CN101402985A

CN101402985A - 核糖核酸的工业化生产方法

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Publication number: CN101402985A
Application number: CNA2008102288126A
Authority: CN
Inventors: 乔宾福; 谢赐福; 黄国新; 俞慧君; 方文增
Original assignee: ZHENAO GROUP CO Ltd
Current assignee: ZHENAO GROUP CO Ltd
Priority date: 2008-11-17
Filing date: 2008-11-17
Publication date: 2009-04-08

Abstract

本发明公开一种核糖核酸的工业化生产方法，是将酿酒酵母Y37培养、在发酵罐中进行连续发酵取得高核糖核酸含量(16％)的菌体，经高温食盐法提取核糖核酸，核糖核酸的总收率大于10％(W/W)，用棉饼过滤机过滤以滤除胶体蛋白等杂质，克服了现有等电点沉淀法、凝聚剂络合法、超滤过滤法等许多过滤方法的不足，使制品中核糖核酸的含量大于90％，具有操作简单、所产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模生产等特点。

Description

核糖核酸的工业化生产方法

技术领域：

本发明涉及一种核糖核酸(RNA)的生产方法，尤其是一种操作简单、所产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模生产且安全可靠的核糖核酸的工业化生产方法。

背景技术：

核酸，学术定义上包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，是生物遗传功能的物质基础，因此地球上的所有生物都含有核酸，核酸制品也已成为食品、医药等领域应用的高营养物质，因此，人们正着手研究大规模生产核酸的方法。

1.为了改造物种，创造一类更有利于人类生存的生物体，基因工程在全世界受到科学家的重视，基因工程的核心技术是遗传物质核酸的重组、转化、转导及其排列顺序的测定和结构改变，许多工作离不开核酸抽提、纯化，但这方面的研究只是在实验室里精细地操作，其核酸只能以克来计，不能实现核酸的大规模生产。

2.草本和木本植物虽然在地球上的数量最大，但核酸含量很低，不能用作核酸提取的原料。

3.微生物类群中，有的细菌和病毒核酸含量虽然高达50％以上，但是要想大量获得这类细菌或病毒是非常困难的，经济成本得不偿失。

虽然已有报道可培养一种细菌，能在胞外产生脱氧核糖核酸或核糖核酸，但其最高产率也只能达到5g/L，远不能达到工业化生产的目标。

目前，国内外大部分都是使用假丝酵母(Candida)作为大规模生产核酸的菌株，但是所生产的核酸制品未见在食品上安全使用的报道。

我国卫生部所提供的可用于保健食品的真菌目录，首选是酿酒酵母，而酿酒酵母确是人类最早利用的微生物之一，它生长繁殖快，容易进行大规模培养，不仅富含核糖核酸(一般含核酸6～8％)，而且还含有较高的蛋白质、维生素、微量元素等生理结构物质，提取核酸后的副产品脱核酵母菌体回收率可达50％以上，蛋白质含量也达到50％左右，是一种高蛋白饲料。目前，国内有以在啤酒生产过程中第6、7代以后的啤酒废弃酵母为原料提取核酸的，但却存在着资源分散、原料数量有限、所产核酸纯度不高的问题，因此虽然用啤酒废酵母可以提取核酸，但是仍然不能大规模生产。

酿酒酵母Y37(Saccharomyces cerevisiae)是与啤酒生产同一种属的酿酒酵母，亦是上述我国卫生部所提供的可用于保健食品的真菌之一，但是迄今为止还没有关于发酵培养酿酒酵母Y37所获得的菌体为原料，大规模生产核糖核酸的任何报道。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、所产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模生产且安全可靠的核糖核酸的工业化生产方法。

