CN101400776A - 啤酒酿造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于酿造啤酒的方法，其包括添加酶组合物来改进成品啤酒的风味和/或风味稳定性，所述酶组合物包含过氧化氢酶，并且不含或基本上不含葡萄糖氧化酶。
Description
发明领域
本发明涉及用于酿造啤酒的方法，其包括添加不含或基本上不含(essentially without)葡萄糖氧化酶的过氧化氢酶组合物，从而改进成品啤酒(finished beer)的风味(flavor)和/或风味稳定性。
背景
已知在酿造方法中应用包含过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的酶组合物来改进啤酒的风味稳定性。然而，使用过氧化氢酶-葡萄糖氧化酶组合物获得的结果并非是完全成功的，并且已显示葡萄糖氧化酶和亚硫酸盐可以作为有吸引力的替代物(Blockmans et al.ASBC Journal 1987，vol.45，85-90)。因此需要用于改进啤酒风味稳定性的进一步的方法。
发明简述
目前本发明人发现通过应用不含葡萄糖氧化酶的过氧化氢酶组合物能够显著改进酶处理的效果。因此，本发明提供用于酿造啤酒的方法，其包括将不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的过氧化氢酶(E.C.1.11.1.6)组合物添加于醪(mash)、发酵麦芽汁(fermenting wort)或经发酵的啤酒(fermented beer)，从而改进成品啤酒的风味和/或风味稳定性。
发明详述
啤酒酿造方法是本领域技术人员熟知的。常规流程可以按照以下方式来概括：起始材料为发芽的(malted)(即使其潮湿、发芽，继而将其干燥的)大麦和/或未发芽的辅料(adjunct)，称为制粉用谷物(grist)。在糖化(mashing)过程中，将制粉用谷物研磨并且与将其水混合、加热并搅拌时，借助于天然存在于麦芽中的酶将碳水化合物降解成可发酵的糖。糖化之后，需要将液体提取物(麦芽汁)从固体(废谷物颗粒和辅料)中分离，从而获得澄清的麦芽汁。麦芽汁过滤是重要的，因为所述固体含有大量的蛋白质，不良改性的(pooly modified)淀粉，脂肪物质，硅酸盐，以及多酚(鞣质(tannin))和蛋白质。在添加啤酒花(hop)之后，将麦芽汁煮沸。由此将发生多酚的沉淀。在冷却并去除沉淀后，向完成的制啤酒用麦芽汁(beer wort)(a)通气并且添加酵母。在持续通常为5-10天的主发酵之后，将大多数酵母去除，并将所谓的新啤酒(green beer)(b)在通常为0-5℃的低温贮藏1-12周。在这期间，剩余的酵母将与多酚一起沉淀。为了去除剩余的过量多酚而进行过滤。现在可以将经发酵的啤酒(c)在装瓶之前碳化(carbonize)。二氧化碳不仅对感觉的“丰满度(fullness)”和“酒体(body)”有所贡献，还作为风味增强剂，其还发挥增强起泡潜力的作用，并且在延长产品贮藏期限(shelf life)方面发挥重要作用。
不受到任何理论的限制，认为在麦芽制造(malting)和糖化期间的氧化处理是引起瓶装啤酒中的异味(off-flavor)和风味不稳定的主要原因。最重要的氧化产物是DMS(二甲基硫醚)、反式-2-壬烯醛(Trans-2-nonenal)(T2N)。DMS和T2N是啤酒中重要的异味。氧化的原因和活性氧的形成归因于在麦芽制造方法的过程中形成的脂氧合酶(lipoxygenase)和来自反应性铜(Cu+)和铁的非酶氧化，其是一种导致自由基和过氧化氢形成的机制。天然麦芽过氧化氢酶使麦芽中的氧自由基水平降低。然而，天然过氧化氢酶在麦芽制造和初始糖化步骤期间容易失活。对酿造过程应用过氧化氢酶是本领域熟知的(EP1122303)。然而，现有技术的应用包括使用包含过氧化氢酶以及葡萄糖氧化酶的酶组合物。通过使用不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的包含过氧化氢酶的酶组合物，在风味和/或风味稳定性上获得了增加的积极效果。不受任何理论的限制，认为通过本发明的方法获得的对风味稳定性的效果的增加可以通过因葡萄糖氧化酶形成的H2O2而引起的氧化产物量的减少来解释。
