CN101405022A

CN101405022A - 用于减少草酸盐的组合物和方法

Info

Publication number: CN101405022A
Application number: CNA2006800529042A
Authority: CN
Inventors: 李青山; H·赛德胡
Original assignee: Oxthera Inc
Current assignee: AUX Sarah Intellectual Property Co. Ltd.
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-15
Publication date: 2009-04-08
Also published as: WO2007075447A3; JP5558002B2; US8900575B2; EP1976553A4; CA2633238A1; US10272043B2; EP2366402A1; ES2362897T3; AU2006329844B2; WO2007075447A2; AU2006329844A8; US20070184118A1; DE602006020347D1; HK1201151A1; AU2006329844A1; ATE499111T1; US20150125538A1; CN104013581A; CN107638563A; JP2009519950A

Abstract

本发明包括用于减少人体内草酸盐的方法和组合物。例如，本发明提供了用于递送一种或多种包埋于颗粒组合物中的减少草酸盐的酶的方法和组合物。本发明的组合物适合于治疗或预防草酸盐相关疾病的方法，和接受了胃肠外科手术和肥胖病手术(因肥胖而手术)的患者和/或接受了抗生素治疗的患者，所述草酸盐相关疾病包括(但不限于)高草酸盐尿、吸收性高草酸盐尿、肠原性高草酸盐尿、原发性高草酸盐尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石症)、外阴痛、与终末期肾病相关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎。

Description

用于减少草酸盐的组合物和方法

相关申请

本申请要求享有于2005年12月16日提交的美国临时专利申请No.60/750,896的优先权，将其全文并入本文。

技术领域

本发明涉及包含一种或多种草酸盐降解酶的组合物，该组合物用于将活性形式的酶递送至胃部，在那里所述一种或多种草酸盐降解酶发挥它们的作用。因而，本发明提供了用于减少胃中的草酸盐的手段。本发明的组合物包含颗粒，该颗粒含有一种或多种包埋于第一聚合材料中的草酸盐降解酶，其中在相似的条件下于37℃的美国药典(USP)模拟胃液中孵育至少60分钟时，所述包埋的酶保留的活性是从同一批次获得的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少两倍。

背景技术

肾/尿路结石疾病(尿石症)是全世界范围的主要健康问题。大多数与尿石症有关的结石是由单独的草酸钙组成，或者由草酸钙加上磷酸钙组成。其它疾病状态也与过量的草酸盐有关。这些包括外阴痛、与终末期肾病有关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、局限性回肠炎以及其它肠道疾病状态。

草酸和/或其盐发现于多种食物中，并因而是人和动物膳食的许多组分的成分。在食用了含有增加量的草酸的食物后可能会发生草酸盐吸收的增加。众所周知，诸如菠菜和食用大黄之类的食物含有高含量的草酸盐，但是大多数其它食物和饮料也含有草酸盐。因为草酸盐存在于如此多样的食物中，因此草酸盐含量低并且同时还可口的食物难以配制出来。此外，依从低草酸盐的膳食常常也是成问题的。

形成肾结石的风险围绕着大量目前尚未完全明白的因素。在西方国家肾或尿路结石疾病发生多至12％的人群中，并且大约70％的这些结石由草酸钙或草酸钙加上磷酸钙组成。一些个体(例如患有诸如局限性回肠炎、炎性肠病或脂肪痢之类的肠道疾病的患者以及已经接受了空肠回肠旁路术的患者)在其膳食中吸收了比其它个体更多的草酸盐。对于这些个体，草酸盐尿石症的发病率显著增加。

发病率的提高是由于肾和尿液中草酸盐水平的增加，并且这(在人中最常见的高草酸盐尿综合征)被称为肠原性高草酸盐尿。草酸盐也是患有终末期肾病的患者的难题，并且近来显示尿中的草酸盐升高也涉及到外阴前庭炎(外阴痛)。

已经建议将含有降解草酸盐的细菌的包肠溶衣的组合物用于降低草酸盐浓度。然而，包肠溶衣的组合物以完整的形式通过了胃(即包衣是完整的)，因此在胃中没有降解草酸盐。因此，仍然需要开发这样的组合物，其能够降解已存在于胃中的草酸盐以便尤其能降解膳食中的草酸盐。此外，这类组合物适用于治疗肠原性高草酸盐尿和吸收性高草酸盐尿，例如导致复发性结石病的高草酸盐尿。该治疗的目的是使患者具有正常的尿草酸盐水平。

发明内容

发明概述

本发明包括用于治疗和预防草酸盐相关疾病的组合物和方法。本发明的组合物包含减少草酸盐的酶。本发明的方法包括施用该组合物来治疗或预防草酸盐相关疾病，以及用于制备和施用这类组合物的方法。本发明的组合物在胃液条件下(例如低的pH并且存在蛋白酶)减少草酸盐。本发明的组合物减少人和其它动物胃中的草酸盐。该组合物减少非系统性的草酸盐，如胃肠道(特别是胃)中的草酸盐，并防止外源性草酸盐(例如，来自食物)进入体循环中。

根据本发明的组合物包含颗粒，该颗粒含有一种或多种包埋于第一聚合材料中的酶，其中在将包埋的酶和未包埋的(游离的)酶两者在37℃下于模拟胃液(84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶，pH范围是1.0至4.0)中孵育至少60分钟时，包埋的酶保留的活性是来自同一批次的所述一种或多种未包埋的酶的至少两倍。组合物包含可另外被第二聚合材料包被的颗粒。组合物还可以包含可以交联的聚合材料，并且任选地，该交联物可以被还原。在具体的实施方案中，第一聚合材料是壳聚糖、藻酸盐、果胶或透明质酸。除了一种或多种酶和第一聚合材料，颗粒组合物还可以包含一种或多种诸如pH调节剂、缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、酶的辅助因子之类的添加剂或一种或多种可药用赋形剂例如充填剂、稀释剂、载体等。

本发明的方法包括提供用于非系统治疗的组合物，例如提供能够减少胃中的草酸盐以避免胃肠道吸收草酸盐的组合物。该组合物保护包埋于其中的减少草酸盐的酶不受胃中酸性和损害酶的环境的损害，并在这样一种苛刻环境中维持酶活性。治疗和预防方法包括提供本文教导的组合物，在该组合物中，一种或多种草酸盐降解酶包埋于第一聚合材料中，任选用第二聚合材料包被所获得的颗粒，任选将第一聚合材料和/或第二聚合材料交联并且任选还原该交联键。

本发明的组合物适用于治疗或预防草酸盐相关疾病的方法，并且适用于已经经历了胃肠外科手术和肥胖手术(针对肥胖症的手术)的患者和/或已经经历了抗菌素治疗的患者，所述草酸盐相关疾病包括(但不限于)高草酸盐尿、吸收性高草酸盐尿、肠原性高草酸盐尿、原发性高草酸盐尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石症)、外阴痛、与终末期肾病相关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎。治疗或预防方法包括将有效量的本发明组合物经口施用给受试者，用以减少受试者胃中的草酸盐，从而以高效率且有效的方式减少受试者的草酸盐总负荷。该组合物经口施用是药学上可接受的。

在本发明的组合物和方法中使用的酶是减少草酸盐的酶，并且包括(但不限于)草酸氧化酶、草酸脱羧酶(在本发明内容中缩写成OxDc)、草酰辅酶A脱羧酶或甲酰辅酶A转移酶或其组合。此外，作为草酸盐降解路径的取代物或参与草酸盐代谢路径(尤其是草酸盐减少)的其它酶、辅因子和辅酶也可以单独使用或者与一种或多种减少草酸盐的酶组合使用。在本发明中，不仅酶(蛋白质)被该定义所涵盖，而且编码减少草酸盐的基因和蛋白质的多核苷酸序列也被本发明所考虑。本发明还考虑这些酶的任何结合配偶体并且包括结合至所述酶或与所述酶相互作用的抗体和抗体片段。

酶可以通过从生物中分离而产生，它们可以被纯化，它们可以通过合成制备、半合成制备或者通过重组手段制备，或者它们可以作为细胞溶解产物使用。在组合物中使用的酶可以是纯化的重组蛋白质，但是由于酶也可以在某些安全的细菌中产生，也考虑将那些细菌作为完整的细胞或作为细胞溶解产物使用。

草酸盐降解酶通常以足以基本降解通常存在于标准膳食中的所有草酸盐的量存在于本发明的组合物中。取决于对食物的选择，平均西方饮食可以包含100至300mg草酸盐/天。一般而言，约0.2g含有酶的颗粒(相当于1mL颗粒悬浮液中的20mg OxDc)可以在模拟胃液条件下在30分钟内除去180mg草酸盐。

本发明的一方面包括组合物，该组合物包含颗粒，该颗粒包含一种或多种包埋于第一聚合材料中的草酸盐降解酶，其中在37℃下于美国药典模拟胃液中孵育至少60分钟时，所述包埋的酶保留的活性是来自同一批次的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少两倍，所述美国药典模拟胃液含有pH＞1(例如pH约1至pH约5的范围，例如pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml的胃蛋白酶。

发明详述

本发明包括用于治疗和预防草酸盐相关疾病的组合物和方法。本发明的组合物包含减少草酸盐的酶。本发明的组合物经过设计，使得即使该组合物遭受胃环境，该酶也能保持它们的活性。本发明的方法包括施用该组合物以治疗或预防草酸盐相关疾病，以及用于制备和使用这种组合物的方法。更具体地说，本发明涉及经设计以能够在胃条件下减少草酸盐，由此能够减少已存在于胃中的草酸盐的组合物。这种组合物经特别设计以用于减少非系统性的草酸盐，如胃肠道(尤其是胃)中的草酸盐，并防止外源性草酸盐(如来自食物)进入体循环中。

如上提及的，本发明背景是需要能够施用草酸盐降解酶至胃部以便降解膳食中的草酸盐并防止胃和肠道吸收草酸盐，这可预防草酸盐相关疾病和障碍，例如高草酸盐尿、原发性高草酸盐尿、特发性草酸钙肾结石病(尿石症)，并且特别是吸收性高草酸盐尿和肠原性高草酸盐尿。施用的酶受到保护而免于在胃的胃液条件(即低pH和存在胃蛋白酶)下发生的蛋白质降解和/或pH或酸性依赖性降解。

因此，本发明涉及组合物，其中酶包埋于保护该酶在胃液条件下免受降解的聚合材料中。可以设想这种组合物可包含任何酶，但是为本发明目的，本发明考虑的是草酸盐降解酶，例如草酸脱羧酶、草酸氧化酶或草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶的组合，或任意这些酶的组合。

根据本发明的组合物包含颗粒，该颗粒含有一种或多种包埋于第一聚合材料中的酶，其中在将所述包埋的酶和未包埋(游离)的酶在37℃下于模拟胃液(84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶，pH范围是1.0至4.0)中孵育至少60分钟时，该包埋的酶保留的活性是来自同一批次的所述一种或多种未包埋的酶的至少两倍。该颗粒可以另外用第二聚合材料包被。如本文所用的，术语“来自同一批次的酶”表示在相同条件下分离或合成的酶，并且通常它们是在同一分离或合成程序中分离或合成的，其中所得的酶组合物通常称为一个批次。例如，将酶溶液分成两部分，其中将一部分酶包埋于颗粒中并可以进行进一步的处理，而将另一部分酶进行不同处理，则这些酶被认为是来自同一批次。

通常，可以采用两种不同的治疗草酸盐相关疾病的途径，这取决于治疗目标是系统性的还是非系统性的。本发明的方法提供了用于非系统性治疗的组合物，即提供了能减小胃中的草酸盐以避免胃肠道吸收草酸盐的组合物。据本发明者所知，这种组合物是新的并且是基于这样的新原则：一方面保护酶免受胃中酸性环境和损害酶的环境的损害，另一方面，即使在酸性环境中也可维持酶活性。这一目标可以通过如下方案实现：将一种或多种草酸盐降解酶包埋于第一聚合材料中，任选用第二聚合材料包被所得的颗粒，任选使第二聚合材料交联并任选还原交联的包被的颗粒。

