CN101395267A - 在聚合膜上的工程细胞生产及其在生物工程方面的应用 - Google Patents

Abstract

从一种包括涂有牺牲聚合物层的基质层的结构中制造一种不需依靠支撑物的薄膜，该薄膜因此涂布有可变形的聚合物层。随后将细胞接种在该可变形的聚合物上，培养并形成组织。然后将此基质层从可变形聚合物层上分离出来，生成一种不需依靠支撑物的薄膜，该薄膜在所述可变形聚合物层上包括该组织。在一个实施方案中，所述细胞是肌细胞，该细胞可以被激活来推进或代替所述不需依靠支撑物的薄膜。在另一个实施方案中，所述不需依靠支撑物的薄膜被用于治疗受伤的人体组织。

Description

在聚合膜上的工程细胞生产及其在生物工程方面的应用

政府支持

本发明完全或部分地由美国国防部下属的国防高级研究项目管理局支持，授予原始授权号码FA9550-01-1-0015。美国政府具有本发明的某些权利。

背景技术

在自然界中，活细胞在复杂的生物系统的形成过程中分裂并相互联结，创造出覆盖微米到米规模的结构-功能体系。这种自下而上杠杆遗传作用设计和环境刺激能够指导细胞自组装和器官形成专门的组织和器官。包括神经网络并行处理的能力，横纹肌的力量、张力和效率的综合以及对病原体的免疫反应远远超过了人造系统可以达到的程度。研究在人造合成体系中使用活细胞作为不可缺少的结构单元从而预计能够创造出一类结合了生物级和工程级材料的优点的混合式装置。由于诱导全体细胞进行这一行为的体内环境的不可复制性，构建生物合成材料或具有这种结构-功能关系的工程组织的努力经常失败。例如，设计功能性肌肉组织需要将肌原纤维节和肌纤维基因控制在微米长度规模，同时连续组织的细胞定位和形成需要超过毫米到厘米长度规模的组织提示。因此，为了构建功能性的生物合成材料，生物-非生物的接触面必须包含能够支持多规模偶联的化学和机械性能。

发明内容

在这里描述的是通过分子发动机整体活化的强健的、本身具有收缩性的生物合成材料。所述整体包括一个或一系列肌细胞，例如，骨骼肌细胞、平滑肌细胞、或心肌细胞。做为选择，还可以使用细胞混合物，例如，肌细胞和神经元细胞混合物。横纹肌细胞包括骨骼肌和心肌。在自然界中，横纹肌组织利用由具有收缩性的亚基组成的肌动蛋白-肌球蛋白发动机复合物的高密度系列，其中，所述具有收缩性的亚基又叫作肌原纤维节，肌原纤维节串联集合进入肌原纤维，肌原纤维覆盖心肌细胞和骨骼成肌细胞的长度。这些肌细胞通过转换葡萄糖进入腺苷三磷酸和控制激动-收缩偶联来为发动机蛋白质供给能量，其中，控制激动-收缩偶联是通过调节Ca2+浓度来实现的。根据这些性质，肌细胞已经被开发为一种单细胞线性致动器。这些致动器通过互相联系形成一种机械上和电学上连续的两维(2D)肌肉组织，例如心肌，从而使发动机蛋白质的致动同步。形成的不需依靠支撑物的、表面-修饰的薄膜，例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜使用模式化胞外基质(ECM)蛋白支持串联定位的肌原纤维节和平行束肌原纤维的肌细胞自组装。虽然肌细胞能够提供收缩功能，但是聚二甲基硅氧烷薄膜能够提供补充的弹性和改进的工艺性能。具体地说，这种聚二甲基硅氧烷薄膜厚度限定了肌肉薄片弯曲劲度，同时聚二甲基硅氧烷薄膜的结构完整性使肌肉薄片形成相近的平面形状且不分裂二维肌细胞组织。

设计这些命名为肌肉薄膜(MTF)的构建物来实现需要的功能性。例如，特异性实施方案包括柔软的机器致动器和半自动仪，自动漂浮或行走的的运动型构建物或在外部电刺激下漂浮或行走的运动型构建物。空间构成的肌原纤维节作为具有固有控制系统的有效线性致动器能够调节收缩开始和传播。同步收缩、协调收缩期间肌细胞的缩短使聚二甲基硅氧烷薄膜在收缩期间弯曲并在扩张期间恢复原状。通过设计组织微体系结构的尺寸、形状、厚度以及致动频率能够获得肌肉薄膜的这些理想的表现特征。在一个实施例中，可以控制这些变量来获得需要的游泳速度。此外，在这里使用的用于在半自动漂浮物中直接产生运动型的空间和暂时对称性中断可以作为一种仿生鳗状运动模型。根据这些实施例，肌肉薄膜在假肢器官装补学、组织设计、肌肉功能微装置、工作台上面药物分析(bench top drug analysis)以及机械和化学传感器方面是有用的。

通过提供一种肌肉薄膜进行测定肌肉收缩性的方法，所述肌肉薄膜包括一种涂有这种肌肉的可变形的聚合物层；将这种肌肉薄膜的末端附在或夹在一种支架结构上；施加刺激从而使肌肉收缩；并测量当肌肉收缩时所述肌肉薄膜的位移。通过测定肌肉收缩时相对于肌肉放松时肌肉薄膜曲率半径的变化来测量肌肉薄膜的位移，同时测量肌肉薄膜的收缩率。这些方法对于筛选候选化合物十分有用，所述化合物用于能够促进收缩(例如，缺氧性收缩反应)或松弛(例如，血管舒张)的药物，用于能够治疗或减少病症严重程度的药物，所述病症以异常的肌肉活动(例如，过度收缩、过度松弛、收缩功能失调(例如，心心律不齐或血管痉挛)为特征。例如，在施加收缩性刺激之前将肌细胞与候选化合物相接触，并在有此候选化合物存在的情况下测量收缩程度或收缩率，同时与不存在此候选化合物的情况下的收缩程度或收缩率相比较。薄膜上的细胞是正常的野生型细胞、病态细胞、物理上受损害的细胞或基因改变的细胞。程度或速率上的差异显示候选化合物能够改变肌肉功能，即，增加收缩功能或减少收缩功能。

在其他的实施方案中，使用神经元、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞或皮肤细胞取代肌肉细胞。这些细胞具有功能性活性，是指所附细胞具有至少一种细胞天然环境下的细胞型功能。例如，肌细胞收缩，例如，心肌细胞沿着单一轴线以特定的方向收缩。神经细胞向另一种神经细胞转换或传达一种电信号。使用这种神经元进行，例如，信号传播。使用成纤维细胞进行ECM沉淀。使用内皮细胞构造或修复血管。使用平滑肌细胞减缓、刺激收缩。

这里描述的工程组织结构的一种应用是修复和/或加强哺乳动物，例如，受伤的或患病的人类主体体内相应组织。例如，在假肢器官、组织植入物、和伤口包扎中使用接种细胞的薄膜/聚合物或将接种细胞的薄膜/聚合物用作假肢器官、组织植入物和绷带。这种绷带能够改善通常难以处理的伤害的治愈效果，所述伤害例如，烧伤、褥疮和皮外损伤。这一结构还对修复其他组织缺陷是有用的，例如，用于先天缺陷，例如腹裂或由于退行性疾病造成的器官修复。绷带组合物应该是轻便的并适于在医院(例如，手术室)和野外(例如战场)应用。

附图说明

图1-5描绘了一种构造步骤的示意图，所述构造步骤可以用来制备用细胞和/或蛋白功能化的不需依靠支撑物的薄膜。

图6是一系列心肌细胞的图像，该心肌细胞培养在纤维结合蛋白不同的均质且微定性层上，从而产生具有不同的微结构的二维心肌。

图7描绘了不对称薄膜形状和组织各向异性现象的实施例。

图8提供了从肌肉薄膜中产生的柔软机器致动器各式各样的实施方案的示例图和图象。

图9为由三角形肌肉薄膜形成的myopod提供了例证说明、图像和图表。

图10为由三角形肌肉薄膜形成的myopod提供了例证说明。

图11-13描绘了生物微控制设备以及他们在微流体系统中作为阀门和/或开关的应用。

图14-19描绘了肌肉薄膜以外部封套或包裹物的形式应用于伤口包扎，以及用于包扎枪伤和用作附属肢体暂时的密封剂。

图20-25描述了肌肉薄膜作为移植物用于修复和/或再生硬组织和/或软组织的应用以及用于融合并再生创伤性肌肉伤害和用作支架来充满肌肉组织中的空隙。

图26显示了一种肌细胞沿着其长度方向非均质地定位的矩形肌肉薄膜，其中该肌肉薄膜在末端用一种聚二甲基硅氧烷阻塞物夹住。

图27显示了图26的夹紧的肌肉薄膜，使肌细胞与此薄膜相接触在此肌肉薄膜中产生曲率半径。

本发明前面描述的和其他特点和优势从下面更为具体的描述中变得显而易见。在所附附图中，相似的参考特性涉及不同视图中相同的或相似的部分。这些附图没有必要按照比例绘制或特别强调，而是为了说明下面论述到的具体的原则。

