CN101407509A - 从新疆藁本中制备肉豆蔻醚的方法 - Google Patents

Abstract

一种从新疆藁本中制备肉豆蔻醚的方法，利用新疆藁本的根茎，干燥粉碎过筛后通过水蒸汽蒸馏获取下层精油；随后进行硅胶柱层析，石油醚与二氯甲烷梯度洗脱后收集合并GF254硅胶板上紫外灯下显紫色的流分，获取含量在90％以上肉豆蔻醚粗品；然后将肉豆蔻醚粗品与醇类有机溶剂混合，超低温冷冻结晶，得到肉豆蔻醚含量在99％以上的白色晶体，室温下为无色油状液体，该化合物对小麦赤霉病菌等植物病原真菌具有极强的离体杀菌活性。按照本发明的方法步骤精制肉豆蔻醚，原料易得、操作简单，且肉豆蔻醚收率高、纯度高，可以用作医药和农药研究开发所需肉豆蔻醚纯品。

Description

从新疆藁本中制备肉豆蔻醚的方法

技术领域

本发明涉及一种天然产物成分-肉豆蔻醚的提取制备方法及其用途，属于医药和农药技术领域。

背景技术

肉豆蔻醚，即5-烯丙基-1-甲氧基-2，3-(甲撑二氧基)苯，分子式C₁₁H₁₂O₃，分子量192.21，CAS号：607-91-0，具有如图1所示的化学结构式、图2所示的红外光谱图以及图3所示的质谱图。它是肉豆蔻科肉豆蔻属植物肉豆蔻Myristica fragans Houtt挥发油的主要芳香成分，肉豆蔻醚在肉豆蔻挥发油中含量为4-8％(Hallstroem and Thuvander，1997)。除此之外，肉豆蔻醚还分布于伞形科的芹属(Apium)、莳萝属(Anethum)、海茴香属(Crithmum)、茴香属(Foeniculum)、欧芹属(Petroselinum)、茴芹属(Pimpinella)、水芹属(Ridolfia)、欧当归属(Levisticum)、欧防风属(Pastinaca)、藁本属(Ligusticum)和胡萝卜属(Daucus)等(Harborne et al.，1969)。

肉豆蔻醚的抗肿瘤、抗氧化、抗菌、保肝、杀虫、增效等生理活性及致幻、促进细胞凋亡的毒性吸引了研究者的极大关注。现代研究表明，肉豆蔻醚具有诱导鼠肝脏谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)活性和抑制苯并芘诱导的鼠肺肿瘤细胞生成的功能(Ahmad et al.，1997；Zhenget al.，1992)，具有治疗脂多糖导致的肝损伤功能(Morita et al.，2003)，对革兰式阳性菌和阴性菌均有抗菌活性(Narasimhan and Dhake，2006)，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目的昆虫和螨类具有一定的杀虫活性并对氨基甲酸酯类和菊酯类杀虫剂有较强的增效作用(Lichterstein and Casida，1963)。然而，肉豆蔻醚在6-7mg/kg剂量时对人有致幻作用(Hallstroem and Thuvander，1997)，通过细胞凋亡程序对人神经细胞瘤细胞有细胞毒活性(Lee et al.，2005)。

肉豆蔻醚广泛有益的生理活性及其特殊的毒性在医药、农药等领域显示出较大的应用前景和较高的使用风险，对其开展研究、检测、应用都需要肉豆蔻醚标准品，目前市场上购买困难、价格昂贵，因此从植物中制备肉豆蔻醚的简单实用的方法具有较高实用价值。

新疆藁本系伞形科山芎属多年生草本植物鞘山芎Conioselinum vaginatum(Spreng)Thell的根茎，产新疆西部，以伊犁地区最多，欧洲中部亦有分布；具有祛风散寒、止痛等功能，用于治疗风寒头痛，寒湿腹痛、泄泻、疥癣等。新疆藁本主要成分为挥发油，肉豆蔻醚在新疆藁本挥发油中含量较高，是肉豆蔻醚的理想植物资源，但制备肉豆蔻醚的方法及其抗植物病原真菌活性未见文献和专利报道。

参考文献如下：

[1]Ahmad H，Tijerina MT，Tobola AS，1997.Preferential overexpression of a classMU Glutathione S-transferase subunit in mouse liver by myristicin.Biochem.Biophys.Res.Commum.236，825-828.

[2]Hallstroem H，Thuvander A，1997.Toxicological evaluation of myristicin.NaturalToxins 5：186-192.