在本发明的一个实施方案中，降低草酸盐吸收是通过提供草酸盐降解酶给胃肠道(尤其是胃)来实现的。本发明的组合物包含减少草酸盐的酶，其包括(但不限于)草酸氧化酶、草酸脱羧酶、草酰辅酶A脱羧酶、甲酰辅酶A转移酶或其组合。这些酶将草酸盐用作底物。本发明的方法包括提供酶组合物，其用于在胃中降解膳食中的草酸盐，从而降低胃中可用于吸收的草酸盐的浓度。这也将减少进入肠中而在胃肠道的这一段吸收的草酸盐的量。除了吸收途径，最近还在人的胃中鉴定了草酸盐分泌途径。本发明的组合物也可用于降解从循环系统分泌到胃中的草酸盐，因此本发明的方法期望总体减轻个体中的草酸盐负荷。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于递送有效量的减少草酸盐的酶至人或动物(尤其是患草酸盐相关疾病的风险增加的那些人或动物)的胃部的组合物和方法。酶活性用于降解胃中的草酸盐并减少胃和肠道中存在的草酸盐的量，由此减少可用于吸收的草酸盐的量。胃肠道中的草酸盐水平较低也可以导致通过草酸盐分泌途径从血液分泌到肠道中的草酸盐增加。

本发明的组合物适用于草酸盐相关疾病并且适用于已经接受了胃肠外科手术和肥胖手术(针对肥胖症的手术)的患者和/或已经接受了抗菌素治疗的患者，草酸盐相关疾病包括(但不限于)高草酸盐尿、吸收性高草酸盐尿、肠原性高草酸盐尿、原发性高草酸盐尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石症)、外阴痛、与终末期肾病相关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎。

本发明组合物的一个特征是颗粒保护草酸盐降解酶免于降解的能力，所述降解是由例如在胃环境中发现的那些条件造成的，包括(但不限于)由蛋白酶例如胃蛋白酶引起的降解或由于酸性环境引起的降解。

如本文所用的，术语“草酸盐降解酶”旨在表示能够减少草酸盐的任何酶。其本身可以减少草酸盐和/或其可以在减少草酸盐的途径中起作用。本发明考虑使用任意已知的减少或降解草酸盐的酶，并且“减少草酸盐的”和“降解草酸盐的”这样的术语在本文中可以交换使用。

在本发明的组合物和方法中使用的酶包括(但不限于)草酸氧化酶、草酸脱羧酶(在本文中缩写为OxDc)、草酰辅酶A脱羧酶或甲酰辅酶A转移酶，或其组合。而且，作为草酸盐降解途径的取代物或参与草酸盐代谢途径(尤其是草酸盐减少)的其它酶、辅因子和辅酶也可以单独使用或与一种或多种上述酶组合使用。在本发明中，不仅酶由该定义所涵盖，而且编码减少草酸盐的基因和蛋白质的多核苷酸序列也为本发明所考虑。本发明还考虑这些酶的任何结合配偶体并且包括结合至所述酶或与所述酶相互作用的抗体和抗体片段。

酶可以从生物分离产生，它们可以被纯化，它们可以通过合成制备、半合成制备或者通过重组手段制备，或者它们可以作为细胞溶解产物使用。通常，酶将作为纯化的重组蛋白质使用，但是由于酶也可以在某些安全的细菌中产生，也考虑将那些细菌作为完整的细胞或作为细胞溶解产物使用。由于本发明组合物的医学应用，优选充分确定一种或多种所使用的酶的纯度和活性。细胞溶解产物(如果使用的话)可以从任何具有减少草酸盐的功能的微生物(例如产甲酸草酸杆菌(O.formigenes))制备。

本发明的组合物还可以包含可提高酶活性的一种或多种另外的因子。这些另外的因子可以是(例如)草酰辅酶A、MgCl₂和/或二磷酸硫胺(活性形式的维生素B₁)。

在具体的实施方案中，采用了来自三种主要类型的草酸盐降解酶的一种或多种酶。

这三种主要类型的草酸盐降解酶包括如下酶。第一类酶(草酸氧化酶)，在高等植物中表达并且催化草酸盐氧依赖性氧化成CO₂，伴随H₂O₂形成。该反应形成了目前用于测定尿中草酸盐水平的测定法的基础。已经开发了一种快速的三步纯化法用以从大麦根获得草酸氧化酶。该酶也存在于甜菜的茎和根、苋属植物的叶、高梁和许多其它谷物中。

草酸脱羧酶(EC 4.1.1.2)是第二种类型的草酸盐代谢酶，主要存在于多种真菌中。这已经有报道并且在多种真菌，例如疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、黑曲霉(Aspergillus niger)的某些菌株、白腐真菌、杂色革盖菌(Coriolus versicolor)和金针菇(Collybiavelutipes)中被表征。这种酶在氧依赖性反应中将草酸盐转化成甲酸盐和二氧化碳。草酸脱羧酶也已经用于血液和尿液的草酸盐的临床测定，并且可用于降低食物和环境中的草酸盐水平。最近，第一种细菌的草酸脱羧酶已经被描述为YvrK基因的产物，YvrK基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达为胞质蛋白。已经将该YvrK蛋白(枯草芽孢杆菌草酸脱羧酶)在大肠杆菌中表达为功能性重组蛋白质，纯化至均质并被完全表征。

第三种类型是细菌酶(草酰辅酶A脱羧酶)，其作用于辅酶A-活化底物上并将其转化成甲酰辅酶A。甲酰辅酶A转移酶随后作用以交换辅酶A上的甲酸盐和草酸盐。已经在草酸盐降解细菌(通常存在于土壤中的草酸假单胞菌(Pseudomonas oxalaticus)和存在于脊椎动物和人胃肠道中的产甲酸草酸杆菌)中研究了这些酶。

这些酶已经在“The enzymes of oxalate metabolism：Unexpectedstructures and metabolism”，Svedruzic D.等，Arch Biochem Biophys.2005 Jan 1；433(1)：176-92中进行了充分的综述，将其全文并入本文。酶(不管是天然的酶、分离的蛋白质还是通过重组技术制备的那些酶)可以通过重组手段或化学手段修饰并且可以包含侧基或其它悬垂的分子。例如，可以将酶修饰成具有用于连接其它分子或化合物的连接分子。

在本发明的具体实施方案中，草酸盐水平降低是通过使用草酸盐降解酶实现的，所述酶通过重组手段，例如已转化以表达草酸盐降解酶的大肠杆菌或其它生物来产生。

本发明中相关的重组酶的实例是：

i)草酰辅酶A脱羧酶，例如具有下列序列之一的草酰辅酶A脱羧酶：

http://www.expasy.org/uniprot/P40149

UniProtKB/TrEMBL登录号为P40149

SEQ.ID 1

1 msnddnvelt dgfhvlidal kmndidtmyg vvgipitnla rmwqddgqrf ysfrheqhag

61 yaasiagyie gkpgvcltvs apgflngvts lahattncfp millsgsser eivdlqqgdy

121 eemdqmnvar phckasfrin sikdipigia ravrtavsgr pggvyvdlpa klfgqtisve

181 eankllfkpi dpapaqipae daiaraadli knakrpviml gkgaayaqcd deiralveet

241 gipflpmgma kgllpdnhpq saaatrafal aqcdvcvlig arlnwlmqhg kgktwgdelk

301 kyvqidiqan emdsnqpiaa pvvgdiksav sllrkalkga pkadaewtga lkakvdgnka

361 klagkmtaet psgmmnysns lgvvrdfmla npdislvneg analdntrmi vdmlkprkrl

421 dsgtwgvmgi gmgycvaaaa vtgkpviave gdsafgfsgm eleticrynl pvtviimnng

481 giykgneadp qpgvisctrl trgrydmmme afggkgyvan tpaelkaale eavasgkpcl

541 inamidpdag vesgriksln vvskvgkk

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝nucleotide&cmd＝search&term＝M77128&d optcmdl＝GenBank

GenBank登记号为M77128

SEQ ID 2

1 gagcaagatg agatgtcctt cctctgtggc aatcaggaat atattgacgg cacgtgtttt

61 ccctacttcc ggtgtgccag acatctccaa agatctcatg tggttttgga atccattttt

121 gccggtatcc cggctattcc ttacttttcc aaattgggtg taatgcaatg aatctatggt

181 ttttaatgct gtatggacaa ttttccggca gtgaaatttt cagatgcatt tcatttgtat

241 tcaggcggat ttgtttaaat tgacctgaat caatattgcc ggattgatct aggtcaatga

301 agtcaaattg acttatgtca atggtgccaa attgacctag gtcaacggga tttttaaagg

361 gtatgcggca tactcggaat tgacgttaaa caacgtttat caaaaccaac caaagaaagg

421 tattactcat gagtaacgac gacaatgtag agttgactga tggctttcat gttttgatcg

481 atgccctgaa aatgaatgac atcgatacca tgtatggtgt tgtcggcatt cctatc acga

541 acctggctcg tatgtggcaa gatgacggtc agcgttttta cagcttccgt cacgaacaac

601 acgcaggtta tgcagcttct atcgccggtt acatcgaagg aaaacctggc gtttgcttga

661 ccgtttccgc ccctggcttc ctgaacggcg tgacttccct ggctcatgca accaccaact

721 gcttcccaat gatcctgttg agcggttcca gtgaacgtga aatcgtcgat ttgcaacagg

781 gcgattacga agaaatggat cagatgaatg ttgcacgtcc acactgcaaa gcttctttcc

841 gtatcaacag catcaaagac attccaatcg gtatcgctcg tgcagttcgc accgctgtat

901 ccggacgtcc aggtggtgtt tacgttgact tgccagcaaa actgttcggt cagaccattt

961 ctgtagaaga agctaacaaa ctgctcttca aaccaatcga tccagctccg gcacagattc

1021 ctgctgaaga cgctatcgct cgcgctgctg acctgatcaa gaacgccaaa cgtccagtta

1081 tcatgctggg taaaggcgct gcatacgcac aatgcgacga cgaaatccgc gcactggttg

1141 aagaaaccgg catcccattc ctgccaatgg gtatggctaa aggcctgctg cctgacaacc

1201 atccacaatc cgctgctgca acccgtgctt tcgcactggc acagtgtgac gtttgcgtac

1261 tgatcggcgc tcgtctgaac tggctgatgc agcacggtaa aggcaaaacc tggggcgacg

1321 aactgaagaa atacgttcag atcgacatcc aggctaacga aatggacagc aaccagccta

1381 tcgctgcacc agttgttggt gacatcaagt ccgccgtttc cctgctccgc aaagcactga

1441 aaggcgctcc aaaagctgac gctgaatgga ccggcgctct gaaagccaaa gttgacggca

1501 acaaagccaa actggctggc aagatgactg ccgaaacccc atccggaatg atgaactact

1561 ccaattccct gggcgttgtt cgtgacttca tgctggcaaa tccggatatt tccctggtta

1621 acgaaggcgc taatgcactc gacaacactc gtatgattgt tgacatgctg aaaccacgca

1681 aacgtcttga ctccggtacc tggggtgtta tgggtattgg tatgggctac tgcgttgctg

1741 cagctgctgt taccggcaaa ccggttatcg ctgttgaagg cgatagcgca ttcggtttct

1801 ccggtatgga actggaaacc atctgccgtt acaacctgcc agttaccgtt atcatcatga

1861 acaatggtgg tatctataaa ggtaacgaag cagatccaca accaggcgtt atctcctgta

1921 cccgtctgac ccgtggtcgt tacgacatga tgatggaagc atttggcggt aaaggttatg

1981 ttgccaatac tccagcagaa ctgaaagctg ctctggaaga agctgttgct tccggcaaac

2041 catgcctgat caacgcgatg atcgatccag acgctggtgt cgaatctggc cgtatcaaga

2101 gcctgaacgt tgtaagtaaa gttggcaaga aataattagc ccaactttga tgaccggtta

2161 cgaccggtca cataaagtgt tcgaatgccc ttcaagttta cttgaagggc atttttttac

2221 cttgcagttt ataaacagga aaaattgaag tattcagagc ggaaaagcag atttaagcca

2281 cgagaaacat tcttttttat tgaaaattgc cataaacaca tttttaaagc tggctttttt

ii).例如具有下列序列的甲酰辅酶A转移酶：

http://www.expasy.or g/uniprot/O06644

UniProtKB/TrEMBL登录号为O06644

SEQ ID 3

1 mtkpldginv ldfthvqagp actqmmgflg anvikierrg sgdmtrgwlq dkpnvdslyf

61 tmfncnkrsi eldmktpegk elleqmikka dvmvenfgpg aldrmgftwe yiqelnprvi

121 lasvkgyaeg hanehlkvye nvaqcsggaa attgfwdgpp tvsgaalgds nsgmhlmigi

181 laalemrhkt grgqkvavam qdavlnlvri klrdqqrler tgilaeypqa qpnfafdrdg

241 nplsfdnits vprggnaggg gqpgwmlkck gwetdadsyv yftiaanmwp qicdmidkpe

301 wkddpayntf egrvdklmdi fsfietkfad kdkfevtewa aqygipcgpv msmkelahdp

361 slqkvgtvve vvdeirgnhl tvgapfkfsg fqpeitrapl lgehtdevlk elglddakik

421 elhakqvv

http://www.ncbi.nlm nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝nucleotide&cmd＝search&term＝U82167&do ptcmdl＝GenBank