本发明的技术解决方案是：一种核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于按以下步骤进行：

a.对酿酒酵母Y37菌种进行培养；

b.将所培养的酿酒酵母Y37种子接入发酵罐进行连续发酵，发酵液经离心得菌体；

c.将所得菌体用高温食盐法抽提核酸，离心取上清液；

d.用棉饼过滤法过滤上清液，得滤液；

e.使滤液中核酸析出沉淀，并对沉淀物洗涤、过滤、干燥。

所述的a步骤是将酿酒酵母Y37培养在麦芽汁固体斜面培养基上，29～31℃，生长31～33小时，接入装有种子培养基的培养瓶中，29～31℃摇瓶培养19～21小时，再接入装有种子培养基的种子罐中，控制温度33℃～34℃、PH3.9±0.1，鼓风培养，直至种子干菌浓度达到0.5％～1％。

所述b步骤是将发酵培养基装在发酵罐中，起始的装液系数为0.4～0.42，接种量14～15％，控制温度34±1℃，PH值3.9±0.1，当干菌浓度达到1.5％后进入连续发酵。

所述的种子和发酵培养基的组分及每升所含重量如下：清糖水溶液中的还原糖30～40g、(NH₄)₂SO₄ 1.5～2.5g、MgSO₄·7H₂O 1～2g、FeSO₄ 0.05～0.10g、磷酸1～2g，所述清糖水溶液是将甘蔗糖蜜用水稀释1～2倍，加热至95～100℃保温30～35分钟，吹风鼓泡2～4小时，自然沉降16～18小时后的清液，是种子和发酵培养基的碳源。

所述c步骤是将b步骤所得菌体在氯化钠溶液中90±2℃的温度下抽提2～3小时，折干菌体及氯化钠的重量与水溶液的体积比分别为7～10％、8～10％，将抽提液离心分离脱核酵母，取上清液。

所述d步骤的是将过滤棉洗净后，经压棉机压干成型，装入板框过滤机，c步骤所得上清液经棉饼过滤机过滤。

所述e步骤是将滤后清液冷却至8～10℃，用食用磷酸调节PH至2.0～2.5，析出沉淀，用食用酒精洗涤沉淀物并过滤后进入干燥机以80±5℃的温度干燥。

将所得干燥物磨粉并取80目标准筛的筛下物。

本发明是将酿酒酵母Y37培养、在发酵罐中进行连续发酵取得高核糖核酸含量(16％)的菌体，经高温食盐法提取核糖核酸，核糖核酸的提取率10～12％(W/W)，用棉饼过滤机过滤以滤除胶体蛋白等杂质，克服了现有等电点沉淀法、凝聚剂络合法、超滤过滤法等许多过滤方法的不足，使制品中核糖核酸的含量大于90％，具有操作简单、所产核糖核酸纯度高、产量大，适合于大规模生产等特点。

具体实施方式：

实施例1：

a.对酿酒酵母Y37菌种进行培养，(原始菌株酿酒酵母Y37从上海市工业微生物研究所购得)

b.将所培养的酿酒酵母Y37种子接入发酵罐进行连续发酵，发酵液离心得菌体；

c.将所得菌体用高温食盐法抽提，离心取上清液；

d.用棉饼过滤法过滤上清液，得滤液；

e.使滤液中核酸析出沉淀，并对沉淀物洗涤、过滤、干燥。

实施例2：

1.制备种子及发酵培养基

将甘蔗糖蜜用水稀释1～2倍，加热至95～100℃保温30分钟，吹风鼓泡2～4小时，自然沉降16小时后的糖水清液为种子和发酵培养基的碳源。

种子和发酵培养基的组份为(g/l)：

用于碳源的糖水清液，用量以每升培养基含还原糖30～40g为准，除此之外，还有(NH₄)₂SO₄1.5～2.5、MgSO₄·7H₂O 1～2、FeSO₄0.05～0.10、磷酸1～2。

2.将酿酒酵母Y37培养在麦芽汁固体斜面培养基上，29～31℃，生长31～33小时，接入装有种子培养基的培养瓶中，29～31℃摇瓶培养19～21小时，再接入装有种子培养基的种子罐中，控制温度33℃～34℃、PH3.9±0.1，鼓风培养，直至种子干菌浓度达到0.5％～1％。

