CN101392226A - 草绿色链霉菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个链霉菌菌株，该菌为草绿色链霉菌(Streptomyces herbaricolor strain)HNS2－2，已于2008年6月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏编号为CGMCC NO.2540。其16SrDNA已被GenBank收录，登录序列号为EU035296。该菌株从神龙架土壤样品中的放线菌中分离筛选得到，其发酵滤液具有抗烟草花叶病毒(TMV)的作用，在盆栽植物试验中对TMV有明显的抑制作用、对寄主具有保护作用和治疗作用，病情指数分别为7.21、8.49、10.91，防治效果分别为61.88％、54.06％及 42.37％，可应用在各种植物的烟草花叶病毒病的防治上。

Description

草绿色链霉菌

技术领域：

本发明涉及微生物技术领域，尤指一种抗植物病毒的微生物草绿色链霉菌。

背景技术：

植物病毒病是农作物的主要病害，目前有1000多种植物病毒病已被世人所认识，由于其种类繁多、发生普遍、危害严重，早已成为研究者关注和研究的重要对象。尽管目前已经发展了多种防治策略来控制植物病毒病，但是由于病毒在植物细胞中复制所需的物质、能量和场所完全依赖寄主，且植物没有完整的免疫系统，迄今为止，几乎没有化学药剂能有效地将感病植株上的病毒完全除去，同时化学药剂给生态环境、人畜生存质量、非靶标生物生存等带来了一些负面影响，其使用受到越来越多的限制；此外，采用组织脱毒、抗病毒育种等传统方法也无法从根本上减轻病毒病的危害；近20年发展起来的抗病毒转基因植物，通过将病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、蛋白酶基因、移动蛋白基因等导入植物体中，对植株产生不同程度的保护作用，在农业生产方面应用前景广阔，但是，应用病毒基因组来源的抗病毒转基因植物存在一定的环境风险。因此，开发和利用来自植物和其它生物资源的活性物防治植物病毒病无疑是21世纪的一个热点。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种能产生植物病毒TMV活性物，具有工业化发酵生产形成新型、高效、无毒(低毒)农药潜力的微生物草绿色链霉菌。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种链霉菌菌株，该菌为草绿色链霉菌(Streptomyces herbaricolor strain)HNS2-2。是从我国神龙架国家自然保护区采集的土壤样品中分离得到。现保存在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2008年6月16日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.2540。

该草绿色链霉菌菌株HNS2-2具有下述性质：

1.形态特征：

以插片法在高氏1号琼脂培养基(GAU)上于28℃培养本菌株15天后，在光学显微镜下观察菌丝的形态和孢子形态，参见图1、图2，气生菌丝发育良好，孢子链直形，圆柱状，基内菌丝交织成网，有分枝、无横膈、无断裂现象。在电子显微镜下观察，参见图3、图4，孢子链直，孢子圆柱状、成熟时表面光滑。

从图1-图4可知，菌株在高氏1号琼脂培养基培养15天的形态学特征与链霉菌属放线菌的形态特征符合。

2.在各种培养基上的特征：

本发明的菌株在大多数培养基上气生菌丝发达、基内菌丝丰富，气生菌丝粉白、淡紫至浅灰色，基内菌丝浅黄至褐色。在高氏1号琼脂培养基上菌落突出、绒毛状，气丝淡紫灰色，基丝黄色、产生草绿色至墨绿色可溶性色素，而在无机盐淀粉琼脂培养基上气丝微红白色，基丝杏仁黄色、可溶性色素浅驼色；柴纳斯琼脂培养基上菌落表面瘤状，产生褐色可溶性色素。具体见下表1。

表1 本发明菌株的培养特征

3.生理生化特征和碳源利用状况：

本发明的菌株的生理生化特征和碳源利用状况见下表2，

表2 本发明菌株的生理生化特性和碳源利用状况

注：“—”表示负反应，“+”“++”“+++”表示反应的强弱程度。

由上表2可知，其生理生化特性符合链霉菌属的特征^[119、120]。HNS2-2菌株能使明胶液化、淀粉水解、牛奶凝固和胨化，能产生硫化氢，并且能强烈分解淀粉，但不能分解纤维素，不能利用酪氨酸产生色素，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。利用D-半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖，不利用甘露醇、肌醇、麦芽糖、鼠李糖。

进一步采用分子生物学手段进行分子上的鉴定，经16SrDNA基因测序分析，得本发明菌株的16SrDNA部分序列如下：

gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg

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ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgca

将HNS2-2菌株的16S rDNA序列与GenBank中相关序列进行BLAST相似性分析，以同源性高的14株菌株采用MEGA软件以相近序列构建系统发育树，结果见图5。