GenBank登记号为U82167

SEQ ID 4

1 aagcttgctt cattttgaga tgttatgcga agtgttagca acccaagtta gtaccttcag

61 ccctttgggc gaagtttttc tttcttggca gttcctttcg gggaaacagc cacagagaat

121 aaaaaccaaa agttgtacca acgacaagga aatgagaaat tatgactaaa ccattagatg

181 gaattaatgt gcttgacttt acccacgtcc aggcaggtcc tgcctgtaca cagatgatgg

241 gtttcttggg cgcaaacgtc atcaagattg aaagacgtgg ttccggagat atgactcgtg

301 gatggctgca ggacaaacca aatgttgatt ccctgtattt cacgatgttc aactgtaaca

361 aacgttcgat tgaactggac atgaaaaccc cggaaggcaa agagcttctg gaacagatga

421 tcaagaaagc cgacgtcatg gtcgaaaact tcggaccagg cgcactggac cgtatgggct

481 ttacttggga atacattcag gaactgaatc cacgcgtcat tctggcttcc gttaaaggct

541 atgcagaagg ccacgccaac gaacacctga aagtttatga aaacgttgca cagtgttccg

601 gcggtgctgc agctaccacc ggtttctggg atggtcctcc aaccgtttcc ggcgctgctc

661 tgggtgactc caactccggt atgcacctga tgatcggtat tctggccgct ctggaaatgc

721 gtcacaaaac cggccgtggt cagaaagttg ccgtcgctat gcaggacgct gttctgaatc

781 tggttcgtat caaactgcgt gaccagcaac gtctggaaag aaccggcatt ctggctgaat

841 acccacaggc tcagcctaac tttgccttcg acagagacgg taacccactg tccttcgaca

901 acatcacttc cgttccacgt ggtggtaacg caggtggcgg cggccagcca ggctggatgc

961 tgaaatgtaa aggttgggaa accgatgcgg actcctacgt ttacttcacc atcgctgcaa

1021 acatgtggcc acagatctgc gacatgatcg acaagccaga atggaaagac gacccagcct

1081 acaacacatt cgaaggtcgt gttgacaagc tgatggacat cttctccttc atcgaaacca

1141 agttcgctga caaggacaaa ttcgaagtta ccgaatgggc tgcccagtac ggcattcctt

1201 gcggtccggt catgtccatg aaagaactgg ctcacgatcc ttccctgcag aaagttggta

1261 ccgtcgttga agttgtcgac gaaattcgtg gtaaccacct gaccgttggc gcaccgttca

1321 aattctccgg attccagccg gaaattaccc gtgctccgct gttgggcgaa cataccgacg

1381 aagttctgaa agaactgggt cttgacgatg ccaagatcaa ggaactgcat gcaaaacagg

1441 tagtttgatc cgtcagactt tctgggcaaa acggcactct ccggagtgcc gtttttttgt

1501 cacacgaaac cctaatcaaa caagcacgtg caatgattcc acatcattgc ggccacattc

1561 atccttcggg tcattactg

iii)草酸脱羧酶，例如具有下列序列的草酸脱羧酶：

http://www.expasy.org/uniprot/O34714

UniProtKB/TrEMBL登录号为O34714

SEQ ID 5

1 mkkqndipqp irgdkgatvk iprnierdrq npdmlvppet dhgtvsnmkf sfsdthnrle

61 kggyarevtv relpisenla svnmrlkpga irelhwhkea ewaymiygsa rvtivdekgr

121 sfiddvgegd lwyfpsglph siqaleegae fllvfddgsf senstfqltd wlahtpkevi

181 aanfgvtkee isnlpgkeky ifenqlpgsl kddivegpng evpypftyrl leqepieseg

241 gkvyiadstn fkvsktiasa lvtvepgamr elhwhpnthe wqyyisgkar mtvfasdgha

301 rtfnyqagdv gyvpfamghy venigdeplv fleifkddhy advslnqwla mlpetfvqah

361 ldlgkdftdv lskekhpvvk kkcsk

http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/dbfetch？db＝emblcds&id＝CAA11727

CoDing序列登记号为AJ223978

SEQ ID 6

1 atgaaaaaac aaaatgacat tccgcagcca attagaggag acaaaggagc aacggtaaaa

61 atcccgcgca atattgaaag agaccggcaa aaccctgata tgctcgttcc gcctgaaacc

121 gatcatggca ccgtcagcaa tatgaagttt tcattctctg atactcataa ccgattagaa

181 aaaggcggat atgcccggga agtgacagta cgtgaattgc cgatttcaga aaaccttgca

241 tccgtaaata tgcggctgaa gccaggcgcg attcgcgagc ttcactggca taaagaagct

301 gaatgggctt atatgattta cggaagtgca agagtcacaa ttgtagatga aaaagggcgc

361 agctttattg acgatgtagg tgaaggagac ctttggtact tcccgtcagg cctgccgcac

421 tccatccaag cgctggagga gggagctgag ttcctgctcg tgtttgacga tggatcattc

481 tctgaaaaca gcacgttcca gctgacagat tggctggccc acactccaaa agaagtcatt

541 gctgcgaact tcggcgtgac aaaagaagag atttccaatt tgcctggcaa agaaaaatat

601 atatttgaaa accaacttcc tggcagttta aaagatgata ttgtggaagg gccgaatggc

661 gaagtgcctt atccatttac ttaccgcctt cttgaacaag agccgatcga atctgaggga

721 ggaaaagtat acattgcaga ttcgacaaac ttcaaagtgt ctaaaaccat cgcatcagcg

781 ctcgtaacag tagaacccgg cgccatgaga gaactgcact ggcacccgaa tacccacgaa

841 tggcaatact acatctccgg taaagctaga atgaccgttt ttgcatctga cggccatgcc

901 agaacgttta attaccaagc cggtgatgtc ggatatgtac catttgcaat gggtcattac

961 gttgaaaaca tcggggatga accgcttgtc tttttagaaa tcttcaaaga cgaccattat

1021 gctgatgtat ctttaaacca atggcttgcc atgcttcctg aaacatttgt tcaagcgcac

1081 cttgacttgg gcaaagactt tactgatgtg ctttcaaaag aaaagcaccc agtagtgaaa

1141 aagaaatgca gtaaataa

和/或

iv)例如具有下列序列的草酸氧化酶：

http://www.expasy.org/uniprot/O24004

UniProtKB/TrEMBL登录号为O24004

SEQ ID 7

1 mgysknlgag lftmlllapa imatdpdplq dfcvadldgk avsvnghtck pmseagddfl

61 fsskltkagn tstpngsavt eldvaewpgt ntlgvsmnrv dfapggtnpp hihprateig

121 mvmkgellvg ilgsfdsgnk lysrvvrage tfviprglmh fqfnvgktea ymvvsfnsqn

181 pgivfvpltl fgsnppiptp vltkalrvea gvvellkskf aggs

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝nucleotide&cmd＝search&term＝Y14203&do ptcmdl＝GenBank

GenBank登记号为Y14203

SEQ ID 8

1 agcttagcag caaccaccag tagtgcctca aaggctcctg atcaacaaac tctagctcat

61 cagtggtagc taagcttgct acatagcaag caatgggtta ctctaaaaac ctaggggctg

121 gcctgttcac catgctgctc cttgctccgg ccatcatggc taccgaccct gaccctctac

181 aggacttctg cgtcgcggac ctcgatggca aggcggtctc ggtgaacggg catacgtgta

241 agcccatgtc ggaggccggc gacgacttcc tcttctcgtc caagctgacc aaggccggca

301 acacgtccac cccgaacggc tcggccgtga cggagctcga cgtggccgag tggcccggta

361 cgaacacgct gggcgtgtcc atgaaccgtg tggacttcgc gccgggcggc accaacccgc

421 cgcacatcca cccgcgtgca accgagatcg gcatggtgat gaaaggtgag ctcctcgttg

481 gaatcctcgg cagctttgac tccggaaaca agctctactc cagggtggtg cgtgccggag

541 agactttcgt catcccgcgc ggcctcatgc acttccagtt caacgttggt aagacggaag

601 cctacatggt tgtgtccttc aacagccaga accctggcat cgtcttcgtg ccgctcacac

661 tcttcggttc caacccgccc atccccacac cggtgctcac caaggctctt cgggtggagg

721 ccggggtcgt ggaacttctc aagtccaagt tcgccggtgg gtcttaactt ccatgagccc

781 caaatgatca atatgaatat gtaattctat atatccatgt atgctgcgaa tttaatagta

841 ctcgacagga gactatattc aagcttctgg ataagctcgc atttcatagt aataagattg

901 aataagttat cctagcggtt cagccttcag aaccaatgcg aggacttaaa atgtattgct

961 tcttattatt

编码草酸盐降解酶的DNA序列是本领域技术人员已知的并且在例如WO 98/16632中有描述，将其全文并入本文。

另外，根据本发明的组合物可以包含这样的酶，该酶含有修饰或突变，包括(但不限于)用含有减少草酸盐的酶的草酸盐降解活性位点的结构域形成的嵌合体，或肽片段，特别是包含活性位点或者由活性位点组成的那些肽片段；修饰或突变，包括(但不限于)用于增加活性缺失、插入、取代、反转、突变、用非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸，或本领域技术人员已知的其它修饰。这类经修饰的酶可以具有比天然酶更大、更小或与之相等的活性，或者可以具有与天然酶或未经修饰的酶相同或不同的特性。本发明考虑的方法和组合物包含减少草酸盐的酶的整个酶、片段、肽、结合区、活性位点或其它功能区、区段、序列以及启动子序列和控制序列。

在一个实例中，草酸脱羧酶进行了修饰。总共，从初始的yvrk基因序列(野生型yvrk)产生了7个基因。初始基因来自枯草芽孢杆菌，该基因序列用GenScript公司(Piscataway，NJ)的算法进行了优化用于在大肠杆菌中表达。针对密码子使用、平衡GC含量、去除重复元件以及确保不含用于克隆的内部限制性位点，对该基因进行了优化。密码子优化的基因产生了具有与野生型yvrk相同的氨基酸序列的蛋白质。

然后，对野生型yvrk基因和优化的yvrk基因两者的单个半胱氨酸密码子进行修饰，产生了6个另外的独特的基因序列。半胱氨酸密码子被修饰成了丝氨酸、精氨酸或丙氨酸密码子。进行该修饰的目的是为了除去二硫键并修饰酶的二级结构和三级结构。

可以用相同的方法使野生型yvrk基因的基因序列优化以用于另外的表达系统，例如毕赤酵母属(Pichia)或酵母菌属(Saccharomyces)。而且，在芽孢杆菌表达系统中的表达可以通过优化基因的最佳密码子使用和GC含量以及去除重复元件来改良。密码子优化还可用于在不同于已修饰的半胱氨酸密码子的位置处(或者除了半胱氨酸修饰外)修饰蛋白质的二级结构，例如作为提高聚乙二醇化、微球结合或胶囊化的方法，或作为提高在低pH时的pH稳定性的方法，或作为提高蛋白质的活性的方法。

