CN101389758A - 用于调节细胞凋亡途径的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节细胞凋亡途径的方法和组合物。特别是，本发明涉及用于诱导癌细胞中的编程性细胞死亡的方法和组合物。本发明进一步涉及用于鉴定调节细胞凋亡途径的药物的方法和组合物。

Description

用于调节细胞凋亡途径的方法和组合物
本发明是在政府支持的情况下完成的，国家癌症学会(NationalCancer Institute)授予的准许号为2RO1CA6066410A1。政府拥有本发明一定的权利。
发明领域
本发明涉及用于调节细胞凋亡途径的方法和组合物。特别是，本发明涉及用于诱导癌细胞中的编程性细胞死亡的方法和组合物。本发明进一步涉及用于鉴定调节细胞凋亡途径的药物的方法和组合物。
发明背景
术语癌症共同意指几乎影响身体每一部位的100种以上的不同疾病。在整个生命过程中，体内的健康细胞以受控方式分裂、生长并且自我更新。当指导这种细胞分裂的基因发生机能障碍时，癌症发生并且细胞开始以失控的方式繁殖和生长。这些异常细胞块或团被称作肿瘤。并非所有的肿瘤均为癌性的。良性肿瘤，诸如痣停止生长并且不会扩散至身体的其他部位。而癌性的或恶性的肿瘤持续生长，从而挤出健康细胞，干扰身体功能并且从身体组织中汲取营养物。恶性肿瘤可以通过称作转移的过程扩散至身体的其他部位。根据肿瘤的不同，来自原始肿瘤的细胞脱落，通过血液或淋巴管或在胸、腹或骨盆内移动并且最终在体内的其它部位形成新的肿瘤。
认为仅5-10％的癌症为遗传性的。在其它时候，导致该疾病的遗传突变是由其它因素引起的。最常见的癌症与吸烟、日晒和饮食有关。综合年龄、家族史和总体健康情况的这些因素促成了个体癌症的风险率。
目前对癌症的治疗包括药物疗法(化疗)、放射和激素疗法。尽管新疗法已经改善了癌症存活率，但是改善的疗法，特别是那些靶向癌细胞而非健康细胞的疗法仍然是需要的。
发明概述
本发明涉及用于调节细胞凋亡途径的方法和组合物。特别是，本发明涉及用于诱导癌细胞中的编程性细胞死亡的方法和组合物。本发明进一步涉及用于鉴定调节细胞凋亡途径的药物的方法和组合物。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法包括：提供细胞，其中该细胞缺乏功能性线粒体p53；和递送细胞内的外源性p53，其中p53包含使p53定向于细胞的线粒体的序列。在某些实施方案中，外源性p53至少90％与SEQ ED NO：3相同。在其它实施方案中，外源性p53具有SEQ ID NO：3的核酸序列。在某些实施方案中，外源性p53可操作地与线粒体靶向分子连接。在某些实施方案中，外源性p53可操作地与Bcl2线粒体靶向序列(例如SEQ ID NO：4)连接。在其它实施方案中，外源性p53可操作地与BclXL线粒体靶向序列(例如SEQ ID NO：5)连接。在某些实施方案中，外源性p53和线粒体靶向分子在一种载体(例如包含SEQ ID NO：1的核酸序列)中。在某些实施方案中，递送包括将该载体递送至细胞中。在某些实施方案中，该载体编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的融合蛋白。在某些实施方案中，递送导致细胞的编程性细胞死亡。在某些实施方案中，该方法进一步包括将第二种外源性p53递送至所述细胞的核中。在某些实施方案中，所述的第二种外源性p53包含在第二种载体中，该载体包含使第二种外源性p53定向于细胞核的第二种序列。
在某些实施方案中，所述的细胞是在宿主动物(例如非人的哺乳动物或人)中的。在某些实施方案中，所述的宿主动物被诊断为患有癌症并且所述的细胞为癌细胞。在某些优选的实施方案中，递送导致癌细胞的编程性细胞死亡。在其它实施方案中，所述的宿主动物被诊断为患有自身免疫性疾病。在某些另外的实施方案中，所述的方法进一步包括将测试化合物递送至宿主动物中的步骤。在其它实施方案中，所述的细胞是在体外的。在某些实施方案中，该方法进一步包括将测试化合物递送至细胞中的步骤。
本发明进一步提供了包含核酸的组合物，所述的核酸包含可操作地与编码线粒体靶向蛋白的基因连接的外源性p53基因。在某些实施方案中，外源性p53至少90％与SEQ ID NO：3相同。在其它实施方案中，外源性p53具有SEQ ID NO：3的核酸序列。在某些实施方案中，外源性p53可操作地与Bcl2线粒体靶向序列(例如SEQ ID NO：4)连接。在其它实施方案中，外源性p53可操作地与BclXL线粒体靶向序列(例如SEQ ID NO：5)连接。在某些实施方案中，所述的核酸具有SEQID NO：1的序列。在某些实施方案中，所述的核酸编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的融合蛋白。
在另外的实施方案中，本发明提供了编码所述核酸序列的载体。在某些实施方案中，本发明进一步提供了第二种载体，其中第二种载体包含第二种外源性p53和使第二种p53靶向至细胞核中的序列。在其它实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含所述的载体和使用该载体诱导细胞中的编程性细胞死亡的用法说明书。
附图说明
附图1表示对可植入Eμ myc B-淋巴瘤模型的概述。
附图2表示对用于随后体内研究的淋巴瘤分离物的表征。附图2a表示从Eμ myc转基因小鼠产生的B-淋巴瘤分离物的各种天然存在的基因型。附图2b表示通过载体递送达到的线粒体靶向的p53蛋白水平与生理应激反应诱导的水平相似。附图2c表示通过免疫印迹检测的NIH3T3细胞中的核和线粒体靶向的p53的逆转录病毒驱动的表达。附图2d表示如通过转导后36小时FACS分析由共表达的GFP标记所确定的病毒转导效率。
附图3表示初生小鼠胚胎成纤维细胞中线粒体靶向的p53的功能性表征。附图3a表示线粒体p53促进MEF中的编程性细胞死亡。附图3b表示线粒体靶向的p53蛋白缺乏转录活性。
附图4表示体外p53裸淋巴瘤细胞中线粒体靶向的p53的功能性表征。附图4a和4b表示线粒体靶向的53抑制培养物中的生长。附图4c表示线粒体靶向的p53蛋白缺乏转录活性。
附图5表示线粒体靶向的p53杀伤体内的淋巴瘤细胞。附图5表示在第28天时收获的重建的淋巴瘤中残余GFP表达的FACS分析的有代表性的实例。
附图6表示通过使其C-末端与人细胞色素b5的ER前导序列融合使p53靶向至内质网。
附图7表示与载体转导的p53裸淋巴瘤细胞相比，表达线粒体靶向的p53的细胞对BclXs同种型的表达水平显著增加，这些同种型为缺乏内部BH1和BH2结构域并且促进编程性细胞死亡的BclX基因的可变剪接产物。
附图8表示稀有异常肿瘤的表征，其中表达p53CTM或核p53的病毒未能杀伤肿瘤细胞。
附图9表示p53CTB的核酸序列(SEQ ID NO：1)。粗体字形式的字母相当于BclXL-驱动的序列。
附图10表示p53CTB的氨基酸(SEQ ID NO：2)和核苷酸(SEQ ID NO：10)序列。
附图11表示表1。
附图12表示表2。
附图13表示人p53的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)；人BclXL的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)；和人Bcl2的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
附图14表示人p53的核酸序列(SEQ ID NO：3)；人BclXL的核酸序列(SEQ ID NO：5)；和人Bcl2的核酸序列(SEQ ID NO：4)。
附图15表示表3。
定义
为了有利于理解本发明，将许多术语和措词定义如下：
本文所用的术语＂受试者＂意指任何动物(例如哺乳动物)，包括，但不限于人、非人的灵长类、啮齿动物等，其将作为特定治疗的接受者。一般而言，术语＂受试者＂和＂患者＂在本文中就人受试者而言可以互换使用。
本文所用的术语＂被诊断为癌症的受试者＂意指经检测并且发现具有癌细胞的受试者。可以使用任何合适的方法诊断癌症，包括，但不限于活组织检查、X射线、血液检验和本发明的诊断方法。
本文所用的术语＂检测存活力的下降＂意指培养物中活细胞的数量减少。在优选的实施方案中，这种减少是因诱导群体中的某些或所有细胞的程序性细胞死亡(例如，编程性细胞死亡)所致。
本文所用的术语＂诱导细胞死亡＂意指诱导程序性细胞死亡(例如，编程性细胞死亡)的分子(例如，本发明的p53靶向载体、测试化合物或药物)。
本文所用的术语＂癌症的病期＂意指对癌症发展水平的定性或定量评价。用于确定癌症的病期的标准包括，但不限于肿瘤的大小、肿瘤是否已经扩散至身体的其他部位和癌症已经扩散到何处(例如，在身体的同一器官或区域内还是扩散至另一器官中)。
本文所用的术语＂非人的动物＂意指所有的非人动物，包括，但不限于：脊椎动物，诸如啮齿动物、非人的灵长类、绵羊科动物、牛科动物、反刍动物、兔类动物、猪科动物、山羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、鸟类等。
本文所用的术语＂基因转移系统＂意指将包含核酸序列的组合物递送至细胞或组织中的任何手段。例如，基因转移系统包括，但不限于载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和其它基于核酸的递送系统)、裸核酸的显微注射、基于聚合物的递送系统(例如基于脂质体和基于金属颗粒的系统)、生物射弹注射等。本文所用的术语＂病毒基因转移系统＂意指包含病毒元件(例如完整病毒、修饰病毒和病毒成分，诸如核酸或蛋白质)以有利于将样品递送至所需细胞或组织中的基因转移系统。本文所用的术语＂腺病毒基因转移系统＂意指包含属于腺病毒科的完整或修饰病毒的基因转移系统。
本文所用的术语＂位点特异性重组靶序列＂意指提供对重组因子和发生重组的位置的识别序列的核酸序列。
本文所用的术语＂核酸分子＂意指任何包含核酸的分子，包括，但不限于DNA或RNA。该术语包括序列，这些序列包括DNA和RNA的任何已知的碱基类似物，包括，但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5′-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
术语＂基因＂意指包含产生多肽、前体或RNA(例如rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以由全长编码序列或由该编码序列的任何部分编码，只要全长或片段的所需活性或功能特性(例如酶促活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)得以保持。该术语还包括结构基因的编码区和邻近于5′和3′末端上的编码区的序列，该序列与每一端分别相距约1kb或1kb以上使得所述基因相当于全长mRNA的长度。位于编码区的5′并且存在于mRNA上的序列被称作5′非翻译序列。位于编码区的3′或下游并且存在于mRNA上的序列被称作3′非翻译序列。术语＂基因＂包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含被称作＂内含子＂或＂间插区＂或＂间插序列＂的非编码序列中断的编码区。内含子为转录成核RNA(hnRNA)的基因的区段；内含子可以包含调节元件，诸如增强子。从核或初级转录物中除去或＂剪接掉＂内含子；内含子因此不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中起作用以便规定新生多肽中的氨基酸序列或顺序。
本文所用的术语＂异源基因＂意指并非在其天然环境中的基因。例如，异源基因包括导入另一物种中的来自一个物种的基因。异源基因还包括以某种方式(例如突变、以多拷贝加入、与非天然调节序列连接等)改变的生物体固有的基因。异源基因不同于内源基因的方面在于异源基因序列一般与DNA序列连接，当然未发现这些DNA序列与染色体中的基因序列相关联或与在自然界未发现的染色体的部分(例如在基因不能正常表达的基因座上表达的基因)相关联。
本文所用的术语＂转基因＂意指整合入生物体(例如非人动物)的基因组并且在有性生殖过程中传递给生物体的子代的异源基因。
本文所用的术语＂转基因生物体＂意指具有整合入其基因组并且在有性生殖过程中传递给其子代的转基因的生物体(例如非人动物)。
本文所用的术语＂基因表达＂意指将在基因中编码的遗传信息通过基因的＂转录＂(即，通过RNA聚合酶的酶促作用)转化成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)并且对编码蛋白质的基因而言，通过mRNA的＂翻译＂转化成蛋白质的过程。可以在该过程的许多阶段上调节基因表达。＂增量调节＂或＂活化＂意指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)产生的调节，而＂减量调节＂或＂阻抑＂意指减少产生的调节。增量调节或减量调节中所涉及的分子(例如转录因子)通常被分别称作＂激活物＂和＂阻抑物＂。
除包含内含子外，基因的基因组形式还可以包括位于存在于RNA转录物上的序列的5′和3′末端上的序列。这些序列被称作＂侧翼＂序列或区(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5′或3′端)。5′侧翼区可以包含调节序列，诸如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3′侧翼区可以包含指导转录终止、转录后切割和聚腺苷酸化的序列。
术语＂野生型＂意指分离自天然存在来源的基因或基因产物。野生型基因为最经常地在群体中观察到的基因并且因此为任意设计的该基因的＂正常＂或＂野生型＂形式。相反，术语＂修饰的＂或＂突变体＂意指在与野生型基因或基因产物相比时展示出序列和/或功能特性的改变(即，改变的特征)的基因或基因产物。注意可以分离天然存在的突变体；通过下列事实鉴定它们，即它们与野生型基因或基因产物相比具有改变的特征(包括改变的核酸序列)。
本文所用的术语＂编码…的核酸分子＂、＂编码…的DNA序列＂和＂编码…的DNA＂意指沿脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。DNA序列因此编码氨基酸序列。
本文所用的术语＂具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸＂和＂具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸＂意指包含基因的编码区的核酸序列，或换句话说为编码基因产物的核酸序列。该编码区可以存在于cDNA、基因组DNA或RNA形式中。当存在于DNA形式中时，寡核苷酸或多核苷酸可以为单链(即有义链)或双链的。如果需要可以将合适的控制元件，诸如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等放置在极接近于基因编码区之处以允许适当启动初级RNA转录物的转录和/或正确加工。或者，用于本发明的表达载体中的编码区可以包含内源性增强子/启动子、剪接点、间插序列、聚腺苷酸化信号等或内源性和外源性控制元件的组合。
