CN101381400B - 纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法 - Google Patents

Abstract

一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，是取纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取，以高速旋转离心方式取悬浮液，经杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物；进一步以硫酸铵沉淀法分离出珍珠蛋白与无法沉淀出的蛋白质，并以Sephadex G25凝胶依照蛋白质分子量进行层析，得到三个级分：级分A，级分B，级分C。使化妆品、食品等产业，可以由此获得有效成分被纯化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。

Description

纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法

技术领域

本发明涉及一种使化妆品、食品等产业可以容易获得有效成分被纯化的珍珠蛋白或珍珠肽的方法，特别涉及一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法。

背景技术

不论珍珠或珍珠母，外套膜外表皮细胞是其形成的唯一基础物质。市售微米级珍珠粉或珍珠母粉，95％～99％由霰石晶型碳酸钙外加少数的方解石晶型碳酸钙组成，只含1％～5％多糖和蛋白质的有机基质。因此，在化妆品、食品等产业，想以珍珠有机基质的有效成分作为调剂时，市售微米级珍珠粉或珍珠母粉，因有机基质含量不高或不稳定或未被纯化，难以直接被实施利用。虽然本件申请人公司负责人已成功研发出纳米级珍珠粉，如台湾专利发明证书第201397号“一种食用珍珠粉制法”的专利案，但其仍属直接食用好消化吸收的阶段，若要在产业上利用其珍珠的有效成分，则会因珍珠有机基质含量不明确及未被纯化，仍然难以在具有经济效益等条件下被实施。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，是取纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取，以高速旋转离心方式取悬浮液，经杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物；再利用胶体过滤分离方式，分离出分子量分级的珍珠蛋白及分级的珍珠肽。使化妆品、食品等产业由此获得有效成分被纯化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。其中优选在所述胶体过滤分离之前，分别将第一及第二珍珠有机基质萃取物先进行硫酸铵沉淀与透析。

本发明的次一目的是提供一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，其中，所述纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取，总共加水之量要使珍珠粉重量与水体积之比为1:10(例如20g珍珠粉以200mL水萃取)，在室温下用搅拌机进行24小时的搅拌，使纳米珍珠粉在水中充分萃取。

本发明的再一目的是提供一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，其中，纳米珍珠水溶性有机基质萃取与分子量分级，是将纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取后置于旋转容器中，以转速每分钟3000rpm的高速旋转离心方式产生悬浮液，并在悬浮液去除杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置(Centriprep Centrifugal Filter)的离心浓缩分离方式，分离出水溶性分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物及小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物。

本发明的次再一目的是提供一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，其中，纳米珍珠非水溶性有机基质萃取与分子量分级，是将纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取，以转速每分钟3000rpm时所产生的离心力，再取珍珠粉沉淀物，加70％甲醇萃取，加70％甲醇之量要使珍珠粉沉淀物重量与70％甲醇体积之比为1:10(例如20g珍珠粉沉淀物以200mL的70％甲醇萃取)，在4℃搅拌12小时，使珍珠粉中的非水溶性有机基质在甲醇中充分萃取，再以高速旋转离心方式取悬浮液，并经杂质过滤后，同样通过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物(外管)及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物(内管)；且萃取的有机基质甲醇液以减压浓缩机浓缩去除甲醇后再冷冻干燥浓缩。

本发明的另一目的是提供一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的装置，该装置包括：溶解槽、搅拌机、离心分离机、离心浓缩滤膜、沉淀与透析器、胶体过滤分离器。其中，所述离心浓缩滤膜装置，是由一圆管形容器、一滤液收集管、一栓钮及一气密盖所构成；所述圆管形容器，用于杂质过滤后悬浮液填装，具有满液标线；所述滤液收集管，设在圆管形容器内，底端内部具有滤膜膜架，上端颈口具有排液凹槽；所述栓钮，锁固在圆管形容器上部限定滤液收集管；所述气密盖，组合在栓钮上端；由此所述离心浓缩滤膜装置以转速每分钟3000rpm时所产生的离心力，即可由滤膜膜架对悬浮液的过滤浓缩作用，能以离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物(外管)及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物(内管)。