[3]Harborne JB，Heywood VH，Williams CA，1969.Distribution of myristicin in seedsof the Umbelliferae.Phytochemistry 8：1729-1732.

[4]Lee BK，Kim JH，Jung JW，Choi JW，Han ES，Lee SH，Ko KH，Ryu JH，2005.Myristicin-induced neurotoxicity in human neuroblastoma SK-N-SH cells，ToxicologyLetters 157(1)：49-56.

[5]Lichterstein EP，Casida JE，1963.Naturally occurring insecticides，myristicin，an insecticide and synergist occurring naturally in the edible parts of parsnips.J.Agric.Food Chem.11：410-415

[6]Morita T，Jinno K，Kawagishi H，Arimoto Y，Suganuma H，Inakuma T，Sugiyama K，2003.Hepatoprotective effect of myristincin from nutmeg(Myristica fragrans)onlipopolysaccharide/D-galactosamine-induced liver injury.J.Agric.Food Chem.51：1560-1565

[7]Narasimhan B，Dhake AS，2006.Antibacterial principles from Myristica fragransseeds.J Med Food 9(3)：395-399

[8]Zheng GQ，Kenney PM，Zhang J，Lam LK，1992.Inhibition of benzo(a)pyrene-inducedtumorigenesis by myristicin，a volatile aroma constituent of parsley leaf oil.Carcinogenesis 13：1921-1923.

[9]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.北京：科学出版社，1992.

[10]中国科学院新疆生物土壤沙漠研究所.新疆药用植物志(第二册).乌鲁木齐：新疆人民出版社，1981.

发明内容

本发明的目的是提供一种从新疆藁本中提取制备杀菌活性成分肉豆蔻醚的方法，其过程包括水蒸汽蒸馏、硅胶柱层析、冷冻结晶和生物测定等几个步骤，提取制备工艺流程参见图4。具体而言，包括如下步骤：

1)取新疆藁本材料，进行干燥，并粉碎，得到新疆藁本粗粉，将所述粗粉与水混匀后进行冷浸处理，随后置于水蒸汽蒸馏装置进行蒸馏，直到不再有挥发油冷凝下沉为止，挥发油用分液漏斗分液后获得下层精油；

2)将第1)步获得的精油进行硅胶柱层析，收集含有肉豆蔻醚的流分；

3)将所述流分与有机溶剂混合，进行冷冻结晶，得到肉豆蔻醚白色结晶。

上述方法制备的肉豆蔻醚对小麦赤霉病菌等植物病原真菌进行离体生物活性测定，发现具有极强的杀菌活性。

其中，提取制备肉豆蔻醚一些更优选的方面如下所述：

第1)步中所述的新疆藁本粗粉是过三号筛得到。

第1)步中的所述粗粉与水混匀是按料液重量比为1∶4～1∶6进行混合；所述冷浸处理的时间为3-9小时，优选为5-7小时，最优选为6小时。

第1)步中的所述的在水蒸汽蒸馏装置进行蒸馏是指加热至沸腾并保持微沸5-7小时，优选为6小时来进行的。

第2)步中硅胶柱层析所用的层析柱的直径与长度比为1∶20～1∶30；上样前，用石油醚浸泡硅胶，通过湿法装柱；上样时，上样量与硅胶量按照1∶8～1∶16(重量比)的比例进行，优选比例为1∶10；硅胶为300～400目层析用硅胶。

第2)步中硅胶柱层析的洗脱剂为石油醚与氯仿，或者石油醚与二氯甲烷的混合物。并且按照体积比10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5的比例进行梯度洗脱。收集的流分是指洗脱液的比例为8∶2时洗脱的、在GF254硅胶板上紫外灯下显紫色的流分，即为肉豆蔻醚粗品。

第3)步是将收集的流分与醇类有机溶剂，优选为乙醇或甲醇混合，优选等体积混合，进行冷冻结晶，优选冷冻结晶是在-60℃～-80℃下静置2～3小时，取出后去除上层溶剂即得到肉豆蔻醚白色晶体。当处于室温时，肉豆蔻醚呈无色油状液体。

采用平皿法(农业行业标准NYT 1156.2-2006)测定平皿内本发明方法制得的肉豆蔻醚纯品对小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、白菜黑斑病菌、南瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌等植物病原真菌的菌丝生长抑制作用，肉豆蔻醚表现出强烈的离体抑菌效果。

