菌、酵母、昆虫细胞如草地夜蛾(SF9),动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和小鼠细胞如NS/O,非洲绿猴细胞如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BNT10,和人类细胞,以及组织培养的植物细胞。尽管细菌和酵母已经是许多包括rhIL-4在内的重组多肽的标准重组宿主细胞,但是最近来自高等植物的转化细胞能够表达人重组蛋白如抗体(Hiatt,A.T.和J.K.Ma,Int.Rev.Immunol,10:139-152,1993)和血红蛋白(Theisen,M.in Chemicals Via HigherPlart Bioengineering,F.Shahidi等,eds,Plenum Publisher,NYP.211-220,1999)。植物生物技术为高效生产异源多肽提供了许多益处,并且这种方法对本文描述的被修饰的人IL-4受体拮抗剂——包括mhL-4和它的衍生物——的产生可以是有用的(也见植物技术:新产品和应用(Plant Technology:New Products and Application),JohnHammond等,eds.,Springer,N.Y.,1999)。
[0056]IL-4或IL-13与1型或2型IL-4受体的稳定复合物的形成使得受体信号传导和随之产生的下游事件被认为在所述个体中引起哮喘症状。因此,在一个实施方式中,本发明提供向个体施用治疗有效量的修饰人的IL-4受体拮抗剂——包括IL-4RA——的方法,以改善与哮喘有关的症状。数据表明,IL-4RA以与wtIL-4相似的结合率和解离率(onand off rates)结合到IL-4受体α链,其或者抑制γc(1型)或者抑制IL-13Rα装配成可信号转导下游事件的受体复合物(见表1)。因此,IL-4RA阻断IL-13Rα1或γc的募集来与IL-4受体α链形成稳定的异二聚体复合物(A.L.Andrews等,ATS2004)。
表1:IL-4R与固定化的IL-4受体α链的表面等离子体共振(Biacorebinding)结合
Kon 106/Ms | Koff 10-3/s | 亲和力(nM) | |
IL-4RA | 16 | 1.7 | 0.14±0.05(n=7) |
[0057]尽管本发明描述了各种剂量,但本领域普通技术人员将会理解,对于任何需要治疗的特定个体,具体剂量水平和剂量频率可能会变化,并且将取决于许多因素。这些因素包括具体多肽或其功能片段的活性、该化合物的代谢稳定性和作用持续时间、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物联合、具体病症的严重性、以及经受治疗的主体。然而,一般地,剂量接近对于具体化合物的已知施用方法而言典型的的剂量。因此,IL-4RA的典型剂量将会是大约0.1至1mg/kg。例如,对于IL-4RA的施用,通过气溶胶吸入的近似剂量将是大约0.3mg至60mg。近似剂量包括,但不限于,大约0.3mg,大约0.5mg,大约1.0mg,大约3.0mg,大约20mg,大约30mg或大约60mg,每天或每周一次或多次将这些剂量施用给个体。在另外的说明性例子中,通过皮下注射施用IL-4RA的近似剂量包括但不限于,大约25mg。通过施用IL-4RA的治疗可以持续几天、几周、几年或无限期地继续下去,只要症状持续。所以,适当的剂量和治疗用药法可以由本领域普通技术人员使用本文提供的那些常规方法确定。
[0058]本发明的组合物和制剂能够全身或局部施用,即,局部地,在其他情况中,特别是作为气溶胶,如雾化吸入喷雾或干粉气溶胶。如此处使用的,“全身施用(systemic administration)”或“系统化施用(administered systemically)”指组合物或制剂被导入到个体血流中,并且在代谢降解和排泄之前以有效剂量在个体的整个身体传送以到达个体身体需要治疗的部分。可以通过例如,口服应用(如,含药糖浆、药片、胶囊和类似的药物等)、针注射、经皮输送(如,纳入皮肤贴剂中的组合物)、以及皮下输送(如,放置在皮肤下面以释放的可代谢的基质中的制剂)完成组合物或制剂的全身施用。如此处使用的,“局部施用”或“局部施用”指组合物被直接导入到个体身体需要治疗的部分。可以通过,例如,注射(如,注射麻醉剂到患者的牙龈)或局部地(如霜、药膏和喷雾)局部地输送组合物或制剂。应当理解,局部使用可能导致施用之后组合物或制剂的全身水平(如,吸入的组合物可以导致组合物的全身水平)。
[0059]如此处使用的,术语“气溶胶”指任何精细的固体或液体颗粒的气态悬浮液。同样地,术语“气溶胶化”指分散或悬浮在空气或气体中的微小固体或液体颗粒的形式。典型的微小固体将具有≤20μm的质量中值气动直径(mass median aerodynamic diameter)。如此处所用的,术语“雾化”指转化(液体)为精细的喷雾或雾化作用的行为。因此,术语“干粉气溶胶”指悬浮在气体,典型地空气中的任何微小固体。本发明的组合物也可能作为缓释制剂而被配置。在所有治疗形式的情况下,可能存在短期治疗或持续治疗。
[0060]在获得期望的纯度之后,通过将IL-4拮抗剂与药学上和/或生理学上可接受的载体、辅助物质或稳定剂(Remington′s PharmaceuticalSciences,loc.cit.)混合,以冻干物或水溶液的形式制备IL-4拮抗剂的治疗剂,用于施用和/或储存。术语“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”在关于载体使用时表示所述载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其它成分相容并且对其接受者没有害处。