在本发明的上下文中，将术语“基本上不含葡萄糖氧化酶”理解为酶组合物中的葡萄糖氧化酶活性与过氧化氢酶活性的比率GODU/CIU小于1，优选地小于0.75，例如小于0.50，小于0.25，小于0.10，小于0.50，小于0.25，小于0.10，小于0.05，小于0.01，小于0.001，小于0.0001，并且最优选地小于0.00001。优选地葡萄糖氧化酶活性在检出水平以下。
根据本发明，在酿酒方法的过程中添加包含过氧化氢酶的酶组合物。所述酶组合物应该不包含或基本上不包含葡萄糖氧化酶。可以在所述方法中的任何步骤添加包含过氧化氢酶的酶组合物，例如添加于醪(mash)、制啤酒用麦芽汁、新啤酒和/或经发酵的啤酒。优选地在糖化步骤之前和/或期间添加所述包含过氧化氢酶的酶组合物。优选将包含过氧化氢酶的酶组合物添加于制粉用谷物和水的混合物(即醪)。可以将过氧化氢酶以0.02-200mg酶蛋白(EP)/kg醪，优选0.2-20mg酶蛋白(EP)/kg醪，更优选1-10mg酶蛋白(EP)/kg醪的量添加。可将过氧化氢酶以1CIU至一千万(10mill)CIU/kg醪，优选10CIU至一百万CIU/kg醪，更优选100CIU至十万CIU/kg醪，并且还更优选1000CIU至1000CIU/kg醪的量添加。
优选地，过氧化氢酶是微生物过氧化氢酶，例如从真菌或细菌分离的过氧化氢酶。优选地，过氧化氢酶源自柱顶孢属菌种(Scytalidium sp.)，优选嗜热柱顶孢(S.thermophilum)的菌株；曲霉属菌种(Aspergillus sp)，优选黑曲霉(A.niger)的菌株；微球菌属菌种(Micrococcus sp.)，优选藤黄微球菌(M.luteus)的菌株。
优选地，所述不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的包含过氧化氢酶的酶组合物是单组分组合物，其通过纯化源自非重组生产菌株的酶组合物获得。用于纯化多肽(包括酶)的方法是技术人员所熟知的。
更优选地，所述包含过氧化氢酶的酶组合物是通过重组技术产生的。通过重组技术，可以获得包含基本上纯的过氧化氢酶的酶组合物，例如不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的组合物。用于重组产生多肽(包括酶)的方法是技术人员所熟知的。
优选的通过重组技术产生的商业酶组合物可以作为来自Novozymes A/S的Terminox UltraTM和来自Genencor Int的Fercolase获得。优选的源自黑曲霉的商业单组分酶组合物可以作为Catazyme从Novozymes A/S获得。
在优选的实施方式中，酶组合物还包含漆酶。
通过本发明的方法产生的啤酒可以是任何类型的啤酒。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性爱儿啤酒(strong ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦味酒(bitter)、出口啤酒(export beer)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。
所述方法可以包括向经发酵的麦芽汁添加水凝硅胶(silica hydrogel)、硅藻土(kieselguhr)和/或聚乙烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone)(PVPP)和进行过滤以提炼嫩啤酒(beer bright)。
在本发明的方法期间应用的过氧化氢酶对重要的引起异味的化合物(off-flavor coursing compound)的浓度具有降低效果。优选地，与通过常规糖化方法产生的麦芽汁或啤酒中的水平相比，将麦芽汁和/或啤酒中DMS的浓度降低，例如分别相对于通过标准Congress(欧洲啤酒协会)糖化方法产生的麦芽汁或啤酒中的水平，降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％或至少60％。优选地，分别与通过常规方法产生的麦芽汁或啤酒中的水平相比，将麦芽汁或啤酒的T2N浓度降低，例如降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％或至少60％。
