CN101402678A

CN101402678A - 一种抗寒蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN101402678A
Application number: CNA2008102265143A
Authority: CN
Inventors: 陈良标; 王道文; 胡鹏; 冯波; 许广会
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2009-04-08
Anticipated expiration: 2028-11-13
Also published as: CN101402678B

Abstract

本发明公开了一种抗寒蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白质。本发明的抗寒基因具有抗寒功能，可转入植物中提高植物的抗寒性。对改善植物，特别是粮食和经济作物的耐寒品质，提高其抵抗自然低温灾害的能力对我们经济发展有着重要的现实意义。

Description

一种抗寒蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种抗寒蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于南极鱼的耐寒蛋白及其编码基因，与它们在提高植物抗寒性中的应用。

背景技术

南极鱼是已知的最耐寒的鱼类，其细胞可以在-1℃～-2℃的低温中完成包括个体发育在内的所有生命活动，寒冷环境下进化形成的基因组编码了低温下生存所需的所有功能分子，是重要的基因资源(Gordon，A.L. 2003.Oceanography：Thebrawniest retroflection.Nature 421：904-905)。因此，对生活在不同温度环境下的南极鱼类基因组的比较分析，以及相关基因的克隆鉴定、功能分析及其作用机制研究，有助于我们理解南极鱼类在0℃以下这样极端的低温环境下生存的机制。生活在南极的鱼类表现出了一系列与抗寒相关的生理和生化性状，如抗冻蛋白的进化(DeVries，A.L.1971.Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes.Science 172：1152-1155；Cheng，A.L. D.a.C.-H.C.2005.Antifreeze Proteins andOrganismal Freezing Avoidance in Polar Fishes.Fish Physiology 22：155-201；De Vries，A.L. C.，C.-H.C.2005.Antifreeze proteins and organismal freezing avoidance in polar fishes.fish physiology seriesThe physiology of polar fishes(eds.Farrell，A.P.&Steffenson，J.F.).San Diego，CA：Elsevier Academic Press 22：155-201)、热休克应答(the heat-shockresponse，HSR)的缺失(Hofmann，G.E.，Buckley，B.A.，Airaksinen，S.，Keen，J.E.，Somero，G.N.，2000.2000.Heat-shock protein expression is absent in the Antarctic fishTrematomus bernacchii(Family Nototheniidae).J.Exp.Biol.203：2331-2339)，血液中红血球大量减少甚至消失(Verde，C.，E.Parisi，and G.di Prisco.2006.The evolution ofthermal adaptation in polar fish.Gene 385：137-145)，肌纤维的数目减少，直径却增大等等。那么这些低温适应的分子基础是什么？在几千万年的寒冷筛选后，鱼类产生了哪些功能上特异抗寒的基因？

冷暖空气的活动是天气变化的基本原因之一。在特定的天气形势下，聚积在高纬度地区的强冷空气迅速南下，入侵我国，造成大范围的剧烈降温，并伴有大风、雨雪、冻害等现象，这类天气过程称为寒潮或强冷空气，由此所造成的损失称为寒潮与冷冻灾害。寒冷的气候会造成农作物的大量减产，在美国，每年由于寒冷而导致农业经济损失达几十亿美元，例如1998年12月份，加利福尼亚州由于冰冻灾害而柑橘大面积死亡，直接经济损失达5亿9千万美元。在中国每年平均有6-7亿亩农田蒙受寒冷的气候的危害，粮食减收200亿公斤(中国可持续发展信息网2003.10.13)。若能利用已发现的抗寒基因培育出新型的具有抗寒的转基因植物，能够使转基因农作物具有更强的耐寒能力，在室外温度突然下降的情况下保持其生理活性，从而使农作物免受寒冷的灾害。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗寒蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的抗寒蛋白，名称为Calmodulin，来源于南极鳕鱼(Dissostichusmawsoni)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)自序列表中的SEQ ID№.2的氨基端残基序列；

2)将自序列表中的SEQ ID№.2的氨基端残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由149个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

为了使1)中的Calmodulin便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK	c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的Calmodulin可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的Calmodulin的编码基因可通过将序列表中SEQ ID№：1的DNA序列中缺失一个或几个编码氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述Calmodulin的氨基末端添加上信号肽序列。

上述抗寒蛋白的编码基因(Gene1_Calmodulin)也属于本发明的保护范围。

上述抗寒蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由450个脱氧核苷酸组成。自序列表中SEQ ID№：1的5’端的第1至450位核苷酸为Gene1_Calmodulin的开放阅读框(Open ReadingFrame，ORF)，序列表中序列1编码序列表中序列2的核苷酸序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的抗寒基因以南极鳕鱼(Dissostichus mawsoni)这个特殊的物种为研究材料，利用cDNA文库的构建和测序的技术发现并利用RT-PCR的方法获得全长序列。将本发明的抗寒基因转入烟草中，获得了可稳定表达本发明的抗寒基因的转基因烟草，经过低温实验表明，转入本发明抗寒基因的烟草在低温(4℃)下生长20天仍保持旺盛的生长状态，没有萎蔫，证实本发明的抗寒基因具有抗寒功能，可转入植物中提高植物的抗寒性。对改善植物，特别是粮食和经济作物的耐寒品质，提高其抵抗自然低温灾害的能力对我们经济发展有着重要的现实意义。