[0061]一般而言,通过将活性成分均匀并且密切地加入与液体载体联合或将固体载体精细地分割或者两者都用,并且随后,如果必要,将产品修整成期望的制剂。可接受的载体,辅助物质或稳定剂在使用的剂量和浓度对于接受者是没有毒的;它们包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris)或醋酸钠以及其它的有机酸;抗氧化剂如抗坏血酸;低分子量多肽(大约10残基以下),蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、亮氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它的糖类,例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、柠檬酸盐、海藻糖、麦芽糊精或糊精;螯合剂如EDTA;糖醇如甘露醇或山梨醇;盐形成抗衡离子如钠离子,和/或非-离子表面活性物质如吐温、聚醚(Pluronics)或聚乙二醇(PEG)。
[0062]这样的药物组合物可以进一步包括一种或多种稀释剂、填充剂、粘合剂以及赋形剂,取决于所考虑的施用模式和剂型。本领域技术人员已知的治疗上惰性的无机或有机载体的例子包括,但不限于,乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、蔬菜油、蜡、脂肪、多羟基化合物如聚乙二醇、水、蔗糖、醇、甘油以及类似物等。在口服给药的情况下,当需要帮助稳定制剂或帮助增加活性成分(一种或多种)的生物利用度或产生可接受的口味或气味的制剂时,也可以加入各种防腐剂、乳化剂、分散剂、调味剂、润湿剂、抗氧化剂、增甜剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液和类似物。本发明的突变蛋白可以单独或以各种联合与其它治疗组合物联合施用。
[0063]本发明的IL-4拮抗剂通常以冻干的形式或在溶液中储存。本发明的IL-4拮抗剂典型地是水溶性的并且可作为干燥的固体利用以干粉末被施用或者在水或盐水中重构。用于肺部输送可吸入的粉末可以通过许多传统的技术生产,如喷射制粉(jet milling)、喷雾干燥、溶剂沉淀、超临界流体浓缩(supercritical fluid condensation)和类似的技术等。
[0064]肺部输送代表施用药物到循环的一种肠胃外的模式。对于分子大小达大约20kDa的宽范围的蛋白质,次级气道上皮是高渗透性的。使用干粉吸入器(dry powder inhalers(DPI))如基于NektarTM、Vectura(GyrohalerTM)、和GSK(DiscusTM)或Astra(TurbohalerTM)推进器的那些计量吸入器(metered dose inhalers),在合适的载体如甘露醇、蔗糖或乳糖中包含药剂的微米大小的干粉可以被输送到末端肺泡表面。使用超声波喷雾器如PARI(LC PlusTM)和Aerogen(Aeroneb ProTM)的那些,含有或没有脂质体的溶液制剂可以被输送。
[0065]本发明的组合物也具有这样的配方,凭借该配方被修饰的人IL-4受体拮抗剂为延迟释放的剂型。例如,延迟释放制剂的合适例子是由含有蛋白质的固体疏水聚合物组成的半通透基质;这些基质是成型的颗粒,例如薄膜片剂或微胶囊。延迟释放基质的例子是聚酯、水凝胶[如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)——由Langer等.,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277[1981]和Langer,Chem.Tech.,12:98-105[1982]描述的——或聚(乙烯醇)]、聚乳酸(美国专利第3,773,919号,EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等,Biopolymers,22:547-556[1983])、非降解乙烯/乙酸乙烯酯(Langer等,loc.sit.)、可降解的乳酸/乙醇酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸/乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球)和聚-D-(-)3-羟丁酸(EP133,988)。尽管聚合物如乙烯/乙酸乙烯酯和乳酸/乙醇酸使分子释放100天以上,在某些水凝胶的情况下,蛋白质在相对短的时间内被释放。如果被包封的蛋白质在体内保持相对长的时间,则它们在37℃能通过水分变性或聚集,导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性的变化。依赖于所涉及的机理,能够发展有意义的策略用以稳定蛋白。例如,如果发现导致聚集的机理是基于硫代二硫化物交换引起的分子间S-S桥形成,则通过修饰巯基、通过酸性溶液冻干、控制水分含量、应用合适的添加剂和开发特定的聚合物/基质组合物,可以实现稳定化。
[0066]呈现延迟释放的本发明制剂也包括包封在脂质体内的被修饰的人IL-4受体拮抗剂。含IL-4拮抗剂的脂质体通过本身已知的方法制备:DE3,218,121;Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82;3688-3692(1985);Hwang等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034(1980);EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;EP142,641;日本专利申请83-118008;美国专利4,485,045和4,544,545;和EP102,324。通常,脂质体是小的(大约200至800埃)单层类型,其具有大约30mol%胆固醇以上的脂含量,其比例在每种情况下都被调整,用于最适IL-4拮抗剂。表现出延长的循环时间的脂质体在美国专利第5,013,556号中被公开。
