CN101402673A - 提取卵黄免疫球蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提取卵黄免疫球蛋白的方法，属于生物分离工程技术领域，主要是应用超滤分离技术，经过稀释、冻融、离心和超滤四个简单步骤，即可从卵黄中提取高纯度的卵黄免疫球蛋白，在提取过程中，未使用有机溶剂，有效避免了有机溶剂引起的蛋白变性，杜绝了溶剂残留造成的产品安全隐患。

Description

提取卵黄免疫球蛋白的方法

技术领域

本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从鸡卵黄中分离提取卵黄免疫球蛋白的方法，产品纯度可达95％以上。

背景技术

免疫球蛋白是机体受抗原(如病原体)刺激后产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。

免疫球蛋白主要存在于动物血浆中，具有不同的种类，其中，IgG是血清免疫球蛋白的主要成分，占总免疫球蛋白的75％，是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体。它在抗感染中起到主力军的作用，能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用(调理作用)，中和细菌毒素的毒性(中和毒素)，并能够与病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力(中和病毒)。

卵黄免疫球蛋白(IgY)是指鸡卵黄中存在的主要免疫球蛋白，是母鸡在接受免疫后的7～10天，即卵黄成熟期，由母鸡血液中的免疫球蛋白IgG选择性的转移到卵黄中而形成的。所以，IgY相当于哺乳动物的IgG。同时，与IgG相比，卵黄免疫球蛋白(IgY)具有诸多优点：(1)IgY不与血清中的类风湿因子结合，不激活哺乳动物补体系统，也不与Fc受体结合，有利于提高免疫诊断检测的特异性和敏感性；(2)IgY的性质稳定，活性保持良好，在75℃以下，IgY活性基本不受影响，在pH3～12之间，活性保持不变；(3)无需采血，符合国际动物保护条例；(4)价廉易得，一枚鸡蛋中含有的IgY的量相当于从200mL血液中提取的量；(5)由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。因此，近年来，许多学者及生物制品公司都在着手于IgY的分离、纯化研究。

目前，从卵黄中分离IgY的主要方法有：盐析法、聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提法、中链脂肪酸法、表面活性剂法等。然而这些技术均存在一定的局限性，其中，盐析法和聚乙二醇沉淀法容易引起蛋白质的失活和变性；氯仿抽提法、中链脂肪酸法、表面活性剂法的处理周期较长，存在残留问题，不利于IgY的药用。

膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。

超滤膜是指膜孔径在1～100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模。

发明内容

本发明的目的是提供一种环境友好，操作简单，易于放大的卵黄免疫球蛋白(IgY)超滤提取方法，其产品纯度可达95％以上。

本发明采取的技术路线是：

1.将鸡蛋的蛋壳、蛋清和蛋黄膜除去，取蛋黄液；

2.使用去离子水或浓度小于500mM、pH4.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液将卵黄液稀释至6～15倍，最佳为7～10倍，充分搅拌20～30分钟后，于-20℃冷冻8～12小时，再解冻，在4℃下离心，弃去沉淀，取上清液；

3.利用截留分子量为30～100kDa的市售超滤膜对上述步骤得到的上清液进行第一次超滤分离，分离条件为：4℃、pH4.0～10.0，最佳为pH6.0～8.0，取截留液；

4.利用截留分子量为70～150kDa的市售超滤膜对步骤3得到的截留液进行第二次超滤分离，分离条件为：4℃、pH4.0～10.0，最佳为pH6.0～8.0，截留液即为高纯度的卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液；

5.将所得到的卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液冻干10～12小时，即获卵黄免疫球蛋白(IgY)干粉。

本发明直接应用超滤分离技术从鸡卵黄中提取获得纯品卵黄免疫球蛋白(IgY)，由于超滤膜是指膜孔径在1～100nm，具有不对称结构的复合膜。其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，而使小分子溶质透过，有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明。

实施例1，从黄皮鸡蛋中提取卵黄免疫球蛋白(IgY)的方法，步骤：

1.取四个新鲜的黄皮鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后，用注射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约50mL；

2.使用去离子水将上述步骤获得的50mL卵黄液稀释至350mL，充分搅拌20分钟后，置于-20℃冷冻8小时，再解冻，将解冻液在4℃下、用3000rpm离心，弃去沉淀，取上清液，约300mL；