具体实施方式

图1-5描述了用来制造不需依靠支撑物的薄膜的步骤缩略图，所述不需依靠支撑物的薄膜用细胞和/或蛋白功能化，用于生物工艺学应用。如图1所示，底物10是通过用一种牺牲聚合物层14涂布硬性基质材料12来制备的；一种可变形的聚合物层16通过该牺牲聚合物层14暂时被结合到该硬性基质材料12上，并在可变形聚合物层16上提供一种工程表面化学品18来增加或抑制细胞和/或蛋白质粘附。如图2所示，细胞20被接种在可变形聚合物层18上，并培养以形成组织22，在这个实施方案中，组织22包括模式各项异性心肌。该可变形的聚合物层所需要的形状可以按照图3所示进行切割；且由于牺牲聚合物层14溶解能够释放可变形的聚合物层16，如图4所示，包括聚合物层16和组织22的该可变形的薄膜可以用一双镊子23剥离，从而产生图5所示的不需依靠支撑物的薄膜26，然后，该不需依靠支撑物的薄膜26可以被激活并进一步的修饰。

该基层材料12由刚性的或半刚性的材料形成，所述刚性的或半刚性的材料例如，金属、陶瓷或弹性模数大于，例如，1MPa的聚合物。适当的底物实施例包括玻璃盖玻片、聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、硅片，等等，在一个实施方案中，该基底材料是涂有牺牲聚合物层的玻璃盖玻片，所述牺牲聚合物层由聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PIPAAM)形成。通过旋涂、浸铸、喷雾等等方法将所述牺牲聚合物层14应用于所述硬性基质材料12上，其中，所述基底材料12在真空下被装在一种夹盘上，并旋转使该基底沿着其对称轴自旋；将该聚合物滴在基底12上，通过自旋产生的离心力使液态聚合物基本上均匀地传播到基底12的表面。所得牺牲聚合物层14用来暂时保护随后形成在这上面的附加涂层。

在一个实施方案中，所述牺牲聚合物是一种温度敏感聚合物，这种温度敏感聚合物能够被熔化或溶解从而使所述可变形聚合物层16释放。这种聚合物的一种实施例是直线型的、非交联的聚(N-异丙基丙烯酰胺)，这种直线型的、非交联的聚(N-异丙基丙烯酰胺)当脱水时是一种固体，且在37℃下也是一种固体(其中所述聚合物是水合的，但是具有相对的疏水性)。然而，当温度降低到32℃或更低时(其中所述聚合物是水合的，但是具有相对的疏水性)，所述聚合物变成一种液体，因此释放所述可变形的聚合物层16。

在另一个实施方案中，所述牺牲聚合物成为亲水性的聚合物，因此在温度变化时释放疏水性涂层。例如，所述牺牲聚合物可以是水合的交联N-异丙基丙烯酰胺，该N-异丙基丙烯酰胺在37℃下是疏水性的，在32℃下是亲水性的。

在依旧另一个实施方案中，所述牺牲聚合物是一种电力致动的聚合物，这种聚合物在使用电视的情况下成为亲水性聚合物并因此释放包覆在其上的疏水性结构(例如用聚二甲基硅氧烷作为所述可变形的聚合物层)。这种聚合物的实施例包括聚(吡咯)，当被氧化时，聚(吡咯)是相对疏水性的，当被还原时聚(吡咯)是相对亲水性的。电力致动聚合物的其他实施例包括聚(乙炔)、聚(噻吩)、聚(苯胺)、聚(芴)、聚(3-己基噻吩)、聚萘、聚(p-亚苯基硫化物)和聚(对-亚苯基次亚乙烯基)，等等。

在依旧另一个实施方案中，所述牺牲聚合物是一种可降解的生物聚合物，这种生物聚合物可以被溶解来释放包覆在其上的结构。在一个实施方案中，所述聚合物(例如，聚乙酸、聚乙醇酸、聚(乳-乙二醇)酸共聚物、聚酰胺纤维，等等)通过水解进行与时间有关的降解作用。在另一个实施例中，所述聚合物通过酶促作用(例如，通过血纤维蛋白溶解酶进行纤维蛋白降解，通过胶原蛋白酶进行胶原降解作用，通过基质金属蛋白酶进行的纤维结合蛋白降解作用，等等)进行与时间有关的降解作用。

所述牺牲聚合物层14为基底材料12与可变形的聚合物层16提供了暂时粘合剂；同样，例如通过旋转涂布施用可变形聚合物层16。从其上除去之后可以检测所述牺牲聚合物层14在可变形的聚合物层16上的痕迹。能够用于形成可变形的聚合物层16的弹性体的实施例包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚氨基甲酸酯。在其他的实施方案中，热塑性聚合物或热固性聚合物被用于形成所述可变形的聚合物层16。选择性的不可降解聚合物包括聚氨基甲酸酯、硅树脂-氨基甲酸乙酯共聚物、碳酸盐-氨基甲酸乙酯共聚物、聚异戊二烯、聚丁二烯、聚苯乙烯和聚丁二烯的共聚物、氯丁橡胶、聚丙烯酸化物橡胶(ACM、ABR)、氟硅酮橡胶(FVMQ)、氟橡胶、全氟弹性体、四氟乙烯/丙烯橡胶(FEPM)和乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVA)。在依旧其他的实施方案中，生物聚合物被用于形成所述可变形的聚合物层16，其中生物聚合物例如胶原蛋白、弹性蛋白及其他细胞外基质蛋白质。合适的生物可降解弹性体包括水凝胶、弹性蛋白-样肽、聚羟基脂肪酸酯和聚(甘油-癸二酸)。合适的非弹性体，生物可降解聚合物包括聚乙酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物。

聚二甲基硅氧烷可变形的聚合物层16的厚度可以通过聚二甲基硅氧烷预聚合物的粘性和旋转涂布的速度来控制，在完成之后厚度范围在14微米到60微米之间。在混合所述聚二甲基硅氧烷预聚合物之后，由于交叉结合密度增加，its粘性开始增加。利用混合(0小时)和凝胶化(9小时)之间的粘性变化旋转涂布不同厚度的聚二甲基硅氧烷薄膜。旋转涂布之后，所述聚二甲基硅氧烷薄膜或者在室温下被完全的制备或者在65℃下被完全制备。

然后，使用工程表面化学品18统一地或有选择地加工所述可变形的聚合物层16从而引起(或抑制)大肺泡上皮细胞生长与功能。工程表面化学品18可以通过暴露于紫外线或臭氧来提供，或通过酸或碱洗涤或血浆处理来提供，从而增加所述表面的亲水性。在其他的实施方案中，所述表面化学品18可以选自下列基团：

(a)指导细胞粘着的细胞外基质蛋白质(例如，胶原蛋白、纤维结合蛋白、层粘蛋白、等等)；

(b)指导对细胞型具有特异性的细胞功能的生长因子(例如，神经生长因子、骨形态学蛋白质、血管内皮生长因子等等)；

(c)脂质、脂肪酸和类固醇(例如，甘油酯、非甘油酯、饱和和不饱和脂肪酸、胆固醇、皮质类甾醇、性类固醇、等等)；

(d)糖及其他生物活性碳水化合物(例如，单糖、低聚糖、蔗糖、葡萄糖、糖原、等等)；

(e)碳水化合物、脂类和/或蛋白质的综合，例如含蛋白多糖(蛋白质核心上附有硫酸软骨素侧链、蛋白质核心上附有硫酸皮肤素侧链、蛋白质核心上附有肝素侧链、蛋白质核心上附有硫酸乙酰肝素侧链、和/或蛋白质核心上附有硫酸角质素侧链)；糖蛋白(例如，选择蛋白、免疫球蛋白、例如人绒毛膜促性腺激素的激素、甲胎蛋白和促红细胞生成素(EPO)，等等)；含蛋白脂质(例如，N-豆蔻酸化蛋白质、棕榈酰化的蛋白质和异戍二烯化的蛋白质)；和糖脂(例如，甘油糖脂、鞘糖脂、葡糖基磷脂酰肌醇、等等)；