[0067]本发明的其它制剂包括白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒、纳米胶囊和粗乳液(macroemulsion)。这种技术在Remington′sPharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.,Ed.(1980)中被提及,其通过引用并入于此。下面的实施例意图说明但不限制本发明。
实施例1
大肠杆菌的发酵
[0068]含有生产突变蛋白的基因的细胞生长在LB培养液(每升10克细菌培养用胰化蛋白胨,5克酵母提取物,10克氯化钠,pH7.5),直到OD600达到0.8-1.0。通过添加IPTG至0.5mM的终浓度并且继续培养5小时诱导表达。通过离心收获细胞。如美国专利第6,130,318中描述的培养表达hIL-4突变蛋白的大肠杆菌转化株。简要地,大肠杆菌在具有下列组分的LB营养液中发酵:细菌培养用胰化蛋白胨10g/l、细菌培养用酵母提取物5g/l和氯化钠10g/l。组分溶于在121℃灭菌20分钟的去离子水。在接种之前,在无菌状态下,适合选择转化株(如,100mg/l氨苄青霉素钠或50mg/l硫酸卡那霉素,取决于载体中使用的选择标记)的抗生素被加入到营养液中。通过取2毫升初步培养液等份试样并且将它们储存在液氮中,所有大肠杆菌转化株的菌株储存液被储备。初步培养发酵在含200ml LB营养液的1升摇瓶中进行。用菌株储存液或用来自LB琼脂板上的单个克隆接种营养液。培养物在30℃孵育12-18小时。同时不断地摇动培养物。
[0069]使用10升搅拌的发酵罐,在LB营养液中进行主培养发酵。用按体积计1-5%的初级培养物接种营养液,该接种物的生物量在接种之前被从初级培养物中离心出来并且重悬在新鲜的LB培养液中。10L主培养的发酵条件如下:37℃,搅拌器旋转率为500转速/每分钟,曝气率为0.5vvma。
[0070]为了监测生物量的生长,在大约1小时的时间间隔从培养液中移出无菌样品,并且测定它们在600nm(OD600)的光密度。当OD600达到0.8-1.2时,诱导培养物。如下进行诱导,IPTG诱导:无菌加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至0.4mM的浓度,诱导时间一般为4-8小时。
[0071]在发酵结束(6-14小时)后,发酵罐的内容物冷却至10-15℃,并且使用标准离心技术(如桶离心机)收获细菌细胞。离心后得到的细胞团临时以冷冻的状态被储存在合适的地方。从用这种方法获得的生物量处理(work up)得到产物。
实施例2
应用可诱导的启动子在大肠杆菌中表达白细胞介素-4突变蛋白
[0072]令人惊讶地,定制的载体系统和大肠杆菌-密码子优化的IL-4突变蛋白基因证明:根据美国专利第6,506,590号,用所述质粒转化的细菌的表达率、质粒和表达稳定性值比用本领域中已知的质粒转化同样的宿主后所观测到的那些表达率、质粒和表达稳定性值高许多倍。
[0073]大肠杆菌噬菌体T5启动子和两个lac操纵子序列来源于属于质粒pDS家族(Bujard等,Methods Enzymol.155,416-433,1987;和Stuber等,Immunological Methods,I.Lefkovits;以及B.Pernis,eds.,Academic Press,Inc.,Vol.IV,121-152,1990)的pQE30质粒(Qiagen)。
[0074]核糖体结合位点(rbs)来源于噬菌体T7(T7g 10前导区)的基因10的上游区域。噬菌体T7的基因10编码壳蛋白,该蛋白是T7感染后表达的主要蛋白。从载体pET-9a获得T7g 10rbs(Studier等,Methods Enzymol.185,60-89,1990)。T7g10前导区包括大约100bp的区域(Olins等,Gene 227-235,1988)。在最后的表达构建中,XbaI位点的上游区域被删除。T7g10前导区序列现在包括42bp的区域并且在优选质粒的3638位置有一个从G到A的碱基转换。
[0075]作为同义密码子使用倾向的有效测量,密码子适用指数(CAI)对于预测特定基因的表达水平可能是有用的(Sharp等,Nucleic AcidsRes.15,1281-1295,1987;和Apeler等,Eur.J.Biochem.247,890-895,1997)。CAR被计算为:相应于基因中使用的每一个密码子的相对同义密码子使用(RSCU)值的几何平均数除以同样氨基酸组成的基因的最大可能CAI。从具体生物体,如大肠杆菌的高表达基因计算每一个密码子的RSCU值,并且代表密码子的观测频率除以在假定氨基酸的同义密码子的使用相同的情况下所期望的频率。高表达的基因,如编码核糖体蛋白的基因,通常具有高的CAI值gtoreq.0.46。难以表达的基因如lad和trpR在大肠杆菌中具有低的CAI值ltoreq.0.3。计算出的对于天然IL-4序列的大肠杆菌CAI值是0.733。这意味着天然基因在大肠杆菌中应该适合高水平的表达。而且,具有最佳的大肠杆菌密码子使用(CAI值=1)的合成基因具有进一步增加表达水平的潜力。因此,设计并克隆了合成的IL-4和IL-4突变蛋白基因。
