CN101386814A - 一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法 - Google Patents

一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法。本发明提供的生物材料玻璃化冷冻载体包括注射针头(1)和麦片(2)；所述注射针头(1)由针头(1－1)和针头座(1－2)组成；所述麦片(2)为开放型拉细麦管，其一端(2－1)套设于所述针头(1－1)的内腔中；另一游离端(2－2)的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5－1/3。本发明还提供了所述生物材料玻璃化冷冻载体的制备方法。本发明具有操作简便，耗时短，成本低等优点，适用于各医院生殖中心实验室及各研究单位使用，对于推动医学领域玻璃化冷冻技术的发展以及卵、胚胎、卵巢组织等的冷冻保存研究有着重要的意义。

Description

一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法。
背景技术
目前，低温冷冻技术在辅助生殖领域应用广泛。玻璃化冷冻技术是利用体积微小的冷冻承载工具，在极快速降温(>2000℃/min)过程中，使高浓度的冷冻保护液由液态转变为黏度很高的类似玻璃样的固态，避免细胞内冰晶的形成，达到冷冻保护的作用，从而显著提高细胞/组织冷冻后的存活力和发育能力。玻璃化冷冻技术具有简单、高效、省时、安全、费用少等优点。近年来，玻璃化冷冻技术在人卵与胚胎的冷冻保存中的应用逐渐增多，利用该技术对人未成熟卵母细胞、成熟卵母细胞、胚胎及囊胚进行冷冻均已有成功报道。
冷冻载体是冷冻保存时承载细胞/组织的物体，玻璃化冷冻成功的关键因素之一就是选择适当的冷冻载体。目前使用的玻璃化冷冻载体主要包括：开放式拉细麦管、封闭式拉细麦管、电子显微镜铜网、Cryoloop、Cryotop和Cryoleaf等。玻璃化冷冻载体的功能在于：承载标本的同时尽量减少负载的冷冻液，达到以下两个目的：冷冻过程中使标本直接接触液氮，快速降温达到玻璃化状态；解冻过程中使冻存标本充分接触解冻液，及时脱离高浓度冷冻保护剂环境。
目前已有的玻璃化冷冻载体在制作、使用中存在着各种问题，影响了冻存效率和玻璃化冷冻技术的开展。开放式拉细麦管或封闭式拉细麦管存在如下问题：制作过程中加热装置(酒精灯或热板)的温度不易控制，温度稍低不能将麦管拉长，温度稍高麦管易断；存储过程中易受到外力破坏而断损，致冻存标本丢失。电子显微镜铜网、Cryoloop、Cryotop在冷冻过程及储存过程容易丢失标本。所以上述冷冻载体在临床应用推广中可行性差，不被广泛接受。Cryoleaf是目前临床上应用最广泛的冷冻载体，但费用昂贵(每支约200元人民币)，在科学研究中难以广泛采用。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法。
本发明提供的生物材料玻璃化冷冻载体，其特征在于：它包括注射针头1和麦片2；
所述注射针头1由针头1-1和针头座1-2组成；
所述麦片2为开放型拉细麦管，其一端2-1套设于所述针头1-1的内腔中；另一游离端2-2的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。
所述针头1-1的内腔与所述开放型拉细麦管的口径最好匹配。
所述冷冻载体还可包括防护套3，所述针头1-1和所述麦片2套设于防护套3内。
为了组装方便，所述麦片2套设于所述针头中的一端2-1的端缘为尖端；所述针头1-1的端缘为平端。
所述麦片2游离端2-2余留麦管壁的横截面具体可为圆周的1/3。
所述麦片2的厚度最好控制在80-100um之间，外径、内径及长度可根据所选用的注射针头而定。
所述麦片2的外径具体可为0.8-1.2mm，优选1mm；所述麦片2的内径具体可为0.6-1.04mm，优选0.8mm；所述麦片2的长度具体可为2.5-3.5cm，优选3cm。
所述注射针头可为任何市售注射针头，所述麦片可由任何市售麦管制作而成。
所述针头1-1的材质具体可为金属，所述针头座1-2的材质具体可为塑料，所述麦片2的材质具体可为聚乙烯，所述防护套3具体可为注射器针头套。
本发明还提供了制备所述生物材料玻璃化冷冻载体的方法。
本发明提供的制备方法，包括如下步骤：是将开放型拉细麦管的一端2-1套设入注射针头1的针头1-1的内腔中；另一端2-2沿纵向切去部分麦管壁，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3；得到生物材料玻璃化冷冻载体。
所述方法中，所述开放型拉细麦管是将麦管在沸水浴中拉长得到的。
所述方法中还可包括将保护套3套设于所述针头1-1和麦片2外的步骤。
为了组装方便，所述麦片2套设于所述针头中的一端2-1的端缘为尖端；所述针头1-1的端缘为平端。
所述麦片2游离端2-2余留麦管壁的横截面具体可为圆周的1/3。
所述麦片2的厚度最好控制在80-100um之间，外径、内径及长度可根据所选用的注射针头而定。
所述麦片2的外径具体可为0.8-1.2mm，优选1mm；所述麦片2的内径具体可为0.6-1.04mm，优选0.8mm；所述麦片2的长度具体可为2.5-3.5cm，优选3cm。
所述注射针头可为任何市售注射针头，所述麦片可由任何市售麦管制作而成。