本文所用的术语＂寡核苷酸＂意指长度较短的单链多核苷酸链。寡核苷酸长度一般小于200个残基(例如15-100个)，然而，本文所用的术语还意欲包括较长的多核苷酸链。寡核苷酸通常根据其长度来命名。例如，24个残基的寡核苷酸被称作＂24-聚体＂。寡核苷酸可以通过自我杂交或通过与其它多核苷酸杂交形成二级和三级结构。这类结构可以包括，但不限于双链体、发夹结构、十字形结构、转角和三链体。
本文所用的术语＂互补＂或＂互补性＂用于指根据碱基配对法则而关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，就＂A-G-T＂序列而言，与序列＂T-C-A＂互补。互补性可以为＂部分的＂，其中仅核酸碱基中的某些按照碱基配对法则配对。或在核酸之间可以存在＂完全＂或＂全部＂互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著效应。这一点在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中具有特别的重要性。
术语＂同源性＂意指互补性的程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即同一性)。部分互补序列为因与＂基本上同源的＂靶核酸杂交而至少部分地抑制完全互补核酸分子的核酸分子。可以使用在低严格条件下的杂交试验(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)检验对完全互补序列与靶序列杂交的抑制作用。基本上同源的序列或探针竞争和抑制在低严格条件下完全同源性的核酸分子与靶的结合(即杂交)。这并不意味着低严格条件能够允许非特异性结合；低严格条件要求两条序列彼此的结合为特异性(即选择性)相互作用。可以通过使用基本上非互补(例如低于约30％同一性)的第二种靶检测不存在非特异性结合；在不存在非特异性结合的情况下，探针不会与第二种非互补靶杂交。
当用于指双链核酸序列，诸如cDNA或基因组克隆时，术语＂基本上同源的＂意指如上所述可以在低严格条件下与双链核酸序列的任一条链或两条链杂交的任何探针。
基因可以产生通过初级RNA转录物的差别剪接生成的多样RNA种类。为相同基因的剪接变体的cDNA包含序列同一性或完全同源性的区(代表两种cDNA上存在相同外显子或相同外显子的一部分)和完全非同一性的区(例如，代表cDNA1上存在外显子＂A＂，而其中cDNA2包含外显子＂B＂)。因为这两种cDNA均包含序列同一性区，所以它们均可以与来源于包含在两种cDNA上发现的序列的完整基因或该基因的部分的探针杂交；这两种剪接变体因此与这种探针和彼此基本上同源。
当用于指单链核酸序列时，术语＂基本上同源的＂意指如上所述可以在低严格条件下与单链核酸序列杂交(即为其互补物)的任何探针。
本文所用的术语＂杂交＂用于指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间结合的强度}受诸如核酸之间互补性的程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂种的Tm和核酸内G：C之比这类因素影响。在其结构内包含互补核酸配对的单分子被认为是＂自我杂交的＂。
本文所用的术语＂Tm＂用于指＂解链温度＂。解链温度为双链核酸分子群变成半数解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的等式为本领域众所周知的。正如标准参考书中所示，可以通过下列等式计算Tm的简单估计值：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，此时核酸在1M NaCl的水溶液中(例如，参见Anderson和Young，Quantitative FilterHybridization，in Nucleic Acid Hybridization[1985])。其它参考书中包括考虑到结构和序列特征来计算Tm的更为复杂的计算。
本文所用的术语＂严格性＂用于指温度、离子强度和其它化合物，诸如有机溶剂存在的条件，在此条件下进行核酸杂交。在＂低严格条件＂下，所关注的核酸序列与其精确的互补物、具有单碱基错配的序列、密切相关的序列(例如具有90％或90％以上同源性的序列)和仅具有部分同源性的序列(例如具有50-90％同源性的序列)杂交。在＂中等严格条件＂下，所关注的核酸序列仅与其精确的互补物、具有单碱基错配的序列和密切相关的序列(例如90％或90％以上同源性)杂交。在＂高严格条件＂下，所关注的核酸序列仅与其精确的互补物和(取决于诸如温度这类条件)具有单碱基错配的序列杂交。换句话说，在高严格条件下，可以升高温度以便排除与具有单碱基错配的序列杂交。
＂高严格条件＂在用于指核酸杂交时包括与下列等同的条件：在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/lEDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.5％ SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在42℃下在包含0.1X SSPE、1.0％ SDS的溶液中洗涤，此时使用约500个核苷酸长度的探针。
＂中等严格条件＂在用于指核酸杂交时包括与下列等同的条件：在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.5％ SDS、5X Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在42℃下在包含1.0X SSPE、1.0％ SDS的溶液中洗涤，此时使用约500个核苷酸长度的探针。
＂低严格条件＂包括与下列等同的条件：在42℃下在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4·H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.1％ SDS、5X Denhardt试剂[每500ml50X Denhardt试剂包含：5g Ficoll(Type 400，Pharamcia)、5g BSA(级分V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在42℃下在包含5X SSPE、0.1％ SDS的溶液中洗涤，此时使用约500个核苷酸长度的探针。
本领域中众所周知可以使用包括低严格条件的大量等同条件；需要考虑到如下因素，诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或是固定的等)和盐的浓度以及其它成分(例如存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇}并且可以改变杂交溶液以便产生不同于，但相当于上述条件的低严格杂交条件。此外，本领域中已知促进在高严格条件下杂交的条件(例如，提高杂交和/或洗涤步骤的温度、在杂交溶液中使用甲酰胺等)(参见上文对＂严格性＂的定义)。
本文所用的术语＂限制性内切核酸酶＂和＂限制酶＂意指细菌酶，其中每一种切割特异性核苷酸序列上或与之接近的双链DNA。
本文所用的术语＂以可操作的组合方式＂、＂以可操作的顺序＂和＂可操作地连接＂意指以产生能够指导指定基因转录和/或所需蛋白质分子合成的核酸分子这样的方式连接核酸序列。该术语还意指以产生功能性蛋白质这样的方式连接氨基酸序列。
术语＂分离的＂在用于指核酸时，如在＂分离的寡核苷酸＂或＂分离的多核苷酸＂的情况中，意指由一般在其天然来源中相关的至少一种成分或污染物鉴定的并且与之分离的核酸序列。分离的核酸以与天然发现它不同的形式或在不同的环境中存在。相反，非分离的核酸是在其天然存在的状态下发现的核酸，诸如DNA和RNA。例如，在与相邻基因邻近的宿主细胞染色体上发现了指定DNA序列(例如基因)；在该细胞中发现了RNA序列，诸如编码特异性蛋白质的特异性mRNA序列，其为与编码众多蛋白质的大量其它mRNA的混合物。然而，作为实例，编码指定蛋白质的分离的核酸包括这类在一般表达指定蛋白质的细胞中的核酸，其中核酸在不同于天然细胞的位置的染色体中，或者位于与天然发现的核酸不同的核酸序列的侧翼。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以单链或双链形式存在。当要将分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸用于表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸应包含最低限度的有义或编码链(即寡核苷酸或多核苷酸可以为单链的)，但可以包含有义和反义链(即寡核苷酸或多核苷酸可以为双链的)。
本文所用的术语＂纯化的＂或＂用于纯化＂意指从样品中除去成分(例如污染物)。例如，通过除去污染的非免疫球蛋白蛋白质纯化抗体；还可以通过除去不与靶分子结合的免疫球蛋白纯化它们。除去非免疫球蛋白蛋白质和/或除去不与靶分子结合的免疫球蛋白导致样品中靶-反应性免疫球蛋白百分比的增加。在另一个实例中，在细菌宿主细胞中表达重组多肽类并且通过除去宿主细胞蛋白质纯化该多肽类；重组多肽类的百分比由此在样品中增加。
＂氨基酸序列＂和术语，诸如＂多肽＂或＂蛋白质＂并不意味着将氨基酸序列限于与所述蛋白质分子相关的完整天然氨基酸序列。
本文所用的术语＂天然蛋白质＂表示蛋白质不含由载体序列编码的氨基酸残基；即，天然蛋白质仅包含那些其在自然界出现的蛋白质中发现的氨基酸。可以通过重组手段生产天然蛋白质或可以从天然存在的来源中分离它。
本文所用的术语＂部分＂在指蛋白质时(如在＂指定蛋白质的一部分＂的情况中)意指该蛋白质的片段。这些片段可以为4个氨基酸残基到完整氨基酸序列减去1个氨基酸的大小。
术语＂DNA印迹＂意指在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上分析DNA以便根据大小对DNA进行分级分离，随后从凝胶上将DNA转移至固相支持体，诸如硝化纤维素或尼龙膜上。然后用标记的探针探测固定化DNA以便检测与所用探针互补的DNA种类。可以在电泳前使用限制酶切割DNA。在电泳后，在转移至固相支持体之前或过程中可以使DNA部分脱嘌呤和变性。DNA印迹为分子生物学家的标准工具(J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，NY，pp 9.31-9.58[1989])。
本文所用的术语＂载体＂用于指将DNA片段从一种细胞转移至另一种细胞的核酸分子。术语＂载体(vehicle)＂有时与＂载体(vector)＂互换使用。载体通常来源于质粒、噬菌体或植物或动物病毒。
本文所用的术语＂表达载体＂意指包含所需编码序列和适当核酸序列的重组DNA分子，所述的编码序列和核酸序列是表达特定宿主生物体中可操作地连接的编码序列所必需的。对于在原核细胞中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选的)和核糖体结合位点，通常还有其它序列。已知真核细胞使用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。
术语＂超表达(overexpression)＂和＂超表达(overexpressing)＂和语法上的同义词用于指mRNA的水平时表示比在对照或非转基因动物的指定组织中观察到的高约3倍(或3倍以上)的表达水平。使用任何本领域技术人员公知的许多技术，包括，但不限于RNA印迹分析来测定mRNA的水平。在RNA印迹上包括适当的对照以便检验从所分析的每一组织中加载的RNA的量的差异(例如，存在于每一样品中的28SrRNA，即以基本上相同的量存在于所有组织中的丰富RNA转录物的量可以用作使在RNA印迹上观察到的mRNA-特异性信号规格化或标准化的手段)。对存在于大小与正确剪接的转基因RNA相当的带中的mRNA的量进行定量；在对转基因mRNA的表达进行定量时不考虑与转基因探针杂交的其它次要种类的RNA。
本文所用的术语＂转染＂意指将外源性DNA导入真核细胞。可以通过本领域中已知的各种方法进行转染，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物射弹。
术语＂磷酸钙共沉淀＂意指用于将核酸导入细胞的技术。当核酸作为磷酸钙-核酸共沉淀物存在时，细胞对核酸的摄取增强。Graham和van der Eb的最早技术(Graham和van der Eb，Virol.，52：456[1973])已经被几个小组进行了改进以便优化用于特定类型细胞的条件。本领域中众所周知这些大量的改进。
术语＂稳定转染＂或＂稳定转染的＂意指将外源性DNA导入和整合入转染细胞的基因组中。术语＂稳定转染子＂意指已经将外源性DNA稳定整合入基因组DNA中的细胞。
术语＂瞬时转染＂或＂瞬时转染的＂意指将外源性DNA导入细胞，其中外源性DNA没有整合入转染细胞的基因组中。外源性DNA继续存在于转染细胞的核中数天。在此期间，对外源性DNA进行调节控制，这些调控可以操纵内源性基因在染色体中的表达。术语＂瞬时转染子＂意指已经摄取了外源性DNA，但尚未能整合这种DNA的细胞。
本文所用的术语＂选择标记＂意指编码酶促活性的基因的应用，所述的活性提供在缺乏另外为必需营养物的培养基中生长的能力(例如酵母细胞中的HIS3基因)；此外，选择标记可以对表达选择标记的细胞提供抗生素或药物抗性。选择标记可以为＂显性的＂；显性选择标记编码可以在任何真核细胞系中检测的酶促活性。显性选择标记的实例包括提供在哺乳动物细胞中对药物G418的抗性的细菌氨基糖苷3′磷酸转移酶基因(也称作neo基因)、提供对抗生素潮霉素的抗性的细菌潮霉素G磷酸转移酶(hyg)基因和提供在有麦考酚酸存在下生长的能力的细菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(也称作gpt基因)。其它选择标记并非为显性的，因为它们必须与缺乏相关酶活性的细胞系一起使用。非显性选择标记的实例包括与tk-细胞系一起使用的胸苷激酶(tk)基因、与缺乏CAD的细胞一起使用的CAD基因和与hprt-细胞系一起使用的哺乳动物次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因。选择标记在哺乳动物细胞系中的应用的综述提供在Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1989)pp.16.9-16.15中。
本文所用的术语＂细胞培养物＂意指细胞的任何体外培养物。在该术语中包括传代细胞系(例如具有无限增殖表型)、初级细胞培养物、转化细胞系、有限细胞系(例如非转化细胞)和在体外维持的任何其它细胞群。