[0076]含有转录终止子Tφ的T7DNA片段来源于载体pET-9a(Studier等,Methods Enzymol.185,60-89,1990)。转录终止子决定了mRNA-RNA聚合酶-DNA复合物解离的位点,从而结束转录。转录终止子在高表达基因末端的存在具有几个优势:它们使可能进行不必要的转录的RNA聚合酶的汇集降到最低,它们将mRNA的长度限制到最短,因而限定了能量消耗,因为强的转录可能干扰复制的起始,由于拷贝数目的维持,转录终止子增加了质粒的稳定性(Balbas和Bolivar,Methods Enzymol.185,14-37,1990)。
[0077]卡那霉素(Kan)抗性基因来源于载体pET-9a(Studier等,Methods Enzymol.185,60-89,1990)。起初,这是来自载体pUC4KISS的Tn903的Kan基因((Barany,Gene 37,111-123,1985))。在优选的质粒中,Kan基因和IL-4以及IL-4突变蛋白基因具有相反的方向,因而由于从T5启动子的通读转录(read-through transcription),Kan基因产物在诱导之后不应该增加。由于卡那霉素是用于GMP-用途(GMP-purposes)的优选的抗生素,所以它被选为选择性标记。此外,基于卡那霉素基因的载体比氨苄青霉素抗性(bla)的质粒更稳定。在药物被分泌的β-内酰胺酶降解时,氨苄青霉素选择在培养物趋向于丧失。对于卡那霉素的细菌抗性的模式依赖于钝化抗生素的氨基糖苷磷酸转移酶。
[0078]受控制的基因表达对于建立稳定的质粒系统是绝对必要的,尤其是在感兴趣的蛋白质对宿主细胞是有害的情况下。优选的质粒使用基于lac的可诱导的系统,其是由lac阻抑蛋白基因(lacI)和两个融合到大肠杆菌噬菌体T5启动子的下游的合成的lac操纵子序列组成。从载体pTrc99A分离lacI.sup.q启动子和lacI结构基因(Amann等,Gene69,301-315,1988)。I.sup.q是可导致lacI阻抑蛋白过量表达的启动子突变。野生型lac阻抑蛋白是四聚体分子,其包含四个同样的每种具有360个氨基酸的亚单位。lacI阻抑蛋白四聚体是两个功能性二聚体的二聚体。通过从残基340-360形成的四-螺旋束(four-helix bundle)使四个亚单位保持在一起。由于通过NarI酶切割从载体pTrc99A分离lacI基因,在氨基酸331处的残基被删除并且通常在lacI基因中不编码的10个氨基酸被添加。已知发生在lacI的C-末端部分中,在氨基酸329处的突变和缺失导致产生与野生型阻抑蛋白表型相似的功能二聚体(Pace等,TIBS 22,334-339,1997)。
[0079]优选的质粒的复制起点(ori)来源于载体pET-9a,该载体的从pBR322起源。优选的质粒因此携带pMBI(ColE1)复制子。具有这种复制子的质粒是多拷贝的质粒,其以“松弛的”(relaxed)方式进行复制。在正常的生长条件下,每个细菌细胞中保持最低的15-20个拷贝的质粒。优选的质粒的实际数目在此范围内。ColE1-型ori的复制由555-核苷的RNA转录本——RNAII启动,其与它在ori附近的模板DNA形成持久稳固的杂交。然后RNA II-DNA杂交在ori被RNase H切割产生游离的3′OH,作为DNA聚合酶I的引物起作用。这种DNA合成的引发(priming)由RNA I——与RNA II的5′末端互补的108-核苷的RNA分子——负调节。反义RNA I与RNA II的相互作用引起RNA II中的构象改变,其抑制RNA II与模板DNA的结合并且因此防止质粒DNA合成的启动。RNA I与RNA II之间的结合被63个氨基酸的小蛋白(Rop蛋白,引物的阻抑蛋白)——其由复制起点下游400个核苷酸的基因所编码——增强(Sambrook等,Molecular Cloning,Cold SpringHarbor,1989)。Rop基因的缺失导致拷贝数目的增加并且由于基因剂量效应(gene dosage effect)导致编码异源基因的质粒的表达水平提高。也对所检测的IL-4表达载体进行了观测。但是证明在非-选择条件下rop-质粒在发酵过程中是不稳定的并且非常迅速地丢失。因此,优选质粒的复制子含有确保质粒高稳定性的rop基因。优选的质粒缺少转移所需要的mob基因并且因此不能引导其自身从一个细菌到另外一个细菌的接合转移。
实施例3
IL-4突变蛋白的制备
[0080]细胞破碎及包含体的分离:25克来自实施例1的大肠杆菌的湿团块在200ml的缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液,pH7.3,0.1%曲拉通(Triton),1mM EDTA,1μg/ml胃蛋白酶抑制剂)中被处理(taken up)并且通过超声处理(Branson B15超声仪)破碎。通过离心(35,000×g,20分钟)分离含有产物的包涵体并且在另外含有4M尿素的破碎缓冲液中洗涤。
[0081]将洗涤的包涵体溶解在125ml的缓冲液(0.2M Tris,pH8.1,8M盐酸胍)中。加入4克亚硫酸钠和2克连四硫酸钾并且将反应混合物搅拌2小时。反应完成后通过离心(35,000×g,20分钟)除去未溶解的组分。将上清液加载到凝胶过滤柱((Sephacryl S-300 HR,Pharmacia,10x90cm)上并且在含6M盐酸胍的PBS缓冲液中以280ml/h的流速进行凝胶过滤。通过SDS-PAGE及其组合的方法确定含有产物的组分。
[0082]为了还原分子,加入β-巯基乙醇(终浓度15mM)。在室温下温育2小时之后,用水5倍稀释混合物并且对缓冲液(3mM NaH2PO4,7mM Na2HPO4,2mM KCl,120mM NaCl)透析3-4天。用乙酸将透析过的材料调整到pH5.0并且通过添加水使它的传导性降低到ltoreq.10mS/cm。在搅拌时,将用25mM乙酸铵平衡的、pH为5.0的50ml CM琼脂糖-FF(Pharmacia)加入到混合物中。未结合的材料被过滤除去并且该凝胶被用于填充柱子。用pH5.0的25mM乙酸铵中的0到1M NaCl的线性梯度,以300ml/h的流速洗脱产物。通过SDS-PAGE或通过分析反相色谱(analytical RP chromatography)确定含有组分的产物。