附图说明

图1为pCAPE3的结构示意图。

图2为野生型植株荧光鉴定照片。

图3为转pCAPE3烟草植株荧光鉴定。

图4为转基因烟草RT-PCR鉴定电泳图。

图5为4℃处理20天的转pCAPE-Calmodulin烟草和对照的表型。

图6为23℃恢复生长15天表型的转pCAPE-Calmodulin烟草和对照的表型。

图7为正常培养30天和在4度处理20天转pCAPE-Calmodulin烟草和对照的Fv/Fm值。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、抗寒基因及其编码蛋白的获得及其抗寒应用

一、本发明的抗寒基因及其编码蛋白的获得

本发明的发明人通过构建了南极鳕鱼(Dissostichus mawsoni)的cDNA文库，并对该文库的EST序列进行了大规模测序，最后通过序列拼接和BLAST分析得到了一系列感兴趣的基因，并对其中一个可能具有抗寒功能的基因进行分析研究，并按照下述方法获得该基因的序列。

设计扩增引物，引物序列如下所示：

上游引物CaM-F：5′-CGCCGACGCGTATGGCTGATCAGCTTACAGA-3′

下游引物CaM-R：5′-CGCCGGAATTCTCACTTCGCCGTCATCATTT-3′

利用TRIZOL试剂提取南极鳕鱼(Dissostichus mawsoni)(Karl-Hermann Kock1，KeithReid，John Croxall and Stephen Nicol 2007 Fisheries in the Southern Ocean：an ecosystemapproach Phil.Trans.R.Soc.B 362，2333-2349，中国科学院遗传与发育生物学研究所)的肝脏RNA，以此RNA为模板，反转录得到第一链cDNA，反转录具体方法如下所述：

在EP管中加入Random Primers 1.0μl(100ng)，南极鳕鱼(Dissostichusmawsoni)的肝脏RNA 2.0μl(5μg)，dNTP mix(10mM)1.0μl，水(RNA-free)8.0μl；在65℃温育5min，至于冰上5min，然后加入5×first-strand Buffer 4.0μl，DTT(0.1M)2.0μl，Rnaseout(40U/μl)1.0μl，混匀后，25℃放置2min；加入1.0μl SuperSeripteII RT轻轻混匀，25℃下放置10min。将混合物置于42℃反应50min，置于70℃下加热15min终止反应，即得第一链cDNA。

以此cDNA为模板，在引物CaM-F和引物CaM-R的引导下，用常规PCR法扩增抗寒基因的cDNA序列。

其中，反应体系(50μl体系)为上述获得的含第一链cDNA的反应液2μl，10×buffer 5μl，dNTP混合液(25mM)2μl，CaM-F(10μM)2μl，CaM-R(10μM)2μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，灭菌水36.5μl。

反应程序为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃下保存。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到450bp的DNA片段，将该片段进行测序，结果表明，PCR扩增得到的片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，将其命名为Gene1_Calmodulin。序列表中序列1的核苷酸序列是由450个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列1的5′端第1-450位核苷酸序列为编码序列(ORF)，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。将该蛋白命名为Calmodulin。

二、利用本发明的抗寒基因及其编码蛋白提高植物抗寒性的应用

1、可在植物中表达本发明的抗寒基因的重组表达载体的构建

将pCAPE2(来自PEBV-VIGS载体系统(由两个T-DNA质粒(pCAPE1，pCAPE2)组成)，Constantin，G.D.，B.N.Krath，S.A.MacFarlane，M.Nicolaisen，I.E.Johansen，and O.S.Lund.2004.Virus-induced gene silencing as a tool for functional genomics in alegume species.Plant J 40：622-631；中国科学院遗传与发育生物学研究所)进行了改造。增加了MluI、EcoRI、SalI、SacI、NcoI酶识别位点。具体的改造方法为：合成含有上述酶切位点的核苷酸片段CACCATGGCTAGCACGCGTCCTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGA，将该片段插入到pCAPE2的NcoI和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒。将鉴定正确的增加了MluI、EcoRI、SalI、SacI、NcoI酶识别位点的重组质粒命名为pCAPE3(其结构示意图如图1所示)。