(f)生物学衍生的均聚物，例如聚乙酸和聚乙醇酸和聚L赖氨酸的均聚物；

(g)核酸(例如，DNA、RNA等等)；

(h)激素(例如，促蛋白合成类固醇、性激素，胰岛素、血管紧张素，等等)；

(i)酶(类型：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶；实施例：胰蛋白酶、胶原酶、基质金属蛋白酶、等等)；

(j)药物(例如，β阻滞药、血管扩张剂、血管收缩剂、止痛药、基因治疗剂、病毒载体、抗炎药，等等)；

(k)细胞表面配位体和受体(例如，整合素、选择蛋白、钙粘附素、等等)；

(1)骨骼丝和/或致动蛋白质(例如，中间纤维、微管、肌动蛋白微丝、动力蛋白、运动蛋白、肌球蛋白、等等)；和

(m)亲水性聚合物(例如，聚环氧乙烷或普卢兰尼克)被用于减少或防止细胞/蛋白质粘附。

使用一种技术可以使穿过表面时表面化学剂的变化变得均匀或进行空间定型(例如，特点是大小在5、10、20、50、100纳米到1-1,000微米范围内或者到更大的规格)，所述技术例如，但不仅限于，软印刷技术、自组装、汽相沉淀和照相平板印刷术。下面依次对这些技术中的每一个进行讨论。

a)软印刷技术

在软印刷技术中，使用弹性印模、塑模和适合的光掩模制造或复制所需结构(特别是那些测量规模在1纳米到1微米之间的结构)。这种软印刷技术的一种是使用聚二甲基硅氧烷印模的微接触印刷。微接触印刷已经通过纤维结合蛋白来实现，且可以延伸到其他细胞外基质蛋白质中应用，所述细胞外基质蛋白质包括但不限于层粘蛋白、胶原蛋白、纤维蛋白等等。由于软印刷技术的可变性，其他的生物聚合物也可以被使用。微接触印刷种使用的聚二甲基硅氧烷印模所产生的模式类型上生物聚合物的几何结构不受限制，即使受限制的话，也是很小的限制。在制造集成电路中使用的显微处理技术可以得到一些印模，在这些印模上的图案依次跨越穿过这些印模。同样地，可利用的设计包括几乎所有可以被现代计算机辅助设计软件绘制出的设计。使用带有相同或不同的蛋白质的相同或不同的印模可以将多层生物聚合物一层一层的刷上，从而形成一种在可变形聚合物层16之上的完整的聚蛋白质(聚生物聚合物)层，该聚蛋白质层随后可以被释放并使用。

b)自组装

各式各样的生物聚合物会自发地形成自组装结构。不带有限制性的自组装实施例包括将胶原蛋白组装进入微纤维中、将肌动蛋白组装进入肌原纤维细丝中和将DNA组装进入双链及其他依赖碱基对序列的结构中。所述自组装可以发生在可变形聚合物层16上，从而产生毫微米到毫米规模的空间组成的生物聚合物层。进一步地，自组装可以与软印刷技术结合，在软印刷技术定型的生物聚合物上产生一种自组装层；做为选择，所述方法可以以相反的顺序进行。依靠分子间作用力的力量和稳定性的所述自组装生物聚合物可以或不可以被交联剂(例如，戊二醛、甲醛、多聚甲醛、等等)稳定，从而维持该生物聚合物层在可变形聚合物层上的完整性。换句话说，范德华力、氢键作用力、疏水性/亲水性相互作用等等造成的分子间作用力是足够强的，可以在可变形聚合物层16上使生物聚合物支架团结在一起。

c)汽相沉淀

使用固体遮蔽物选择性的控制可变形的聚合物层16表面的入口，通过从水蒸气相中浓缩，生物聚合物可以在易感区域沉淀出来。为了将生物聚合物引入蒸汽相，在控制环境的反应室内进行沉淀，在此反应室内压力减少温度上升从而使生物聚合物的蒸汽压接近反应室环境的压力。通过水蒸汽沉淀产生的生物聚合物表面可以与通过自组装和/或软印刷技术产生的生物聚合物表面相结合。

d)图案化的光交联作用

图案化的光、x射线、电子束或其他电磁辐射可以通过照相平板印刷术穿过遮蔽物；作为选择，在立体平版印刷技术中，射线可以以聚集的光束形式被使用，从而控制可变形的聚合物层16上生物聚合物的结合位置。可以对生物聚合物使用照相平板印刷术来促进聚合物链的交联或解开，从而使暴露于光线中的表面部分在展开液中变的可溶或不可溶，所述生物聚合物本身是光交联的或能够通过释放光依赖型基团或通过次级光敏化合物改变反应活性，所述展开液随后依靠应用于暴露出的生物聚合物只剩下所需的完整图样。在本身具有光敏性的生物聚合物溶液中，或在包含其他光敏性化合物的生物聚合物溶液中提供生物聚合物。

可以使用的光交联方法的实施例包括：(a)蛋白与DNA的紫外线光交联(如Paleologue等人的文献“光引发的蛋白与5SRNA和60S核糖体亚基中28-5.8S RNA的交联”Eur.J.Biochem.149，525-529(1985)所述)；(b)哺乳动物细胞内通过光反应性氨基酸位点特异性整合作用进行的蛋白光交联作用(如N.Hino等人的文献＂Protein Photo-Cross-Linking in Mammalian Cells bySite-Specific Incorporation of a Photoreactive Amino Acid，＂(哺乳动物细胞内通过光反应性氨基酸位点特异性整合作用进行的蛋白光交联作用)Nature Methods 2，201-206(2005))；(c)使用连吡啶钌或卟啉钯作为蛋白质的光致敏交联剂(如美国专利6,613，582号(Kodadek等人)所述)；和(d)肝磷脂与结合的蛋白质通过交联剂2-(4-叠氮苯基氨基)-4-(1-铵基-4-氮杂双环[2，2，2]-1-辛基)-6-吗啉-1，3，5，-三嗪氯化物进行光交联作用(如Y.Suda等人的文献＂Novel Photo AffinityCross-Linking Resin for the Isolation of Heparin Binding Proteins，＂(用于分离肝磷脂结合蛋白的新型光结合交联树脂)Journal ofBioactive and Compatible Polymers 15，468-477(2000)中所述)。

为了附着细胞，将底物放入带有细胞悬浮液的培养基中，如图2所示，允许细胞20沉淀并附着于表面18上。在粘合表面处理的情况下，细胞与所述材料以表面化学所规定的方式结合。对于有图案的化学品，细胞根据生长与功能适应图案。被附着的细胞类型的实施例包括用于以肌肉为基础的运动的肌细胞(例如，心肌细胞)；用于电信号传播的神经细胞；用于细胞外基质传播的成纤维细胞；用于血液接触的内皮细胞；用于缓慢的紧张性收缩的平滑肌细胞；和皮肤细胞。

在生理环境下(例如，在37℃下)在恒温箱中培养位于底物上的细胞直到所述细胞形成两维(2D)组织(即，厚度小于200微米的细胞层，或在特别的实施方案中，厚度小于100微米的细胞层，或只是单细胞层)，通过工程表面化学确定细胞的各向异性现象或各向同性现象。使用解剖刀32在可变形的聚合物膜16中切割出指定的形状24(适合本应用的形状)(如图3所示)，冲压、冲模或雷射。然后将牺牲层14溶解或活化，从而释放将所述可变形聚合物16从刚性基层12中释放出来(例如，通过在温度低于35℃时滴定；如图4所示，随后切割出的形状24自动浮起或被轻轻地剥离。如图5所示，要求形状的不需依靠支撑物的可变形膜26可以通过采用/形成三维(3D)构造进一步地进行修饰，随后被整合到多结构装置中或被制备从而应用于组织工程、再生支架，用于例如，生物学驱动的控制设备、台上药物分析、伤口包扎、人工脏器和用于修复软组织和硬组织的移植物的制造和使用。