[0083]CM琼脂糖汇集物被装载到用0.1%TFA平衡的的Vydac C-4柱(1×25cm,10μm)上,并用逐渐增加梯度的乙腈洗脱。合并并且冻干含有纯的产物的级分。
实施例4
IL-4突变蛋白减少了治疗上的灵长类动物模型中预先存在的哮喘
[0084]在食蟹猴——对猪蛔虫(Ascaris suum)抗原天然敏感,如在(图1)中所示——中评价了IL-4RA对过敏源诱导的气道炎症和气道高应答性(哮喘的动物模型)进行皮下治疗的治疗效果。对于这些实验,研究周期被延长到24天,在此期间,动物在第3、5、7、12、14、19和21天接受吸入的抗原刺激。在第0、10、17和24天检查气道对吸入的乙酰甲基胆碱的反应以及气道细胞组成(BAL)。在第10天,在评价气道反应和气道炎症之后,用IL-4RA(0.5mg/kg,s.c.)进行第一次治疗,并且连续每天两次治疗直到第23天(共计治疗14天)。因此,本研究被设计为评价IL-4RA在逆转已有的气道炎症和气道高应答性中的效力。
[0085]与载体治疗对照研究相反,在研究的第17天,IL-4RA(0.5mg/kg/bid,s.c.)的施用防止了任何的气道高应答性进一步增加,并且在第24天逆转了大约-79%的气道高反应性(p=0.018,图2a)。也观测了IL-4RA治疗对于气道炎症的效果。在第17天嗜酸性粒细胞的净流入量明显减少(p=0.05)并且在第24天仍然表现为减少(图2b,值为平均数±SD,n=6)。
[0086]这些研究证明皮下施用的IL-4RA在持续的抗原刺激存在的情况下,能有效地逆转气道高应答性,表明这种化合物可以在临床疾病中具有治疗效用。
实施例5
皮下输送到人类哮喘病患者中的IL-4突变蛋白的研究
[0087]在一个中心,在随机的、双盲的、安慰剂对照的、平行组研究中,在24个哮喘病患者中,评价了皮下施用的(s.c.)IL-4RA对过敏原-诱导的肺功能、气道高应答性以及与哮喘有关的其他迹象和症状的改变的作用。每天用25mg的IL-4RA s.c.(n=12)或安慰剂(无菌盐水,n=12)治疗个体28天,并且在第一终点时评价其对过敏源的后期哮喘反应(late asthmatic response(LAR))(通过1秒钟用力呼气容积(theforced expiratory volume in 1sec(FEV1))测量)。此外,评价其对吸入的乙酰甲基胆碱气道应答性的影响。由于患者在试验过程中继续他们现在的治疗,药剂连同患者的症状报告一起被监测。
[0088]相对于安慰剂,IL-4RA治疗组在LAR中显示46%的改善并且在1秒钟用力呼气容积(FEV1)中的最高下降中显示26%的改善。图3显示治疗组从药物之前(筛选访问2)到第28天最后治疗之后的改善。在接受IL-4RA的患者中,在乙酰甲基胆碱气道应答性方面也有改善的趋势。除了对个体肺功能积极效果,接受IL-4RA的那些个体报告:与接受安慰剂(在6个个体中有14个事件,同时11个个体需要β-激动剂)的个体相比,他们具有57%以下并且轻微的哮喘相关的不利事件(在4个个体中有6个事件,同时3个个体需要β-激动剂)。需要β-激动剂治疗的安慰剂和IL-4RA治疗的患者之间的差异是显著的(p=0.03,图4)。
实施例6
用于非-人类灵长类研究的Aeroneb 中的IL-4突变蛋白的气溶胶表征
[0089]在研究非人类灵长类之前,已经确定了气溶胶化对IL-4RA稳定性的影响。IL-4RA(5mL)、柠檬酸盐或乳酸盐制剂±0.01%吐温的溶液被放置在Aerogen Aeroneb ProTM喷雾器中并且该喷雾器运行到干燥。在雾化之前或之后收集IL-4RA样品并且分析浓度、聚集以及活性。使用几种方法确定蛋白质浓度。在雾化之前或之后的样品中通过Bradford类方法或RP-HPLC没有测定到蛋白质浓度的差异。SEC测量法也显示在雾化之后的样品中有95-101%蛋白质复性。此外,SEC-HPLC表明在样品中不存在可溶聚集体。进行了SDS-PAGE分析以确定溶液的雾化是否导致IL-4RA的降解。在凝胶的顶部或在凝胶本身没有观测到降解产物如大的不可溶的聚集体的聚集体或片段的证据。在TF-1/IL-4增殖分析中确定雾化之前和雾化之后的样品中IL-4RA的活性。如通过比较从样品雾化之前和之后确定的EC50值所显示的,IL-4RA抑制IL-4诱导的细胞增殖(EC50大约为0.2-0.3nM)的能力在雾化之后没有降低(图5)。应用表面等离子体共振,测量雾化的样品中IL-4RA与IL-4受体α链的结合能力。结果显示在雾化之前和之后的样品之间没有差异,具有获得的大约0.1nM的Kd。数据证明蛋白质含量、IL-4RA的活性和完整性在雾化之后继续保持。
实施例7
在猴子中IL-4突变蛋白的吸入研究
[0090]在对猪蛔虫(Ascaris suum)天然敏感的食蟹猴中评价了气溶胶化的IL-4RA对过敏原-诱导的气道炎症和气道高应答性(哮喘的动物模型)的影响。应用7天灵长类哮喘模型进行研究。在连续三天(第3,4,5天)吸入猪蛔虫提取物之前2天(第0天)和之后2天(第7天),通过支气管肺泡灌洗(BAL)测定气道对吸入的乙酰甲基胆碱的反应性和气道细胞组成。通过对照研究确立(bracketed)治疗研究以保证对抗原的敏感性不随着时间的推移发生变化。所有的动物在对照研究和治疗研究之间休息4到6周以使气道应答性和炎症返回到基线(前-抗原)水平。