所述针头1-1的材质具体可为金属，所述针头座1-2的材质具体可为塑料，所述麦片2的材质具体可为聚乙烯，所述防护套3具体可为注射器针头套。
得到的生物材料玻璃化冷冻载体可以消毒后售出，也可直接售出，使用前进行消毒即可。常规消毒方法均可采用，如环氧乙烷熏蒸法。
本发明提供的生物材料玻璃化冷冻载体，具有如下优点：
1)材料主要是一次性注射针头和麦管，来源丰富、成本低(注射器针头每支1.0元，麦管每支0.4元)。
2)冷冻载体上有多处用于标记的部位，使用很方便。
3)冷冻载体占用储存容器空间小，取放轻便，易于储存、运输。
4)具有防护套，可以防止外界的机械碰触而导致的冻存标本丢失，冻存标本放心、可靠。
应用本发明的方法制备生物材料玻璃化冷冻载体，具有如下优点：
1)在制作过程中麦管加热装置采用沸水浴，温度恒定维持在100℃左右，使麦管受热均匀、柔韧性好，易于牵拉，拉长、拉细程度可因不同需要而随意调整并且不会变质。
2)制作方法简单易行、重复性好。
3)制备时间短：煮沸水10分钟，拉管10秒，修管及装管1分钟。
本发明可以解决目前存在的自制冷冻载体难度大，而商品化载体价格昂贵的问题，适用于各医院生殖中心实验室及各研究单位使用，对于推动玻璃化冷冻技术的发展以及卵、胚胎、卵巢组织等的冷冻保存研究有着重要的意义。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为生物材料玻璃化冷冻载体的结构示意图。
图2为麦片的结构示意图。
图3为图2的俯视图。
图4A、图4B、图4C为应用生物材料玻璃化冷冻载体的操作示意图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、生物材料玻璃化冷冻载体的制备
一、材料的准备
市售注射针头(18号)；市售注射器针头套(18号)；
麦管(0.25ml)：法国I.M.V公司。
二、生物材料玻璃化冷冻载体的制备
1)用钳子将注射针头的针头前二分之一处剪断成平口，得到平口注射针头；
2)用电炉将双蒸水煮沸；
3)用血管钳将麦管两端夹住；
4)手持血管钳，将麦管浸入沸水浴中，向两端平拉至原管长的4倍，得到开放型拉细麦管(外径1.0mm，内径0.8mm)；
5)将开放型拉细麦管抬离液面，维持原先的拉力数秒，至冷却；
6)用剪刀将开放型拉细麦管剪成3厘米的管段；
7)将开放型拉细麦管(3厘米)一端剪成0.5厘米斜口末端；
8)将管段的斜口末端插入平口注射针头，进深1.3厘米；
9)用手术刀片从开放型拉细麦管(3厘米)中点开始，沿纵向切去长1.5cm、截面2/3圆周的管壁，剩余管壁修整为长1.3cm、宽0.1cm的薄片；
得到生物材料玻璃化冷冻载体。
如图1所示，生物材料玻璃化冷冻载体由注射针头1、麦片2和防护套3组成；其中，注射针头1由端缘为平端的针头1-1和针头座1-2组成；麦片2的一端2-1的端缘为尖端、套设于针头1-1的内腔中，另一端2-2麦管壁部分缺失，呈薄片状；针头1-1和麦片2套设于防护套3内。由图2和图3可见，麦片2的一端2-1为斜口末端，另一端2-2麦管壁部分缺失，呈薄片状。
针头1-1的作用为把持、固定麦片；针头1-1的孔可作为减压孔，不仅可以在将载体浸入液氮时做为液氮自行注入管内的进口，在从液氮中取出时，还可以释放管内因液氮迅速气化而产生的高压。针头座1-2用于操作时把持和文字标记。麦片2的2-1端与注射针头1的针头1-1连接，起固定作用。麦片2的2-2端：承载要冻存的标本，浸入液氮中使标本与液氮直接接触而急速降温达到玻璃化状态。防护套3保护麦片2及冻存标本免遭外界机械性碰撞，避免存放时标本丢失，还可用于文字标记。所以组装后的注射针头1和麦片2的长度等于或略小于防护套3的长度。
实施例2、生物材料玻璃化冷冻载体的应用
将实施例1制备的冷冻载体用环氧乙烷熏蒸法消毒。用消毒后的冷冻载体玻璃化冷冻53枚小鼠成熟卵母细胞，冷冻1天后，解冻卵母细胞，检测其存活情况。复苏卵母细胞存活标准为：卵母细胞折光性好，透明，没有明显的胞浆皱缩，透明带与细胞膜完整。
平衡液(EM)：10％乙二醇+10％二甲基亚砜+10％胎牛血清+DPBS；
玻璃化冷冻液(VM)：20％乙二醇+20％二甲基亚砜+10％胎牛血清+DPBS；
解冻液(T1溶液)：0.1M蔗糖+10％胎牛血清+DPBS；
解冻液(T2溶液)：0.5M蔗糖+10％胎牛血清+DPBS；
解冻液(T3溶液)：0.25M蔗糖+10％胎牛血清+DPBS；
解冻液(T4溶液)：10％胎牛血清+DPBS；
M16培养基：Sigma公司。
一、玻璃化冷冻
室温下将小鼠成熟卵母细胞在平衡液(EM)中停留5分钟后移入玻璃化冷冻液(VM)中40秒，移到用冷冻载体的麦片上(见图4A)，立即投入液氮(见图4B)，在液氮中盖好注射器针头帽(见图4C)。
二、快速解冻
将冷冻1天的小鼠成熟卵母细胞进行解冻，并检测解冻后细胞的存活情况，具体操作如下：
从液氮中迅速取出冷冻载体，在室温下把负载小鼠成熟卵母细胞的冷冻载体的麦片(见图4A)迅速放入T1溶液，在体式显微镜下找到卵母细胞，依次移入T2溶液、T3溶液和T4溶液中，各停留3min，最后移入M16培养基于培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时后观察卵母细胞存活情况。
结果表明，冻存53枚卵母细胞，解冻复苏后获得53枚卵母细胞，存活47枚，无丢失，存活率88.7％。