本文所用的术语＂真核生物＂意指可区别于＂原核生物＂的生物。意图是该术语包括所有含有表现出真核生物常见特征的细胞的生物，诸如存在由核膜包围的真正的核，其中存在染色体；存在膜被的细胞器；和在真核生物体中通常观察到的其它特征。因此，该术语包括，但不限于诸如真菌、原生动物和动物(例如人)这类生物。
本文所用的术语＂体外＂意指人工环境和在人工环境中发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成，但不限于它们。术语＂体内＂意指自然环境(例如动物或细胞)和在自然环境中发生的过程或反应。
术语＂测试化合物＂和＂候选化合物＂意指为用于治疗或预防疾病、病、病症或身体机能障碍(例如癌症)的候选物的任何化学个体、药品、药物等。测试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。可以通过使用本发明的筛选方法筛选确定测试化合物为治疗性的。
本文所用的术语＂样品＂以其最广泛的含义使用。在一种含义中，它旨在包括获自任何来源的样本或培养物以及生物和环境样品。生物样品可以获自动物(包括人)并且包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，诸如血浆、血清等。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。然而，这类实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。
发明详述
p53介导的肿瘤抑制主要根据其细胞凋亡活性确定。废除p53介导的编程性细胞死亡为人肿瘤中的主要缺陷。这使得p53死亡途径的功能性恢复成为′通用′癌症策略的首要治疗靶，具有获得巨大的临床成果的潜力。在本发明研发过程中进行的实验证实利用最短已知的p53死亡信号传导线路，例如不依赖于直接转录的线粒体p53死亡程序具有治疗效用。
到本发明为止，研究工作集中在恢复转录介导的p53编程性细胞死亡。一种研究途径试图鉴定在结构上拯救肿瘤衍生的p53突变蛋白的小分子。两种原型化合物CP-31398和PRIMA-1可以恢复基于细胞的体外测定中的转录p5功能并且减缓裸鼠中肿瘤异种移植物的肿瘤生长。然而，其作用机制尚不清楚(Foster等，1999.Science286：2507-2510；Bykov等，2002.Nat Med 8：282-288)且其在天然小鼠癌症模型中和在癌症患者中的体内功效未经测试。
另一个研究范围集中在通过基因疗法提供常规野生型p53(Moll，2000.New p53-based strategies for cancer therapy.EatonPublishing，Natick，MA.439-455pp.)。在美国和欧洲进行的使用肿瘤内注射携带常规核野生型p53的腺病毒或逆转录病毒载体的几项I和II期临床研究最初确实证实了这些试剂为充分可耐受的并且表现出有限的抗肿瘤活性(Moll，supra；Zeimet等，2003.Lancet Oncol.4：415-422；Nemunaitis等，2000.J Clin.Oncol.18：609-622；Kuball等，2002.J Clin Oncol.20：957-965；Vecil和Lang，2003.J Neuro.Oncol.65：237-246)。然而，近期最大的野生型p53基因疗法试验的失败强烈表明，尽管其方法合理，但是肿瘤细胞阻碍了目的在于恢复转录p53死亡功能的治疗方式(Zeimet等，文献同上)。在这种国际随机化的II/III期临床试验中，对具有p53突变的卵巢癌患者与标准化疗联合腹膜内给予腺病毒AdSCMV-wtp53。然而，在首次临时分析后终止了本研究，因为未能显示出治疗有益性(Zeimet等，文献同上)。两种原因可以解释这种失败。wtp53和小分子途径的共同之处在于它们依赖于肿瘤细胞对p53靶基因转录活化作出反应的保留的能力。然而，许多人类癌症因其导致广泛异常的基因沉默模式的基因组的总体外遗传失调而失去了这种先决条件(Herman和Baylin，2003.NEng.J Med 349：2042-2054)。此外，wtp53作为转录因子起通过其C-末端四聚化结构域介导的同型四聚体的作用。这一事实使得异位wtp53蛋白易受内源性p53突变体的所谓的显性负调控抑制的攻击，所述的内源性p53突变体以极高水平在癌组织中天然表达。约50％的人癌表达非野生型p53蛋白的突变体。对异位wtp53蛋白的非显性负调控干涉的附加攻击来源于也时常在人癌中超表达的p63和p73的δN同种型(Concin等，Moll.2004.Cancer Res 64：2449-2460；Moll MM，Slade N.2004.Mol Cancer Res 2：371-386；Moll等，2001.Biochim Biophys Acta 1552：47-59)。
p53-依赖性编程性细胞死亡主要利用内源线粒体途径(Schuler和Green.2001.Biochem Soc Trans 29：684-688)。编程性细胞死亡依赖于蛋白质和不需要新基因转录的DNA降解酶的预先装配型死亡系统。实际上，可以引发编程性细胞死亡并且使其在无核的细胞质中进行至其生化终点(Jacobson等，Bmbo J 13：1899-1910；Martin等，1996.J Biol Chem 271-.28753-28756；Schulze-Osthoff等，1994.J CellBiol.127：15-20)。
在本发明的研发过程中进行的实验证实了正常和肿瘤细胞中应激诱导的内源性p53的部分自然移动至它直接引发线粒体外膜透化的线粒体中，其中宿主释放激活细胞编程性细胞死亡的因子(Marchenko等，Moll.2000.J Biol Chem.275：16202-16212；Sansome等，Moll.2001.FEBS Lett.488：110-115.Mihara等，Moll.2003.Molecular Cell，11：577-790。这一生物学事实在本发明中得以利用，它表明p53的转录恢复(在细胞核中发生)对体内肿瘤杀伤而言并非必要。而是通过利用由线粒体引发的不依赖于直接和快速转录的细胞凋亡p53程序实现肿瘤细胞退化。线粒体p53利用其DNA-结合结构域(该结构域对其转录作用而言也是重要的)抑制位于线粒体外膜上的抗细胞凋亡性Bclx1/Bcl2蛋白和诱导能够随后释放细胞色素C的BAK寡聚化(Mihara等，2003.Methods MoI Biol 234：203)。核磁共振研究证实了p53上的BclXI相互作用表面包括用于接触DNA的相同区(Petros等，2004.FEBS Letters 28073：1-4)。然而，与转录活性p53相反，线粒体p53无需四聚化，因为其C-末端结构域是完全不必要的。本发明并不限于特定的机理。实际上，理解机理对实施本发明而言并非必要。但是，值得关注的是这一机理提供另一个优势的方面在于线粒体靶向的p53可以避免受到内源性突变p53蛋白和在肿瘤中超表达的δNp63/p73同种型的显性负调控抑制。共同地，其不依赖于转录性和避免显性负调控干涉的潜能提供了一种治疗方式。
在本发明的研发过程中进行的实验证实了p53CTB严格靶向至线粒体。p53CTM首先靶向至线粒体，其中某些另外靶向至内质网。未观察到可检测的靶向至核或其它细胞器。线粒体靶向的p53缺乏转录活性并且不依赖于反式激活、反式阻抑并且不依赖于外遗传沉默，而这种情况在人癌中极为常见并且可能对需要DNA结合和转录作用的任何试剂而言造成严重障碍。在本发明的研发过程中进行的进一步实验证实了线粒体靶向的p53促进体外初级淋巴瘤细胞中的编程性细胞死亡。进一步的实验证实了线粒体靶向的p53在用于人伯基特淋巴瘤的充分表征的小鼠模型中杀伤体内初级淋巴瘤细胞(该模型受c-Myc癌基因驱动并且携带ARF/p53肿瘤阻抑轴中的失活突变)。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了诱导编程性细胞死亡(例如在癌细胞中)和由此治疗诸如癌症和自身免疫性疾病这类特征在于细胞凋亡途径缺陷的疾病的方法。本发明进一步提供了鉴别改变(例如拯救)突变线粒体p53的化合物的方法。
I.细胞凋亡诱导疗法
在某些实施方案中，本发明提供了癌症疗法。在某些优选的实施方案中，疗法使p53靶向至线粒体。然而，本发明并不限于治疗癌症。本发明的方法和组合物适用于治疗特征在于细胞凋亡途径缺陷的任何疾病，包括，但不限于癌症和自身免疫性疾病。在某些实施方案中，疗法为遗传疗法。在其它实施方案中，疗法为小分子疗法。
A.遗传疗法
在某些实施方案中，本发明提供了用于改变细胞凋亡途径的遗传疗法。本发明关注任何遗传操作在用于使p53表达靶向至线粒体中的应用(例如在癌细胞中的应用)。在优选的实施方案中，p53作为与线粒体靶向序列融合的融合蛋白递送。本发明并不限于特定的线粒体靶向序列。实际上，关注各种线粒体靶向序列，包括，但不限于BclX1蛋白和Bcl2蛋白。在某些优选的实施方案中，BclXI为靶向序列。在特别优选的实施方案中，使用由SEQ ID NOs：1和2描述的p53CTB载体。
可以使用任何合适的方法进行核酸构建体至体外或体内细胞的递送。合适的方法为将核酸构建体导入细胞以使所需事件(例如在线粒体中p53蛋白的表达)发生的方法。
可以通过任何不同的方法将携带遗传信息的分子导入细胞，包括，但不限于定向注射裸DNA寡聚体，使用载有所述构建体的金粒子轰击和使用例如脂质体、生物聚合物等的大分子介导的基因转移。优选的方法使用来源于病毒的基因递送载体，包括，但不限于腺病毒、逆转录病毒、痘苗病毒和腺伴随病毒。代表性的方法在下文中更详细地描述。
1.腺病毒载体
在某些实施方案中，腺病毒载体用于将p53递送至线粒体。自我繁殖的腺病毒(Ad)载体已经广泛用于将外源性基因递送至大量不同的体外和体内细胞类型。＂自我繁殖病毒＂为那些可以通过将单段DNA(重组病毒基因组)转染入单包装细胞系以便产生感染性病毒的病毒；自我繁殖病毒无需使用辅助病毒进行繁殖。就许多载体而言，腺病毒载体对它们能够递送至细胞中的异源核酸的量具有限制。例如，腺病毒的容量约为8-10kb，腺伴随病毒的容量约为4.8kb，而慢病毒的容量约为8.9kb。
在致力于解决与第一代Ad载体相关的病毒复制问题的过程中，已经研发了所谓的＂第二代＂Ad载体。第二代Ad载体缺失Ad基因组的早期区(E2A、E2B和E4)。高度修饰的第二代Ad载体在大规模载体制备过程中不太可能产生可复制病毒，并且Ad基因组复制的完全占据应消除晚期基因复制。对晚期病毒蛋白的宿主免疫应答由此减少[参见Amalfitano等，J.Virol.72：926-933(1998)]。从Ad基因组中消除E2A、E2B和E4基因还可提供增加的克隆能力。例如，从Ad基因组中缺失这些基因中的两种或多种能够通过Ad载体递送全长或cDNA基因[Kumar-Singh等，Hum.MoI.Genet.，5：913(1996)]。
＂内部受损的＂或依赖辅助病毒的Ad载体包含指导腺病毒复制和包装的顺式作用DNA序列，但不含病毒编码序列[参见Fisher等，Virology 217：11-22(1996)和Kochanek等，Proc.Nat.Acad.ScLUSA 93：5731-5736(1996)]。内部受损的载体为通过在有提供所有转运中的必需病毒蛋白的辅助病毒存在下复制产生的缺陷型病毒。由于内部受损的载体不含任何病毒基因，所以病毒蛋白的表达是不可能的。
近期的研发已经发展了内部受损的载体产生的领域[参见Hardy等，J.Virol.71：1842-1849(1997)和Hartigan-O′Conner等，J.Virol.73：7835-7841(1999)]。内部受损的Ad载体能够最大限度地容纳达约37kb的外源性DNA，然而，28-30kb更为典型。例如，内部受损的Ad载体可以容纳全长基因或cDNA，而且可以容纳表达盒或效应物蛋白。
2.慢病毒载体
基于人或猫慢病毒的载体已经显示为另一种用于基因疗法应用的载体。基于慢病毒的载体感染不分裂的细胞作为其正常生活周期的组成部分并且通过在表达病毒蛋白的细胞系中能够包装的载体构建体的表达产生。慢病毒颗粒的小尺寸限制了它们能够携带达约10kb的外源性DNA的量。
3.逆转录病毒载体
将逆转录病毒(逆转录病毒科)分成三组：泡沫病毒(例如人泡沫病毒)；慢病毒(例如人免疫缺陷病毒和绵羊髓鞘脱落病毒)和瘤病毒(例如MLV、劳斯肉瘤病毒)。
逆转录病毒为感染动物细胞的有包膜的(即被源自宿主细胞的脂双层膜包围的)单链RNA病毒。当逆转录病毒感染细胞时，其RNA基因组被转化成双链线性DNA形式(即它被逆转录)。随后这种病毒的DNA形式作为原病毒被整合入宿主细胞基因组。原病毒用作产生附加病毒基因组和病毒mRNA的模板。包含两拷贝的基因组RNA的成熟病毒颗粒从受感染细胞的表面萌芽。病毒颗粒包含基因组RNA、逆录酶和病毒壳体(包含病毒gag基因产物)内部的其它po1基因产物，其被来源于包含病毒包膜糖蛋白(也称作膜缔合性蛋白)的宿主细胞的脂双层膜包围。
大量逆转录病毒的基因组结构为本领域众所周知的并且这使逆转录病毒基因组得到适应以便产生逆转录病毒载体。携带所关注基因的重组逆转录病毒载体的生产一般以两步骤完成。首先，将所关注的基因插入逆转录病毒载体，所述载体包含有效表达所关注基因所必需的序列(包括可以由病毒长末端重复序列[LTR]或由内部启动子/增强子和相关剪接信号提供的启动子和/或增强子元件)、将病毒RNA有效包装入感染性病毒体所需的序列(例如包装信号[Psi]、tRNA引物结合位点[-PBS]、逆转录所需的3′调节序列[+PBS]和病毒LTR)。LTR包含病毒基因组RNA、逆录酶和整合酶功能的关联所需的序列和参与指导在病毒颗粒中待包装的基因组RNA的表达的序列。为了安全，许多重组逆转录病毒载体缺乏病毒复制所必需的基因的功能拷贝(这些必需基因缺失或功能失效)；认为所得病毒为复制缺陷型的。
其次，在构建重组载体后，将载体DNA导入包装细胞系。包装细胞系提供了将病毒基因组RNA包装入具有所需宿主范围的病毒颗粒的转运中所需的病毒蛋白(即病毒编码的gag、pol和env蛋白)。宿主范围部分受到病毒颗粒表面上表达的包膜基因产物类型的控制。包装细胞系可以表达亲嗜性、双嗜性或异嗜性包膜基因产物。或者，包装细胞系可能缺乏编码病毒包膜(env)蛋白的序列。在这种情况下，包装细胞系将病毒基因组包装入缺乏膜缔合性蛋白(例如env蛋白)的颗粒。为了产生包含允许病毒进入细胞的膜缔合性蛋白的病毒颗粒，用编码膜缔合性蛋白(例如疱疹性口腔炎病毒[VSV]的G蛋白)的序列转染包含逆转录病毒序列的包装细胞系。转染的包装细胞系随后产生包含由转染的包装细胞系表达的膜缔合性蛋白的病毒颗粒；认为这些病毒颗粒为假型病毒颗粒，这些病毒颗粒包含来源于一种病毒的病毒基因组RNA，所述病毒被另一种病毒的包膜蛋白包壳。
最常用的重组逆转录病毒载体来源于双嗜性莫洛尼鼠白血病毒(MoMLV)(Miller和Baltimore，Mol.Cell.Biol.，6：2895[1986])。MoMLV系统具有几个优点：1)这种特异性逆转录病毒可以感染许多不同细胞类型；2)可利用建立的包装细胞系生产重组MoMLV病毒颗粒；和3)转移的基因被持久地整合入靶细胞染色体。建立的MoMLV载体系统包含含有小部分逆转录病毒序列(病毒的长末端重复序列或＂LTR＂和包装或＂psi＂信号)的DNA载体和包装细胞系。将待转移的基因插入该DNA载体。存在于该DNA载体上的病毒序列提供将载体RNA插入或包装入病毒颗粒和表达插入的基因所必需的信号。包装细胞系提供了颗粒装配所需的病毒蛋白(Markowitz等，J.Virol.，62：1120[1988])。