在特定的实施方案中，所述细胞外基质蛋白质、纤维结合蛋白被附着到所述聚二甲基硅氧烷中。培养在不同均匀的微模式纤维结合蛋白层上的心肌细胞生产具有不同微观结构的二维心肌。均匀的纤维结合蛋白包覆层产生各向同性的没有长程序的二维心肌(如图6A和6B所示)。对于肌原纤维节的α-辅肌动蛋白的染色显示肌原纤维节在任何轴向上都没有优先定位。高低密度互变的20-微米-宽的纤维结合蛋白线的微模式(如图6C和6D所示)产生连续各向异性的二维心肌。对于肌原纤维节的α-辅肌动蛋白的染色显示肌原纤维节在单个轴向上一致的轴向排列。通过印模的相对浓度和背景细胞外基质蛋白质的相对浓度可以控制二维组织的各向异性现象。互变20-微米-宽的高密度纤维结合蛋白和普卢兰尼克的微模式(如图6E和6F所示)产生各向异性ID心肌条的不连续系列。这些组织条进行电解相互分离从而预防整个肌肉薄膜的同等自发性收缩。对于肌原纤维节α-放线素的染色显示肌原纤维节在单个轴向上一致的轴向排列。该图像代表10X相；核、F-肌动蛋白和肌原纤维节α-放线素的63x萤光免疫检验法；和单独得自肌原纤维节α-放线素的信号，用于强调肌原纤维节定位的方向。

在一个实施方案中，将初级新生鼠心室肌细胞接种在纤维结合蛋白-包覆的聚二甲基硅氧烷上并在使用前在37℃下培养3到6天。所述肌细胞自发地联合所述纤维结合蛋白，通过图案化的细胞外基质的几何形态标记肌纤维基因。邻近的肌细胞自发产生通过肋的机械连接和缝管隙连接形式，从而建立通过遗传编成通道的电气连接。一旦形成心肌，从恒温箱中除掉肌肉薄膜，且将培养基换成蒂罗德溶液，从而为延长收缩提供需要的离子和葡萄糖浓度。当冷却至室温时，用解剖刀手动制备理想的肌肉薄膜形状，同时使PIPAAm层水溶解并将所述肌肉薄膜释放入溶液中。依赖于所述组织微体系结构和肌肉薄膜形状，构建物自动收缩或更准确的通过外界刺激电极控制收缩。因此，组织构造、薄膜形状和厚度和体外起搏术达到设计的功能性。

图7描述了使用这里公开的方法可以实现的对称薄膜形状和组织各向异性现象的实施例。这种构建物不产生实际替换作用，但可以用作致动器。各向异性的二维组织规定收缩作用的主轴线。在各向异性现象的各个方向上增加收缩上的形变作用，因此，该形变作用可以被最大化用于长度更长的不间断的肌原纤维。如图7的左侧所示，样品是具有各向异性现象的矩形36，平行于长度、y(即，矩形36沿着长度y方向上带有肌细胞定位)，其中，较大的单一轴向位移在这种情况下是明显的，只沿着长度，y的方向。线条指明肌细胞的定位，且在收缩期间从水平面弯曲出的末端用箭头指明。在该示意图的右边，表示了两个静止的图像显示了处于0.00秒松弛状态(在最前的部分，心脏舒张)下和在大约0.25秒之后收缩状态(在最前的部分，收缩)的构建物。通过使用圆周42作为横坐标轴圆周44作为纵坐标轴指明记录位置，并在图表右侧绘制单一收缩的曲线。在每个图像中的标杆是1毫米。

在这种情况下和在其他具有不同形状(例如正方形和三角形)以及不同肌细胞定位方向的情况下，所述肌肉薄膜沿着心肌定位轴方向收缩，沿着与轴成直角的方向具有最小的收缩。肌肉薄膜的弯曲程度取决于两个因素，所述聚二甲基硅氧烷薄膜的弯曲劲度和肌肉收缩作用的强度。对于同样大小的矩形，沿着长度、Y方向定位的肌细胞收缩大约800微米(如图7所示，图表)，而肌细胞沿着同样大小矩形的宽度、x方向收缩大约175微米。沿着任何一种给定轴的肌肉薄膜的弯曲劲度与弹性模数、厚度和宽度一起增加，而长度却有所减少，所述给定轴更像一种支架。

当从盖玻片上释放时，聚二甲基硅氧烷薄膜不再被坚硬的底物限制因而可以自由的适应三维构造。较厚的膜，例如用于对称的矩形、正方形和三角形实施例的膜只在肌细胞收缩期间从水平面当中弯曲出来。然而，较薄的膜从肌肉薄膜从盖玻片上释放时就开始弯曲，在收缩期间产生两种可能的薄膜弯曲方式。在其凸面上具有肌细胞的构建物25′(图8A)收缩并向水平面内弯曲薄膜26′，增加(乃至反向增加)薄膜的曲率半径。相反，在凹面上具有肌细胞的构建物25＂和25′′′(图8B和8C)收缩并向平面外弯曲薄膜26＂和26′′′，从而减少薄膜的曲率半径。这两个不同的薄膜构建物可以相互补充从而设计各种在收缩期间具有增加或减少的薄膜曲率半径的不同的构建物。

通过这种技术可以产生多种致动器及其他装置，在一个实施方案中，由大长宽比形成的螺旋状线性致动器、带有相对于薄膜长轴方向离轴定位的肌肉纤维的矩形薄膜26能够环向、轴向延伸，并可以以可变节距改变方向并反向旋转(如图8A所示)。使用65℃下处理的聚二甲基硅氧烷产生肌肉薄膜构建物，该构建物首先处于一种放松的，几乎平坦的状态，随后收缩卷成螺旋状。作为一种柔软的机器致动器，从平坦的矩形向三维螺旋形的转变产生轴向位移和带有简单制造步骤的旋转。使用这种系统可以产生多种二维形状，这些二维形状将会折叠成复杂的三维形状。当起搏状态在0.5赫兹20伏时，该薄膜条26′在肌细胞收缩期间旋转并延长，显示出大约200微米的心动扩充，同时伴随有大约55°旋转。

图8B显示了以薄矩形条形式存在的夹子26＂。所述夹子26＂具有沿着长度方向定位的各向异性的肌细胞(且在凹面上)且在该长度方向上产生端部。在收缩期间，夹子26＂的回合直到他们接触并由于接触力终止。与简单地打开和关闭一次不同，夹子26＂可以通过增加起搏速率从开放状态(心脏舒张)转变到关闭状态(峰值收缩)，直到肌肉薄膜的二维心肌进入强直收缩状态。在图8B中，在5赫兹起搏状态下可以得到一种关闭的夹子，带有在1和2赫兹起搏状态下开放/关闭状态的中间产物，因此显示控制肌肉薄膜功能性和瞬时状态的能力，所述肌肉薄膜的功能性和瞬时状态基于电起搏的软机器致动器。

在图8C中，盘绕的薄膜条26′′′是带有沿着长度方向定位的各向异性心肌(在凹面上)的矩形，该薄膜条在肌细胞自发收缩期间在盘绕和解开盘绕的状态下转变。在这种结构中，肌肉薄膜26＂从卷起状态到展开状态之间转变，并不断重复，环状收缩不需要体外起搏术。这种自我起搏可能是由于由显著的机械变形引起的展开-活化的离子通道的缘故。

对于每种构建物类型，示意图给出了在从盖玻片上分离之前25’、25”和25”’的形状，其中用线条指出了各项异性的肌细胞定位。侧面图显示了从盖玻片上释放之后薄膜的三维构造，箭头表示了薄膜的弯曲方向。静止图片显示(a)图8A显示了0.00秒时处于松弛状态的薄膜片26’；(b)图8B显示了在0.60秒时处于收缩状态的薄膜片26”；(c)图8C分别表示了在0.60秒和0.000秒时处于两种状态下的薄膜片26”’。每个图的比例标尺为1毫米。