SEQ ID 9

原始yvrk序列，半胱氨酸密码子用粗体标出。

AAAAAACAAAATGACATTCCGCAGCCAATTAGAGGAGACAAAGGAGCAACGGTAAAAATC

CCGCGCAATATTGAAAGAGACCGGCAAAACCCTGATATGCTCGTTCCGCCTGAAACCGAT

CATGGCACCGTCAGCAATATGAAGTTTTCATTCTCTGATACTCATAACCGATTAGAAAAA

GGCGGATATGCCCGGGAAGTGACAGTACGTGAATTGCCGATTTCAGAAAACCTTGCATCC

GTAAATATGCGGCTGAAGCCAGGCGCGATTCGCGAGCTTCACTGGCATAAAGAAGCTGAA

TGGGCTTATATGATTTACGGAAGTGCAAGAGTCACAATTGTAGATGAAAAAGGGCGCAGC

TTTATTGACGATGTAGGTGAAGGAGACCTTTGGTACTTCCCGTCAGGCCTGCCGCACTCC

ATCCAAGCGCTGGAGGAGGGAGCTGAGTTCCTGCTCGTGTTTGACGATGGATCATTCTCT

GAAAACAGCACGTTCCAGCTGACAGATTGGCTGGCCCACACTCCAAAAGAAGTCATTGCT

GCGAACTTCGGCGTGACAAAAGAAGAGATTTCCAATTTGCCTGGCAAAGAAAAATATATA

TTTGAAAACCAACTTCCTGGCAGTTTAAAAGATGATATTGTGGAAGGGCCGAATGGCGAA

GTGCCTTATCCATTTACTTACCGCCTTCTTGAACAAGAGCCGATCGAATCTGAGGGAGGA

AAAGTATACATTGCAGATTCGACAAACTTCAAAGTGTCTAAAACCATCGCATCAGCGCTC

GTAACAGTAGAACCCGGCGCCATGAGAGAACTGCACTGGCACCCGAATACCCACGAATGG

CAATACTACATCTCCGGTAAAGCTAGAATGACCGTTTTTGCATCTGACGGCCATGCCAGA

ACGTTTAATTACCAAGCCGGTGATGTCGGATATGTACCATTTGCAATGGGTCATTACGTT

GAAAACATCGGGGATGAACCGCTTGTCTTTTTAGAAATCTTCAAAGACGACCATTATGCT

GATGTATCTTTAAACCAATGGCTTGCCATGCTTCCTGAAACATTTGTTCAAGCGCACCTT

GACTTGGGCAAAGACTTTACTGATGTGCTTTCAAAAGAAAAGCACCCAGTAGTGAAAAAG

AAATGCAGTAAA

针对大肠杆菌优化了Yvrk基因序列，在5′末端和3′末端具有限制性位点(下划线标出)，并且半胱氨酸密码子用粗体标出。

SEQ ID 10

CATATGAAAAAACAGAATGACATTCCACAGCCGATTCGCGGCGATAAAGGCGCGACCGTC

AAAATTCCTCGCAATATCGAACGCGACCGCCAGAATCCGGATATGCTGGTGCCGCCGGAG

ACGGACCATGGCACGGTGTCTAACATGAAATTCTCTTTTAGCGATACCCACAACCGCCTG

GAAAAAGGTGGCTACGCGCGCGAGGTTACCGTCCGTGAACTGCCAATTAGCGAAAATCTG

GCTTCGGTTAACATGCGTCTGAAACCAGGTGCTATCCGTGAGCTGCACTGGCACAAGGAA

GCGGAATGGGCGTATATGATTTACGGTTCAGCACGTGTTACCATCGTAGACGAGAAAGGT

CGTAGCTTTATCGATGATGTTGGCGAAGGTGATCTGTGGTATTTCCCATCTGGCCTGCCG

CATTCGATTCAGGCGCTGGAAGAAGGCGCTGAATTTCTGCTGGTGTTCGATGATGGTTCC

TTTTCTGAAAACAGCACGTTCCAGCTGACGGATTGGCTGGCGCACACGCCGAAAGAAGTC

ATTGCGGCCAATTTTGGGGTAACCAAAGAAGAAATTTCCAACCTGCCGGGCAAAGAAAAG

TATATTTTTGAGAATCAGCTGCCGGGCTCTCTGAAGGACGATATTGTAGAAGGCCCTAAC

GGTGAGGTGCCGTATCCGTTCACCTATCGTCTGCTGGAGCAGGAACCGATTGAAAGCGAA

GGCGGTAAAGTTTATATCGCAGATTCCACTAACTTTAAAGTCTCCAAGACCATTGCCAGC

GCCCTGGTCACCGTGGAACCGGGAGCGATGCGCGAGCTGCACTGGCATCCGAACACGCAC

GAATGGCAGTATTATATTTCCGGCAAAGCACGCATGACCGTTTTTGCCTCAGATGGACAC

GCTCGCACGTTTAATTATCAAGCGGGTGATGTTGGCTACGTTCCTTTCGCCATGGGCCAT

TATGTAGAAAATATCGGCGATGAACCACTGGTGTTTCTGGAGATCTTTAAAGATGACCAC

TATGCCGATGTTTCACTGAATCAGTGGCTGGCCATGCTGCCGGAAACTTTTGTTCAGGCG

CATCTGGACCTGGGTAAAGACTTTACGGATGTGCTGAGCAAAGAAAAACACCCGGTAGTC

AAGAAGAAATGCAGTAAAGGATCC

草酸盐降解酶通常以足以基本降解通常存在于标准膳食中的所有草酸盐的量存在于本发明的组合物中。取决于对食物的选择，平均西方饮食可以含有100至300mg草酸盐/天。一般而言，约0.2g含有酶的颗粒(相当于1mL颗粒悬浮液中的20mg OxDc)可以在模拟胃液条件下30分钟内除去180mg草酸盐。

有效量包括将减少一部分存在的草酸盐的减少草酸盐的酶活性的活性单位的量，或与施用组合物之前存在的草酸盐的量比较，将促使个体中的草酸盐量减少或者维持减少量的草酸盐的减少草酸盐的酶活性的活性单位的水平。可用于单剂量组合物中的减少草酸盐的酶活性的活性单位的数量范围可以是约0.0001单位至约5,000单位、约5单位至100单位、0.05单位至50单位、0.5单位至500单位、约0.01单位至约50单位、约0.01单位至约5单位、约1单位至约100单位、约25单位至约50单位、约30单位至约100单位、约40单位至约120单位、约60单位至约15单位约50单位至约100单位、约100单位至约500单位、约100单位至约300单位、约100单位至约400单位、约100单位至约5,000单位、约1,000单位至约5,000单位、约2,500单位至约5,000单位、约0.001单位至约2,000单位以及其中涵盖的所有范围。一个酶单位是在37℃下每分钟降解一微摩尔草酸盐的酶的量。

本发明的组合物包含颗粒，该颗粒含有包埋于第一聚合材料中的草酸盐降解酶。在本文的非限制性实施例中，描述了如何将所述酶包埋于第一聚合材料中的方法。本领域中的技术人员可找到适用于制备根据本发明的组合物的其它方法。通过将酶掺入第一聚合材料中，所述酶得到了某种保护来对抗在pH和胃蛋白酶方面与胃液相似的条件。所得的包埋的酶组合物表现为颗粒，即微米或纳米尺寸的离散单元。因此，术语“颗粒”、“微粒”和“纳米粒”在本文中用于描述含有包埋于第一聚合物或第一聚合物和第二聚合物中的一种或多种减少草酸盐的酶的组合物。一般而言，术语“颗粒”作为最广泛的术语使用，即没有任何具体的粒度或形状属性，而术语“微粒”是在所得颗粒的平均粒度范围是1μm至1000μm时使用。同样，术语“纳米粒”是在所得颗粒的平均粒度范围是1nm至1000nm时在本文中使用。如本文使用的，单数的术语“酶”指多个拷贝的酶分子，如通常对蛋白质分子所理解的那样。如本文使用的，术语“一种或多种酶”表示可存在一种类型的酶，例如甲酰辅酶A转移酶是期望的，或者多种类型的酶，例如包含(例如)草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶；草酸脱羧酶和草酸氧化酶的组合物，或者野生型酶和突变型酶的组合可存在于组合物中。

通常，本发明的组合物颗粒的平均直径是约50nm至约1mm，例如约500nm至约500μm、约1μm至约500μm、约2μm至约100μm、约4μm至约80μm、约6μm至约60μm、约8μm至约40μm、约10μm至约20μm。

如本文使用的，术语“包埋的”旨在表示酶以如下方式与第一聚合材料混合或接触：

i)第一聚合材料基本包被了酶，即颗粒可以认为是被第一聚合材料包围的含酶的核；该核可以包含所述酶以外的其它物质，例如也是一部分聚合材料，或者

ii)将酶以这样一种方式掺入第一聚合材料中，该方式使得颗粒表面的主要部分是由第一聚合材料组成，但是较小部分的酶也可出现在颗粒表面上。一般来说，考虑颗粒的至少50％的外表面是由第一聚合材料组成并且至多约20重量％的存在于颗粒中的酶可以存在于颗粒的外表面上，和/或

iii)所述酶基本上均匀分布于第一聚合材料中。

因而，在本发明的组合物中，草酸盐降解酶受到保护而免受(胃)环境损害。此外，本发明的组合物基本上不会将酶释放进(胃)环境中。换而言之，在经口施用后，酶在足以能够使胃中的草酸盐降解的时间内保留在组合物中。在组合物中，第一聚合材料可以作为酶的保护载体起作用并且同时可以允许底物，即草酸盐，扩散进组合物中或者以别的方式运输进组合物中，以使得能原位降解草酸盐。本发明组合物的一个特征是，与未包埋于聚合基质中的酶所观察到的结果相比，该组合物能更长时间维持酶活性(特别是在酸性条件下)。因此，本发明的一个方面包括组合物，该组合物包含颗粒，该颗粒包含一种或多种包埋于第一聚合材料中的草酸盐降解酶，其中在37℃下于美国药典模拟胃液中孵育至少60分钟时，所述包埋的酶保留的活性是来自同一批次的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少两倍，所述美国药典模拟胃液含有pH＞1(如pH约1至pH约5的范围，例如pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶。重要的是，用于根据本发明的组合物和游离酶的测试条件是相同的，例如酶的性质和纯度、酶的起始浓度、测试体积、孵育介质(例如模拟胃液或流体)的组成、温度等都相同。

通常，在37℃下于美国药典模拟胃液中孵育至少30分钟，至少45分钟，至少60分钟，至少75分钟，至少90分钟，至少105分钟或至少120分钟时，包埋的酶保留的活性是获自同一批次的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少三倍，至少四倍或至少五倍，所述美国药典模拟胃液包含pH＞1(例如pH的范围是pH约1至pH约5、pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶。

在一个具体的实施方案中，在37℃下于pH＞1(例如pH的范围是pH约1至pH约5，pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，、pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟时，本发明组合物中的一种或多种包埋的草酸盐降解酶保留的活性是获自同一批次的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少两倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。

上面提及的模拟胃液(胃流体)在美国药典中描述并且含有胃蛋白酶以及具有特定比例的浓盐酸。1L体积的美国药典模拟胃液含有2NaCl、3.2g胃蛋白酶和7mL浓盐酸。该溶液的pH的范围通常是1.2-1.5，这取决于使用的HCl的浓度。在本文的一些实例中，pH被调节至2以上。在采用无任何包衣的微粒时，可以是这种情况。为本发明目的，pH应该在酸性范围内，即至多约7，至多为6并且pH范围应该通常是约1至约5，约2至约5。在本文的实验部分是有关上述测试和酶活性测定的更多细节。

在人胃中的滞留时间平均是约120分钟。期望本发明组合物的酶活性在120分钟或更长的时间内保持在足够的水平、有效的水平上。从本文的实施例发现，根据本发明的组合物在暴露于酸性环境中120分钟后，有可能保留至少50％的酶活性。如果所使用的酶未包埋于聚合物中(如未包埋的酶)，则在酸性环境中活性下降非常迅速，并且60分钟后活性丧失。

通常，当在含水缓冲溶液中孵育约60分钟，约90分钟，约105分钟或约120分钟，并且初始活性被设置为100％时，根据本发明的组合物中的一种或多种草酸盐降解酶的活性至多降低至约30％，至多降低至40％例如至多降低至约50％，至多降低至约60％或至多降低至约70％，所述的含水缓冲液的pH的范围是约1.0至约5，约1.0至约4.5，约1.5至约4.5，约2.0至约4.0或约2.2至约4.0。