按照步骤一的方法扩增Gene1_Calmodulin基因，然后用MluI和EcoRI双酶切后，将酶切得到Gene1_Calmodulin基因片段插入到pCAPE3的MluI和EcoRI酶切位点之间得到重组载体，将该重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定正确的含有Gene1_Calmodulin基因片段的重组载体命名为pCAPE-Calmodulin。

2、转入本发明的抗寒基因的转基因烟草的获得

1)转pCAPE-Calmodulin烟草的获得

分别pCAPE1、pCAPE3及pCAPE-Calmodulin转农杆菌GV3101(购自promega公司)后，鉴别，挑取转化成功的克隆，划线28℃培养过夜，提取质粒进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明正确的含有pCAPE1的工程菌株命名为GV-pCAPE1，将鉴定表明正确的含有pCAPE1的工程菌株命名为GV-pCAPE3，将鉴定正确的含有pCAPE-Calmodulin的工程菌株命名为GV-pCAPE-Calmodulin；

挑取上述GV-pCAPE1、GV-pCAPE3或GV-pCAPE-Calmodulin分别接种到5ml添加50mg/L利福平(Rif)和50mg/L卡那霉素(Kana)的LB培养基中28℃培养过夜；然后将培养过夜的菌液分别转接到50ml添加50mg/L利福平(Rif)、50mg/L卡那霉素(Kana)、20μM乙酰丁香酮(Acetosyringone)和10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)(MES)的LB培养基中，28℃培养过夜；

离心收集上述GV-pCAPE1、GV-pCAPE3或GV-pCAPE-Calmodulin菌液，然后重悬在添加了10mM MgCl₂、10mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)(MES)+200μM乙酰丁香酮(Acetosyringone)的LB培养基中，调OD₆₀₀＝2.0，在室温下静置3小时得到OD₆₀₀为2.0的GV-pCAPE1、GV-pCAPE3或GV-pCAPE-Calmodulin菌液。

将上述获得的OD₆₀₀为2.0的GV-pCAPE1菌液分别与GV-pCAPE3菌液或GV-pCAPE-Calmodulin菌液按照1∶1的体积比混合，得到GV-pCAPE1与GV-pCAPE3的混合菌液和GV-pCAPE1与GV-pCAPE-Calmodulin的混合菌液。

将烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana，购自中国农业科学院烟草研究所)播种于蛭石中，在25℃培养间内，16小时光照，8小时黑暗培养，长到5-6片展开叶时用于农杆菌注射。将上述得到的GV-pCAPE1与GV-pCAPE3的混合菌液或者GV-pCAPE1与GV-pCAPE-Calmodulin的混合菌液分别注射上述5-6片展开叶的烟草，注射时要注射近轴端的嫩叶。将注射后的烟草于23度，40％湿度，16小时光照/8小时黑暗温室下培养25天得到转pCAPE-Calmodulin烟草或转pCAPE3烟草。

2)转pCAPE-Calmodulin烟草的鉴定

A、转pCAPE3烟草的鉴定

将步骤1)得到的转pCAPE3烟草进行表达情况荧光鉴定，具体方法为：取1平方厘米的转pCAPE3烟草和野生型烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)(作为野生型对照，WT)叶片，置于盖玻片上，滴蒸馏水一滴，压片，置于激光共聚焦显微镜下观察，转入pCAPE3和pCAPE1的阳性植株在激光共聚焦显微镜的470nm激发下显示绿色荧光；同时用激光共聚焦显微镜观察转pCAPE3烟草和野生型烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)的叶绿体荧光作为对照。结果如图2和图3所示，结果表明有6株转pCAPE3烟草全部为成功转入pCAPE3和pCAPE1并且可在烟草中正常表达的转基因烟草。图2中，A为野生型烟草的GFP荧光照片，B为野生型烟草的叶绿体荧光照片，C为A和B所示荧光的重叠。图3中，A为转pCAPE3烟草的GFP荧光照片，B为转pCAPE3烟草的叶绿体荧光照片，C为A和B所示荧光的重叠。

B、转pCAPE-Calmodulin烟草的鉴定

将上述步骤1)得到的转pCAPE-Calmodulin烟草通过RT-PCR的鉴定，RT-PCR的引物为：

上游引物Cal-up：TGAGTTCAAGGAGGCATTTTCG；

下游引物Cal-down：CACTTCGCCGTCATCATTTGTA。

以步骤1)获得的转pCAPE-Calmodulin烟草的第一链cDNA模板为模板进行PCR扩增反应。同时以26S rRNA作为对照，PCR扩增引物为5’端上游引物为：GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC；3’端下游引物为：TCTCCCTTTAACACCAACGG。

其中，反应体系(50μl体系)为含转pCAPE-Calmodulin烟草的第一链cDNA 2μl(0.1ug)，10×buffer 5μl，dNTP混合液(25mM)2μl，Cal-up(10μg/L)2μl，Cal_down(10μg/L)2μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl，灭菌水36.5μl。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，440bp的DNA片段即是目标片段。