尽管存在这些优点，但是基于MoMLV的现存逆转录病毒载体受到几个内在问题的限制：1)它们无法感染不分裂的细胞(Miller等，MoI.Cell.Biol.，10：4239[1992])；2)它们产生低滴度的重组病毒(Miller和Rosman，BioTechn.，7：980[1989]；和Miller，Nature357：455[1992])；和3)它们以低效率感染某些细胞类型(例如人淋巴细胞)(Adams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8981[1992])。与基于MoMLV的载体相关的低滴度至少部分归因于病毒编码的包膜蛋白的不稳定性。通过物理方法(例如超速离心和超滤)浓缩逆转录病毒原液导致感染性病毒严重损失。
已经通过使用包含VSV的G蛋白作为膜缔合性蛋白的假型逆转录病毒载体克服了由基于MoMLV的载体所致的低滴度和对某些细胞类型感染无效的缺陷。不同于结合特异性细胞表面蛋白受体以便进入细胞的逆转录病毒包膜蛋白，VSV G蛋白与质膜的磷脂成分发生相互作用(Mastromarino等，J.Gen.Virol.，68：2359[1977])。因为VSV进入细胞不依赖于特异性蛋白受体的存在，所以VSV具有极其广泛的宿主范围。具有VSV G蛋白的假型逆转录病毒载体具有改变的VSV宿主范围特征(即，它们可以感染几乎所有种类的脊椎动物、无脊椎动物和昆虫细胞)。重要的是，可以在不显著丧失感染性的情况下通过超速离心将VSV G-假型逆转录病毒载体浓缩2000倍或2000倍以上(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8033[1993])。
VSV G蛋白还被用于基于人免疫缺陷病毒(HIV)的假型逆转录病毒载体(Naldini等，Science 272：263[1996])。因此，VSV G蛋白可以用于产生多种假型逆转录病毒载体并且不限于基于MoMLV的载体。
4.载体的递送
可以按照各种方式对受试者给予载体。例如，在本发明的某些实施方案中，使用直接注射给予载体至肿瘤或与肿瘤相关的组织中。在其它实施方案中，给予通过血液循环或淋巴循环进行(例如，参见PCT公开99/02685，将该文献完整地引入本文作为参考)。腺病毒载体的典型剂量水平优选为108-1011加入到灌注液中的载体颗粒。
B.联合疗法
本发明并不限于表达线粒体p53。在某些实施方案中，本发明考虑联合疗法。例如，在某些实施方案中，核p53和线粒体p53二者均被用于癌症疗法(例如遗传疗法)。这类联合疗法具有杀伤携带p53错义突变的癌细胞的用途。本发明并不限于特定的机理。实际上，理解这一机理对实施本发明而言并不是必要的。尽管如此，但是值得关注的是线粒体与核p53的组合在诱导癌细胞的编程性细胞死亡中提供了协同作用。
在其它实施方案中，提供了本发明的组合物与现存疗法的组合。在某些实施方案中，提供了本发明的化合物与已知癌症化疗剂的组合。本发明并不限于特定的化疗剂。
打算将不同种类的抗肿瘤(例如抗癌)药用于本发明的某些实施方案中。适用于本发明的抗癌药包括，但不限于：诱导编程性细胞死亡的活性剂；抑制腺苷脱氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤环生物合成、抑制核苷酸互变、抑制核糖核苷酸还原酶、抑制胸苷一磷酸(TMP)合成、抑制二氢叶酸还原、抑制DNA合成、与DNA形成加合物、损伤DNA、抑制DNA修复、插入DNA、使天冬酰胺脱去氨基、抑制RNA合成、抑制蛋白质合成或稳定性、抑制微管合成或功能等的活性剂。
在某些实施方案中，适用于本发明的组合物和方法的典型抗癌药包括，但不限于：1)生物碱类，包括微管抑制剂(例如长春新碱、长春碱和长春地辛等)、微管稳定剂(例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛等)和染色质功能抑制剂，包括拓扑异构酶抑制剂，诸如表鬼臼毒素(例如依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等)，和靶向拓扑异构酶I的活性剂(例如喜树碱和isirinotecan(CPT-11)等)；2)共价DNA-结合剂(烷基化剂)，包括氮芥(例如metchlorethamine、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosphamide)和白消安(MYLERAN)等)；亚硝基脲类(例如卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等)，和其它烷基化剂(例如达卡巴嗪、羟甲基蜜胺、塞替派和丝裂霉素等)；3)非共价DNA-结合剂(抗肿瘤抗生素)，包括核酸抑制剂(例如，更生毒素(放线菌素D)等)；蒽环类抗生素(例如柔红霉素(道诺霉素和红变霉素)、多柔比星(阿霉素)和伊达比星(去甲氧柔红霉素)等)；蒽二酮类(例如蒽环类抗生素类似物，诸如米托蒽醌等)、博来霉素(BLENOXANE)等和普卡霉素(光辉霉素)等；4)抗代谢物，包括抗叶酸剂(例如氨甲蝶呤、葡萄糖酸铁(FOLEX)和氨甲蝶呤钠(MEXATE)等)；嘌呤抗代谢物(例如6-巯基嘌呤(6-MP、PURINETHOL)、6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、硫唑嘌呤、阿昔洛韦、更昔洛韦、氯脱氧腺苷、2-氯脱氧腺苷(CdA)和2′-脱氧考福霉素(喷司他丁)等)；嘧啶拮抗剂(例如氟嘧啶(例如5-氟尿嘧啶(ADRUCIL)、5-氟脱氧尿嘧啶(FdUrd)(氟脲嘧啶脱氧核苷))等)和阿糖胞苷类(例如CYTOSAR(ara-C)和氟达拉滨等)；5)酶，包括L-天冬酰胺酶和羟基脲等；6)激素，包括糖皮质类固醇、抗雌激素药(例如他莫昔芬等)、非类固醇抗雄激素药(例如氟他胺等)和芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑(ARIMIDEX)等)；7)铂化合物(例如顺铂和卡铂等)；8)与抗癌药、毒素和/或放射性核素等缀合的单克隆抗体；9)生物反应调节物(例如干扰素(例如IFN-α等)和白细胞介素(例如IL-2等)等)；10)过继免疫治疗；11)造血生长因子；12)诱导肿瘤细胞分化的活性剂(例如全反式视黄酸等)；13)基因治疗技术；14)反义治疗技术；15)肿瘤疫苗；16)对准肿瘤转移灶的疗法(例如巴马司他等)；17)血管发生抑制剂；18)蛋白体抑制剂(例如VELCADE)；19)乙酰化和/或甲基化抑制剂(例如HDAC抑制剂)；20)NF κ B调节剂；21)细胞周期调节抑制剂(例如CDK抑制剂)；22)p53蛋白功能调节剂；和23)电离辐射。
常规用于癌症治疗情况中的任何溶瘤剂都可用于本发明的组合物和方法中。例如，美国食品与药品管理局保存了批准在美国使用的溶瘤剂的处方集。U.S.F.D.A.的国际对应机构保存了类似的处方集。表4中提供了批准在美国使用的典型抗癌药的表单。本领域技术人员能够认识到所有美国批准的化疗剂上所需的＂产品标签＂均描述了对典型药剂批准的适应症、给药信息、毒性数据等。
表4
 
阿地白介素(脱-丙氨酰基-1，丝氨酸-125人白细胞介素-2) Proleukin Chiron Corp.，Emeryville，CA
阿仑单抗(IgG1κ抗CD52抗体) Campath Millennium andILEX Partners，LP，Cambridge，MA
阿利维A酸(9-顺式-视黄酸) Panretin LigandPharmaceuticals，Inc.，San Diego CA
别嘌醇(1，5-二氢-4H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-4-酮一钠盐) Zyloprim GlaxoSmithKline，Research TrianglePark，NC
六甲蜜胺(N，N，N″N′，N″，N″-六甲基-1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺) Hexalen US Bioscience，WestConshohocken，PA
氨磷汀(乙硫醇，2-[(3-氨丙基)氨基]-，磷酸二氢盐(酯)) Ethyol US Bioscience
阿那曲唑(1，3-苯二乙腈，a，a，a′，a′-四甲基-5-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)) Arimidex AstraZenecaPharmaceuticals，LP，Wilmington，DE
三氧化二砷 Trisenox Cell Therapeutic，Inc.，Seattle，WA
天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酰胺水解酶，EC-2型) Elspar Merck & Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ
活BCG(牛分枝杆菌减毒菌株的冻干制品(卡介苗[BCG]，次代株蒙特利尔)) TICEBCG Organon Teknika，Corp.，Durham，NC
贝沙罗汀胶囊(4-[1-(5，6，7，8-四氢-3，5，5，8，8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸) Targretin LigandPharmaceuticals
 
贝沙罗汀凝胶 Targretin LigandPharmaceuticals
博来霉素(轮枝链霉菌产生的细胞毒性糖肽抗生素；博来霉素A2和博来霉素B2) Blenoxane Bristol-Myers SquibbCo.，NY，NY
卡培他滨(5′-脱氧-5-氟-N-[(戊氧基)羰基]-胞苷) Xeloda Roche
卡铂(铂，二胺[1，1-环丁烷二羧酸(2-)-0，0′]-，(SP-4-2)) Paraplatin Bristol-Myers Squibb
卡莫司汀(1，3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲) BCNU，BiCNU Bristol-Myers Squibb
含有聚苯丙生20植入物的卡莫司汀 Gliadel Wafer GuilfordPharmaceuticals，Inc.，Baltimore，MD
塞来考昔 Celebrex Searle
(作为4-[5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺) Pharmaceuticals，England
苯丁酸氮芥(4-[双(2氯乙基)氨基]苯丁酸) Leukeran GlaxoSmithKline
顺铂(PtCl2H6N2) Platinol Bristol-Myers Squibb
克拉屈滨(2-氯-2′-脱氧-b-D-腺苷) Leustatin，2-CdA R.W.JohnsonPharmaceuticalResearch Institute，Raritain，NJ
环磷酰胺(2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-13，2-氧杂氮杂磷杂环己烯2-氧化物一水合物]) Cytoxan，Neosar Bristol-Myers Squibb
阿糖胞苷(1-b-D-呋喃阿拉伯糖基胞嘧啶，C9H13N3O5) Cytosar-U Pharmacia & UpjohnCompany
阿糖胞苷脂质体 DepoCyt SkyePharmaceuticals，Inc.，San Diego，CA
达卡巴嗪(5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺(DTIC)) DTIC-Dome Bayer AG，Leverkusen，Germany
更生菌素，放线菌素D(微小链霉菌产生的放线菌素，C62H86N12O16) Cosmegen Merck
 
Darbepoetin alfa(重组肽) Aranesp Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA
柔红霉素脂质体((8S-顺式)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-á-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-萘二酮盐酸盐) DanuoXome NexstarPharmaceuticals，Inc.，Boulder，CO
柔红霉素HCl，道诺霉素((1S，3S)-3-乙酰基-1，2，3，4，6，11-六氢-3，5，12-三羟基-10-甲氧基-6，11-二氧代-1-萘基3-氨基-2，3，6-三脱氧-(α)-L-来苏-吡喃己糖苷盐酸盐) Cerubidine Wyeth Ayerst，Madison，NJ
地尼白介素-毒素连接物(重组肽) Ontak Seragen，Inc.，Hopkinton，MA
左丙亚胺((S)-4，4′-(1-甲基-1，2-乙二基)双-2，6-哌嗪二酮) Zinecard Pharmacia & UpjohnCompany
多西他赛((2R，3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸，N-叔丁酯，13-酯与5b-20-环氧-12a，4，7b，10b，13a-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4-乙酸酯2-苯甲酸酯，三水合物) Taxotere AventisPharmaceuticals，Inc.，Bridgewater，NJ
盐酸多柔比星(8S，10S)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-a-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-8-乙醇酰基-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-1-甲氧基-5，12-萘二酮盐酸盐) Adriamycin，Rubex Pharmacia & UpjohnCompany
多柔比星 Adriamycin PFSIntravenousinjection Pharmacia & UpjohnCompany
多柔比星脂质体 Doxil SequusPharmaceuticals，Inc.，Menlo park，CA
丙酸屈他雄酮(17b-羟基-2a-甲基-5a-雄甾-3-酮丙酸盐) Dromostanolone Eli Lilly & Company，Indianapolis，IN