HNS2-2菌株的16SrDNA序列与GenBank中相关序列的BLAST比对结果表明，HNS2-2属于链霉菌属(Streptomyces)，与穗状产色链霉菌S.racemochromogenes strain NRRL B-5430(DQ026656.1)和多产色链霉菌S.polychromogenes strain NRRL B-3032的序列同源性高达99％，与淡紫灰链霉菌S.lavendulae DNA strain IFO 14028(D85114.1)的序列同源性为98％，与草绿色链霉菌的模式菌株S.herbaricolor strain NRRL B-3299T的序列同源性为100％，在系统进化发育树上处于同一分支。

通过对本发明所述的链霉菌进行形态特征、培养特征、生理生化特性和16SrDNA序列的测定，表明菌株HNS2-2具有草绿色链霉菌的模式菌株S.herbaricolor strain NRRL B-3299T的典型特征即在培养基中产生草绿色扩散性色素，孢子丝直形；两者的序列同源性为100％，因此将其归入草绿色链霉菌，在GenBank注册，登录序列号为EU035296。

附图说明：

图1是本发明的草绿色链霉菌菌株HNS2-2在高氏1号琼脂培养基上的菌丝形态照片。

图2是本发明的草绿色链霉菌菌株HNS2-2在高氏1号琼脂培养基上的孢子形态照片。

图3是本发明的草绿色链霉菌菌株HNS2-2在高氏1号琼脂培养基上的孢子电镜照片一。

图4是本发明的草绿色链霉菌菌株HNS2-2在高氏1号琼脂培养基上的孢子电镜照片二。

图5是本发明的草绿色链霉菌HNS2-2依据16SrDNA序列构建的菌株与相关菌株的系统发育树。

图6是本发明的草绿色链霉菌菌株HNS2-2的发酵滤液对TMV在系统侵染寄主上的防效图。其中：a：对照b：经保护作用处理c：经治疗作用处理d：经抑制作用处理。

图7是酸碱对抑菌生物活性物稳定性的影响。

图8是温度对抑菌生物活性物稳定性的影响。

具体实施方式：

以下具体说明本发明菌株的分离筛选过程及应用实例。

本发明菌株采用稀释平板分离法从神龙架土壤样品中分离具有抗植物病原微生物的放线菌得到，分离筛选方法如下：

①菌株分离

采用稀释平板分离法，取土壤样品10g加入无菌水90mL混合均匀制备样品悬液，随后进行10倍梯度稀释；

取适当浓度稀释液(一般为10³、10⁴、或10⁵样品稀释液)涂布接种于高氏1号培养基中(高氏1号合成琼脂：可溶性淀粉20g，KNO₃1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄7H₂O0.5g，NaCL0.5g，FeSO₄0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4.)置28℃培养4d。挑取单个菌落斜面保藏，共分离保藏数株放线菌。

②放线菌菌株的初筛和复筛

1)土壤放线菌发酵滤液的制备

分别将放线菌单个菌落接种于高氏1号液体培养基中，置摇床28℃、220rpm培养4d，发酵液较粘稠，具有特殊香气，且镜检无杂菌污染，则酸化过滤，滤液冰箱保存备用。

2)接种方法

取TMV感染病叶加入适量0.O1mol/L pH7.2磷酸缓冲液(7mL磷酸缓冲液/g病叶)，置灭菌研钵中研磨成匀浆，4层纱布过滤，喷洒400目石英砂，采用常规汁液摩擦接种，接种后5min-10min用清水轻轻冲洗叶片，试验在25℃-30℃无虫温室内进行。

3)以烟草花叶病毒TMV作为供试病原，系统侵染寄主普通烟草K326、枯斑寄主曼陀罗作为供试植物，各菌株发酵滤液作为抗病生物活性物，采用摩擦接种法接种系统侵染寄主普通烟草K326、枯斑寄主曼陀罗进行初筛，从初筛结果中再进行复筛，获取本发明菌株HNS2-2。

本发明菌株对TMV在枯斑寄主曼陀罗上的防效

取长势一致、4-5片叶的枯斑寄主曼陀罗分别分为3组，进行按以下体外抑制作用、保护作用和治疗作用3种接种处理：菌株HNS2-2发酵滤液5倍稀释(20％)与TMV等体积混合1h后接种、接种前24h和接种后24h分别喷洒20％发酵滤液，采用常规方法机械摩擦接种，每处理5株(每株3片真叶)，重复2次，另设有对照，接种后5d调查病斑数，取平均值计算枯斑抑制率。

结果表明：20％发酵滤液与TMV制备液等体积混合1h后接种在曼陀罗上，平均枯斑数为4.38。没有采用本发明菌株的发酵滤液的曼陀罗叶片平均枯斑数为56.55。因而，枯斑抑制率为92.62％。发酵滤液于接种前、后24h施用的平均枯斑数分别为9.16、18.65，枯斑抑制率分别为83.78％、67.26％。并且比较进行不同处理5d后的枯斑寄主曼陀罗盆栽植株，枯斑数量有明显差异，但对植株长势的影响无明显区别。试验结果说明此菌株的发酵滤液中含有对植物病毒TMV有生物活性作用的代谢产物，对病毒具有较强的体外抑制作用，同时对寄主有一定的保护作用和治疗作用。