3.利用截留分子量为30kDa的市售聚砜膜对步骤2得到的上清液进行第一次超滤分离，分离条件为：4℃、pH6.0，取截留液约160mL；

4.利用截留分子量为70kDa的市售再生纤维素膜对步骤3得到的截留液进行第二次超滤分离，分离条件为：4℃、pH6.0，截留液即为卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液，纯度95.8％；

5.将得到的IgY溶液置于-60℃冷阱中冻干8小时，获得IgY干粉约550mg。

实施例2，从白皮鸡蛋中提取卵黄免疫球蛋白(IgY)的方法，步骤：

1.取三个新鲜的白皮鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后，用注射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约38mL；

2.使用pH4.0、100mM的磷酸盐缓冲溶液将上述步骤获得的卵黄液稀释至380mL，充分搅拌30分钟后，置于-20℃冷冻12小时，再解冻，将解冻液在4℃下、用6000rpm离心，弃去沉淀，取上清液，约320mL；

3.利用截留分子量为100kDa的市售聚醚砜膜对步骤2得到的上清液进行第一次超滤分离，分离条件为4℃、pH8.0，取截留液约170mL；

4.利用截留分子量为150kDa的市售聚醚砜膜对步骤3得到的截留液进行第二次超滤分离，分离条件为4℃、pH8.0，截留液即为卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液，纯度95.1％；

5.将得到的IgY溶液置于-60℃冷阱中冻干12小时，获得IgY干粉约418mg。

实施例3，从鸡蛋中提取卵黄免疫球蛋白(IgY)的方法，步骤：

1.取五个新鲜的鸡蛋，用自来水洗净蛋壳，再用纸擦干，去除蛋壳和蛋清后，用注射器针头轻轻将蛋黄膜刺破，收集蛋黄液，约60mL；

2.使用pH10.0、400mM的磷酸盐缓冲溶液将上述步骤获得的卵黄液稀释至420mL，充分搅拌25分钟后，置于-20℃冷冻10小时，再解冻，将解冻液在4℃下用5000rpm离心，弃去沉淀，取上清液，约360mL；

3.利用截留分子量为70kDa的市售聚醚砜膜对步骤2得到的上清液进行第一次超滤分离，分离条件为4℃、pH7.0，取截留液约200mL；

4.利用截留分子量为100kDa的市售聚醚砜膜对步骤3得到的截留液进行第二次超滤分离，分离条件为4℃、pH7.0。截留液即为卵黄免疫球蛋白(IgY)溶液，纯度96.2％；

5.将得到的IgY溶液置于-60℃冷阱中冻干11小时，获得IgY干粉约660mg。

本发明工艺仅涉及稀释、冻融、离心和超滤四个简单步骤，相对目前的工业、实验室提取工艺，具有操作简单、分离浓缩同步进行、活性损失小、回收率高的特点，且未使用有机溶剂，可有效避免传统提取方法中有机溶剂引起的蛋白变性，杜绝了有机溶剂残留造成的产品安全隐患，能耗低、环境污染小、分离效率高、产品纯度可调控、控制因素单一，便于工业放大。

Claims (3)

1.一种提取卵黄免疫球蛋白的方法，其特征是按如下步骤进行：

①将鸡蛋的蛋壳、蛋清和蛋黄膜除去，取蛋黄液；

②使用去离子水或浓度小于500mM、pH4.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液将卵黄液稀释至6～15倍，充分搅拌20～30分钟后，于-20℃冷冻8～12小时，再解冻，在4℃下离心，弃去沉淀，取上清液；

③利用截留分子量为30～100kDa的市售超滤膜对上述步骤得到的上清液进行第一次超滤分离，分离条件为4℃、pH4.0～10.0，取截留液；

④利用截留分子量为70～150kDa的市售超滤膜对步骤3得到的截留液进行第二次超滤分离，分离条件为4℃、pH4.0～10.0，截留液即为高纯度的卵黄免疫球蛋白溶液；

⑤将所得到的卵黄免疫球蛋白溶液冻干10～12小时，即获卵黄免疫球蛋白干粉。

2.依据权利要求1所述的提取卵黄免疫球蛋白的方法，其特征是使用去离子水或磷酸盐缓冲溶液将卵黄液稀释至7～10倍。

3.依据权利要求1所述的提取卵黄免疫球蛋白的方法，其特征是所说的第一次超滤分离和第二次超滤分离的pH值为6.0～8.0。