肌肉收缩的速度要比放松的速度快，这是通过聚二甲基硅氧烷的复原弹性作用驱使的。在凹面还有肌细胞并延长度方向排列的大长宽比矩形片26”’清楚地说明了这一问题(如图8C所示)。

在图9A中，myopod由带有各项同性心肌(在凸面上)的三角形肌肉薄膜54通过手动折叠成三维构象56破坏对称性而组成。虽然肌肉薄膜最初的形状是一种等腰三角形54，使用镊子将三角形54的端点58折叠起来(如图9A所示从右侧向下折叠到三角形高的一半)。室温处理的聚二甲基硅氧烷是疏水性的且在水溶液中相互粘连，因此可以方便的制备复合的三维构造。这能形成一种带角的支架60，通过腿62的位移对三角其他部分产生的推力，由于在推力作用下接触、维持定向位移的角的存在，支架60只能够按照一个方向滑动。图9A的示意图表明在从盖玻片上释放之前三角形54的形状，其上带有用统一的阴影表示的各项同性的心肌。侧面图显示释放后人工形成的三维构象，且箭头表示了薄膜弯曲的方向。视图结构的分析表明myopod通过从放松的状态(0.00秒)到收缩的状态(0.60秒)延伸后腿62穿过皮氏培养皿的底部。图9B绘制了myopod的前部，来表示当脉冲为1赫兹和20伏特时，沿着恒定的方向持续定向的平均速度为大约8毫米/分钟的移动。每个图的比例标尺为1毫米。

在图10中，三角形的游泳片64使用多刻度对称的缺口来复制鳗状水上游泳。对称的缺口作为一个整体，在收缩期间产生定向的推动力，因此，可以作为最简单的水上运动方式。通过时间与空间上对称的缺口，通过模仿水上生物的肌肉结构和形状标记从自动性向机动性的转变可以实现定向移动，所述水上生物例如美洲鳗。通过改变肌肉薄膜的空间结构和聚二甲基硅氧烷底物的形状和肌肉组织构造，可以实现满足机动性所需的空间构造。在三角形游泳片64中，聚二甲基硅氧烷薄膜的厚度大约是30微米，且此肌肉薄膜被切割成等腰三角形，肌肉薄膜上带有沿着高的方向定位的各项异性心肌(水平的，如图10A上面的图所示)，产生只沿着其轴方向的收缩。这种形状使三角形64的底部66到端点68之间硬度的降低，因此沿着三角形64高方向上的心肌使产生的张力最大化，从而像尾巴一样拉住三角形端点68。这种等腰三角形形状的肌肉薄膜被用来破坏对称性。带有沿着长度定位的肌细胞的相似大小的矩形(如图7所示)原位振荡。

图10A表示了脉冲为1赫兹，20伏时带有与各项同性的心肌细胞(三角形70)相反的各项异性心肌细胞的相似形状的三角形游泳片(三角形64)的位移。表示了机动性方面明显的区别。当两种构建物在同一时刻开始时，13秒之后，各项异性的三角形游泳片移动，而各项同性的三角形游泳片不移动。游泳片64和70的痕迹表示各项异性的游泳片64比各项同性的游泳片70快大约5倍。通过平行于三角形非对称轴(即，高度方向)方向定位肌细胞可以得到所述肌肉薄膜各向异性的三角形游泳片64。图10B通过线条表示了所述肌细胞定位；箭头指明了薄膜弯曲方向，其中图10B还指出了肌细胞收缩时向纸水平面内弯曲的部分。通过随后的视频图像在收缩过程中跟踪三角形游泳片64显示通过将三角形的端点(顶点)推向底线方向能够使松弛的构建物收缩。当肌细胞放松时，三角形恢复成原来的形状，产生一种推力使构建物向前移动。三角形的游泳速度是起搏率的函数。自发收缩及时产生0.5到0.75毫米的位移。脉冲在0.5赫兹、1.0赫兹和2.0赫兹时产生环状收缩，这种环状收缩在1.0赫兹时使游泳速率达到24毫米/分钟的峰值。

单独的肌肉薄膜的形状是不足以产生游泳运动的。与相似的三角形游泳片相比，一个具有各项同性心肌的64和另一个具有各项异性心肌的70(图10A)显示了组织的微观构造产生推力，尤其是各项异性组织中增加的单轴向应变和受力。在13秒的时间里，各项异性的游泳片64以3毫米/分钟的速率按照恒定的方向前进，前进的距离比各项同性的游泳片70远5倍，各项同性的游泳片70以0.3毫米/分钟的速率向一侧移动。而且，各项同性的游泳片70移动的线路是随机的，各项异性的游泳片64移动的方向是定向的。

三角形游泳片的体外起搏术可以用来使游泳速率最大化，即，用于破坏短期对称性。为了使速度最大化，游泳片需要持续的运动。如果频率太低的话，游泳片会在收缩时停止；如果频率太快，收缩会在完成之前重复，造成游泳片的原位颤动。起搏频率的最佳位置出现在1赫兹脉冲时，从而使肌肉薄膜游泳片达到24毫米/分钟的游泳速度。根据生物相关性，通过滑片确定的游泳片的机械效率是0.024，这个数量级低于生物制动的鱼和美洲鳗，但是仍然对单层肌细胞制动的大规模设备有重要影响。

肌肉薄膜表示了一种有效的用于在不需依靠支撑物的聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性膜上产生工程二维心肌的技术，该技术能够广泛的用于软机器人技术、组织工程和心脏生物力学研究上。大量软机器致动器表明各种方法和应用参数可以被控制用来产生独特的功能性，包括弯曲、扭曲、直线平移、旋转、抓握、抽吸、行走和游泳。通过从生物体中借用生物设计原理，这些能力可以被用于建造更先进的软机器设备，所述生物体例如章鱼，章鱼使用带有弹性的、由肌肉组成的附属肢体进行复杂的运动。可以人工模仿章鱼的臂膀，使用外围马达设计也能产生两足动物的运动，所述外围马达设计并不需要大脑来起作用。另外，肌细胞提供影响深刻的固定控制系统，这种系统具有高密度的化学能量，带有葡萄糖分子从而刺激ATP合成；自动自组装入带有电连续性的单层中；且调节外界刺激，例如电刺激、机械晃动和药物相互作用引起的收缩。由于一些肌肉类型，例如心肌，并不分裂，因此需要初级的动物源，肌肉薄膜依赖于来源可靠的肌细胞来制备组成有效的组织用于大量生产。因此，肌肉薄膜规模放大用于大规模生产是以哺乳动物骨骼肌肌细胞或来源于生物体的心肌肌细胞为基础的，所述生物体例如斑马鱼，这两种肌细胞表示肌肉组织可以在体内和体外复制。

通过这里描述的方法产生的肌肉薄膜可以在很宽的范围内被使用。在第一组实施方案中，如图11-13所示，肌肉薄膜26的一端(作为一种枢纽)84被固定，且在微流体系统中作为一种阀(开关)80。肌肉薄膜26被安装在一种液体流动通道82中，且被设置成在收缩状态(如图11所示)或在松弛状态(如图12所示)时关闭通道82并在相反的状态下打开通道82。因此，根据选择的肌肉薄膜26在其松弛状态下的方向性，阀80可以被设计成具有一种默认打开火关闭设计。在图13所述的实施方案中，肌肉薄膜26在定向液体流的分支处被安装作为一种开关。如图所示，肌肉薄膜26在其松弛状态下会阻碍右下方的通道86，并重新引导液体从左面的通道82流入右上方的通道88。当肌肉薄膜26(在薄膜的上侧带有肌肉组织)收缩时，它会向上弯曲关闭上侧通道88，直到液体流入目前打开的通道86中。通过外界刺激或对液体直接刺激的应答可以控制肌肉薄膜26的松弛状态和收缩状态。来自液体的刺激的例子是液体中含有的肌肉松弛剂，这种肌肉松弛剂可以被用于例如芯片实验室设备中(例如，作为其中的智能阀)或被应用于血管扩张肌中(作为治疗剂)。

在其他的实施方案中，类似的，肌肉薄膜可以用作一种门、开口或芯片实验室设备操作间的盖子，其中，该操作间被处于松弛状态的肌肉薄膜所覆盖，且此肌肉薄膜包含一种组合物来消除药物或其他重要组合物的影响，其中，当肌肉薄膜暴露于重要的组合物之中时，肌肉薄膜会收缩，因此释放相反的组合物。例如，当肌肉薄膜暴露于血管收缩剂中时该肌肉薄膜可以被设计成收缩状态，因此为操作间提供入口，在操作间中包含血管扩张剂。