[0091]在这种每日两次的治疗研究中,在第2天的下午、在第3、4和5天抗原攻击之前1小时和攻击后5小时、以及在第6天的早晨和下午,IL-4RA被施用。吸入的IL-4RA以在喷雾器装置中0.5、1.0、和3.0mg(在3ml的体积中)的名义剂量被评价。应用与Bird Mark7A呼吸器连接的Aerogen Aeroneb Pro喷雾器系统,进行吸入研究。应用此系统,已经显示IL-4RA在雾化之后保持活性和完整性(实施例6)。在气溶胶输送过程中,应用具有5秒屏气的5次呼吸/分钟(20cmH2O的吸气压力临界),通过气管内管使动物通风。根据两个限定性对照研究,确定从第0天到第7天乙酰甲基胆碱刺激物浓度的日志中的变化以及BAL的总细胞数目和噬酸性粒细胞数目中的变化并且平均用于与治疗研究比较。
[0092]每日两次吸入的IL-4RA对抗原诱导的气道高反应性的影响被显示在图6中(n=6-10,平均数±SEM)。吸入的IL-4RA有效地防止由抗原-诱导的气道高应答性以剂量依赖的方式产生,在3mg BID的名义剂量达到64%的最大抑制作用(p<0.001)。
[0093]也观测了吸入的IL-4RA对气道炎症的影响。每日两次输送(BID)的吸入的IL-4RA对抗原-诱导的气道(BAL)嗜曙红细胞增多(n=6-10,平均数±SEM)——作为气道炎症的标记——被研究。在3mg BID的名义剂量,观察到吸入的IL-4RA对过敏原-诱导的BAL嗜曙红细胞增多(60%抑制,p=0.003)的明显的抑制作用(图7)。IL-4RA的生物利用度大约为6-30%。
实施例8
[0094]在研究患哮喘症的人之前,使用Pari LC Plus喷雾器和Pari ProNeb Ultra压缩机,也确定了气溶胶化对IL-4RA的影响。IL-4RA(3mL,乳酸盐制剂)的溶液被放置在Pari LC PlusTM喷雾器中并且该喷雾器运行到干燥。在雾化之前和之后收集IL-4RA样品并且分析浓度、聚集以及活性。TF-1/IL-4增殖分析被用于评价雾化后的IL-4RA样品的活性。分光光度测定法(A280)和RP-HPLC分析被用于确定喷雾化后的样品的浓度。通过SDS-PAGE和RP-HPLC,证实雾化后的IL-4RA样品的完整性。TF-1增殖分析显示雾化之前的IC50为0.4594nM、雾化之后的IC50为0.4826nM,说明在喷雾化之后IL-4RA的活性被保持(图8A和8B)。通过SDS-PAGE和RP-HPLC,也证实了雾化之后的IL-4RA的完整性。在单独的研究中,应用同样的喷雾器和压缩机,使用Anderson级联冲击器确定质量平均气动粒子的大小并且发现为4μm。精细粒子分数(4.7μm以下并且因此是可呼吸的大小的粒子的%)为57%。应用呼气模拟器和成人呼吸方式,估计大约38%的剂量被输送到肺中。
实施例9
在人类哮喘症患者中IL-4突变蛋白的吸入研究
[0095]在30个哮喘患者中评价了气溶胶化的IL-4RA对过敏原-诱导的肺功能的变化、气管应答性以及其它的与哮喘有关的迹象和症状的影响。相等数目的个体随机接受IL-4RA(60mg)或相匹配的体积的安慰剂。通过PARI LC Plus喷雾器的雾化施用治疗,其已经显示出保持IL-4RA的完整并且具有完全的活性(实施例8)。个体接受每天两次施用的IL-4RA或安慰剂施用27天并且在第28天接受单一的上午给药。在研究之前或在研究的过程中,定时测量症状、重要的迹象、ECG、呼出的一氧化氮和肺功能。对过敏原刺激(如测量的FEV1)的晚期哮喘反应(LAR)被评价为主要终点(primary endpoint)。此外,获得血液样品以测量IL-4RA、抗-IL-4RA抗体、IgE、Sil-13Rα2、IFN-γ和反应的遗传标记(单核苷酸多态性,Single NucleotidePolymorphisms),以及,标准血液学和临床化学参数。在第27天,用吸入的抗原——患者以前对该抗原显示出超敏性——刺激患者,并且在第28天,在吸入攻击过程中用腺苷一磷酸(AMP)检测气道的高应答性。
[0096]在第27天,与安慰剂相比,在抗原的吸入攻击——患者以前对该抗原显示出超敏性——之后(p<0.01),晚期哮喘FEV1反应有72%的减少。图9显示从给药之前(筛选)到第27天的最后治疗之后治疗组中的改善。同样地,与安慰剂相比,在第28天,对AMP的气管反应也有降低。对呼出的一氧化碳——哮喘炎症严重性的生物标记——的评估,显示用每日两次吸入的IL-4RA治疗27天,呼出的一氧化氮减少(图10。)
[0097]IL-4RA使个体的抗原诱导的肺功能降低不发展并且降低了非特异性的气道应答。在抗原的吸入刺激——患者以前对该抗原显示出超敏性——之后,不论暴露的途径,猴子和患哮喘病的人都显示出肺功能方面的改善。猴子的数据也显示肺部炎症,如通过肺灌洗嗜酸性粒细测量的,随着IL-4RA的治疗降低,而呼出的一氧化氮、症状、和β-激动剂使用的减少表明类似的反应发生在哮喘病患者中。在皮下或吸入治疗之后,人类和猴子中的IL-4RA的药物动力学的评估显示,吸入后的全身剂量比皮下IL-4RA治疗后的全身接触低大约10倍(图11,人类;图12,猴子)。这种更高的肺部剂量,但较低较低的全身剂量与吸入治疗后人类和猴子中更好的或类似的结果有关。将猴子和人类的数据放在一起,该数据表明IL-4RA直接作用在肺和肺相关的组织(脉管系统和淋巴结)而不是由其它的全身器官和组织主要介导。
[0098]虽然本发明已经参考了上述的实施例进行描述,但是应当理解,改变和变化都包含在发明的精神和范围之内。因而,本发明只限于下面的权利要求。
Claims (48)
1.一种治疗哮喘的方法,包括向需要其的个体施用含治疗有效量的人IL-4突变蛋白的药物组合物,所述人IL-4突变蛋白包含具有修饰的野生型hIL-4的氨基酸序列,其中第一修饰是发生在野生型hIL-4蛋白第121、124或125位的一个或多个氨基酸与另一天然氨基酸的置换,并且所述人IL-4突变蛋白进一步任选地包含N-末端甲硫氨酸。
2.权利要求1所述的方法,其进一步包括选自下列内容的第二修饰:
i)其中C-末端的修饰;
ii)其中潜在的糖基化位点的删除;