在特定的实施方案中，当在约2.0至约4.0的pH下试验60分钟时，本发明组合物中的草酸盐降解酶的活性至多降低至80％，初始活性被设置为100％。

在另外的具体实施方案中，当在pH范围为约2至约4.5的含水缓冲溶液中孵育2小时时，并且初始活性被设置为100％，本发明组合物中的一种或多种草酸盐降解酶的活性至多降低至约20％。值得注意的是，活性至多降低至30％，并且初始活性被设置为100％。

用于提供具有特定pH的缓冲液的合适缓冲物质是本领域技术人员已知的。实例是甘氨酸缓冲液(pH 2-3)、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等。缓冲液可以包含另外的成分，例如无机盐以便调节该缓冲液的离子强度，或者可包含一种或多种蛋白酶(如胃蛋白酶)以便确保缓冲液中的条件能测试出是否包埋的酶可以经受住这样苛刻的条件。如果包含一种或多种蛋白酶，则它的浓度通常与美国药典模拟胃液中使用的水平相同。

如本文先前提及的，草酸盐降解酶可以具有多种类别、类型、特征和性质。在一个优选的方面，本发明的组合物包含一种或多种草酸盐降解酶，所述酶包括草酸脱羧酶、草酸氧化酶或草酰辅酶A脱羧酶和甲酰辅酶A转移酶的组合，或者它们的组合。

用作本发明组合物中的第一聚合材料的合适的聚合材料包括(但不限于)人造聚合物或天然聚合物，包括(但不限于)：i)多糖：藻酸盐(alginate)包括藻酸、藻酸盐或酯(例如藻酸钠、藻酸钾、藻酸铵、藻酸钙、丙-1，2-二醇藻酸酯)、阿拉伯胶、角叉菜胶、壳聚糖及其衍生物、硫酸软骨素、葡聚糖衍生物、肝素、透明质酸、菊粉、纤维素或纤维素衍生物(包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基甲基纤维素等)等等，或其它们的组合；ii)粘多糖；iii)树胶，包括豆角胶、瓜尔胶、黄芪胶、琼脂、阿拉伯胶、黄原胶、刺梧桐树胶、他拉胶、胶凝糖胶等或其组合；iv)胶凝剂或溶胀剂，包括水胶体和水胶凝剂例如琼脂、角叉菜胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等或其组合；v)其它材料，例如蛋白质和聚酰胺：胶原蛋白、白蛋白、精蛋白、精胺；合成聚合物：聚(丙烯酸)、多聚氨基酸(多聚赖氨酸等)、聚磷酸、三聚磷酸盐、聚(L-乳酸)、聚(乙烯醇)、聚(DL-乳酸共乙醇酸)或它们的混合物和组合。

在具体的实施方案中，第一聚合材料是壳聚糖、藻酸盐、果胶或透明质酸。在更具体的实施方案中，第一聚合材料是壳聚糖或藻酸盐。

其它聚合材料可以是生物聚合物或合成聚合物。生物聚合物的实例包括(但不限于)蛋白质、多糖、粘多糖、肝素、硫酸肝素、类肝素、硫酸皮肤素、戊聚糖聚硫酸酯、硫酸软骨素、纤维素、琼脂糖、甲壳质、角叉菜胶、亚油酸，以及尿囊素、交联胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、交联弹性蛋白、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖藻酸盐、葡聚糖、甲基纤维素、多聚赖氨酸和天然橡胶。在形成聚合基质的本发明组合物中，这些基质是多孔的，这样小的水溶性分子可以进出该聚合基质，所述分子包括(但不限于)例如草酸盐、甲酸、甲酸盐、二氧化碳、氧或草酰辅酶A。在本发明组合物中第一聚合材料的浓度范围通常是总干物质的20％至70％。

除了一种或多种酶和第一聚合材料之外，颗粒也可以包含一种或多种添加剂，例如pH调节剂、缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、酶的辅因子或一种或多种可药用赋形剂，例如填充剂、稀释剂、载体等。

此外，当生理条件导致pH大大高于合理的酶工作范围时，在蛋白质周围产生局部的酸性pH环境是有利的。例如，在较高pH的区域，在pH 3具有最大活性的草酸盐降解蛋白质将受益于能够将酶附近的局部pH降低至约3的递送载体。

一种用于降低局部pH的方法是掺入可在生理条件下经历水解降解而产生降低局部pH的酸性产物的聚合物。例如，α聚酯(例如PLA、PGA和PLGA)通过体内水解生物降解形成有机酸(乳酸和乙醇酸)，所述有机酸可以将pH局部降低至酶在功能上合乎需要的范围内。聚(dl-丙交酯)(DLPLA)是表现出乳酸的两种同分异构形式的随机分布的无定形聚合物，其能迅速降解。

另外，期望递送载体中包含碱形式、含有碱或产生碱的物质形式的缓冲液，所述缓冲液与体内的pH或局部pH或两者的组合共同作用以优化/控制酶周围的局部pH。这些缓冲液可包含有机化合物或无机化合物的盐或许多其它缓冲液。应该理解，与缓冲物质相关/产生缓冲物质的共轭酸的pKa可用于适当地选择缓冲物质。

可以使颗粒接受交联程序。这种交程序可以加强颗粒的性质，例如用于避免在存储过程中或在经口施用后由环境中的pH或胃蛋白酶的负面影响引起的酶活性丧失，或者用于减少酶从颗粒中释放，或用以减少或防止酶迁移至颗粒表面。本文描述了交联程序和在该程序中使用的合适材料。

本发明的颗粒可以由通过物理或化学交联而发生交联的聚合物构建。物理交联可以包括带相反电荷的聚合物通过盐键彼此交联(例如，带正电荷的壳聚糖与作为带负电荷聚合物的三聚磷酸盐或肝素交联)、带电荷的聚合物与带相反电荷的离子交联(例如：藻酸盐与Ca²⁺交联、羧甲基纤维素与Al³⁺交联)。在本发明中使用的术语“物理交联”还包括非共价结合和/或相互作用。

化学交联通常包括通过具有两个活性官能团的交联剂进行的交联，例如通过具有胺基团的聚合物进行的交联，例如蛋白质、聚酰胺、壳聚糖及其衍生物进行的交联，可以通过戊二醛或京尼平交联。可以使用UV辐射来诱导具有光敏基团的聚合物形成共价交联。

用于制备纳米粒和微粒的方法是本领域已知的并且包括乳化法、凝聚/沉淀法、喷雾干燥技术等。纳米粒或微粒的性质(例如：微环境缓冲能力、机械强度、粒度、草酸盐扩散速率、与酶相互作用)很大程度上取决于所选择的聚合物、聚合物组分和比率、交联方法和制备工艺。可以将多于一种类型的交联应用于本发明的微粒(例如化学交联以及物理交联，参见本文的实施例)。

在一个具体的实施方案中，第一聚合材料自身交联和/或与一种或多种包埋于第一聚合材料中的酶交联。

在本发明的组合物中，例如其中第一聚合材料自身交联和/或与包埋在其中的酶交联的组合物中，在37℃下在84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶，pH＞1(例如范围是pH约1至pH约5、pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5如pH约3)中孵育至少30分钟、至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，与包埋在聚合物(但该聚合物未交联或者酶和聚合物未交联)中的同一批次酶的组合物比较或者与同一批次的游离酶比较，保留的酶活性水平增加了至少2倍，至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

也可以为颗粒，任选其中至少一部分第一聚合材料交联了的颗粒提供包衣。这样一种包衣通常具有与第一聚合物相同的功能，即用于避免包埋于第一聚合物中的酶的酶活性在存储过程中和/或在经口施用后大量减降。

因此，在一个具体的实施方案中，将颗粒用第二聚合材料包被。合适的包衣材料是这类材料，该材料允许含有草酸盐的含水组合物扩散进入(或以别的方式进入)本发明颗粒中的材料。如上面提及的，底物(即含草酸盐的介质)进入本发明的颗粒组合物中，使得可以发生草酸盐的酶促降解。因而，可以采用产生扩散包衣或其它可渗透包衣(例如，含有基本上是水溶性的成孔物质的包衣)的包衣材料。

合适的包衣材料的实例包括(但不限于)考虑作为第一聚合材料的材料。可以选择不同于用作第一聚合材料的包衣材料，但是第一聚合材料和包衣材料也可以是相同的。包衣材料的具体实例是成膜剂例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、聚葡萄糖、麦芽糖糊精或其它多糖(包括壳聚糖、藻酸盐和透明质酸)。在一个具体的实施方案中，包衣材料(如果存在的话)是可以接受交联的包衣材料，例如壳聚糖和藻酸盐。

在一个具体的实施方案中，第一聚合材料和/或第二聚合材料是多糖，例如壳聚糖、藻酸盐、果胶或透明质酸。第一聚合材料和第二聚合材料可以相同或不同。

通常，第一聚合物材料和第二聚合物材料(如果存在的话)的聚合物百分比是总干颗粒材料的约10％至约80％，约60％至约80％。

如果存在的话，包衣材料通常以这样的量应用，该量使颗粒的重量增加至多约40％。如在本文实施例中所观察到的，颗粒组合物中的包衣材料的浓度通常至多为25％w/w，例如至多约20％w/w，至多约15％w/w或至多约10％。具有包衣的颗粒在本文中称作被包被的组合物。

在本发明的组合物中，例如在本发明被包被的组合物中，在37℃下于pH＞1(例如范围是pH约1至pH约5，pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，与包埋于无包衣的颗粒中的同一批次酶的组合物比较，或者与同一批次的游离酶比较，保留的酶活性水平增加了至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。

如上提及且如本文实施例中显示的，本发明组合物中草酸盐降解酶的酶活性的稳定性可以通过采用带包被的颗粒来提高，其中包衣已经接受了交联。聚合材料的交联是本领域所熟知的，并且可以通过物理交联或者通过利用化学交联剂来完成。

用于本发明的合适的化学交联剂包括(但不限于)二醛、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)或(N-[对马来酰亚氨基苯基]异氰酸酯(PMPI)。在一个具体的实施方案中，交联剂是二醛，特别是戊二醛或乙二醛。在一个实施方案中，交联剂是戊二醛。交联通常是在37℃下于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中的1-5％戊二醛中摇动进行1-2小时。

如上提及的，本发明组合物的一个特征是，第一聚合材料和第二聚合材料(如果存在的话)是小分子可渗透的，以允许由一种或多种酶催化的反应的底物和产物扩散通过所述聚合材料。此外，在37℃，在pH＞1，例如范围是pH约1至pH约5、pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，第一聚合材料和/或第二聚合材料能基本上保持完整。

在另一个实施方案中，第一聚合材料和/或第二聚合材料自身交联和/或互相交联和/或与一种或多种酶交联。

在本发明的组合物中，例如在本发明的被包被或被包被且交联了的包衣组合物中，在37℃下于pH＞1例如范围是pH约1至pH约5，pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，与包埋于颗粒中(但其中颗粒没有第二层聚合材料(包衣)或没有交联的第二层)的同一批次酶的组合物比较，或者与同一批次的游离酶比较，保留的酶活性水平增加了至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。

如在本文实施例中所观察到的，其中化学交联剂和一种或多种酶和/或第一聚合材料和/或第二聚合材料之间的键已经由还原剂还原的本发明组合物可导致在保留组合物的酶活性方面的进一步改善。这样的还原剂可以是本领域中熟知的还原剂，例如诸如NaBH₄或NaCNBH₃之类的还原剂。

在本发明的组合物中，特别是在被包被的、具有交联包衣和还原了交联物的本发明的组合物中(其中第一聚合材料和/或第二聚合材料可以被交联并且这种交联的物质可以或可以不被还原)，在37℃下于pH＞1例如范围是pH约1至pH约5，pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，与尚未经受还原剂的颗粒中的同一批次酶的组合物比较，或者与同一批次的游离酶比较，保留的酶活性水平增加了至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。

在本发明的一个具体的实施方案中，在37℃下于pH＞1例如范围是pH约1至pH约5，pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，一种或多种包埋的酶保留的活性是获自同一批次酶的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少2倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。

在本发明的另一个具体的实施方案中，在37℃下于pH＞1例如范围是pH约1至pH约5，pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，一种或多种包埋的酶保留的活性是该包埋的酶的初始活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。