丙酸屈他雄酮 Masteroneinjection Syntex，Corp.，PaloAlto，CA
埃利奥氏B溶液 Elliott′s BSolution Orphan Medical，Inc
 
表柔比星((8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-a-L-阿拉伯-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮盐酸盐) Ellence Pharmacia & UpjohnCompany
红细胞生成素α(重组肽) Epogen Amgen，Inc
雌莫司汀(雌-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇(17(β))-，3-[双(2-氯乙基)氨基甲酸酯]17-(磷酸二氢盐)，二钠盐，一水合物，或雌二醇3-[双(2-氯乙基)氨基甲酸酯]17-(磷酸二氢盐)，二钠盐，一水合物) Emcyt Pharmacia & UpjohnCompany
磷酸依托泊苷(4′-去甲基表鬼臼毒素9-[4，6-0-(R)-亚乙基-(β)-D-吡喃葡糖苷]，4′-(磷酸二氢盐)) Etopophos Bristol-Myers Squibb
依托泊苷，VP-16(4′-去甲基表鬼臼毒素9-[4，6-0-(R)-亚乙基-(β)-D-吡喃葡糖苷]) Vepesid Bristol-Myers Squibb
依西美坦(6-亚甲基雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮) Aromasin Pharmacia & UpjohnCompany
非尔司亭(r-metHuG-CSF) Neupogen Amgen，Inc
氟脱氧尿苷(动脉内)(2′-脱氧-5-氟尿苷) FUDR Roche
氟达拉滨(抗病毒药阿糖腺苷的氟化核苷酸类似物，9-b-D-呋喃阿拉伯糖基腺苷(ara-A)) Fludara Berlex Laboratories，Inc.，Cedar Knolls，NJ
氟尿嘧啶，5-FU(5-氟-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮) Adrucil ICN Pharmaceuticals，Inc.，Humacao，Puerto Rico
氟维司群(7-α-[9-(4，4，5，5，5-五氟戊基亚磺酰基)壬基]雌-1，3，5-(10)-三烯-3，17-β-二醇) Faslodex IPR Pharmaceuticals，Guayama，PuertoRico
吉西他滨(2′-脱氧-2′，2′-二氟胞苷一盐酸盐(b-异构体)) Gemzar Eli Lilly
吉姆单抗奥佐米星(抗-CD33 hP67.7) Mylotarg Wyeth Ayerst
 
醋酸戈舍瑞林([D-Ser(But)6，Azgly10]LHRH的乙酸盐；焦-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙酸盐[C59H84N18O14·(C2H4O2)x]) Zoladex Implant AstraZenecaPharmaceuticals
羟基脲 Hydrea Bristol-Myers Squibb
替伊莫单抗(由单克隆抗体Ibritumomab与接头-螯合剂tiuxetan[N-[2-双(羧甲基)氨基]-3-(对-异硫氰酸苯基)-丙基]-[N-[2-双(羧甲基)氨基]-2-(甲基)-乙基]甘氨酸之间的硫脲共价键产生的免疫缀合物) Zcvalin Biogen IDEC，Inc.，Cambridge MA
伊达比星(5，12-萘二酮，9-乙酰基-7-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-(α)-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，9，11-三羟基盐酸盐，(7S-顺式)) Idamycin Pharmacia & UpjohnCompany
异环磷酰胺(3-(2-氯乙基)-2-[(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1，3，2-氧杂氮杂磷杂环己烯2-氧化物) IFEX Bristol-Myers Squibb
甲磺酸伊马替尼(4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐) Gleevec Novartis AG，Basel，Switzerland
干扰素α-2a(重组肽) Roferon-A Hoffmann-La Roche，Inc.，Nutley，NJ
干扰素α-2b(重组肽) Intron A(冻干的重组干扰素) Schering AG，Berlin，Germany
盐酸伊立替康((4S)-4，11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶子基哌啶子基)羰基氧基]-1H-吡唑并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)二酮盐酸盐三水合物) Camptosar Pharmacia & Upjohnompany
来曲唑(4，4′-(1H-1，2，4-三唑-1-基亚甲基)二苄腈) Femara Novartis
亚叶酸(L-谷氨酸，N[4[[(2-氨基-5-甲酰基-1，4，5，6，7，8-六氢-4氧代-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]，钙盐(1：1)) Wellcovorin，Leucovorin Immunex，Corp.，Seattle，WA
 
盐酸左旋咪唑((-)-(S)-2，3，5，6-四氢-6-苯基咪唑并[2，1-b]噻唑一盐酸盐C11H12N2S·HCl) Ergamisol Janssen ResearchFoundation，Titusville，NJ
洛莫司汀(1-(2-氯-乙基)-3-环己基-1-亚硝基脲) CeeNU Bristol-Myers Squibb
Meclorethamine，氮芥(2-氯-N-(2-氯乙基)-N-甲基乙胺盐酸盐) Mustargen Merck
醋酸甲地孕酮17α(乙酰氧基)-6-甲基孕-4，6-二烯-3，20-二酮 Megace Bristol-Myers Squibb
美法仑，L-PAM(4-[双(2-氯乙基)氨基]-L-苯丙氨酸) Alkeran GlaxoSmithKline
巯基嘌呤，6-MP(1，7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮一水合物) Purinethol GlaxoSmithKline
美司钠(2-巯基乙烷磺酸钠) Mesnex Asta Medica
氨甲蝶呤(N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸) Methotrexate Lederle Laboratories
甲氧沙林(9-甲氧基-7H-呋喃并[3，2-g][1]-苯并吡喃-7-酮) Uvadex Therakos，Inc.，WayExton，Pa
丝裂霉素C Mutamycin Bristol-Myers Squibb
丝裂霉素C Mitozytrex SuperGen，Inc.，Dublin，CA
米托坦(1，1-二氯-2-(邻-氯苯基)-2-(对-氯苯基)乙烷) Lysodren Bristol-Myers Squibb
米托蒽醌(1，4-二羟基-5，8-双[[2-[(2-羟乙基)氨基]乙基]氨基]-9，10-蒽二酮二盐酸盐) Novantrone Immunexcorporation
苯丙酸诺龙 Durabolin-50 Organon，Inc.，WestOrange，NJ
若莫单抗 Verluma Boehringer IngelheimPharma KG，Germany
奥普瑞白介素(IL-11) Neumega Genetics Institute，Inc.，Alexandria，VA
奥沙利铂(顺式-[(1R，2R)-1，2-环己二胺-N，N′][草酸(2-)-0，0′]铂) Eloxatin Sanofi Synthelabo，Inc.，NY，NY
 
紫杉醇(5β，20-环氧-1，2a，4，7β，10β，13a-六羟基紫杉-11烯-9-酮4，10-二乙酸酯2-苯甲酸酯13-酯与(2R，3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨酸) TAXOL Bristol-Myers Squibb
帕米膦酸盐(膦酸(3-氨基-1-羟基亚丙基)双-，二钠盐，五水合物，(APD)) Aredia Novartis
培格脱氨酶((一甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基)11-17-腺苷脱氨酶) Adagen(PegademaseBovine) EnzonPharmaceuticals，Inc.，Bridgewater，NJ
天门冬酰胺酶(一甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基L-天冬酰胺酶) Oncaspar Enzon
培格非格司亭(Pegfilgrastim)(重组甲硫氨酰基人G-CSF(非格司亭)与一甲氧基聚乙二醇的共价轭合物) Neulasta Amgen，Inc
喷司他丁 Nipent Parke-DavisPharmaceutical Co.，Rockville，MD
哌泊溴烷 Vercyte Abbott Laboratories，Abbott Park，IL
普卡霉素，光辉霉素(褶链霉菌产生的抗生素) Mithracin Pfizer，Inc.，NY，NY
卟菲尔钠 Photofrin QLTPhototherapeutics，Inc.，Vancouver，Canada
丙卡巴肼(N-异丙基-μ-(2-甲基肼基)-对-甲苯酰胺一盐酸盐 Matulane Sigma TauPharmaceuticals，Inc.，Gaithersburg，MD
米帕林(6-氯-9-(1-甲基-4-二乙基-胺)丁氨基-2-甲氧基吖啶) Atabrine Abbott Labs
拉布立酶(重组肽) Elitek Sanofi-Synthelabo，Inc.，
美罗华(重组抗-CD20抗体) Rituxan Genentech，Inc.，South San Francisco，CA
沙格司亭(重组肽) Prokine Immunex Corp
 
链佐星(链佐星2-脱氧-2-[[(甲基亚硝基氨基)羰基]氨基]-a(和b)-D-吡喃葡萄糖和220mg无水柠檬酸 Zanosar Pharmacia&UpjohnCompany
滑石(Mg3Si4O10(OH2)) Sclerosol Bryan，Corp.，Woburn，MA
他莫昔芬((Z)2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺2-羟基-1，2，3-丙三羧酸酯(1：1)) Nolvadex AstraZenecaPharmaceuticals
替莫唑胺(3，4-二氢-3-甲基-4-氧代咪唑[5，1-d]-as-四嗪-8-甲酰胺) Temodar Schering
替尼泊苷，VM-26(4′-去甲基表鬼臼毒素9-[4，6-0-(R)-2-噻吩亚甲基-(β)-D-吡喃葡糖苷]) Vumon Bristol-Myers Squibb
睾内酯(13-羟基-3-氧代-13，17-开环雄-1，4-二烯-17-酸[dgr]-内酯) Teslac Bristol-Myers Squibb
硫代鸟嘌呤，6-TG(2-氨基-1，7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮) Thioguanine GlaxoSmithKlinc
塞替派(氮丙啶，1，1′1″-膦基内鎓盐三-，或三(1-氮丙啶基)膦硫化物) Thioplex ImmunexCorporation
盐酸托泊替康((S)-10-[(二甲氨基)甲基]-4-乙基-4，9-二羟基-1H-吡唑并[3′，4′：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14-(4H，12H)-二酮一盐酸盐) Hycamtin GlaxoSmithKline
托瑞米芬(2-(对-[(Z)-4-氯-1，2-二苯基-1-丁烯基]-苯氧基)-N，N-二甲基乙胺柠檬酸盐(1：1)) Fareston RobertsPharmaceuticalCorp.，Eatontown，NJ
托西莫单抗，I131托西莫单抗(重组鼠免疫治疗单克隆IgG2aλ抗-CD20抗体(I131为放射性免疫治疗抗体)) Bexxar Corixa Corp.，Seattle，WA
曲妥单抗(重组单克隆IgG1κ抗-HER2抗体) Herceptin Genentech，Inc
维A酸，ATRA(全反式视黄酸) Vesanoid Roche
尿嘧啶氮芥 尿嘧啶氮芥胶囊 Roberts Labs
 
戊柔比星，N-三氟乙酰基阿霉素-14-戊酸酯((2S-顺式)-2-[1，2，3，4，6，11-六氢-2，5，12-三羟基-7-甲氧基-6，11-二氧代-[[42，3，6-三脱氧-3-[(三氟乙酰基)-氨基-α-L-来苏-吡喃己糖基]氧基]-2-萘基]-2-氧代乙基戊酸酯]) Valstar Anthra-->Medeva
长春碱，长春新碱(C46H56N4O10·H2SO4) Velban Eli Lilly
长春新(C46H56N4O10·H2SO4) Oncovin Eli Lilly
长春瑞滨(3′，4′-二脱氢-4′-脱氧-C′-去甲长春碱[R-(R*，R*)-2，3-二羟基丁二酸(1：2)(盐)] Navelbine GlaxoSmithKline
唑来膦酸盐，唑来膦酸((1-羟基-2-咪唑-1-基-膦酰基乙基)膦酸一水合物) Zometa Novartis
C.小分子药物
在某些实施方案中，本发明提供了通过再活化(例如重折叠)突变线粒体p53减轻或消除癌症的药物(例如小分子药物)。在某些实施方案中，使用本文所述的药物筛选(例如下文的部分II中所述)鉴定小分子药物。
D.药物组合物
本发明进一步提供了药物组合物(例如包含上述的治疗化合物)。可以根据是需要局部治疗还是全身治疗和所治疗的区域的不同以许多方式给予本发明的药物组合物。给药可以为局部的(包括眼部和对粘膜，包括阴道和直肠递送)、肺部的(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)、口服或非肠道的。非肠道给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内给药。