下面是相对具体的一种实施方式：

1)水蒸汽蒸馏：取新疆藁本材料，经干燥粉碎后，过三号筛得到藁本粗粉，按照料液比重量比1∶5的比例将新疆藁本粗粉和水混匀后冷浸处理约6小时，随后置于水蒸汽蒸馏装置中加热至沸腾并保持微沸约6小时，直至不再有挥发油冷凝下沉为止，挥发油用分液漏斗分液后获得下层黄色精油，此步骤的收率为0.9％～1.2％。

2)硅胶柱层析：选择直径与长度比为1∶20的层析柱，石油醚浸泡硅胶湿法装柱，按照上样量与硅胶量(300～400目层析用硅胶)1∶10的比例上样(上述黄色下层精油)，石油醚与二氯甲烷按照10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5的比例梯度洗脱，按照与硅胶等质量的量收集各流分，合并石油醚与二氯甲烷8∶2时洗脱出的在紫外灯下GF254薄层层析硅胶板上紫外灯下显色检验呈紫色的流分得到浅黄色肉豆蔻醚粗品，其中肉豆蔻醚含量达95％以上。

3)冷冻结晶：将浅黄色肉豆蔻醚粗品与无水乙醇按等体积比混合后放入玻璃器皿中，然后置于-80℃超低温冰箱中静置2～3小时后取出，迅速倒除上层溶剂后得肉豆蔻醚白色结晶，室温下呈无色油状液体，经色谱分析纯度在99％以上。

4)生物测定：用丙酮作溶剂、PDA作培养基将肉豆蔻醚倍性稀释成系列浓度的含药平板，等量丙酮与PDA混合液为对照，每处理三次重复，无菌条件下接入直径为5mm病原菌菌落，在25±2℃培养箱中培养72小时后用十字交叉法测定菌落直径，按照下式计算肉豆蔻醚对植物病原真菌菌丝生长抑制率：

$I(\%)=\frac{\mathrm{Do}-\mathrm{Dt}}{\mathrm{Do}}\×100$ (式中：I——菌丝生长抑制率；Do——对照菌落增长直径；

Dt——药剂处理菌落增长直径。)

生物测定结果显示肉豆蔻醚对小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、白菜黑斑病菌、南瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌等植物病原真菌的菌丝生长的最低有效抑制浓度(Minimum Effective Concentration，MEC)在0.06～0.5μl·mL^-1之间，肉豆蔻醚表现出强烈的离体抑菌效果。

本发明具有如下优点：

本发明是首次从新疆藁本中高效提取制备肉豆蔻醚，原料易得、操作简单，相对化学合成的方法操作更简单、成本更低廉。按照本发明的方法步骤精制肉豆蔻醚，肉豆蔻醚收率高、纯度高，可以用作中药中有毒成分肉豆蔻醚检测分析所需标准对照品，以及医药和农药研究开发所需肉豆蔻醚纯品。采用平皿法测定平皿内本发明方法制得的肉豆蔻醚纯品对小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、白菜黑斑病菌、南瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌等植物病原真菌的菌丝生长抑制作用，肉豆蔻醚表现出强烈的离体抑菌效果。肉豆蔻醚本身具有一定的抗肿瘤、抗氧化、抗菌、保肝、杀虫、增效等活性，从而也能以此化合物为模板衍生合成系列化合物并从中筛选更高活性的医药及农药新产品提供原料。

附图说明

图1  肉豆蔻醚的化学结构式

图2  肉豆蔻醚的红外光谱图

图3  肉豆蔻醚质谱图

图4  从新疆藁本中制备肉豆蔻醚工艺流程图

图5  新疆藁本精油化学成分GC-MS分析结果

图6  新疆藁本精油柱层析第2～第7号流分GC-MS分析结果

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：

1)水蒸汽蒸馏

取新疆藁本粉碎，过三号筛后得到新疆藁本粗粉1.5千克，按照料液比1∶5(重量比)的比例将新疆藁本粗粉和水混匀后冷浸处理6小时，然后置于水蒸汽蒸馏装置中蒸馏6小时至没有挥发油冷凝下沉为止，挥发油用分液漏斗分液后，合并下层精油得18.3克，收率为1.2％，藁本精油化学成分GC-MS分析结果参见图5和表1；

其中，GC-MS分析条件：AI/AS 3000 Trace GC 2000 DSQ气相色谱质谱仪；DB-1701毛细管柱(30m×0.25mm，膜厚0.25μm)；升温程序：起始温度40℃，保持1分钟，10℃/分钟升温至200℃，保留10分钟；进样口温度200℃，40℃；进样量1μl，分流比100∶1；离子源温度250℃，70ev，30-300质量范围全扫描。