过氧化氢酶活性
可以用CIU测量过氧化氢酶活性。过氧化氢酶催化一级反应：
2H2O2→2H2O+O2
使用分光光度法在240nm监测过氧化氢的降解。在指定的H2O2浓度吸光率减少指定量所用的时间是一种过氧化氢酶活性的表示方式。将1CIU定义为在pH 7.0和25℃每分钟将降解1μM H2O2，将H2O2浓度从10.3降至9.2mM的酶活性。
反应条件：
酶浓度 大约100CIU/mL
底物浓度 10.3mM H2O2
缓冲液 50mM磷酸盐
温度 25℃
pH 7.0
检测：
波长 240nm
吸收范围 0.450-0.400
时间范围 0.267-0.400分钟(16-24秒)
对CIU标准方法(EB-SM-0250.02/01)的详细描述可以通过请求从Novozymes A/S获得。
葡萄糖氧化酶活性
葡萄糖氧化酶单位(Glucose-oxidase Unit；GODU)是每分钟氧化1μmolβ-D-葡萄糖的酶量。葡萄糖氧化酶(β-D-葡萄糖：氧-1-氧化还原酶，EC 1.1.3.4.)在氧存在下将β-D-葡萄糖氧化为δ-葡糖酸内酯和过氧化氢。产生的过氧化氢在过氧化物酶(POD)存在下氧化ABTS-R(2，2-连氮-二-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸酯(2，2-Azino-di-(3-ethylbenzthiazoline)-6-sufonate))。这会产生蓝绿色(green-blue colour)，其可通过光度计在405nm测量。
反应条件
底物 葡萄糖90mM(16.2g/L)
ABTS 1.25mM(688mg/L)
葡萄糖氧化酶 0.0061-0.0336GODU/mL
过氧化物酶(POD) 2930U/L
缓冲液 乙酸盐，100mM
pH 5.60±0.05
温度 30℃±1
反应时间 36秒(8 x 4.5秒)
波长 405nm
对GODU标准方法(EB-SM-0244.02)的详细描述可通过请求从Novozymes A/S获得。
材料和方法
电子自旋共振(ESR)谱法
为了预知啤酒的风味稳定性，电子自旋共振(ESR)谱法迄今已经使用了多年，用于通过在升高的温度(60℃)加速啤酒陈化(beer ageing)来测定啤酒的所谓的滞后时间(lag time)。将通过这种方法测定的滞后时间值看作啤酒内源抗氧化潜能(endogenous anti-oxidative activity)的判断标准(criterion)，其主要基于还原性化合物(例如SO2、抗坏血酸)，并且其本身与氧化啤酒稳定性直接相关联。
通过ESR谱法的滞后时间测量基于在加速啤酒陈化期间对啤酒中自由基产生的间接检测。能够通过以自旋捕捉器(spin trap)捕获来监测形成的短寿命反应性自由基，并使用ESR谱法来检测长寿命的自旋加合物(spin adduct)。
在特定的时间段中，可以通过啤酒的内源抗氧化活性来延迟或防止自由基形成(滞后期)。在滞后期之后，自由基的量开始随时间迅速增加。
内源抗氧化潜能(EAP)是啤酒样本将在加热至63℃并暴露于大气氧时产生的自由基淬灭(quench)的天然能力。在ESR信号中的滞后期越长，啤酒中的EAP越高。遵循这个观点，自由基将在啤酒中天然地形成。为了比较不同的啤酒，将在给定时间的总ESR(T300-700)信号等同于在特定时间点仍在63℃和暴露于大气时形成的自由基的量。信号越低，则啤酒样本中形成的自由基越少。
定义为BAX(sp)＝EAP-值/ΔSO2-含量[min*l/mg]的饮料抗氧化指标(BAX)测量的是掺料的SO2(spiked SO2)对啤酒的影响，以及与啤酒中存在的天然抗氧化剂的相互作用。