用于局部给药的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或需要的。
用于口服给药的组合物和制剂包括粉末或颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、小药囊或片剂。可能需要增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂。
用于非肠道、鞘内或心室内给药的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂，诸如，但不限于渗透促进剂、载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括，但不限于溶液、乳液和包含脂质体的制剂。可以由包括，但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体的各种成分生成这些组合物。
可以按照制药工业中众所周知的常规技术制备本发明的药物制剂，可以将其便利地制成单位剂型。这类技术包括使活性组分与药用载体或赋形剂组合的步骤。一般而言，通过均匀和紧密混合活性组分与液体载体或细碎的固体载体或它们两者，且然后如果必要使产物成形来制备制剂。
可以将本发明的组合物配制成任何许多可能的剂型，诸如，但不限于片剂、胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂和灌肠剂。还可以将本发明的组合物配制成在水性、非水性或混合介质中的栓剂。水悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液粘度的物质，包括，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，可以将药物组合物配制成泡沫和以泡沫形式使用。药物泡沫包括诸如，但不限于乳液、微乳液、霜剂、胶冻剂和脂质体这类制剂。尽管在性质上基本上类似，但是这些制剂在终产物的成分和稠度方面可以改变。
还可以将促进寡核苷酸在细胞水平上摄取的活性剂加入到本发明的药物和其它组合物中。例如，阳离子脂质，诸如lipofectin(美国专利US 5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，诸如聚赖氨酸(WO 97/30731)也可以促进寡核苷酸的细胞摄取。
本发明的组合物还可以另外包含通常在药物组合物中存在的其它辅助成分。因此，例如，组合物可以包含附加的相容性药物活性物质，诸如，例如止痒剂、收敛剂、局麻剂或消炎剂或可以包含用于物理配制本发明组合物的各种剂型的附加物质，诸如染料、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，这类物质在添加时不应过度地干扰本发明组合物成分的生物活性。可以对制剂进行灭菌，并且如果需要，将其与助剂混合，例如，所述助剂为润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、矫味剂和/或芳香物质等，它们不会与制剂中的药物活性剂发生有害相互作用。
本发明的某些实施方案提供了包含下列成分的药物组合物：(a)本发明的一种或多种化合物；和(b)通过非反义机理起作用的一种或多种其它化疗剂。这类化疗剂的实例包括，但不限于：抗癌药，诸如柔红霉素、放线菌素D、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟脱氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、依托泊苷、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。还可以在本发明的组合物中联合使用消炎药，包括，但不限于非类固醇消炎药和皮质类固醇和抗病毒药，包括，但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦。其它非反义化疗剂也属于本发明的范围。可以共同或依次使用两种或多种联用的化合物。
给药取决于所治疗的疾病状态的严重程度和反应性，其中治疗过程持续几天至几个月或直到治愈或实现减轻疾病状态为止。可以根据患者身体中的药物蓄积测量值计算最佳给药时间安排。给药的医生易于确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳剂量可以根据各个寡核苷酸的相对效能而改变并且一般可以基于发现在体外或体内动物模型中有效的EC50值或基于本文所述的实施例来估计。一般而言，剂量在0.01μg-100g/kg体重，并且可以每天、每周、每个月或每年给药一次或多次。治疗的医生可以基于测定的药物在体液或组织中的保留时间和浓度估计给药的重复频率。在成功治疗后，可能需要对受试者进行维持疗法以便预防疾病状态的复发，其中以维持剂量给予寡核苷酸，即0.01μg-100g/kg体重，每天给药一次或多次至每隔20年一次。
II.药物筛选
在某些实施方案中，本发明提供了药物筛选试验(例如用于筛选抗癌药)。在某些实施方案中，本发明的筛选方法使用了本文所述的p53线粒体靶向载体。例如，在某些实施方案中，本发明提供了筛选使功能失活的突变线粒体p53蛋白质重折叠的化合物的方法。在其它实施方案中，本发明提供了筛选有利于正常p53靶向至线粒体或增强线粒体中正常p53表达的化合物的药物筛选方法。在某些实施方案中，候选化合物为小分子。
A.p53表达试验
在一种筛选方法中，针对候选化合物改变(例如增加)线粒体上野生型p53表达的能力来评价该化合物，该评价通过使化合物接触细胞且然后测定候选化合物对线粒体p53表达的效应来进行。在某些实施方案中，通过检测细胞表达的线粒体p53mRNA的水平来测定候选化合物对p53的线粒体表达的效应。可以通过任何合适的方法，包括，但不限于本文披露的那些方法检测mRNA表达。
在某些实施方案中，通过RNA印迹分析检测RNA。RNA印迹分析包括分离RNA和与互补标记的探针杂交。用于RNA印迹分析的方法为本领域众所周知的。
在其它实施方案中，通过特异性结构的酶促切割检测RNA表达(INVADER测定法，Third Wave Technologies；例如，参见美国专利US 5,846,717；US 6,090,543；US 6,001,567；US 5,985,557；和US5,994,069；将这些文献各自引入本文作为参考)。INVADER测定法通过使用切割经与重叠寡核苷酸探针杂交形成的复合物的结构特异性酶检测特异性核酸(例如RNA)序列。
在另外的实施方案中，通过与寡核苷酸探针杂交检测RNA(或相应的cDNA)。可以利用使用用于杂交和检测的各种技术的各种杂交试验。例如，在某些实施方案中，使用TaqMan试验(Applied Biosystems，Foster City，CA；例如，参见美国专利US 5,962,233和US 5,538,848，将这些文献各自引入本文作为参考)。在PCR反应过程中进行该试验。TaqMan试验利用了AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′外切核酸酶活性。在PCR反应中包括由具有5′-报道染料(例如荧光染料)和3′-猝灭染料的寡核苷酸组成的探针。在PCR过程中，如果探针与它的靶结合，AMPLITAQ GOLD聚合酶的5′-3′溶核活性则切割在报道染料与猝灭染料之间的探针。报道染料与猝灭染料的分离导致荧光增加。信号随着每一PCR循环累加并且可以使用荧光计监测。
在其它实施方案中，将逆录酶PCR(RT-PCR)用于检测RNA的表达。在RT-PCR中，使用逆录酶使RNA酶促转化成互补DNA或＂cDNA＂。然后将cDNA用作PCR反应的模板。可以通过任何合适的方法检测PCR产物，所述方法包括，但不限于凝胶电泳和使用DNA特异性染色剂染色或与标记探针杂交。在某些实施方案中，使用应用美国专利US 5,639,606、US 5,643,765和US 5,876,978(将这些文献各自引入本文作为参考)中所述的竞争性模板方法的标准化混合物的定量逆录酶PCT。
在其它实施方案中，通过测定线粒体p53多肽表达水平检测候选化合物的效果。可以使用任何合适的方法，包括，但不限于本文披露的那些方法测定多肽的表达水平。在某些实施方案中，通过结合对蛋白质具有特异性的抗体检测蛋白质。本发明并不限于特定的抗体。可以使用特异性检测线粒体p53的任何抗体(单克隆或多克隆的)。用于产生抗体的方法如下所述。
通过本领域中公知的技术检测抗体结合。例如，在某些实施方案中，使用合适的技术检测抗体结合，所述的技术包括，但不限于放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、＂夹心式＂免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集试验(例如凝胶凝集试验、血细胞聚集试验等)、互体结合试验、免疫荧光试验、蛋白质A测定和免疫电泳测定。在其它实施方案中，将免疫组织化学用于检测抗体结合。
在一个实施方案中，通过检测初次抗体上的标记来检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测二次抗体或试剂与初次抗体的结合来检测初次抗体。在另一个实施方案中，标记二次抗体。用于检测免疫测定中的结合的许多方法为本领域公知的并且属于本发明的范围。
在某些实施方案中，使用自动化检测试验。用于免疫测定自动化的方法包括，但不限于美国专利US 5,885,530、US 4,981,785、US6,159,750和US 5,358,691中所述的那些方法，将这些文献各自引入本文作为参考。在某些实施方案中，分析和显示结果也是自动化的。例如，在某些实施方案中，使用基于存在或不存在一系列相当于癌症标记的蛋白质生成诊断和/或预后的软件。
在其它实施方案中，使用美国专利US 5,599,677和US 5,672,480中所述的免疫测定，将这些文献各自引入本文作为参考。在其它实施方案中，通过免疫组织化学检测蛋白质。
如上所述，在某些实施方案中，本发明提供了筛选使功能失活的突变线粒体p53蛋白质重折叠的化合物的方法。正如通过下述实验所示，携带突变p53的肿瘤细胞与其异常升高的(突变)p53蛋白质的总细胞水平成正比，在线粒体上具有组成性存在的突变p53，但是它是功能失活的(Mihara等，Mol.Cell，2003)。因此，在某些实施方案中，Mihara的论文中所述的细胞色素c释放试验提供了快速的药物筛选，其用于鉴定使突变p53重折叠的小分子化合物，按照这类方式使得它们恢复线粒体的生物功能。
B.细胞试验
与正常细胞或具有野生型p53的癌细胞相反，具有突变p53基因的人癌细胞以组成型方式在线粒体上表达高水平的突变p53蛋白质。然而，测试的8种源自不同肿瘤的p53突变体中的所有8种在线粒体上均不是功能失活的。在某些优选的实施方案中，本发明提供了鉴定突变线粒体p53的小分子激活物的方法。在某些实施方案中，使用具有突变p53的细胞系(例如癌细胞系)并且监测p53的线粒体功能和编程性细胞死亡。
本发明也不限于特定的测试化合物。在某些实施方案中，使用已知用于拯救有利于转录功能的突变p53的前导化合物(例如包括，但不限于CP-31398和PRIMA-I)。然而，本发明并不限于使用CP-31398和PRIMA-I。生成测试化合物的各种商品来源和方法为本领域公知的。可以使用本领域中公知的组合文库方法中的许多途径之任一种获得本发明的测试化合物，包括生物文库；类肽文库(具有肽类官能度，但具有新的非肽骨架的分子的文库，它们耐受酶促降解，而仍然保持生物活性；例如，参见Zuckennann等，J.Med.Chem.37：2678-85[1994])；空间可寻址平行固相或溶液相文库；需要解旋的合成文库法；′一珠一化合物′文库法；和使用亲和色谱选择的合成文库法。优选将生物文库和类肽文库途径与肽文库联用，而其它的四种途径适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
用于合成分子文库的方法的实例可以在本领域中，例如在下列文献中查找到：DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909[1993]；Erb等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 91：11422[1994]；Zuckermann等，J.Med.Chem.37：2678[1994]；Cho等，Science261：1303[1993]；Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059[1994]；Carell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061[1994]；和Gallop等，J.Med.Chem.37：1233[1994]。
可以在溶液中(例如Houghten，Biotechniques 13：412-421[1992])或在珠粒(Lam，Nature 354：82-84[1991])、芯片(Fodor，Nature 364：555-556[1993])、细菌或孢子(美国专利US 5,223,409；引入本文作为参考)、质粒(Cull等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA89：18651869[1992])或噬菌体(Scott和Smith，Science249：386-390[1990]；Devlin Science 249：404-406[1990]；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382[1990]；Felici，J.Mol.Biol.222：301[1991])上呈现化合物的文库。
C.体内试验
在其它实施方案中，在药物筛选应用中使用动物模型(例如癌症模型)。代表性动物描述在实验部分中(例如淋巴瘤模型)。在某些实施方案中，在癌症动物模型中测试p53靶向载体。在其它实施方案中，在动物模型中测试小分子(例如上述那些)。
III.抗体
本发明提供了分离的抗p53的抗体。例如，这些抗体可用于本文所述的药物筛选方法中。
针对本发明蛋白质的抗体可以为任何的单克隆或多克隆抗体，只要它能够识别所述的蛋白质。可以通过使用本发明的蛋白质作为抗原按照常规的抗体或抗血清制备方法生产抗体。
本发明关注单克隆和多克隆抗体的应用。任何合适的方法都可以用于产生用于本发明方法和组合物中的抗体，包括，但不限于本文所披露的那些方法。例如，就单克隆抗体的制备而言，将蛋白质本身或与合适的载体或稀释剂一起在允许产生抗体的条件下给予动物(例如哺乳动物)。为了提高抗体产生能力，可以给予完全或不完全弗氏佐剂。一般而言，每隔2周-6周将蛋白质给予一次，总体上，约2次-约10次。适用于这类方法的动物包括，但不限于灵长类、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。