在依旧另一个实施方案中，肌肉薄膜(尤其是滚成圆管形的)可以被用作一种泵，薄膜的收缩和松弛可以使液体发生转移。在依旧另一个实施方案中，肌肉薄膜可以以之前所述的行走片或游泳片的形式存在；且可以与需要被运输的物体相附着。因此，行走片或游泳片可以作为所附着物体的推动物或划桨。事实上，游泳片可以被安装在物体上并设计成与鱼身上的鱼鳍相同的方式运行，其中，游泳片的拍打作用推动附着物体穿过流体。

该肌肉薄膜还可以被用于听觉应用，在一个实施方案中，将涂有心肌的薄膜调整到收缩状态，因此在暴露于指定的可闻信号时可以传递信号。在其他的实施方案中，所述肌肉薄膜被用作一种仿生的感觉系统。例如，该肌肉薄膜可以作为机器人的触觉系统，其中，所述肌肉薄膜对受到的物理刺激起反应，所述物理刺激例如生物体或物体在其上运动。在肌肉薄膜被构造成夹子形状时，薄膜四周收缩，从而包含住或抓住物体或生物体。

进一步地，所述肌肉薄膜可被用于基于细胞的模拟计算机，其中该薄膜与刺激源相结合，所述刺激源例如电势或张力。当暴露于所述刺激条件下时，所述肌肉薄膜输出信号(更像打开开关)，这时肌肉薄膜更像是一种力量放大器，例如，以较大的收缩应答微小应变。

以弹性模片移植物材料形式存在的肌肉薄膜还可以用于结合肌肉组织并为组织再生和/或增加的功能提供导管。该移植物可以是永久的或在一段时间内可生物降解的。进一步的，该移植物生物可降解的附着于肌肉的两侧或者粘附一侧另一侧不粘附。该移植物以预切割、定型配件的形式用于特定的应用，他以被剥离的薄片形式被提供，从而切割成指定大小的薄片用于靶向应用。该移植物可以作为一种被动元件，或可以被动力驱动来增强宿主细胞的功能。该移植物还可以作为一种模板用作再生组织各向异性(图案化的)生长，且适合于跌打损伤或者消耗病。

在一个实施方案中，植入该肌肉薄膜并附着在眼部作为眼部肌肉的替换物。

在其他的实施方案中，如图14-19所示，该肌肉薄膜被用于包扎外部伤口。一种弹性材料，例如聚二甲基硅氧烷，被用作这种可变形的聚合物。聚二甲基硅氧烷薄膜被制造成封套90的形式(通过，例如，在滚筒上旋转涂布)或包裹物(带)形式。微模式化的细胞外的基质蛋白质被用于聚二甲基硅氧烷层从而指导成纤维细胞和免疫细胞的生长(增加伤口愈合并使伤痕最小化)和/或装载上抗生素来治疗感染。

例如，如图14-16所示，所述绷带可以被用于带有枪伤94的肢体92(如图14所示)，如果可能的话，绷带可以起到控制流血并清洁受伤位点的作用。在本实施例中，所述绷带以弹性封套90的形式存在(如图15所示)同时其内表面96进行过涂布处理，例如，涂上抗生素层。展开弹性封套90并滑过病人的脚98，放置在伤口94(如图16所示)。做为选择，除了封套，可以使用同样材料制成的包裹物在伤口位点包裹肢体，包裹方式与ACE绷带所使用的包裹方式相同。因此，这种包裹物可以被用于覆盖更多种类的伤口形状。

在另一个实施例中，如图17-19所示，所述肌肉薄膜可以被用作一种临时密封物来保护被截断的肢体。如图17所示，首先清洁被截断的部分腿100；以封套102的形式存在的肌肉薄膜具有封端104和内部处理过的表面(例如，用抗生素处理的表面)，所述肌肉薄膜滑过肢体被截断的末端106并将其密封(如图19所示)。聚二甲基硅氧烷是氧渗透性的，从而允许呼吸作用的进行；然而，被截断的肢体100通过冰冻来延长其存活期用于重新附着到躯体上。

在依旧另一个实施方案中，如图20-25所示，肌肉薄膜被用作一种移植物来修复并使软组织或硬组织再生。薄膜的机械性能与所述组织的机械性能相配，表面化学物的选择取决于移植物的作用。所选择的表面化学物或者能够促进细胞粘附并指导细胞生长，或者可以防止细胞附着从而避免外科粘连。根据组织类型、是否需要支持物和再生能力，这种薄膜可以是能够生物降解的或者是不能生物降解的。

例如，所述肌肉薄膜可以被用作移植物用于修复并再生创伤损害的肌肉。图20显示了受到创伤损害的小腿108。在这种情况下，展开附着有再生长肌肉的有弹性的移植物110。如图21所示，所述移植物110是一种聚二甲基硅氧烷薄膜，在此薄膜的两侧带有细胞外基质蛋白质定型，从而粘附并指导所述骨骼肌细胞和组织碎片(装载有抗生素)的定位生长。所述肌肉薄膜移植物110被移植入小腿108的创伤性损害肌肉并缝合现有肌肉，如图22所示；在植入薄膜移植物110之后，伤口愈合。

在另一个实施例中，如图23-25所示，所述肌肉薄膜被用作移植物112用于修复并再生肌肉空隙，例如，病人因为伤害、肿瘤等等在肌肉中产生洞114。所述移植物112是一种聚二甲基硅氧烷膜，这种聚二甲基硅氧烷膜在一侧用细胞外基质蛋白质和生长因子处理过的、并在另一侧带有一种无粘着力的材料(例如，普卢兰尼克、聚环氧乙烷，等等)。做为选择，聚二甲基硅氧烷可以被任何一种类似的弹性材料所取代，所述弹性材料例如聚氨基甲酸酯、热塑性弹性体等等。

收缩功能和药物筛选的评价

下面对肌肉细胞的收缩功能进行了评价。如图26和27所示，使用肌肉薄膜测定二位心肌的收缩性。例如，将肌肉薄膜切成矩形，在其上有沿着长方向各项异性定位的肌细胞。将肌肉薄膜的一端固定PDMS固定物中。图26显示了被固定的肌肉薄膜，该肌肉薄膜带有处于松弛状态下的肌细胞，因此，肌肉薄膜基本上是平坦的。当肌细胞收缩时，他们使肌肉薄膜弯曲，如图27所示。由于PDMS的机械性质是已知的，由肌细胞在收缩过程中产生的作用力通过测定肌肉薄膜的曲率半径来计算；如图27所示，使用图像处理软件确定曲率半径，其中虚线显示了以曲率半径为半径的圆。这种仪器可以有效地用作台上系统来研究模拟疾病状态(肌病)的肌肉薄膜的收缩性或病理治疗作用。例如，所述薄膜可以用于确定不同肌病在收缩率方面的区别，用于药物筛选，且可以用于确定药物对正常肌肉收缩性和肌病的影响。可以使用由心肌细胞、平滑肌细胞或骨骼肌细胞组成的二维肌肉进行该过程。

对于药物筛选，将肌肉细胞(肌肉薄膜)与候选化合物相接触。例如，将肌肉薄膜进入包含药物的介质池中，测定药物对肌肉功能的作用。作为选择，将肌肉薄膜进入包含候选化合物的池中，随后在测量肌肉功能之前清洗细胞。接种在薄膜上的细胞是正常的肌肉细胞(心肌细胞、平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、不正常的肌肉细胞(例如来源于染病组织的肌细胞或通过物理方法或基因手段改变产生不正常或病理症状或功能的肌细胞)、或以不正常或异常的构想接种/印刷到薄膜上的正常细胞。在一些情况下，肌肉细胞和神经细胞存在于薄膜上。肌肉功能的评价包括确定收缩程度，即，肌肉薄膜的弯曲程度，以及与正常参照物或参照物薄膜不存在候选化合物时相比较时，松弛状态下的收缩速率或频率。收缩程度或收缩速率的增加表明化合物在治疗或缓解与肌肉疾病有关的病理时时有效地，所述肌肉疾病例如肌无力或肌肉消耗。这种曲线还表示了所述试剂作为血管收缩剂是有效的。收缩程度的减少或收缩速率的减少表明该化合物作为血管扩张剂是有效的，能够有效地治疗以收缩过度或肌肉过厚影响功能为特点的肌肉或神经肌肉疾病。