在本发明的另外的具体的实施方案中，在37℃，在pH＞1，例如范围是pH约1至pH约5、pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，一种或多种酶保留的活性是该包埋的酶¹的初始活性的约95％至约100％。

包埋于本发明颗粒中的酶能够降低食物的草酸盐含量。如在本文的实施例中证实的，含有20毫克所述一种或多种草酸盐降解酶的本发明组合物在pH＝2.5时在1小时内降解200克菠菜中存在的草酸盐的至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少95％或至少99％。

本发明的组合物可以通过采用多种聚合材料制备。在本文的实施例中使用了下列符号：

OxDc XX纳米粒(例如壳聚糖纳米粒)表示其中将壳聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料的纳米粒。

YY包被的OxDc XX微粒(例如藻酸盐包被的OxDc壳聚糖纳米粒)表示这样一种纳米粒：在所述纳米粒中，将壳聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料并且将该纳米粒用藻酸盐包被。

ZZ交联的YY包被的OxDc XX微粒(例如戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖微粒)表示这样一种微粒，在所述微粒中，将壳聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料并且将纳米粒用藻酸盐包被以形成微粒，并且随后将该微粒与戊二醛交联。

还原的ZZ交联的YY包被的OxDc XX微粒(例如还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖微粒)表示这样一种微粒，在所述微粒中，将壳聚糖用作包埋了OxDc的第一聚合材料并且将形成的纳米粒用藻酸盐包被而形成微粒，然后将该微粒与戊二醛交联并让其接受到还原。

因此，

OxDc壳聚糖/TPP纳米粒是由壳聚糖制成的纳米粒，所述壳聚糖包含TPP并且在其中包埋了OxDC。

藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒是基于由壳聚糖和TPP及包埋的OxDc形成的纳米粒的微粒，该纳米粒用藻酸盐包被而形成微

¹ 这里想说明什么？所述酶活性(尽管这些是在颗粒中)与游离酶活性之间的比较？包埋的酶与游离酶之间的稳定性比较。

粒。

戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒对应于上面提及的微粒，但是该微粒已经接受了戊二醛处理而建立交联。

还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒对应于进一步接受了还原处理的上面提及的微粒。

本发明的组合物适用于经口施用给受试者。将组合物作为口服药物制剂提供，其可以在摄入食物前或在摄入食物后立即，以缓释液体剂、口或胃中的快速释放片剂(涂覆在食道上)、伴随食物的液体或固体形式递送至口腔、口(颊贴剂)、胃(附在胃粘膜上)。

施用的组合物通常是固体形式，如以颗粒形式或以固体剂型，例如小药袋剂、胶囊剂或片剂形式(例如将颗粒剂可通过本领域技术人员熟知的方法进一步加工成合适的剂型)。为此，可以加入合适的可药用赋形剂，例如填充剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、调味剂、pH调节剂、稳定剂等。而且，可以加入一种或多种其它治疗和/或预防性物质和/或其它酶、辅因子、底物、辅酶、矿物质和有助于减少草酸盐的其它物质。

合适的可药用赋形剂的实例包括：糊精、麦芽糖糊精、右旋糖、果糖、葡萄糖、乳糖、纤维素衍生物(包括羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、微晶纤维素(例如多种等级的

))、淀粉或改性淀粉(例如马铃薯淀粉、玉米淀粉、米淀粉、预胶化淀粉)、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸钠、交联羧甲基纤维素钠、磷酸氢钙、磷酸钙(例如碱性磷酸钙、磷酸氢钙)、硫酸钙、羧烷基纤维素、葡萄糖结合剂、磷酸氢钙、明胶、阿拉伯胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙二醇、聚氧化乙烯、以及润滑剂：滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、氢化植物油等。

本发明的方法包括通过施用有效量的减少草酸盐的组合物来治疗或预防人和动物中的草酸盐相关疾病，所述组合物包含本文教导的颗粒组合物中的一种或多种减少草酸盐的微生物、一种或多种减少草酸盐的酶或它们的组合和混合物。方法包括提供含有本文教导的包埋了酶的颗粒的组合物给受试者、人或动物，并减少存在于受试者中的草酸盐，治疗或预防草酸盐相关疾病和/或减少一部分摄入的草酸盐。用于减少人或动物中的草酸盐的方法包括施用有效量的组合物给受试者、人或动物，并减少存在的草酸盐，所述组合物包含本发明包埋了酶的颗粒组合物中具有草酸盐减少活性的一种或多种减少草酸盐的酶或片段。减少可以在受试者的任何组织或体液环境中发生。体液包括身体的分泌物如鼻分泌物或胃分泌物、唾液、血液、血清、尿液、食糜或消化物、组织液和人或动物产生的其它流体或半固体物质。例如，可以将包埋了酶的颗粒组合物经口施用给人或动物并且减少草酸盐的酶活性可减少人或动物胃中存在的草酸盐。可以将本发明的包埋了酶的颗粒组合物混合进液体、食物或其它膳食原料中并将其提供给人或动物，使得颗粒的减少草酸盐的酶活性在胃环境中是有效的。本发明的包埋了酶的颗粒组合物也可以与其中发现有草酸盐的食品或其它物质混合，并且该颗粒的减少草酸盐的酶活性减少了存在于该食品或其它物质中的草酸盐。

用于治疗和预防草酸盐相关疾病的方法包括施用包含颗粒的组合物，该颗粒包含有效量的减少草酸盐的酶。有效量包括将减少一部分存在的草酸盐的减少草酸盐的酶活性的活性单位的量，或与施用组合物之前存在的草酸盐的量比较，将起始个体中的草酸盐量减少或者维持降低量的草酸盐的减少草酸盐的酶活性的活性单位的水平。可以在单剂量组合物中使用的减少草酸盐的酶活性的活性单位的数量的范围可以是约0.0001单位至约5,000单位、约5单位至100单位、0.05单位至50单位、0.5单位至500单位、约0.01单位至约50单位、约0.01单位至约5单位、约1单位至约100单位、约25单位至约50单位、约30单位至约100单位、约40单位至约120单位、约60单位至约15约50单位至约100单位、约100单位至约500单位、约100单位至约300单位、约100单位至约400单位、约100单位至约5,000单位、约1,000单位至约5,000单位、约2,500单位至约5,000单位、约0.001单位至约2,000单位以及其中涵盖的所有范围。组合物可以另外包含其它酶、辅因子、底物、辅酶、矿物质和有助于减少草酸盐的其它物质。一个酶单位是将在37℃下每分钟降解一微摩尔草酸盐的酶的量。

在治疗方法中，将有效量的如本文教导的颗粒组合物经口施用给受试者，让受试者每天摄入至少1次，每天至少2次，每天至少3次，每天至少4或更多次(如果需要的话)，并且这样的施用可以进行1天、2天、3天、4天、5天或1周、2周、3周或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、超过6个月、1年、2年或多年或者在患者的一生中持续施用。可以持续这样的治疗来在受试者中维持想要的草酸盐水平。

必需注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“a，一个”、“一种，an”和“该，the”包括复数指代，除非上下文另外清楚明确地指明。

本文所包括的所有专利、专利申请和参考文献特别以引用的方式全文并入本文。

当然，应该理解的是，上述内容只涉及本发明的示例性实施方案并且在这里可以进行多种修改或改变而不会背离如在本公开内容中所阐明的本发明的精神和范围。

附图说明

图1是显示在具有胃蛋白酶pH 3下微粒I(在pH 3.9制备)和微粒II(在pH 8制备)中OxDc的稳定性的图。

图2是显示在具有胃蛋白酶pH 3时，用于形成藻酸盐微粒的藻酸盐浓度对壳聚糖包被的OxDc藻酸盐微粒中OxDc稳定性的影响的图。

图3是显示根据本文实施例2制备的颗粒的粒度分布的图。图3.体积统计(Arithmetic)17795s3_07_01.$1s，从0.040μm至2000μm进行计算。体积：100％；平均值：48.53μm；中值：29.10μm；平均值/中值比率：1.668；众数：28.70μm；S.D.：65.43μm；CV：135％；偏度：4.384右偏斜；峰度：26.90；尖顶峰度：d₁₀ 8.814μm；d₅₀ 29.10μm；d₉₀ 109.9μm。

图4是显示在具有胃蛋白酶pH 3时，用藻酸盐或角叉菜胶包被对壳聚糖/TPP纳米粒中OxDC稳定性的影响的图。

图5是显示在具有胃蛋白酶pH 2.4的情况下时，用于交联的戊二醛浓度对戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒中OxDc稳定性的影响的图。

图6是显示在pH 2.2和pH 1.85下，两种交联并还原的微粒中OxDc的稳定性的图。

图7是显示在施用本发明组合物后草酸盐(可溶性部分)的生物利用度的图。

图8是说明在三种不同的模拟条件下，微粒除去的菠菜中总可溶性草酸盐的时间过程的图。

图9是显示在pH 2.4并存在胃蛋白酶时，在壳聚糖微粒中用戊二醛(1-5％)交联的影响的图。

图10是说明在不同的pH下并存在胃蛋白酶时，戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TTP微粒中的希夫碱的还原的图。

图11A和图11B是显示在pH 3时，由还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒除去的草酸盐的图。

图12A是显示在施用本发明组合物后草酸盐(可溶性部分)的生物利用度的图；图12B是说明除去的总草酸盐的百分比的图。

具体实施方案

尽管在这里提供了本发明的示例性实施方案，但是本发明不受限于这些实施方案。存在本领域技术人员理解的许多修饰或改变。

通过本文包含的实施例来进一步说明本发明，提供所述实施例以便理解清楚。示例性的实施方案不应该以任何方式解释为限定它们的范围。相反，应该清楚地了解，可以采用其它实施方案、修改形式和其等价方案，在阅读了这里的说明书后，本领域技术人员将理解它们而不会背离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围。

实施例

方法

酶活性测定法

将样品用Tris缓冲液适当地稀释(通常5或10倍稀释)至0.5-1mg/ml，将10μL该溶液等分放入1.5mL的埃彭道夫管中。将390μL温的底物缓冲液(通常为20mM柠檬酸盐缓冲液，pH4中的20mM草酸盐)加至每支管中，并立即将管置于恒温混匀器上整10分钟，在达到10分钟时加入100μL 0.5M H₂SO₄。通过HPLC直接测量产生的总甲酸盐。用离子交换柱(Aminex HPX-87H，BioRad)和20mM H₂SO₄的等度梯度，在210nm处通过UV检测甲酸盐，通常在14.3分钟时出现洗脱峰。

稳定性试验

在pH约2至约3的缓冲液中孵育

在将OxDc游离酶或所考虑的含包埋于聚合材料中的OxDc酶的组合物在pH范围为2至3的100mM甘氨酸缓冲液中孵育一段时间后，分析剩余的OxDc活性。

在模拟胃液中孵育

将含有约2mg OxDc至约20mg OxDc的颗粒组合物置于含有100mL模拟胃液的容器中，该模拟胃液根据美国药典制备，即通过溶解2g NaCl、3.2g胃蛋白酶和7mL浓盐酸至终体积1L而制备。以合适的时间间隔，吸出样品并如上所述的测定OxDc活性。

在缓冲液中孵育

与上面描述的程序(用于模拟胃液的程序)相同。但是，采用了不同的缓冲液，这取决于目标pH值。合适的缓冲液包括甘氨酸缓冲液(pH 2-3)、醋酸盐缓冲液(pH 3-6)、磷酸盐缓冲液(pH 5-8)、硼酸盐缓冲液(pH 8-9)等。可以将蛋白酶(例如胃蛋白酶)以通常与美国药典模拟胃液中发现的浓度相当的浓度加入。

实施例1

OxDc藻酸盐微粒的制备以及各种工艺参数对稳定性的影响

该实施例阐明了OxDc藻酸盐微粒的制备和稳定性，而且还阐明了各种工艺参数对包埋于微粒中的OxDc的稳定性的影响。

OxDc藻酸盐微粒的制备

微粒I-乳化1：

将11ml在50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3.9)中的藻酸盐(1.8％，w/v)和OxDc(10∶1 v/v；OxDc，20mg/ml，于10mM TrisHCl，pH 3.9中)的混合物与20ml含0.5％triton x-100的矿物油在600rpm下通过磁力搅拌混合10分钟以达到稳定的乳化状态，然后加入4ml CaCl₂矿物油乳剂(2ml 0.2M CaCl₂+2ml矿物油)并继续搅拌30分钟。然后加入8ml壳聚糖矿物油乳剂(4ml 0.8％壳聚糖和4ml矿物油)并另外搅拌30分钟。通过离心收集微粒。在下文中，这些微粒被称为微粒I。