为了制备产生单克隆抗体的细胞，选择已经确认了抗体滴度的单个动物(例如小鼠)，并且在最终免疫接种后2天-5天，采集其脾或淋巴结并且使其中包含的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以便制备所需的单克隆抗体产生杂交瘤。例如，可以通过使如下文中所述的标记蛋白与抗血清反应且然后测定与抗体结合的标记物质的活性对抗血清中的抗体滴度进行测定。可以按照已知方法，例如Koehler和Milstein所述的方法(Nature 256：495[1975])进行细胞融合。例如，作为融合促进剂，使用聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(HVJ)，优选PEG。
骨髓瘤细胞的实例包括NS-I、P3U1、SP2/0、AP-I等。抗体产生细胞(脾细胞)的数量和将要使用的骨髓瘤细胞的数量之比优选为约1:1-约20:1。优选加入约10％-约80％浓度的PEG(优选PEG 1000-PEG6000)。可以通过在约20℃-约40℃，优选约30℃-约37℃下将两种细胞的混合物孵育约1分钟-10分钟有效地进行细胞融合。
各种方法可以用于筛选产生抗体(例如抗p53)的杂交瘤。例如，将杂交瘤上清液加入到直接或与载体一起吸附抗体的固相(例如微量培养板)中且然后加入抗免疫球蛋白抗体(如果将小鼠细胞用于细胞融合，那么使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或用放射性物质或酶标记的蛋白质A以便检测针对结合到固相上的该蛋白质的单克隆抗体。或者，将杂交瘤上清液加入到吸附抗免疫球蛋白抗体或蛋白质A的固相中且然后加入用放射性物质或酶标记的该蛋白质以便检测针对结合到固相上的该蛋白质的单克隆抗体。
可以按照任何公知的方法或其改进方法对单克隆抗体进行筛选。一般而言，使用加入了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)的动物细胞培养基。可以使用任何一种选择和生长培养基，只要杂交瘤能够生长。例如，可以使用包含1％-20％，优选10％-20％胎牛血清的RPMI 1640培养基；包含1％-10％胎牛血清的GIT培养基；用于培养杂交瘤的不含血清的培养基(SFM-101，Nissui Seiyaku)等。一般而言，培养在20℃-40℃，优选37℃下和在约5％ CO2气体环境中进行约5天-3周，优选1周-2周。可以按照与上述关于抗血清中的抗-蛋白质抗体滴度相同的方法测定杂交瘤培养物上清液中的抗体滴度。
可以按照与常规多克隆抗体的分离和纯化相同的方法对单克隆抗体(例如抗p53)进行分离和纯化，诸如免疫球蛋白的分离和纯化，例如盐析、醇沉淀、等电点沉淀、电泳、使用离子交换剂(例如DEAE)吸附和解吸附、超速离心、凝胶过滤或特异性纯化方法，其中使用活性吸附剂，诸如抗原结合固相、蛋白质A或蛋白质G专门收集抗体并且拆开结合以便获得抗体。
可以通过任何公知的方法或这些方法的改进方法制备多克隆抗体，包括从患者中获得抗体。例如，制备免疫原(针对蛋白质的抗原)和载体蛋白的复合物并且按照与对于上述单克隆抗体制备所述相同的方法用该复合物免疫接种动物。从免疫接种的动物中回收包含其抗体的物质并且分离和纯化该抗体。
就欲用于免疫接种动物的免疫原和载体蛋白的复合物而言，可以使用任何一种载体蛋白和任何混合比例的载体和半抗原，只要有效产生在载体上交联并且用于免疫接种的针对该半抗原的抗体。例如，可以使牛血清白蛋白、牛环状球蛋白、钥孔
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血蓝蛋白等与半抗原按照每1份半抗原约0.1份至约20份，优选约1份至约5份的重量比偶联。
此外，可以将各种缩合剂用于偶联半抗原与载体。例如戊二醛、碳化二亚胺、马来酰亚胺活化酯、包含巯基或二硫代吡啶基的活化酯试剂等可用于本发明。对允许抗体产生的动物的某一部位单独给予或与合适的载体或稀释剂一起给予缩合产物。为了提高抗体产生能力，可以给予完全或不完全弗氏佐剂。一般而言，每隔2周-6周将蛋白质给予一次，总计约3次-约10次。。
从通过上述方法免疫接种的动物的血液、腹水等中回收多克隆抗体。可以按照与上述关于杂交瘤培养物上清液所述相同的方法测定抗血清中的抗体滴度。可以按照与对于上述单克隆抗体所述相同的免疫球蛋白分离和纯化方法对抗体进行分离和纯化。
本文中用作免疫原的蛋白质不限于任何特定类型的免疫原。例如，p53蛋白质(进一步包括具有部分改变的核苷酸序列的基因)可以用作免疫原。此外，可以使用该蛋白质的片段。可以通过任何方法，包括，但不限于表达基因片段、蛋白质的酶促加工、化学合成等获得片段。
在某些实施方案中，使抗体(例如单克隆抗体)人源化。这类人源化抗体特别可用于下述的癌症免疫疗法。改变人源化抗体以便使其对人的免疫原性较低，例如通过构建嵌合抗体，其中使小鼠抗原结合可变区与人恒定区偶联。人源化抗体一般为人抗体，其中某些CDR残基和可能某些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。用于使抗体人源化的方法为本领域众所周知的并且包括，但不限于下列文献中披露的那些方法：美国专利US 6,054,297、US 4,816,567、US6，180,377、US 5,871,907、US 5,585,089和US 6，180,370，将这些文献各自引入本文作为参考。
实验
提供下列实施例以便证实和进一步举例说明本发明的某些优选实施方案和方面，但并不用来限制本发明的范围。
在下列实验披露部分中，使用下列缩写：N(正常)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；pmol(皮摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；1或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；和℃(摄氏度)。
实施例1
线粒体靶向p53
本实施例描述了p53在体外和体内的线粒体靶向。
A.材料和方法
逆转录病毒构建体。通过克隆与MSCV多接头下游的杀稻瘟菌素S-脱氨酶融合的绿色荧光蛋白构建复制缺陷型小鼠干细胞病毒MSCV/CMV-GFP Bla。通过单独的CMV启动子驱动GFP Bla，因为尽管进行了p53表达，但是通过内部核糖体进入位点由p53-驱动LTR启动子驱动它的尝试并未成功。在EcoRI/Not I位点上将下列cDNA亚克隆入该载体中：人野生型p53(Nucl p53)；在其C-末端分别与BclXL(p53CTB)或Bcl2(p53CTM)跨膜结构域p53或与细胞色素b5的ER前导序列(p53ER)和不含p53的分离的BclXL的跨膜结构域融合的野生型p53。在PhoenixE细胞中产生逆转录病毒原液(Petrenko等，Mol CellBiol 23：5540-5555)。
淋巴瘤模型。使Em myc转基因小鼠(C57BL/6-TgMyc)与p53+/-小鼠或INK4a/ARF+/-小鼠杂交并且通过PCR对幼仔进行基因分型(Jacks等，1994.Curr.Biol.4：1-7)。在90％的p53+1-和ARF+I-动物中，淋巴瘤存在30-50天(Schmitt等，1999.Genes Dev 13：2670-2677)并且80％的肿瘤已经丧失了其保留的野生型p53或INK4a/ARF等位基因。将这些淋巴瘤植入正常同基因小鼠中，在该小鼠中它们充分再现其生物行为(Schmitt等，文献同上)。从具有肿瘤的供体淋巴结中采集淋巴瘤。通过FACS将细胞免疫分型为Thy 12-、B220+和IgM-(前B细胞)或IgM+(成熟B细胞淋巴瘤)。将原发性肿瘤细胞培养3天以便消除正常细胞混杂。再基因分型证实了在所有分离物中保留的等位基因丧失，从而产生了p53-/-ARF+/+或p53+/+ARF-/-淋巴瘤。使用来源于6只小鼠的独立的分离物。将细胞悬浮液在丝裂霉素抑制的NIH3T3饲养器(feeder)上铺板并且使其在45％ Iscove培养基、45％Dulbecco培养基、10％ FBS中生长，此后进行spinocculation(Schmitt等，2000.Nat.Med.6：1029-1035)。
由14.5d胚胎(C57BL/6)制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。p53-/-MEF来源于Trp53tmlTyj突变小鼠。将MEF和NIH 3T3维持在DME培养基+10％ FBS中。通过在等数量的饲养器上按照一式三份进行等数量铺板测定感染的淋巴瘤细胞的体外生长，其中每天通过Coulter计数器和FACS对非贴壁细胞进行计数。为了进行集落形成试验，用表达逆转录病毒的ElA感染MEF(Petrenko等，文献同上)，随后在36小时后用空病毒、p53CTM或p53CTB病毒感染。在杀稻瘟菌素中对细胞选择2天并且使用H-RasV12转导(Petrenko等，文献同上)。在16天后，对姬姆萨染色的转化灶计数。为了进行体外编程性细胞死亡研究，最初将样品调整至65％的GFP阳性细胞。就淋巴瘤细胞而言，在无额外DNA损伤的情况下在转导后36小时进行TUNEL(Roche，Nutley，New Jersey)。就MEF而言，转导ElA致敏的细胞，然后用杀稻瘟菌素选择2天以便获得100％ GFP阳性并且保持细胞未经处理或用阿霉素(0.34μM)处理细胞6或12小时。
蛋白质表达。用对下列具有特异性的抗体对完整细胞切割物(50-70μg)进行免疫印迹：p53(小鼠特异性CM-5，载体，Burlingame，California)(人特异性DO-1 Calbiochem，Darmstadt，Germany)；p21(SXM30，Pharmingen，San Diego，California)、PUMAα、β(AbCam Cambridge，Massachusetts)；p19ARF(Ab80-50，AbCam)；p21(F5)，MDM2(SMP14)，BclXL/xs(S18)，ElA(135-5)和PCNA(均获自Santa Cruz Biotechn.，Santa Cruz，California)。
免疫荧光。使淋巴瘤细胞在载玻片上进行细胞旋转；使3T3细胞生长在8-孔腔式载玻片中。将细胞在4％低聚甲醛中固定20分钟并且用PBS/0.5％ Tween 20透化处理5分钟。在10％正常山羊血清中封闭载玻片，随后与CM-1(1：500；人特异性p53，载体)和细胞色素c(1：200；克隆2G8)或mt hsp70(1：25；ABR Affinity BioreagentsGolden，Colorado)一起孵育2小时以便检测线粒体。就p53ER而言，使用DO-1检测p53并且使用抗-钙网织蛋白(ABR)检测ER。将抗小鼠IgG和抗兔IgG用于对照。将载玻片在Cy5-和TRITC-缀合的二次抗体中孵育1小时。在共聚焦激光显微镜(ZEISS LSM 510)下观测细胞。借助于免疫过氧化物酶用DO-1染色肿瘤切片。
体内竞争实验。如结果中所讨论的使用应用40:60，75:25和90:10的GFP阳性比例的三种不同方案。将FACS分选的细胞培养3天，此后进行注射以便验证无菌性。将在100μl PBS中的1x106个淋巴瘤细胞注入同基因非转基因受体小鼠的尾静脉。26-30天后，动物在颈部和/或腹股沟、腋窝和腹膜后区出现可触及的淋巴瘤。偶尔观察到结外淋巴瘤。从每一受体中，收集所有肿瘤并且进行FACS分析以便确定残留GFP阳性。为了验证组织病理学，处理每一肿瘤以便进行H&E。在所观察的肿瘤内部或周围不存在炎性淋巴细胞性浸润。同样，不存在正常组织成分，包括脉管结构和基质的损伤。为了进行体内编程性细胞死亡试验，固定淋巴瘤并且通过TUNEL与Hoechst复染染色。或者，将2x106个转导的淋巴瘤细胞经皮下注入正常同基因小鼠并且在2，4，8和12天后处死动物。采集注射部位并且处理以便进行TUNEL/H&E和使用DO-1的p53免疫过氧化物酶染色。
B.结果
用于体内研究的原发性淋巴瘤分离物和逆转录病毒的表征。Eμmyc转基因小鼠超表达其B细胞谱系中的c-myc癌基因并且在4-6个月龄内发生前B和B细胞淋巴瘤(Harris等，1988 J.Exp.Med.167:353-371)。这种沿用已久的可植入肿瘤模型具有许多优点(附图1)。此外，可以在离体环境下通过逆转录病毒基因转移将测试基因有效导入分离的原发性淋巴瘤细胞并且注入正常同基因受体小鼠的尾静脉以便进行淋巴瘤重建。肿瘤形成和攻击性取决于不起作用的p53途径(Schmitt等，1999，Genes Dev 13：2670-2677；Schmitt等，2000Nat Med 6：1029-1035；Eischen等，2001，Mol Cell Biol21：7653-7662；Eischen等，2001，Mol Cell Biol 21：5063-5070；Eischen等，1999，Genes Dev 13：2658-2669；Jacobs等，1999，GenesDev.13：2678-2690)。肿瘤编程性细胞死亡通过线粒体途径发生，因为并非在这些淋巴瘤中超表达的Bcl2在强制性超表达时产生多抗药性(Schmitt等，2000，文献同上)。p53的丧失等同于INK4a/ARF，即p53的正上游调控子的丧失，并且这两种情况均大大加速了c-myc淋巴瘤生成(Schmitt等，1999，文献同上)。与亲代肿瘤相比，p53-和ARF-裸淋巴瘤均为高度扩散性的并且具有严重细胞凋亡缺陷和对化疗的显著抗性(Schmitt等，1999，文献同上)。
4种独立的p53-/-ARF+/+和两种ARF-/-p53+/+B淋巴瘤分离自p53+/-和ARF+/-Eμmyc小鼠(附图2a)。使用表达GFP的鼠干细胞病毒和常规p53(核p53)或2种形式的线粒体靶向p53通过与BclXL(p53CTB)或Bcl2(p53CTM)的跨膜结构域融合转导分离物。对照病毒缺乏p53插入片段(附图2a)。对所有构建体而言，感染效率约为40％(附图2d)。在p53裸和ARF裸淋巴瘤中和在NIH3T3细胞中，p53CTM和p53CTB的表达水平等同于正常照射的胸腺细胞的生理应激诱导的p53水平(附图2b左侧)。核p53的水平稍低于靶向p53CTM(附图2b右侧和附图2c)。
p53CTB和p53CTM靶向至线粒体。定位研究证实了p53CTB独占地定位于所有测试细胞类型中的线粒体，这与天然BclXL的排他性线粒体定位一致(Kaufmann等，2003，J Cell Biol 160：53-64)。p53CTM表现出主要的线粒体定位(Mihara等，2003，Mol Cell.11：577-590)，加上某些次要的定位于内质网(ER)，这与天然Bcl2的定位一致(Kaufmann等，2003，文献同上)。为了排除p53CTM的ER-定位部分有助于编程性细胞死亡，通过用细胞色素b5的ER前导序列置换Bcl2结构域使p53靶向至ER。p53ER在p53裸H1299和SaOS-2细胞中缺乏任何细胞凋亡能力，这表明p53CTM的细胞凋亡能力完全因其线粒体作用所致(附图6)。