按照这种方式评价的化合物在处理或改善如下所述的肌肉和神经肌肉病理学方面是有效的。肌肉营养不良包括Duchenne(杜兴氏)肌肉营养不良症(DMD)(又名假肥大性肌肉营养不良症)、Becker(贝克尔)肌肉营养不良症(BMD)、埃-德二氏肌肉营养不良症(EDMD)、肢节型肌营养不良症(LGMD)、面肩胛肱型肌营养不良症(FSH或FSHD)(又名Landouzy-Dejerine肌肉营养不良症)、肌强直性营养不良(MMD)(亦称Steinert氏疾病)、眼咽肌肉营养不良症(OPMD)、远端型肌营养不良症(DD)和先天性肌肉营养不良症(CMD)。运动神经元疾病包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)又名Lou Gehrig氏疾病)、婴儿脊髓性进行性肌萎缩(SMA、SMA1或WH)(又名1型脊髓性进行性肌萎缩、Werdnig-Hoffman肌肉营养不良症)、中间物脊髓性肌萎缩(SMA或SMA2)(又名2型脊髓性肌萎缩)、少年脊髓性肌萎缩(SMA、SMA3或KW)(又名3型脊髓性肌萎缩、Kugelberg-Welander氏脊髓性肌萎缩)、脊椎球肌肉萎缩(SBMA)(又名肯尼迪氏疾病和X-连接的SBMA)、成人脊髓性肌萎缩(SMA)。炎症性骨骼肌变性包括皮肤肌炎(PM/DM)、多发性肌炎(PM/DM)、包含体肌炎(IBM)。肌肉神经接点病状包括重症肌无力(MG)、(Lambert-Eaton)朗伯-伊顿综合症(LES)、和先天性类重症肌无力综合征(CMS)。由于内分泌反常导致的骨骼肌变性包括甲亢性肌病(HYPTM)、和甲状腺机能不足性肌病(HYPOTM)。外周神经疾病包括进行性神经性腓骨肌萎缩(CMT)(又名遗传性运动与感觉神经病(HMSN)或腓骨侧肌肉萎缩(PMA))、代-索二氏病(DS)(又名3型CMT或渐行性肥大性间质性神经病)、和弗里德棘希氏共济失调(FA)。其他的骨骼肌变性包括先天性肌强直(MC)(两种形式：托马森氏疾病和贝克尔疾病)、先天性肌强直病(PC)、中心核疾病(CCD)、纤维状骨骼肌变性(NM)、肌小管性骨骼肌变性(MTM或MM)、周期性麻痹(PP)(两个形式：低血钾-HYPOP-周期性麻痹和高血钾-HYPP-周期性麻痹)以及与人类免疫缺陷性病毒/爱滋病有关的骨骼肌变性。所述方法和薄膜还可以有效的用于识别治疗或改善代谢性肌肉病症症状的治疗剂，所述症状例如磷酸化酶缺乏症(MPD或PYGM)(又名麦卡德尔症)、酸性麦芽糖酶缺乏症(AMD)(又名庞佩氏病)、磷酸果糖激酶缺乏症(PFKM)(又名Tarui氏疾病)、脱支酶缺乏症(DBD)(又名Cori氏病或Forbes氏病)、线粒体肌病(MITO)、肉碱缺乏症(CD)、肉毒碱棕榈酰基转移酶缺乏症(CPT)、磷酸甘油酸激酶缺乏症(PGK)、磷酸甘油酸变位酶缺乏症(PGAM或PGAMM)、乳酸脱氢酶缺乏症(LDHA)、和肌腺苷酸脱胺酶缺乏症(MAD)。除了上面列出的病症之外，所述方法还可以用于识别能够减少血管痉挛、心律不齐、心肌病的试剂。

根据上述方法识别的血管扩张剂可以用于减轻高血压并缓解与动脉粥样硬化斑块有关的肌肉功能。与动脉粥样硬化斑块有关的平滑肌细胞具有改变的细胞形状和异常收缩功能的特点。这种细胞被用于接种到薄膜上，暴露于上述候选化合物中，按照上面所述方法评估肌肉功能。这些能够改善细胞形状和功能的试剂可以有效用于治疗或减轻这些疾病的症状。

平滑肌细胞和/或条纹肌细胞在体内排成许多内腔结构，例如气道组织、胃及肠组织(例如食道、肠)、和泌尿组织。按照上面所述的方法评价在存在或不存在候选化合物时平滑肌细胞在薄膜上的功能，从而识别能够增加或降低肌肉收缩程度或速度的试剂，用来治疗或缓解与收缩病理程度或速率相关的症状。例如，这种试剂可以用来治疗胃肠道动力紊乱。

实施例

a.底物制备

通过多步旋转涂布法制备聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜底物。将聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)(聚合物化学公司)溶解到99.4％的1-丁醇(W/V)中，质量百分比为10％，将其旋转涂布到玻璃盖玻片上。Sylgard 184(道康宁公司)聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体以10∶1的比例与治疗剂相混合旋转涂布在涂有聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)的玻璃盖玻片上。随后处理涂布有聚二甲基硅氧烷的盖玻片。

b.各项同性和各项异性模式化的纤维结合蛋白

用各项同性或各项异性的纤维结合蛋白(FN)层涂布聚二甲基硅氧烷薄膜。在每种情况下，在用纤维结合蛋白处理之前，对涂布聚二甲基硅氧烷的盖玻片放入紫外区处理8分钟，从而灭菌并增强表面亲水性。随后在生物处理器中进行的所有随后的步骤都是在无菌条件下进行的。通过在聚二甲基硅氧烷上加入1毫升包含25微克/毫升纤维结合蛋白的无菌去离子水(DI)培养15分钟可以沉淀各向同性的纤维结合蛋白。培养之后，用去离子水洗涤三次除去多余的纤维结合蛋白，然后在接种心肌细胞之前风干3小时。

使用微接触印刷(μCP)技术进行纤维结合蛋白的各向异性模式化。基础微接触印刷技术已经被很好的建立了，从而允许使用聚二甲基硅氧烷印模使生物分子在各种平面底物上快速的模式化。这里使用的变化使用聚二甲基硅氧烷印模使纤维结合蛋白在涂布有聚二甲基硅氧烷的玻璃盖玻片上模式化，从而形成各向异性二维心肌。通过进行1分钟的保形接触，能够使纤维结合蛋白从印模上转移到聚二甲基硅氧烷薄膜上。

c.心肌细胞的接种和培养

使用公开的方法从两天大的新生斯普拉-道来(氏)大鼠中分离新生的鼠心室肌细胞。在接种培养基(SM)(补充有10％FBS的M199培养基)中将所述细胞稀释到-350,000每毫升，在每个盖玻片上接种3毫升。培养24小时之后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将盖玻片洗涤3次，出去没有粘附上的细胞，并用接种培养基回收。另外培养24小时之后，将所述培养基换成维持液(MM)(补充有2％胎牛血清(FBS)的M199培养基)使成纤维细胞的生长最小化，所述成纤维细胞是不可避免地存在于初次获得的心肌细胞中的成纤维细胞。

d.型材的产生、释放和三维构造的产生

一旦心肌细胞形成适当的二维心肌微观结构，就将聚二甲基硅氧烷薄膜制成型材并从盖玻片上释放。将皮氏培养皿置于带有暗视野照明的立体显微镜上，使用外科解剖刀切过聚二甲基硅氧烷薄膜从而将型材手动切割。一旦蒂罗德溶液被冷却到温度低于35℃，聚(N-异丙基丙烯酰胺)层从疏水状态转变成亲水状态，并开始溶解。一旦聚(N-异丙基丙烯酰胺)溶解，所述肌细胞在聚二甲基硅氧烷薄膜上的收缩将切割出来的型材拉离盖玻片进入溶液中。一旦从盖玻片上释放，聚二甲基硅氧烷薄膜的构造取决于心肌的微观结构、切割形状和处理条件。在室温下处理聚二甲基硅氧烷薄膜，厚度小于20微米的地方可以进一步与使用镊子进行弯曲处理，使没有覆盖肌细胞的侧面相互接触。

e.实验性检验参数(蒂罗德溶液、起搏、显象记录)