微粒II-乳化2：

全部与“乳化1”相同，除了藻酸盐和OxDc的混合物是在10mM的TrisHCl缓冲液，pH 8中。在下文中，这些微粒称为微粒II。

壳聚糖包被的OxDc藻酸盐微粒-不同浓度的藻酸盐凝胶化(乳化)和用壳聚糖进一步包被微粒：

将8ml藻酸盐(1.2％或3％；w/v)与50 mM TrisHCl缓冲液，pH9中的0.5ml OxDc(16mg/ml)混合，然后将其与15ml含0.8％tritonx-100的矿物油在600rpm下通过磁力搅拌混合10分钟以达到稳定的乳化状态，然后加入8ml CaCl₂矿物油乳剂(4ml 1M CaCl₂+4ml矿物油)并继续搅拌30分钟，随后在搅拌下加入50ml的1M CaCl₂。通过离心收集微粒并用水洗涤两次。将所有微粒(约4ml)合并到36ml 0.4％壳聚糖(pH 5.45)和4ml 4M CaCl₂的混合物中并在200rpm下摇动1小时。在下文中，这些微粒称为壳聚糖包被的OxDc藻酸盐微粒。

在该实施例中获得的所有微粒的粒度分布的范围估计为约1-100μm。

如上描述测定所得微粒的酶活性。总的酶活性是在将酶包埋于聚合基质中之前所述酶的酶活性，并且将该量设置为100％。得到了下列结果：

在pH 3.9制备的微粒(微粒I)和在pH 8制备的微粒(微粒II)分别发现总酶活性的约40％和48％。在pH 3用3.2mg/ml的胃蛋白酶检测这两种微粒的稳定性。在用1.2％的藻酸盐和3％的藻酸盐制备的壳聚糖包被的OxDc藻酸盐微粒中分别发现总酶活性的约42％和60％。在pH 3用3.2mg/ml的胃蛋白酶检测这两种壳聚糖包被的OxDc藻酸盐微粒的稳定性(图2)。

图1是在pH 3下用胃蛋白酶测得的微粒I(在pH 3.9制备)和微粒II(在pH 8制备)中的OxDc稳定性的图。正方形是微粒I，三角形是微粒II。图2是显示在pH 3用胃蛋白酶测得的用于形成藻酸盐微粒的藻酸盐浓度对壳聚糖包被的OxDc藻酸盐微粒中的OxDc稳定性的影响的图。正方形是用3％藻酸盐形成的微粒，实心圆是用1.2％藻酸盐形成的微粒。

因此，在制备微粒过程中存在的pH似乎影响了孵育过程中OxDc的稳定性，即pH的增加促使更稳定，并且藻酸盐浓度的增加似乎也对稳定性具有积极的影响。

实施例2

OxDc纳米粒及其包衣的制备

该实施例阐明了含OxDc的纳米粒及其不同包衣的制备。

OxDc壳聚糖/三聚磷酸盐纳米粒：

将含有0.5mg/ml OxDC的40ml 0.15％(w/v)的三聚磷酸盐(TPP)，pH8.1(在加入OxDC前用HCl调节)滴加至0.13％(w/v)乙酸(pH 3.92)中的120ml 0.18％(w/v)壳聚糖中。将纳米粒通过离心收集并用水洗涤两次。该工艺产生了约4ml的纳米粒混悬液。用藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP纳米粒：

将0.8ml所述纳米粒混悬液搅拌稀释于10ml水中，然后滴加5ml1.2％的藻酸盐溶液(在25mM TrisHCl缓冲液中，pH 8.6)。持续搅拌该混合物5分钟。有包衣的纳米粒的大小由于纳米粒的聚集和通过藻酸盐交联而增加至2-400μm，大多数纳米粒在30μm左右(参见图3)。通过在3000g下离心3分钟收集微粒。将微粒用水洗涤两次并再次悬浮。在图3中，体积统计(Arithmetic)17795s3_07_01.$1s。从0.040μm至2000μm进行统计。体积：100％；平均值：48.53μm；中值：29.10μm；平均值/中值比率：1.668；众数：28.70μm；S.D.：65.43μm；CV：135％；偏度：4.384，右偏斜；峰度：26.90；尖顶峰度：d₁₀ 8.814μm；d₅₀ 29.10μm；d₉₀ 109.9μm。

用角叉菜胶包被的OxDc壳聚糖/TPP纳米粒：

将0.8ml纳米粒混悬液搅拌稀释于10ml水中，然后滴加5ml 0.5％角叉菜胶溶液(自然的pH为8.9)。继续搅拌该混合物5分钟。有包衣的纳米粒应该会形成微粒并具有与用藻酸盐包被的那些(见上)相似的分布。通过离心收集微粒并用水洗涤两次，并再次悬浮。

用藻酸盐或角叉菜胶包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒与不同戊二醛浓度的戊二醛交联

将0.2ml微粒混悬液搅拌稀释于0.8ml水中，然后加入2ml0.15-7.5％的戊二醛溶液(在50mM KPB，pH 7.5中)并将其混合。保持搅拌该混合物15-40分钟并通过离心收集微粒，并且用水洗涤两次。

戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒的还原

制备了两种不同类型的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒：一种微粒进行交联而未加入CaCl₂，另一种微粒在交联反应(1％的戊二醛)开始后10分钟加入1.2M CaCl₂。在交联反应进行了1小时后，通过离心收集微粒并用水洗涤两次。将这两种微粒另外悬浮于100mM KPB，pH 7.5中。将一定量的NaBH₄粉末加至该混悬液中以获得20mM NaBH₄的终浓度，将其保持在黑暗中并摇动14小时。

得到下列结果：

OxDc壳聚糖/TPP纳米粒：

纳米粒太小而不能在光学显微镜下用肉眼观察到。在当前条件下OxDc几乎100％被纳米粒包埋。在这些条件下，用高pH(8.6)的TPP溶解OxDC，然后滴加入低pH(3.92)的壳聚糖溶液中。相对于低pH充分优先将酶溶解于高pH中是在纳米粒形成阶段能将酶维持在纳米粒中的一个因素。在pH 3.0在OxDc壳聚糖/TPP纳米粒中OxDc的稳定性位于实施例1和图1中的微粒I和微粒II的稳定性之间。

藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒：

当应用藻酸盐包衣时，与未包被的纳米粒比较，在pH 3.0下OxDc的稳定性得到进一步提高，参见图4，其中正方形是没有包衣的纳米粒，闭合圆环是具有藻酸盐包衣的微粒，而三角形是具有角叉菜胶包衣的微粒。

角叉菜胶包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒：

当应用角叉菜胶包衣时，在pH 3.0下OxDc的稳定性得到进一步提高(与未包被的纳米粒比较)(图4)。

其中整个颗粒与不同戊二醛浓度的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒：

(尽管不希望受任何理论束缚，但据信戊二醛交联主要发生在壳聚糖分子中，(壳聚糖分子与其自身交联和并互相之间交联)，以及在壳聚糖分子和酶分子之间交联)。

附加了交联的藻酸盐包被的微粒在低pH下显示出比没有藻酸盐包衣的纳米粒更高的稳定性。高水平的交联提高了在低pH下OxDc在藻酸盐包被的微粒中的稳定性(图5)。最稳定的微粒可浸没在具有胃蛋白酶的pH为2.6的溶液中4小时而不会丧失活性。在pH 2.4下用胃蛋白酶孵育3.5小时后活性为约30％。参见图5，其显示了在具有胃蛋白酶(pH 2.4)的情况下，用于交联的戊二醛浓度对戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒中的OxDc稳定性的影响。正方形是无藻酸盐包衣的1％的戊二醛，实心圆是0.5％的戊二醛，朝上的三角形是1％的戊二醛，而朝下的三角形是2％的戊二醛，并且菱形是5％的戊二醛。

戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒的还原：

在还原希夫双键后在低pH下戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒的稳定性得到了显著提高。在交联过程中加入CaCl₂，戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒在120分钟后丧失了80％的OxDc活性，然而在约2.0的pH下没有加入CaCl₂的微粒在非常短的时间内就丧失了80％的活性。对于详细情况，参见图6，其是显示两种类型的交联且还原了的微粒在pH 2.2和pH 1.85下的OxDc稳定性的图，其中正方形是pH 2.2(无Ca⁺²)，实心圆是pH 2.2(添加了Ca⁺²)，朝上的三角形指代pH 1.85(无Ca⁺²)，而朝下的三角形是pH.1.85(具有Ca⁺²)。

从上面的一系列试验中，选择还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒用于进一步开发。

实施例3

在模拟的胃条件下除去来自食物的草酸盐的体外测试实验

还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒的体外试验

分别将10g、20g和40g菠菜与12ml模拟胃液(胃流体)(具有3.2mg/ml胃蛋白酶的84mM HCl)混合。然后加入水使得终体积分别为40、80和160ml。在将菠菜、模拟胃液和水均质化后，加入还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒用以降解从菠菜释放出的草酸盐。对于所有这三种情形，菠菜/微粒的(剂量)比例都是200(200g菠菜与1g微粒混合)。选择菠菜用于该试验是因为它含有大量的草酸盐(冷冻的菠菜叶中含有约200mM草酸盐)。

结果和讨论：

可溶性草酸盐的量受到pH的显著影响。对于10g、20g和40g菠菜的情况，pH值分别为2.5、3.5和4.2。对于10g、20g和40g菠菜的情况，初始的可溶性草酸盐的浓度分别是30.0mM、22.8mM和14.7mM(图7)。如果所有的草酸盐都是可溶性的，则它的浓度应该是大约48mM。因此，在所有这三种情形中都存在不溶性草酸盐。图7显示，初始的可溶性草酸盐在数分钟内几乎被完全除去。剩余的可溶性草酸盐没有降低至0，而是在一段时间内保持在低的水平，因为不溶性草酸盐在更多的可溶性草酸盐被除去时开始溶解。图7显示了在所有这三种情况下草酸盐(可溶部分)的生物利用度都迅速降低。正方形是具有0.05g洗涤过的微粒的10g菠菜，菱形是具有0.1g洗涤过的微粒的20g菠菜，朝上的三角形是具有0.2g微粒的40g菠菜。

OxDc微粒持续去除越来越多的可溶草酸盐(图8)。在1小时后，在第一种情况下(正方形)菠菜中几乎所有的草酸盐都被除去，而在第二种情况下(菱形)，约90％的草酸盐被除去。对于第三种情况(三角形)，仅除去了50％的草酸盐，但是可溶部分接近于0。因此，在所有这三种情况下，草酸盐的吸收也可以在胃肠道中得到有效限制，因为可溶性草酸盐的浓度非常低而且大部分的草酸盐被减少。图8是在三种不同的模拟条件下，菠菜中总的可溶性草酸盐被微粒除去的时间进程图。每种菠菜样品中的总草酸盐浓度是约50mM。正方形是具有0.05g微粒的10g菠菜，菱形是具有0.1g微粒的20g菠菜，朝上的三角形是具有0.2g微粒的40g菠菜。

如果用这些结果来模拟体内处理，则假设胃中含有120ml胃液的人开始摄入总量为400g的菠菜。在摄入100g菠菜后，服用4g微粒。在2分钟内除去了几乎所有的可溶性草酸盐。虽然继续摄入菠菜直到吃进了400g，但可溶性草酸盐在摄入过程中维持在3mM以下并且在摄入后迅速降低至0。