为了进一步排除单独的短线粒体靶向肽(来源于BclXL)可能在异位表达时诱导淋巴瘤细亡，构建了仅包含人BclXL的跨膜结构域：L S R K G Q E R F N R W F L T G M T V A G V V L L G S L F S RK*(SEQ ID NO：9)作为插入片段的逆转录病毒。然而，感染了这种病毒的p53裸淋巴瘤细胞未能经历任何编程性细胞死亡。
线粒体靶向p53促进体外初级淋巴瘤细胞中的编程性细胞死亡。首先分析了p53CTB和p53CTM在体外对初级小鼠胚胎成纤维细胞和淋巴瘤分离物的细胞凋亡能力。通过ElA使野生型p53裸和ARF裸MEF对细胞死亡预先致敏。在使用阿霉素处理6和12小时后，线粒体p53CTB和p53CTM蛋白质比单独的载体在所有三种基因型中使编程性细胞死亡增加了约2倍(附图3a)。线粒体p53抑制了ElA和癌基因H-RasV12对MEF的转化。与空病毒相比，在有p53CTB或p53CTM存在下使转化病灶的数量减少了几乎50％。更重要的是，p53CTM和p53CTB抑制了初级p53裸淋巴瘤细胞的生长，从而导致在5天后比载体在细胞数量上减少4倍(附图4a)。同样，在生长竞争性试验中，p53CTM-和核p53-感染的淋巴瘤细胞数量在10-25天内显著下降，而空病毒感染的细胞仅略有下降(附图4b)。如通过TUNEL试验所示，表达p53CTM和p53CTB的淋巴瘤细胞的体外丧失是因p53诱导的编程性细胞死亡所致，因为在无额外DNA损伤的情况下，其表达使自发性编程性细胞死亡2倍于空病毒。
线粒体靶向p53缺乏转录活性。在所有测试的细胞，包括p53-/-和ARF-/-淋巴瘤细胞、所有3种基因型的MEF、NIH3T3和H1299细胞的核中均未能检测到p53CTB和p53CTM。为了排除这些蛋白质的残留转录活性，分析了其诱导细胞凋亡和受阻种类的内源性靶基因的能力。p53CTM和p53CTB甚至在DNA损伤剂阿霉素的存在下也未能诱导p53裸MEF中的PUMA、Bid或p21Wafl(附图3b)。p53CTM和p53CTB在p53裸淋巴瘤细胞中也缺乏残留转录活性，如通过PUMA、Bax、p21Waf1和MDM2所示(附图4c)。与空病毒相比，p53CTM转导的淋巴瘤增加了其BclXs同种型的水平，所述的BclXs同种型即缺乏内部BH1/BH2结构域的Bcl-X基因的先期细胞凋亡可变剪接产物(Lindenboim等，2001，Cell Death Differ 8：933-942；Boise等，L.H.，1993，Cell74：597-608)(附图7)。这些数据共同证实p53CTB/CTM的细胞凋亡效能是因其在线粒体上的直接作用所致，而并非因隐性转录依赖性p53功能所致。
线粒体靶向p53杀伤体内初级淋巴瘤细胞
为了评价线粒体靶向p53对体内肿瘤细胞编程性细胞死亡和肿瘤负荷的影响，将转导的淋巴瘤细胞注入同基因正常受体的尾静脉，其中在26-30天内它们再次产生结淋巴瘤并且有时产生结外淋巴瘤。因此，快速重建的淋巴瘤仅因存在和不存在p53蛋白质而不同(Schmitt等，2000，文献同上)。在p53裸淋巴瘤的情况中，这种模型提供了作为细胞p53唯一来源的线粒体p53是否具有有效的体内肿瘤杀伤作用而导致肿瘤在天然部位退化的定量量度。小鼠和人p53在体内是功能上可互换的，因为在小鼠基因骨架内包含人p53DNA结合结构域的基因敲入小鼠具有未改变的p53功能(Luo等，2001，Oncogene20：320-328)。
使用3种不同的方案，进行作为转导细胞与亲代细胞之间的体内竞争的所有实验。在第一种方案中，将在36小时时证实了GFP阳性的40％的新鲜转导的p53裸淋巴瘤细胞(附图2d)与60％GFP阴性的亲代淋巴瘤细胞混合并且立即注入受体(1 x 106个细胞/小鼠)。4周后，对每一受体收集重建的肿瘤并且通过FACS确定其残留GFP阳性(表I(附图11中所示))。注射了40％空病毒-GFP的18只小鼠产生了30.8％+/-18％的残留GFP阳性肿瘤，从而反映出载体转导的细胞在血流中存活并且按比例有助于淋巴瘤重建的能力。接受40％p53CTM-GFP转导的细胞的14只小鼠产生了仅具有2.8+/-2.4％残留GFP阳性细胞的肿瘤。p53CTM组的各个肿瘤GFP+得分分别为0％，0％，0％，0％，0％，0％，0％，0％，0％，0％，0.6％，1.5％，3.5％和34％(与空病毒组相比P<0.0005)(附图5)。当除去了具有34％GFP阳性的非典型动物时(因为分析表明它表达了功能失活的p53)(参见附图8)，p53CTM组降至0.4+/-1.0％GFP阳性(与载体组相比P<0.0001)。同样，注射了40％表达p53CTB-GFP的细胞的4只小鼠产生了没有检测到的残留绿色细胞的肿瘤(各个GFP得分为0％，0％，0％和0％)(附图5)。因此，82％的重建肿瘤完全(14/17小鼠)且18％几乎完全(3/17小鼠)不存在表达线粒体靶向p53的肿瘤细胞，而肿瘤是由存活的亲代细胞组成的。注射了40％表达核p53的细胞的12只对照小鼠各自因肿瘤重建过程中有效的p53介导的编程性细胞死亡也产生了0％的残留GFP阳性。这共同表明了表达作为其p53唯一来源的线粒体p53的淋巴瘤细胞可以在体内发生显著肿瘤退化，这与使用异位核p53实现的退化几乎同样有效。
随后的使用较高比例的转导的淋巴瘤细胞与亲代淋巴瘤细胞的竞争方案证实了线粒体靶向p53的体内杀伤能力。在注射前对转导的细胞进行药物选择或FACS分选以便获得高于通过单独转导可获得的百分比。在75:25方案中，首先在杀稻瘟菌素中预选择转导的p53裸细胞4-10天(表I(附图11中所示))。这快速消除了具有高p53表达的细胞并且富集了具有低表达的能够在培养物中存活较长时间的细胞。一旦在体内，这些细胞就很可能接受引发其编程性细胞死亡的附加生理应激信号。将75％转导的细胞和25％亲代细胞的混合物注入正常受体。注射了75％载体-GFP细胞的3只小鼠产生了具有44.3％+/-3％GFP阳性的肿瘤，这反映出这些细胞有助于淋巴瘤的能力降低但仍然很强。相反，注射了75％ p53CTM-GFP细胞混合物的11只小鼠产生了仅含1.1+/-0.1％残留GFP阳性的肿瘤(与空病毒相比P<0.0005)，从而证实了在40:60方案中所观察到的p53CTM结果。注射了75％核p53-GFP细胞的阳性对照动物产生了12％残留GFP阳性。然而，进一步的分析表明该肿瘤因逆转录病毒p53区的重排而选择性丧失了p53表达，这解释了相对高数量的存活GFP阳性细胞(附图8)。
附图8表示罕见异常肿瘤的表征，其中表达p53CTM或核p53的病毒未能杀伤肿瘤细胞。注射了包含40％ p53CTM感染的细胞的p53裸淋巴瘤细胞的小鼠(n＝13)产生了平均仅具有0.4+/-1.0％残留GFP阳性细胞的肿瘤(表I，附图11)。(a)然而，单个额外肿瘤例外，因为它仅表现出最小限度降至34％ GFP阳性。对来自重建肿瘤的p53CTM的全长测序排除了已经在体内进行了选择突变。对原始注射的和重建的肿瘤细胞的免疫印迹分析揭示出在该肿瘤中的p53蛋白质已经经历了使人联想到遍在化的异常翻译后修饰。较高分子量p53带的紧密梯存在于新鲜收集的重建肿瘤切割物中(泳道4，9)，其表达在培养物中是稳定的(泳道5，10)。这种p53也是自发稳定化的。这种回收的肿瘤细胞在培养物中在3天内使其GFP得分从34％增加至99％。最初注射的细胞几乎排他性表达未修饰的p53(泳道2，7)。尽管p53稳定化(泳道4，5)，但是MDM2和Arf蛋白质水平仍保持不变。本发明并不限于特定的机理。实际上，理解机理对实施本发明而言并非必要。但是值得关注的是p53蛋白质在这种肿瘤中与其不起作用的细胞凋亡功能共同表现出功能性失活。
注射了包含40％核p53感染的细胞的p53裸淋巴瘤细胞的小鼠(n＝12)产生了具有0％残留GFP阳性的肿瘤，这是因p53介导的这些细胞的编程性细胞死亡所致。(b)1只注射了75％核p53感染的细胞的动物产生了具有12％残留GFP阳性的肿瘤。免疫印迹分析显示出在这种肿瘤中核p53表达完全丧失，从而表明这种肿瘤已经经历了其逆转录病毒p53序列的重排。
在第三种方案中，依据GFP对感染后48小时其峰值表达时的转导细胞进行FACS分选至>99％纯度。将分选的细胞与亲代细胞以90:10之比混合并且立刻注入受体。注射了90％载体-GFP感染的细胞的14只对照小鼠产生了具有70+/-10％ GFP阳性的肿瘤，而注射了90％p53CTM转导的细胞的7只小鼠产生了平均仅具有14+/-14％残留GFP阳性的肿瘤(表I(附图11中所示))。
p53CTM组中的减少再次非常显著(与空病毒相比P<0.0005)。注入p53CTM组的转导细胞均来源于单个分离物(#3)。然而，重建的肿瘤分成2个亚组。来自4只动物的肿瘤表现出预计的表达p53CTM的细胞的显著减少，其中残留GFP得分为2％，2％，3.5％和5％。然而，3只小鼠仅表现出中度减少，其中得分分别为26％，28％和36％GFP阳性。本发明并不限于特定的机理。实际上，理解机理对实施本发明而言并非必要。但是值得关注的是对这种双峰分布的一种可能的解释是亲代分离物#3为遗传异质性的并且包含在供体内淋巴瘤生成过程中已经获得附加的细胞凋亡性突变的克隆亚群。这后一种克隆在具有相对高GFP得分的3只动物中可能已变为随机显性的，但在具有低得分的4只动物中并非如此。总之，这些数据证实作为细胞p53唯一来源的线粒体靶向p53在天然肿瘤部位上具有体内肿瘤杀伤作用。此外，这种杀伤作用无需附加的放疗剂或化疗剂。
尽管存在野生型p53基因，但是ARF裸淋巴瘤表现出对致癌性失调的p53活性的强烈丧失(Schmitt等，1999，文献同上；Eischen等，文献同上)。为了测试靶向p53是否在体内也杀伤这些细胞，将两个独立的ARF裸肿瘤分离物用于竞争性40/60方案(附图2b和表II(附图12中所示)。一般而言，与p53裸淋巴瘤细胞相比，在ARF裸淋巴瘤细胞中发现了对自发和p53诱导的细胞死亡的更高的敏感性。注射了40％空病毒感染的细胞混合物的小鼠(n＝14)产生了具有18+/-13％GFP阳性的重建肿瘤。相反，注射了40％表达p53CTM的细胞混合物的小鼠(n＝12)产生了仅具有0.2+/-0.4％残留GFP阳性的肿瘤(P＝0.0001)。同样，注射了40％表达p53CTB的细胞混合物的小鼠(n＝11)产生了仅具有0.4+/-0.7％残留GFP阳性的肿瘤(P＝0.0001)。p53CTB和p53CTM比率与注射了核p53的阳性对照小鼠(n＝13)相同(0.6％+/-0.6％残留GFP阳性)。因此，如同在p53裸淋巴瘤中的情况，表达线粒体靶向p53的ARF裸淋巴瘤表现出显著的体内退化。此外，在这些细胞中，线粒体p53程序可以在功能上取代不起作用的内源性p53程序。作为由线粒体靶向p53介导的肿瘤细胞杀伤特异性的另一种对照标准，表3(附图15中所示)显示出：1)与核或线粒体野生型p53相反，天然存在的突变p53不能杀伤淋巴瘤细胞，而能够使其在体内扩充。还显示出：2)具有人形式的核或线粒体野生型p53的小鼠肿瘤细胞的杀伤是特异性的而不是因非特异性免疫排斥所致。
将以上说明书中提及的所有出版物和专利引入本文作为参考。在不脱离本发明范围和实质的情况下对本发明所述的方法和系统的各种改进和改变对本领域技术人员而言是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所请求保护的本发明不应不适当地限于这类具体的实施方案。实际上，对相关领域的技术人员而言显而易见的对所述的实施本发明的方式的各种改变均属于下列权利要求的范围。

Claims (26)

1.一种方法，包括:
a)提供细胞，其中所述的细胞缺乏功能性线粒体p53；和
b)将外源性p53递送至所述细胞中，其中所述的p53包含使所述p53定向于所述细胞的线粒体的序列。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的外源性p53至少90％与SEQID NO:3相同。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的外源性p53具有SEQ ID NO:3的核酸序列。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的外源性p53可操作地与线粒体靶向分子连接。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的外源性p53可操作地与Bc12线粒体靶向序列连接。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的Bc12线粒体靶向序列具有SEQ ID NO:4的核酸序列。
7.权利要求4所述的方法，其中所述的外源性p53可操作地与BclXL线粒体靶向序列连接。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的BclXL线粒体靶向序列具有SEQ ID NO:5的核酸序列。
9.权利要求4所述的方法，其中所述的外源性p53和所述的线粒体靶向分子在一种载体中。
10.权利要求9所述的方法，其中所述的递送包括将所述的载体递送至所述的细胞中。
11.权利要求9所述的方法，其中所述的载体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
12.权利要求9所述的方法，其中所述的载体编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的融合蛋白。
13.权利要求1所述的方法，其中所述的递送导致所述细胞的编程性细胞死亡。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的细胞是宿主动物中的。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的宿主动物为非人哺乳动物。
16.权利要求14所述的方法，其中所述的宿主动物为人。
17.权利要求14所述的方法，其中所述的宿主动物被诊断为患有癌症并且所述的细胞为癌细胞。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的递送导致所述癌细胞的编程性细胞死亡。
19.权利要求14所述的方法，其中所述的宿主动物被诊断为患有自身免疫性疾病。
20.权利要求1所述的方法，进一步包括将第二种外源性p53递送至所述细胞的核中。
21.权利要求20所述的方法，其中所述的第二种外源性p53包含在第二种载体中，并且其中所述的第二种载体包含使所述第二种外源性p53定向于所述细胞的核的第二种序列。
22.权利要求14所述的方法，进一步包括将测试化合物递送至所述宿主动物中的步骤。
23.权利要求1所述的方法，其中所述的细胞是体外的。
24.权利要求23所述的方法，进一步包括将测试化合物递送至所述细胞的步骤。
25.一种载体，包含与编码线粒体靶向蛋白的基因可操作地连接的外源性p53基因。
26.一种组合物，包含核酸，该核酸包含与编码线粒体靶向蛋白的基因可操作地连接的外源性p53基因。
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