Claims (10)

1、一种生物材料玻璃化冷冻载体，其特征在于：它包括注射针头(1)和麦片(2)；
所述注射针头(1)由针头(1-1)和针头座(1-2)组成；
所述麦片(2)为开放型拉细麦管，其一端(2-1)套设于所述针头(1-1)的内腔中；另一游离端(2-2)的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。
2、如权利要求1所述的冷冻载体，其特征在于：所述冷冻载体还包括防护套(3)，所述针头(1-1)和所述麦片(2)套设于防护套(3)内。
3、如权利要求1或2所述的冷冻载体，其特征在于：所述麦片(2)套设于所述针头中的一端(2-1)的端缘为尖端；所述针头(1-1)的端缘为平端。
4、如权利要求1至3中任一所述的冷冻载体，其特征在于：所述麦片(2)游离端(2-2)余留麦管壁的横截面为圆周的1/3。
5、如权利要求1至4中任一所述的冷冻载体，其特征在于：所述麦片(2)的外径为0.8-1.2mm、内径为0.6-1.04mm，所述麦片(2)的长度为2.5-3.5cm；
所述麦片(2)的外径优选为1mm、内径优选为0.8mm，所述麦片(2)的长度优选为3cm。
6、如权利要求1至5中任一所述的冷冻载体，其特征在于：所述针头(1-1)的材质为金属，所述针头座(1-2)的材质为塑料，所述麦片(2)的材质为聚乙烯，所述防护套(3)为注射器针头套。
7、制备权利要求1所述生物材料玻璃化冷冻载体的方法，是将开放型拉细麦管的一端(2-1)套设入注射针头(1)的针头(1-1)的内腔中；另一端(2-2)沿纵向切去部分麦管壁，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3；得到生物材料玻璃化冷冻载体。
8、如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将保护套(3)套设于所述针头(1-1)和麦片(2)外的步骤；所述开放型拉细麦管是将麦管在沸水浴中拉长得到的。
9、如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述麦片(2)套设于所述针头中的一端(2-1)的端缘为尖端；所述针头(1-1)的端缘为平端。
10、如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：所述麦片(2)的外径为0.8-1.2mm、内径为0.6-1.04mm，所述麦片(2)的长度为2.5-3.5cm；
所述麦片(2)的外径优选为1mm、内径优选为0.8mm，所述麦片(2)的长度优选为3cm；
所述针头(1-1)的材质为金属，所述针头座(1-2)的材质为塑料，所述麦片(2)的材质为聚乙烯，所述防护套(3)为注射器针头套。
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