本发明菌株对TMV在系统侵染寄主上的防效

取长势一致普通烟K326，每处理30株，重复3次，进行以下体外抑制作用、保护作用和治疗作用3种接种处理：菌株HNS2-2发酵滤液5倍稀释(20％)与TMV等体积混合1h后接种、接种前24h和接种后24h分别喷洒5倍稀释(20％)的发酵滤液，采用常规方法机械摩擦接种，发病后调查病情指数，取平均值计算防治效果。

结果表明：在普通烟草K326上，HNS2-2发酵滤液对TMV有明显的抑制作用、对寄主具有保护作用和治疗作用，病情指数分别为7.21、8.49、10.91，防治效果分别为61.88％、54.06％及42.37％。将普通烟草K326经保护作用、治疗作用、抑制作用3种处理30d后，从图6可知，在普通烟K326上均有发病现象，但病情低于对照，对照组部分植株全株叶片花叶，叶片畸形并形成线形叶，病株矮化；而处理组只出现心叶脉明、轻微花叶或1/3-1/2叶片花叶，没有植株矮化及叶片畸形现象。

由上可知，本发明菌株的发酵滤液对TMV感染具有预防作用、抑制作用及治疗作用，具有抗植物病毒TMV活性。

进一步对本发明菌株的生物活性物进行化学性质稳定试验，即分别采用pH1-12(结果参见图7)，40℃、60℃、80℃、100℃、120℃(结果参见图8)以及40w日光灯光照和太阳光光照(结果见表3)处理发酵滤液，以金黄色葡萄球菌为指示菌种，采用管碟法测定发酵滤液抑菌活性(管碟法的步骤为：将已融化冷却至45℃的营养琼脂培养基，按0.2％(V/V)接种量，接入供试细菌液体培养物，混合均匀后倒入已灭菌的培养皿中，待凝固后即在每个培养皿中放置牛津杯，牛津杯等距放置，设无菌水做空白对照，然后在每个牛津杯中接入200μL已经过膜过滤器处理过的发酵液，每个处理重复3次，取平均值。置于36℃的恒温培养箱，培养24h后测量抑菌圈直径。)。

表3 光对抑菌生物活性物稳定性的影响

结果表明本发明菌株的生物活性物分别在pH4-9、40℃-80℃、40w日光灯光照2-8小时条件下表现稳定。

在采用管碟法测定本发明菌株发酵滤液抑菌活性试验中还表明，其发酵滤液对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有明显的抑制作用，并形成较大的抑菌圈；而对大肠杆菌及沙门氏杆菌的抑制圈小。其结果说明本菌株活性成分对革兰氏阳性菌抑制作用效果好。对镰刀菌、青霉有明显的抑制作用，其抑制作用的强弱为赤霉菌>镰刀菌>青霉。

序列表

<110>  湖南农业大学

<120>  草绿色链霉菌

<130>  PHWO8443

<140>  200810031605.1

<141>  2008-06-27

<160>  1

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  1074

<212>  DNA

<213>  链霉菌属(Streptomyces)

<400>  1

Claims (6)

1、一种链霉菌菌株，其特征在于：该菌为草绿色链霉菌(Streptomycesherbaricolor strain)HNS2-2，已于2008年6月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏编号为CGMCC NO.2540。

2、根据权利要求1所述的链霉菌菌株，其特征在于：该菌株的形态特征及基于16SrDNA序列的系统进化分析，将其归入草绿色链霉菌，在GenBank注册，登录序列号为EU035296，该菌的16SrDNA部分序列如下：

gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg

atgaagccct tcggggtgga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc

ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggg tctaataccg gatacgactg cgggaggcat

ctcctgtggt ggaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt

ggggtaatgg cccaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac

tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg

ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc

tttcagcagg gaagaagcga aagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt

gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga

gctcgtaggc ggcttgtcac gtcggatgtg aaagcccgag gcttaacctc gggtctgcat

tcgatacggg ctagctagag tgtggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa

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catataccgg aaagcattag agatagtgcc ccccttgtgg tcggtataca ggtggtgcat

ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgca

3、根据权利要求1所述的链霉菌菌株，其特征在于：所述菌株具有抗植物病毒TMV活性。

4、根据权利要求1所述的链霉菌菌株，其特征在于：所述菌株的生物活性物在pH4-9条件下化学性质表现稳定。

5、根据权利要求1所述的链霉菌菌株，其特征在于：所述菌株的生物活性物在40℃-80℃条件下化学性质表现稳定。

6、根据权利要求1所述的链霉菌菌株，其特征在于：所述菌株的生物活性物于40w日光灯光照2-8小时条件下化学性质表现稳定。

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