在室温下，在台罗德氏液中进行肌细胞-聚二甲基硅氧烷构建物的观测和传动动作，台罗德氏液每30分钟更换一次。使用带有暗视野照明的立体显微镜进行聚二甲基硅氧烷薄膜切割、释放、自发性收缩和起搏的测定。使用平行铂丝电极，间隔～1厘米并直接插入到皮氏培养皿的中心进行电起搏。使用外磁场激活剂(Myopacer，IonOptix)，电极之间产生20伏10毫秒持续时间矩形波，在最多2分钟的持续时间中，起搏速率从0.1变化到5赫兹。

f.固定和染色

将样品固定并染色用于萤光免疫检验法成像，来观察组织微体系结构。第4天从恒温箱中取出样品，用磷酸盐缓冲液洗涤3次并在含有4％多聚甲醛和2.5％TritonX-100的磷酸缓冲液中固定15分钟。使用1∶200稀释后的位于磷酸缓冲液中的肌原纤维节α-辅肌动蛋白单克隆初级抗体对样品染色1小时。然后，用1∶200稀释的位于磷酸缓冲液中的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、毒伞素结合的Alexa-氟488和结合罗丹明的羊抗鼠刺激抗体对样品染色1小时。在Leica DMI 6000B反向光学显微镜上使用落射荧光照明对样品成像并用4兆象素的CCD摄像机数字俘获该图像。

g.视频和图像分析

使用ImageJ(NIH)软件进行致动器活动的定量评价并分析。随后使用人工跟踪插件程序手动跟踪致动器通过每一块框架。跟踪结果被输入文本文件并转化为构建物的时间-位移曲线和游泳片和行走片的XY图路径。

在本发明描述的实施方案中，为了更为清楚而使用指定的术语。为了更清楚的描述，所有的专用术语至少包括能够通过以相似的方式操作完成相似目的的所有技术和功能等效物。另外，在有些情况下，本发明的特定的实施方案包括系统单元或方法步骤的复数，所述单元或步骤可以与单一单元或步骤替换；同样，单个单元或步骤也可以替换成起到相同作用的单元或步骤的复数。进一步地，本发明的实施方案中指定了用于各式各样性质的参数，这些参数可以被向上或向下调整二十分之一、十分之一、五分之一、三分之一、二分之一等等，或其整数近似值，除非另有说明。此外，尽管以及参照特定的实施方案对本发明进行了显示和描述，本领域普通技术人员应该理解在不脱离本发明范围的情况下，本发明在形式和细节方面可以进行各式各样的替换和变更；更进一步的，其他的方面、功能和优点也包含在本发明范围内。本申请引用的所有参考文献的内容，包括专利和专利申请，通过引证在此全部并入本文。所引用的适当的元素和方法可以被选择用与本发明及其实施方案中。更进一步，在背景技术部分识别的元素和方法对本发明所公开的内容来讲是不可缺少的，且可以与本发明公开的内容中其他部分所描述的元素与方法相结合或相互替换。

Claims (40)

1.制造一种不需依靠支撑物的薄膜的方法，该方法包括：

提供一种基质层；

用牺牲聚合物层对基质层涂布；

在牺牲聚合物层上涂布一种可变形的聚合物层，该可变形的聚合物层比基质层更为柔韧；

在可变形的聚合物上接种细胞；

培养细胞形成一种组织；且随后

从基质层上释放该可变形的聚合物层从而形成一种不需依靠支撑物的薄膜，该薄膜包括在可变形的聚合物层上的组织。

2..根据权利要求1所述的方法，其中所述基质层具有大于1MPA的弹性模量。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基质层是一种玻璃盖玻片。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述牺牲聚合物层包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中可变形的聚合物层包括聚二甲基硅氧烷。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自下面的组：肌细胞、神经细胞、纤维原细胞、内皮细胞和真皮细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞是心肌细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述肌细胞排列成一种各项异性组织。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述牺牲聚合物层通过旋转涂布的方法涂布在基质层。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述可变形的聚合物层通过旋转涂布的方法涂布在牺牲聚合物层上。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述牺牲聚合物是未交联的聚(N-异丙基丙烯酰胺)，且其中通过将温度下降到32℃或更低的温度来释放可变形的聚合物，使牺牲聚合物液化。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述牺牲聚合物是交联的N-异丙基丙烯酰胺，且其中通过将温度下降到32℃或更低的温度来释放可变形的聚合物，使牺牲聚合物变成亲水性的。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述牺牲聚合物是一种电致动的聚合物，且其中通过对牺牲聚合物应用一定的电势来释放该可变形的聚合物。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述牺牲聚合物是一种可降解的生物聚合物，且其中通过溶解牺牲聚合物可以释放该可变形的聚合物。

15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在可变形的聚合物接种细胞之前，向可变形的聚合物层提供一种工程表面化学品。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述工程表面化学品包括一种细胞外基质蛋白。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述工程表面化学品以带有间隙的模式被提供。

18.根据权利要求1所述的方法，其中当可变形的聚合物层被释放时，所述培养细胞的厚度是200毫米或更少。

19.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将可变形的聚合物层和组织切割成需要的形状。

20.根据权利要求1所述的方法，进一步包括释放后将薄膜用作一种致动器。

21.根据权利要求20所述的方法，其中通过暴露于生物底物中使薄膜致动。

22.根据权利要求20所述的方法，其中该薄膜被外部致动。

23.根据权利要求1所述的方法，其中该薄膜是一种具有两个末端的条带，且其中所述细胞是肌细胞，该方法进一步包括致动组织从而使两个末端相互接触，使薄膜起到夹子的作用。

24.根据权利要求1所述的方法，其中该薄膜是一种条带且所述细胞是肌细胞，该方法进一步包括致动组织使该条带卷起或不卷起。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是肌细胞，且该方法进一步包括致动组织推动薄膜。

26.根据权利要求25所述的方法，其中折叠薄膜产生平衡性破缺，且其中通过穿过表面的行走移动推动薄膜。

27.根据权利要求26所述的方法，其中通过穿过液体的游泳运动推动薄膜。

28.根据权利要求1所述的方法，该方法进一步包括在液体流通道中固定释放的薄膜并致动薄膜从而打开或关闭液体流的门。

29.根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括在操作室的门口固定释放的薄膜并致动薄膜从而打开或关闭致动室的门。

30.根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括致动薄膜来抽吸液体。

31.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在薄膜释放后，对受伤的人类组织使用该薄膜。

32.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在薄膜释放后对严重损伤的肢体使用该薄膜。

33.一种用于生产薄膜的构建物，该构建物包括：

一种基质层；

一种涂布在基质层上的牺牲聚合物层；

比基质层更为柔韧，涂布在牺牲聚合物层上的可变形的聚合物层；和

接种在可变形聚合物层上的细胞。

34.一种不需依靠支撑物的薄膜，包括：

一种可变形聚合物层

以预先确定的模式涂布在可变形聚合物层上的大量分离的细胞，其中所述细胞形成一种功能性的组织结构。

35.根据权利要求34所述的不需依靠支撑物的薄膜，其中该组织结构包括排列的肌肉细胞。

36.根据权利要求35所述的不需依靠支撑物的薄膜，其中该组织结构具有200毫米或更小的厚度。

37.一种测定肌肉收缩率的方法，该方法包括：

提供一种包括可变形的聚合物层的肌肉薄膜，所述可变形的聚合物层涂布有肌肉；

将此肌肉薄膜的一端附着到一种固定结构上；

应用刺激使肌肉收缩；且

当肌肉收缩时测量肌肉薄膜的位移。

38.根据权利要求37所述的方法，其中当肌肉收缩时测定肌肉薄膜的曲率半径。

39.根据权利要求37所述的方法，其中测定收缩速度。

40.根据权利要求37所述的方法，进一步包括在应用刺激之前将肌肉薄膜与候选化合物相接触并将候选化合物存在的情况下的收缩程度或收缩速度与不存在候选化合物时的位移向比较，其中，程度和速度上的差异表明候选化合物改变了肌肉的功能。

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