3.将发酵培养基装在100立方米发酵罐中，起始的装液系数为0.4～0.42，接种量14～15％，控制温度34±1℃，PH值3.9±0.1，当干菌浓度达到1.5％后进入连续发酵，流加同一组份的发酵培养基稳定发酵6～7天后，干菌浓度达到1.2％～1.5％，酵母细胞核酸含量由开始的9％～11％不断上升，达到16％以上，每天可获折干高核酸酵母10.5吨以上。

4.发酵液离心得菌体，菌体在氯化钠溶液中90±2℃的温度下抽提2～3小时，菌体(按折干菌体计)及氯化钠的重量与水溶液的体积比分别为7～10％(w/v)、8～10％(w/v)，将抽提液离心分离脱核酵母，清液为核糖核酸清液，核糖核酸对酵母提取率为10～12％(W/W)。

5.将过滤棉洗净后，经压棉机压干成型，装入板框过滤机，将上步骤所得上清液经棉饼过滤机过滤，除去胶体蛋白等杂质，简易、高效，且保证了产品核酸含量达90％以上。

6.将滤后清液冷却至8～10℃，用食用磷酸调节PH至2.0～2.5，析出沉淀，用食用酒精洗涤沉淀物并过滤后进入闪蒸干燥机以80±5℃的温度干燥。

7.将所得干燥物磨粉并取80目标准筛的筛下物。

经常规的核酸检验方法检验，所得淡黄色粉末即为成品核糖核酸(RNA)。成品核糖核酸的纯度≥90％，浊度≤40％，水份≤8％。

经过生产实践，核糖核酸日产量达到1.5吨以上，脱核酵母达到8吨以上，一年可生产核糖核酸400～500吨。

Claims

1.一种核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于按以下步骤进行：

a.对酿酒酵母Y37菌种进行培养；

c.将所得菌体用高温食盐法抽提核酸，离心取上清液；

d.用棉饼过滤法过滤上清液，得滤液；

e.使滤液中核酸析出沉淀，并对沉淀物洗涤、过滤、干燥。

2.根据权利要求1所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于：所述的a步骤是将酿酒酵母Y37培养在麦芽汁固体斜面培养基上，29～31℃，生长31～33小时，接入装有种子培养基的培养瓶中，29～31℃摇瓶培养19～21小时，再接入装有种子培养基的种子罐中，控制温度33℃～34℃、PH3.9±0.1，鼓风培养，直至种子干菌浓度达到0.5％～1％。

3.根据权利要求2所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于：所述b步骤是将发酵培养基装在发酵罐中，起始的装液系数为0.4～0.42，接种量14～15％，控制温度34±1℃，PH值3.9±0.1，当干菌浓度达到1.5％后进入连续发酵。

4.根据权利要求2或3所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于：所述的种子和发酵培养基的组分及每升所含重量如下：清糖水溶液中的还原糖30～40克、(NH₄)₂SO₄ 1.5～2.5克、MgSO₄·7H₂O 1～2克、FeSO₄ 0.05～0.10克、磷酸1～2克，所述清糖水溶液是将甘蔗糖蜜用水稀释1～2倍，加热至95～100℃保温30～35分钟，吹风鼓泡2～4小时，自然沉降16～18小时后的清液，是种子和发酵培养基的碳源。

5.根据权利要求4所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于：所述c步骤是将b步骤所得菌体在氯化钠溶液中，90±2℃的温度下抽提2～3小时，折干菌体及氯化钠的重量与水溶液的体积比分别为7～10％、8～10％，将抽提液离心分离脱核酵母，取上清液。

6.根据权利要求5所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于：所述d步骤是将过滤棉洗净后，经压棉机压干成型，装入板框过滤机，c步骤所得上清液经棉饼过滤机过滤。

7.根据权利要求6所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于：所述e步骤是将滤后清液冷却至8～10℃，用食用磷酸调节PH至2.0～2.5，析出沉淀，用食用酒精洗涤沉淀物并过滤后进入干燥机以80±5℃的温度干燥。

8.根据权利要求7所述的核糖核酸的工业化生产方法，其特征在于：将所得干燥物磨粉并取80目标准筛的筛下物。