iii)蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联,以及其任意组合。
3.权利要求1所述的方法,其中所述第一修饰包括按照野生型hIL-4编号的R121D和Y124D取代。
4.权利要求1所述的方法,其中所述施用是全身的或局部的。
5.权利要求1所述的方法,其中所述施用是通过吸入。
6.权利要求5所述的方法,其中所述组合物通过吸入被施用给个体的肺并且进入所述个体的体循环。
7.权利要求5所述的方法,其中所述组合物在施用之前被气溶胶化。
8.权利要求1所述的方法,其中所述组合物在施用之前被雾化为液体或气溶胶化为干粉。
9.权利要求1所述的方法,其中所述施用每天发生一次。
10.权利要求1所述的方法,其中所述施用每星期发生三次。
11.权利要求10所述的方法,其中所述IL-4的量为大约0.7mg。
12.权利要求10所述的方法,其中所述IL-4的量为大约7.0mg。
13.权利要求10所述的方法,其中所述IL-4的量为大约20mg。
14.权利要求9所述的方法,其中所述IL-4的量为大约30mg。
15.权利要求5所述的方法,其中所述施用每天发生一次。
16.权利要求5所述的方法,其中所述IL-4的量为大约0.3mg。
17.权利要求5所述的方法,其中所述IL-4的量为大约3.0mg。
18.权利要求5所述的方法,其中所述IL-4的量为大约30mg。
19.权利要求5所述的方法,其中所述IL-4的量为大约60mg。
20.权利要求1所述的方法,其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
21.权利要求20所述的方法,其中所述载体选自乳酸盐、柠檬酸盐以及蔗糖缓冲液。
22.权利要求1所述的方法,其中所述IL-4蛋白与非蛋白质聚合物共轭。
23.权利要求22所述的方法,其中所述聚合物是亲水的。
24.权利要求23所述的方法,其中所述聚合物是聚乙烯吡咯烷酮。
25.权利要求22所述的方法,其中所述聚合物是疏水的。
26.权利要求25所述的方法,其中所述聚合物是聚乙二醇。
27.权利要求4所述的方法,其中所述施用是皮下施用。
28.权利要求27所述的方法,其中所述施用每天发生两次。
29.权利要求28所述的方法,其中所述IL-4的量为大约30mg。
30.权利要求27所述的方法,其中所述IL-4的量为大约25mg。
31.权利要求1所述的方法,其中所述IL-4的量为大约0.1至1mg/kg。
32.监测用于治疗患有哮喘的个体的治疗用药法的方法,其包括确定治疗过程中肺功能和炎症的变化,其中肺功能的增强或炎性细胞的减少可表示积极治疗效果。
33.权利要求32所述的方法,其中肺功能的增强是由改善的即时哮喘反应、改善的后期哮喘反应或气道高反应性的减少决定。
34.权利要求32所述的方法,其进一步包括确定治疗过程中BAL噬酸性粒细胞浓度的变化,其中BAL噬酸性粒细胞浓度的降低可表示积极治疗效果。
35.权利要求32所述的方法,其进一步包括确定与治疗前呼出的一氧化氮相比较,治疗过程中呼出的一氧化氮的变化,其中一氧化氮浓度的减少可表示积极治疗效果。
36.权利要求32所述的方法,其中所述治疗包括权利要求1所述的治疗。
37.包含治疗有效量的突变人IL-4蛋白和药学上可接受的载体的治疗组合物,所述突变人IL-4蛋白包括具有修饰的野生型hIL-4的氨基酸序列,其中第一修饰是发生在野生型hIL-4蛋白第121、124或125位的一种或多种氨基酸与另一天然氨基酸的置换,并且所述突变人IL-4蛋白进一步任选地包括N-末端甲硫氨酸,其中所述组合物是气溶胶化的。
38.权利要求37所述的组合物,其中所述蛋白质进一步包括选自下列内容的第二修饰:
i)其中C-末端的修饰;
ii)其中潜在的糖基化位点的删除;
iii)蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联,以及其任意组合。
39.权利要求37所述的组合物,其中所述蛋白质的所述第一修饰包括按照所述野生型hIL-4编号的R121D和Y124D取代。
40.权利要求35所述的组合物,其中所述载体选自乳酸盐、柠檬酸盐或蔗糖缓冲液。
41.权利要求37所述的组合物,其中所述IL-4蛋白与非蛋白质聚合物共轭。
42.权利要求41所述的组合物,其中所述聚合物是亲水的。
43.权利要求42所述的组合物,其中所述聚合物是聚乙烯吡咯烷酮。
44.权利要求41所述的组合物,其中所述聚合物是疏水的。
45.权利要求44所述的组合物,其中所述聚合物是聚乙二醇。
46.包含治疗有效量的突变人IL-4蛋白和药学上可接受的载体的治疗性气溶胶化的组合物,所述突变人IL-4蛋白包括具有修饰的野生型hIL-4的氨基酸序列,其中第一修饰是发生在野生型hIL-4蛋白第121、124或125位的一种或多种氨基酸与另一天然氨基酸的置换,并且所述突变人IL-4蛋白进一步任选地包括N-末端甲硫氨酸,其中所述IL-4蛋白与非蛋白质聚合物共轭。
47.权利要求46所述的组合物,其中所述蛋白质进一步包括选自下列内容的第二修饰:
i)其中C-末端的修饰;
ii)其中潜在的糖基化位点的删除;
iii)所述蛋白质与非蛋白质聚合物的偶联,以及其任意组合。
48.权利要求46所述的组合物,其中所述蛋白质的所述第一修饰包括按照所述野生型hIL-4编号的R121D和Y124D取代。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US75844206P | 2006-01-11 | 2006-01-11 | |
US60/758,442 | 2006-01-11 | ||
US60/841,583 | 2006-08-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101426518A true CN101426518A (zh) | 2009-05-06 |