表1新疆藁本精油化学成分GC-MS分析结果

2)硅胶柱层析

然后取10克精油进行硅胶柱层析：选80厘米×3厘米的玻璃层析柱，石油醚(60～90℃)浸泡300～400目层析用硅胶100克湿法装柱，石油醚与二氯甲烷梯度洗脱(按照10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5比例)，100毫升/瓶收集流分，接着对各流分进行TLC和GC-MS检测分析(第2～第7号流分化学成分GC-MS分析结果参见图6)，合并第2、3、4号流分，减压蒸馏除去溶剂后得浅黄色肉豆蔻醚粗品6.12克(GC-MS分析结果显示肉豆蔻醚含量为95.7％)。

3)冷冻结晶：将浅黄色肉豆蔻醚粗品与乙醇等体积比混合后放入玻璃器皿中，然后置于-80℃超低温冰箱中静置2小时后取出，迅速倒除上层溶剂后得一白色结晶，室温下呈无色油状液体，经色谱分析纯度在99％以上，经GC-MS分析后谱图检索并参考文献比对质谱及红外光谱鉴定，所获得的产品具有如图1所示的化学结构式，图2和3所示的红外光谱图和质谱图。因此，表明通过上述方法获得的产品确系肉豆蔻醚。

4)生物活性测定：用丙酮作溶剂、PDA作培养基将肉豆蔻醚倍性稀释成系列浓度的含药平板，等量丙酮与PDA混合液为对照，每处理三次重复，无菌条件下接入直径为5mm病原菌菌落，在25±2℃培养箱中培养72小时后用十字交叉法测定菌落直径，按照下式计算肉豆蔻醚对植物病原真菌菌丝生长抑制率：

$I(\%)=\frac{\mathrm{Do}-\mathrm{Dt}}{\mathrm{Do}}\×100$ (式中：I——菌丝生长抑制率；Do——对照菌落增长直径；

Dt——药剂处理菌落增长直径。)

按照上述平板法测定制备的肉豆蔻醚纯品对小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、白菜黑斑病菌、南瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌等植物病原真菌的抑菌活性，首先将肉豆蔻醚稀释并制备终浓度为1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125，0.015625μl·mL^-1等系列浓度含药平板，等量丙酮与PDA混合液为对照，每处理三次重复，无菌条件下接入直径为5mm植物病原菌菌落，在25±2℃培养箱中培养72小时后测定并计算抑制率，结果见表2。

表2肉豆蔻醚对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

Claims (10)

1.一种从新疆藁本中制备杀菌活性成分肉豆蔻醚的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取新疆藁本的根茎作材料，进行干燥并粉碎，得到新疆藁本粗粉，将所述粗粉与水混匀后进行冷浸处理，随后置于水蒸汽蒸馏装置进行蒸馏，直到不再有挥发油冷凝下沉为止，挥发油用分液漏斗分液后获得下层精油；

2)将第1)步获得的精油进行硅胶柱层析，有机溶剂梯度洗脱后收集含有肉豆蔻醚的流分；

3)将所述流分与醇类有机溶剂混合，进行冷冻结晶，得到肉豆蔻醚白色晶体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第1)步中所述的藁本粗粉是过三号筛得到。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第1)步中所述粗粉与水混匀是按料液重量比为1∶4～1∶6混合；所述冷浸处理的时间为3-9小时，优选为5-7小时，最优选为6小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第1)步中的所述的在水蒸汽蒸馏装置进行蒸馏是指加热至沸腾并保持微沸5-7小时，优选为6小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第2)步中硅胶柱层析所用的层析柱的直径与长度比为1∶20～1∶30；上样前，用石油醚浸泡硅胶，通过湿法装柱；上样时，上样量与硅胶量按照重量比1∶8～1∶16的比例进行；硅胶为300～400目层析用硅胶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第2)步中硅胶柱层析时采用石油醚与氯仿，或者石油醚与二氯甲烷进行梯度洗脱。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述梯度洗脱是两种物质按照体积比为10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5的比例进行。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：收集含肉豆蔻醚的流分是在两种物质按照体积比为8∶2时洗脱的、在GF254硅胶板上紫外灯下显紫色的流分。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：第3)步是将收集的流分与醇类有机溶剂，优选为乙醇或甲醇混合，优选等体积混合，进行冷冻结晶，优选为超低温冷冻结晶，即在-60℃～-80℃下静置2～3小时，取出后去除上层溶剂即得到肉豆蔻醚白色结晶。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法制得的肉豆蔻醚作为医药标准品和植物源杀菌剂的应用。

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