结果如图4所示，结果表明有6株转pCAPE-Calmodulin烟草中Gene1_Calmodulin基因已全部成功通过pCAPE-Calmodulin转入烟草中并在该转pCAPE-Calmodulin烟草中正常表达。

3、转入本发明的抗寒基因的烟草(转pCAPE-Calmodulin烟草)抗寒性的鉴定

将步骤2鉴定阳性的转pCAPE3烟草(对照)、转pCAPE-Calmodulin烟草和烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana，购自中国农业科学院烟草研究所)的种子萌发后生长25天，然后分别置于4℃，16h光照/8h黑暗，生长20天，然后再在23℃，16h光照/8h黑暗，恢复生长15天，同时设置在23℃，16h光照/8h黑暗的条件下生长，其余条件相同的转pCAPE3烟草(对照)、转pCAPE-Calmodulin烟草和野生型烟草作为阳性对照。在培养的过程中对植株进行表型观察。如图5所示，转基因烟草在4℃，16h光照/8h黑暗，生长20天后，对照组植株(转pCAPE3烟草，图5中对照)有明显的冷伤害的表型，植株精干弯曲，叶片萎靡，而转pCAPE-Calmodulin烟草(图5中Gene1_Calmodulin)则在4℃低温处理后生长依旧良好，低温处理并没有导致其有不良反应。在植株4℃冷处理20天后，置于23℃，16h光照/8h黑暗，恢复生长15天后其表型如图6所示，可以看到，对照组植物(图6中对照)在冷处理受到低温伤害后再置于正常温度下培养，依旧不能恢复到正常的生长状态，说明4℃的低温处理对烟草的伤害是永久性的，不可恢复的，而转pCAPE-Calmodulin烟草(图6中Gene1_Calmodulin)，4℃冷处理20天后，置于23℃恢复生长15天后，植株能够继续正常生长发育，没有表现出任何低温所造成的伤害性状。

为了进一步证实转基因植株的抗寒能力，我们进一步测定了上述转pCAPE-Calmodulin烟草在正常培养30天和在4度处理20天的光合作用系统II光化学效率(Fv/Fm)这一生理指标(Tarantino，D.，Vianelli，A.，Carraro，L.and Soave，C.(1999)A nuclear mutant of Arabidropsis thaliana selected for enhanced sensitivity tolight-chill stress is altered in PS II electron transport activity.Physiol.Plant.107，361-371)，以转pCAPE3烟草为对照。结果如图7所示，实验数据表明对照组植株的FV/Fm下降明显，而转pCAPE-Calmodulin烟草植株FV/Fm下降很小，说明实验组转Gene1_Calmodulin烟草植株对低温有明显的抗性。表明Gene1_Calmodulin具有抗寒的功能。

序列表

<160>2

<210>1

<211>450

<212>DNA

<213>南极鳕鱼(Dissostichus mawsoni)

<400>1

atggctgatc agcttacaga agagcagatt gctgagttca aggaggcatt ttcgctcttt 60

gacaaggatg gcgatggcac catcaccacc aaagagctgg gcacagtgat gcgctctctg 120

ggccagaacc ccactgaggc agagctgcag gacatgatca atgaagtgga tgctgatgga 180

aatggaacga tagacttccc agagttcctc accatgatgg ccaggaagat gaaggacaca 240

gacagcgagg aggagatcag agaagcattc cgtgtctttg acaaggatgg caatggatac 300

atcagtgctg ctgagctgcg ccatgtgatg acaaacctgg gggagaagct gactgacgag 360

gaagtggacg agatgatcag agaagcagac attgacggag atggtcaggt caactatgaa 420

gagttcgtac aaatgatgac ggcgaagtga 450

<210>2

<211>149

<212>PRT

<213>南极鳕鱼(Dissostichus mawsoni)

<400>2

Met Ala Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala

1 5 10 15

Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu

20 25 30

Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu

35 40 45

Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Ash Gly Thr Ile

50 55 60

Asp Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr

65 70 75 80

Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp

85 90 95

Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn

100 105 110

Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu

115 120 125

Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln

130 135 140

Met Met Thr Ala Lys

145

Claims

1、一种抗寒蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)自序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列；

2)将自序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗寒活性的蛋白质。

2、权利要求1所述的抗寒蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述抗寒蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

4、含有权利要求2或3所述的抗寒蛋白的编码基因的重组表达载体。

5、含有权利要求2或3所述的抗寒蛋白的编码基因的转基因细胞系。

6、含有权利要求2或3所述的抗寒蛋白的编码基因的宿主菌。

7、权利要求1所述的抗寒蛋白在提高植物或动物的抗寒性中的应用。

8、权利要求2或3所述的抗寒蛋白的编码基因在提高植物或动物的抗寒性中的应用。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草。