Family
ID=40616647
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2007800052112A Pending CN101426518A (zh) | 2006-01-11 | 2007-01-11 | 用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101426518A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110431240A (zh) * | 2017-04-13 | 2019-11-08 | 雷杰纳荣制药公司 | 在编码il33和il1rl1的基因中具有风险等位基因的患者的炎症性肺部疾病的治疗和抑制 |
-
2007
- 2007-01-11 CN CNA2007800052112A patent/CN101426518A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110431240A (zh) * | 2017-04-13 | 2019-11-08 | 雷杰纳荣制药公司 | 在编码il33和il1rl1的基因中具有风险等位基因的患者的炎症性肺部疾病的治疗和抑制 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7947648B2 (en) | Methods for treating asthma in human and non human primates using IL-4 mutant compositions | |
JP6441867B2 (ja) | インターロイキン2のスーパーアゴニストおよびアンタゴニスト | |
RU2235729C2 (ru) | Селективные агонисты и антагонисты il-2 | |
JP5766124B2 (ja) | 炎症性疾患および自己免疫疾患の処置の組成物および方法 | |
CA2082951C (en) | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor | |
AU2018372167A1 (en) | Partial agonists of interleukin-2 | |
JP4883665B2 (ja) | インターフェロン−βを使用する腎不全のための治療法 | |
JP2003517846A (ja) | 可溶性インターロイキン−20レセプター | |
CN103998053B9 (zh) | 通过抑制il-4和/或il-13与其各自的受体结合来预防或治疗某些障碍的方法 | |
EA009377B1 (ru) | Еро-имитирующие миметические антитела человека с центральной шарнирной областью, композиции, способы и применения | |
EA005005B1 (ru) | ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | |
US20090202533A1 (en) | Treatment and prophylaxis of th2 mediated disorders | |
CN103182072B (zh) | 白介素‑22在治疗和预防神经损伤疾病或神经退行性疾病中的用途 | |
JP2003507006A (ja) | 血管内皮増殖因子改変体 | |
JP2007039463A (ja) | インターフェロンβを用いる慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシーの治療 | |
JP4774368B2 (ja) | 改変型il−4ムテイン受容体アンタゴニスト | |
CN101426518A (zh) | 用于治疗人类和非-人类灵长类中哮喘的方法和组合物 | |
AU2006301494A1 (en) | Antagonists against interaction of PF4 and RANTES | |
KR101563852B1 (ko) | 소 과립구 콜로니 자극 인자 및 그의 변이체를 위한 제제 | |
US6465616B1 (en) | Interleukin-5 antagonist | |
WO2000009150A2 (en) | Cytokine and cytokine receptor, agonist, antagonist and/or antibody combination for therapeutic use | |
EP2431049A2 (en) | Pharmaceutical preparation to be administered into respiratory organs for treating or preventing inflammatory respiratory diseases, and method for treating or preventing such diseases | |
CN111565736B (zh) | 猪g-csf变体和其用途 | |
CA2256368A1 (en) | An interleukin-5 antagonist | |
JPH05178899A (ja) | 修飾ポリペプチドおよびそれを有効成分とする血小板減少症治療剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090506 |