高EAP以及高BAX与较佳的啤酒贮藏稳定性相关(Uchida et al.1996，J.Am.Brew.Chem.54 205-211，Andersen et al.1998.J.Agric.Food Chem.1998，Vol46，pp.1272-1275，Andersen et.al.2000.J.Agric.Food Chem.2000，Vol 48，pp.3106-3111)。
实施例1
制啤酒用的麦芽汁产生自包含35％麦芽(Esperanza Riego)、未发芽大麦15％和50％玉米渣(maize grit)的制粉用谷物。使用0ppm过氧化氢酶(对照)、2ppm过氧化氢酶(按照mg/kg DS)和10ppm对照来糖化所述制粉用谷物。所述过氧化氢酶是高度纯化的来自黑曲霉的过氧化氢酶，其具有132000CIU/ml的活性，并且不具有可检测的葡萄糖氧化酶活性。用酿酒酵母(brewer’s yeast)将麦芽汁发酵成陈贮啤酒(lager beer)。在从发酵台(fermentation rest)转移时，向新啤酒添加以下添加剂；34gr/Hl Britesorb(硅酸镁盐)和2gr/Hl异抗坏血酸钠(sodium eritorbate)。
分析麦芽汁和啤酒，所得结果示于表1和2。
表1.对使用0ppm过氧化氢酶(对照)、2ppm过氧化氢酶(按照mg/kg DS)和10ppm对照糖化的制粉用谷物产生的麦芽汁的分析。
表2.对使用0ppm过氧化氢酶(对照)、2ppm过氧化氢酶(按照mg/kg DS)和10ppm对照糖化的制粉用谷物产生的啤酒的分析。
对啤酒进行由经过训练的品尝组进行的感官分析(sensorial analysis)。用于强制稳定性测试(forced stability test)的方法如下：在搅拌下24小时和在38℃3天。风味稳定性的等级为从1到7。1表示未品尝出氧化，而7是带有高度氧化的啤酒。结果示于表3。
表3.风味稳定性。风味稳定性等级为从1到7，其中数值1表示未品尝出氧化，而7表示高度氧化。
实施例2
使用100％比尔森大麦麦芽(barley pilsner malt)来酿造经典德国比尔森型啤酒(classic German pilsner type beer)。在糖化步骤期间添加酶，然后将麦芽汁煮沸、熟化(maturation)并装瓶。使用的酶是包含葡萄糖氧化酶副活性的黑曲霉过氧化氢酶组合物
以及不含葡萄糖氧化酶副活性的嗜热柱顶孢过氧化氢酶组合物(Terminox 
)。
将瓶装啤酒贮藏在20℃，并在4周和12周之后进行分析。
1：含有3870GODU/g(葡萄糖氧化酶单位)；2：在1.5GODU/g的检出水平以下的水平
实施例3
使用比尔森大麦麦芽和玉米淀粉辅料来酿造比尔森型啤酒。在糖化步骤期间添加酶，然后将麦芽汁煮沸、熟化并装瓶。使用的酶是包含葡萄糖氧化酶副活性的黑曲霉过氧化氢酶组合物
不含葡萄糖氧化酶副活性的黑曲霉过氧化氢酶组合物的纯化样品，以及不含葡萄糖氧化酶副活性的嗜热柱顶孢过氧化氢酶组合物(Terminox )。
将瓶装啤酒贮藏在20℃，并在120天时进行分析。
1：含有3870GODU/g(葡萄糖氧化酶单位)；2：在1.5GODU/g的检出水平以下的水平；3：在1.5GODU/g的检出水平以下的水平。
Claims (7)
1.用于生产啤酒的方法，其包括向醪、发酵麦芽汁、新啤酒(green beer)和/或经发酵的啤酒添加过氧化氢酶组合物，从而改进成品啤酒的风味和/或风味稳定性，所述过氧化氢酶组合物不含或基本上不含葡萄糖氧化酶。
2.根据权利要求1的方法，其中所述过氧化氢酶是微生物过氧化氢酶，例如可从细菌或真菌得到的过氧化氢酶。
3.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述微生物过氧化氢酶可从真菌得到，特别是从属于柱顶孢属菌种，优选嗜热柱顶孢，曲霉属菌种，优选黑曲霉，和/或微球菌属菌种，优选藤黄微球菌的真菌得到。
4.根据权利要求1的方法，其中所述过氧化氢酶通过重组技术产生。
5.根据权利要求3的方法，其中所述酶组合物进一步包含漆酶。
6.不含或基本上不含葡萄糖氧化酶的包含过氧化氢酶的酶组合物在用于生产啤酒的方法中的用途。
7.根据前项权利要求的酶组合物的用途，其中存在漆酶。
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