实施例4

根据本发明配制的OxDc

I.制备配制的OxDc(微粒)并测试它在低pH下的稳定性

如下制备了还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒：

1.通过将三聚磷酸盐(TPP)溶液滴加至壳聚糖和OxDc的混合物中，制备OxDc壳聚糖/TPP纳米粒。

2.通过加入藻酸盐溶液至上述混悬液中，用藻酸盐包被上述纳米粒。由于在这一过程中发生了纳米粒的聚集和通过藻酸盐的物理交联，纳米粒形成了微粒。

3.用戊二醛使上述微粒交联

4.用NaBH₄还原希夫碱

按照实施例2中的描述制备该制剂。

测试游离的OxDc或配制的OxDc在低pH下的稳定性：

在将作为游离酶的OxDc或所述微粒中的OxDc在pH范围为2至3的100mM甘氨酸缓冲液中孵育一段时间后，分析剩余的OxDc活性。图9是显示在pH 2.4并存在胃蛋白酶时，与戊二醛(0.5-5％)交联提高了藻酸盐包被的壳聚糖/TPP微粒中OxDc的稳定性的图。正方形是0％的戊二醛，实心圆是0.5％的戊二醛，朝上的三角形是1％的戊二醛而菱形是5％的戊二醛。

如图9中显示的，在pH 2.4下，未交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒(对照)的活性(用正方形点表示)在少于15分钟内被彻底破坏。相比之下，与0.5-5％戊二醛交联使藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒的酶活性稳定直到2小时。已知天然的(未配制的、游离的、未包埋的)OxDc在pH＜3.0时将不可逆地失活。戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒的稳定性在这些微粒中的希夫碱还原后得到了进一步提高(图10)。

图10是显示在pH 2.2并存在胃蛋白酶时(正方形点)，希夫碱的还原提高了戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TTP微粒中的OxDc稳定性的图。微粒在pH＜2.0时迅速失活(三角形点)。

还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TTP微粒可在pH低至2.2时保持稳定性。这是显著的提高，因为未配制的酶(游离的，未包埋的)在pH＜3.0时不可逆地失活。

II.对OxDc微粒降解草酸盐的研究

A.低浓度范围的草酸盐(草酸钠)的降解：

在37℃下pH为3时，将含有2mg OxDc或20mg OxDc的OxDc微粒(按照上述实施例4的I中的描述制备)与浓度为0.05至2mM的100ml草酸盐溶液混合。在一段时间内测量所产生的甲酸盐。

如图11A和B中显示的，还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TTP微粒可以降解至少浓度范围是0.05mM至2.0mM的草酸盐。

在人的胃中，0.05mM至2.0mM的草酸盐浓度相当于膳食摄入了5mg至180mg的草酸盐并且假定胃的容积为1L。据报道在西方饮食中草酸盐的平均日摄入量是100-500mg/天(在所有膳食中)。如果进食了一些高草酸盐含量的食物像菠菜，则摄入量会高很多。来自菠菜的范围为15至30mM的草酸盐的降解也已经进行了研究并在下面描述。

图11A和图11B是显示还原的戊二醛交联的藻酸盐包被的OxDc壳聚糖/TPP微粒在pH 3去除草酸盐的图。A，相当于100ml草酸盐溶液中20mg OxDc的微粒；B，相当于100ml草酸盐溶液中2mg OxDc的微粒。正方形是0.05mM的草酸盐浓度，实心圆是0.2mM的草酸盐浓度，朝上的三角形是1.0mM的草酸盐浓度，而朝下的三角形是2.0mM的草酸盐浓度。

20mg OxDc(1.0ml微粒制剂中酶蛋白的估计量)在2分钟内几乎完全降解了0.05mM至2mM的草酸盐。

菠菜草酸盐在模拟胃液条件下的降解：

菠菜与模拟胃液混合：将10g、20g和40g菠菜与12ml模拟胃液(具有3.2mg/ml胃蛋白酶的84mM HCl)混合，然后加入水使得终体积分别为40ml、80ml和160ml。

通过OxDc除去草酸盐：在将菠菜、胃液和水的混悬液均质化后，加入OxDc微粒用以降解从菠菜中释放的草酸盐。对于所有这三种情况，菠菜/OxDc的(剂量)比例都是大约2000(2000g菠菜与具有1g OxDc活性的微粒混合)。

计算出所有上述制剂中的总草酸盐是50mM(据报道菠菜每kg含有18g量的总草酸盐)。由于菠菜的存在导致对胃液的不同水平的缓冲作用，三种菠菜混悬液的最终pH分别为2.5、3.5和4.2。已知介质的pH可影响可溶性草酸盐的可利用度，因而在试验的三种制剂中可生物利用的草酸盐的浓度分别是30mM(正方形点)、22mM(菱形点)和15mM(三角形点)(图12)。

表1

菠菜制剂	pH	总草酸盐浓度	可溶性草酸盐浓度
菠菜制剂	pH	总草酸盐浓度	可溶性草酸盐浓度	10g/40ml胃液	2.5	50mM	30mM
20g/80ml胃液	3.5	50mM	22mM	10g/40ml胃液	2.5	50mM	30mM
20g/80ml胃液	3.5	50mM	22mM	40g/160ml胃液	4.2	50mM	15mM

图12A是显示草酸盐(可溶性部分)的生物利用度的图，在所有这三种情况中所述草酸盐都迅速减少；图12B是显示除去的总草酸盐的百分比的图。正方形是具有相当于5mg OxDc量(根据酶活性)的微粒的10g菠菜；菱形是具有相当于10mg OxDc量的微粒的20g菠菜；朝上的三角形是具有相当于20mg OxDc量的微粒的40g菠菜。

具有OxDc的微粒能够在pH范围为2.5至4.2的模拟胃液条件下(参见图12A和12B)或在pH3的缓冲液中(图11A和11B)降解浓度从0.05mM至30mM的草酸盐。根据这组试验，可估计具有OxDc的20mg微粒(在1.0ml混悬液中)在30分钟内可降解180mg草酸盐。

Claims

1.一种组合物，它包含颗粒，该颗粒包含一种或多种包埋于第一聚合材料中的草酸盐降解酶，其中在37℃，在pH＞2，例如在pH约2.5至pH约3.5的范围内，例如pH约3的含有84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶的美国药典模拟胃液中孵育至少60分钟时，所述包埋的酶保留的活性是获自同一批次的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少两倍。

2.根据权利要求1的组合物，其中在pH范围为约1.0至约4.5，例如pH约2.0至pH约3.0的含水缓冲液中孵育60分钟，并且初始活性被设置为100％时，所述一种或多种草酸盐降解酶的活性至多降低至约30％。

3.根据权利要求2的组合物，其中所述活性至多降低至40％，例如至多降低至约50％，至多降低至约60％或至多降低至约70％，并且初始活性被设置为100％。

4.根据权利要求2或3的组合物，其中所述活性至多降低至80％，并且初始活性被设置为100％。

5.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中在pH范围为约1至约4.5，例如约2.0至约3.0的含水缓冲液中孵育2小时时，所述一种或多种草酸盐降解酶的活性至多降低至约20％，并且初始活性被设置为100％。

6.根据权利要求5的组合物，其中所述活性至多降低至30％，并且初始活性被设置为100％。

7.根据权利要求2-6任意一项的组合物，其中所述缓冲液还含有蛋白酶，例如胃蛋白酶。

8.根据权利要求7的组合物，其中胃蛋白酶的浓度范围是约0.5mg/ml至约10mg/ml，例如约1mg/ml至约7.5mg/ml、约2.5mg/ml至约4mg/ml，例如约3.2mg/ml。

9.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述一种或多种草酸盐降解酶是分离的/纯化的酶。

10.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述一种或多种草酸盐降解酶选自草酸脱羧酶，草酰辅酶A脱羧酶，或草酸氧化酶和甲酰辅酶A转移酶的组合。

11.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述一种或多种草酸盐降解酶是草酸脱羧酶。

12.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中在37℃，在pH＞2，例如在pH约2.5至pH约3.5的范围内，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟时，所述一种或多种包埋的草酸盐降解酶保留的活性是获自同一批次的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少两倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。

13.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述第一聚合材料自身交联和/或与所述一种或多种酶交联。

14.根据权利要求13的组合物，在37℃，在pH＞2，例如在pH约2至pH约5的范围内，例如约pH 2.5至约pH 3.5，例如约pH 3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少30分钟，例如至少60分钟、至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述组合物保留的酶活性水平与相同批次但未交联的组合物比较增加了至少2倍，例如至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

15.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述颗粒被第二聚合材料包被。

16.根据权利要求15的组合物，在37℃，在pH＞2，例如在pH约2至pH约5的范围内，例如约pH 2.5至约pH 3.5，例如约pH 3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟，例如至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述组合物保留的酶活性水平与相同批次但未被第二聚合材料包被的组合物比较增加了至少2倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。

17.根据权利要求15或16任意一项的组合物，其中所述第一聚合材料和/或第二聚合材料自身交联和/或互相交联和/或与所述一种或多种酶交联。

18.根据权利要求17的组合物，在37℃，在pH＞1，例如在pH约1至pH约5的范围内，例如pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟，例如至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述组合物保留的酶活性水平与相同批次但既缺乏交联又缺乏第二层聚合材料的组合物比较增加了至少2倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。

19.根据权利要求13-18任意一项的组合物，其中所述交联通过物理交联进行。

20.根据权利要求13-18任意一项的组合物，其中所述交联通过利用化学交联剂进行。

21.根据权利要求20的组合物，其中所述化学交联剂选自二醛、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)和(N-[对马来酰亚氨基苯基]异氰酸酯(PMPI)。

22.根据权利要求21的组合物，其中所述二醛选自戊二醛和乙二醛。

23.根据权利要求21或22任意一项的组合物，其中所述二醛是戊二醛。

24.根据权利要求20-23任意一项的组合物，其中在所述化学交联剂和所述一种或多种酶和/或所述第一聚合材料和/或所述第二聚合材料之间的键已被还原剂还原。

25.根据权利要求24的组合物，其中所述还原剂选自NaBH₄和NaCNBH₃。

26.根据权利要求25的组合物，在37℃，在pH＞1，例如在pH约1至pH约5的范围内，例如pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟，例如至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述组合物保留的酶活性水平与未经受还原剂的相同批次组合物比较增加了至少2倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。

27.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中在37℃，在pH＞1，例如在pH约1至pH约5的范围内，例如pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟，例如至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述一种或多种包埋的酶保留的活性是获自同一批次的所述一种或多种未包埋的游离酶的活性的至少两倍，例如至少10倍、至少50倍或至少100倍。

28.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中在37℃，在pH＞1，例如在pH约1至pH约5，例如pH约2至pH约5，pH约2.5至pH约4.5，pH约2.5至pH约3.5的范围内，例如pH约3的84mM HCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟，例如至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述一种或多种包埋的酶保留的活性是它们初始活性的至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。

29.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中在37℃，在pH＞1，例如在pH约1至pH约5的范围内，例如pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mMHCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟，例如至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述一种或多种酶保留的活性是它们初始活性的约95％至约100％。

30.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述的第一聚合材料和第二聚合材料，如果其存在的话，是小分子可渗透的，以允许由所述一种或多种酶催化的反应的底物和该反应的产物扩散通过所述聚合材料。

31.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述颗粒的直径是约50nm至约1mm，例如约500nm至约500μm、约1μm至约500μm、约2μm至约100μm、约4μm至约80μm、约6μm至约60μm、约8μm至约40μm、约10μm至约20μm。

32.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中在37℃，在pH＞1，例如在pH约1至pH约5的范围内，例如pH约2至pH约5、pH约2.5至pH约4.5、pH约2.5至pH约3.5，例如pH约3的84mMHCl和3.2mg/ml胃蛋白酶中孵育至少60分钟，例如至少80分钟、至少100分钟、至少120分钟、至少140分钟、至少160分钟、至少180分钟、至少200分钟、至少220分钟或至少240分钟时，所述的第一聚合材料和/或第二聚合材料基本上保持完整。

33.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述第一聚合材料和/或第二聚合材料是多糖。

34.根据权利要求33的组合物，其中所述多糖选自壳聚糖、藻酸盐、果胶和透明质酸。

35.根据权利要求15-34任意一项的组合物，其中所述第一聚合材料和第二聚合材料相同或不同。

36.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中所述第一聚合材料和第二聚合材料，如果该第二聚合材料存在的话，的聚合物百分比是约1％至约10％，例如约2％至约3％。

37.根据前述权利要求任意一项的组合物，其中含有20毫克所述一种或多种草酸盐降解酶的组合物在pH＝2.5时在1小时内降解200克菠菜中存在的草酸盐的至少40％，例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少95％或至少99％。