本发明的又一目的是提供一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的装置，其中，分离出蛋白分子量分级的所述胶体过滤分离方式，可以利用一胶体过滤器，是一管柱内填装多孔性凝胶颗粒构成，形成网状筛孔。所述凝胶可以是Polydextran葡聚糖胶体溶液凝结构成，利用分子流经其内部网状筛孔时，大分子只流经凝胶与管柱间孔隙排除在筛孔之外，因而快速流出管柱；小分子进入凝胶内筛孔中，在管柱中停滞时间较长，较慢流出管柱，因而区分出大小不同的分子；由不同型号的凝胶选择运用，使分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物，可再作分子量大小区分，得到分子量分级的珍珠蛋白，以及使分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物，可再作分子量大小区分，得到分子量分级的珍珠肽。

本发明的有益效果是：纳米珍珠粉的有机基质(有效成分)，能便利地由本发明方法加以萃取，并可进一步将其分离出分子量分级的珍珠蛋白与分级的珍珠肽，且可再经由生物活性测试得到更具显着效果的单一成分，并仅须图谱等鉴定流程的建立，即可大量提供化妆品、食品等产业，作符合经济效益的最佳利用。

附图说明

图1为本发明方法流程图；

图2为本发明方法离心浓缩滤膜装置实施例构造示意图；

图3为本发明方法硫酸铵沉淀法示意图；

图4为本发明方法胶体过滤分离方式实施例构造示意图；

图5为本发明方法纳米珍珠粉蛋白以Sephadex G25凝胶进行层析后的蛋白质含量分布；

图6为以本发明方法得到的微米珍珠粉蛋白以Sephadex G25凝胶进行层析后的蛋白质含量分布；

图7为本发明方法纳米珍珠粉经由饱和硫酸铵沉淀后得到的蛋白质，以Sephadex G25凝胶进行层析，收集于不同管的SDS-PAGE电泳分析图(4～9管)；

图8为本发明方法纳米珍珠粉经由饱和硫酸铵沉淀后得到的蛋白质，以Sephadex G25凝胶进行层析，收集于不同管的SDS-PAGE电泳分析图(10～15管)；

图9为本发明方法所萃取分离出的分子量大于5kDa与小于5kDa的蛋白质，以SDS-PAGE验证所得到的示意图；

图10为本发明方法所萃取的纳米珍珠有机基质萃取物，加入人类皮肤纤维母细胞24小时后所测得的细胞增生情况示意图；

图11为本发明方法所萃取的纳米珍珠有机基质萃取物与熊果素对酪氨酸酶抑制效果的统计分析图；

图12为本发明方法所萃取的纳米珍珠有机基质萃取物的生物活性评估的流程示意图；

图13为本发明方法所得到的分子量分级的珍珠蛋白及分级的珍珠肽，其再次生物活性测试及鉴定的流程示意图。

附图标记说明：1-纳米珍珠粉；1A-珍珠粉沉淀物；11、11A-悬浮液；12A-第一珍珠有机基质萃取物；12B-第二珍珠有机基质萃取物；13A-纯化的珍珠蛋白；13B-纯化的珍珠肽；20、20A-搅拌机；30-旋转容器；40-离心浓缩滤膜装置；41-圆管形容器；410-满液标线；42-滤液收集管；420-滤膜膜架；421-颈口；422-排液凹槽；43-栓钮；44-气密盖；50-胶体过滤器；51-管柱；52-凝胶。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，如图1所示，是取纳米珍珠粉1先后两次加水搅拌使之充分萃取，以高速旋转离心方式取悬浮液11，经杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置40的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物12B；分别将第一及第二珍珠有机基质萃取物12A、12B，利用胶体过滤分离方式，分离出分子量分级的珍珠蛋白13A及分级的珍珠肽13B；使化妆品、食品等产业，由此可以获得有效成分被纯化的珍珠蛋白或珍珠肽作最佳利用。

根据上述实施例，其中，如图1所示，纳米珍珠粉1先后两次加水搅拌使之充分萃取，其中是以20g珍珠粉总共以200mL水萃取，在室温下用搅拌机20进行24小时的搅拌，使纳米珍珠粉1可在水中充分萃取。

根据上述实施例，其中，如图1所示，将纳米珍珠粉1先后两次加水搅拌使之充分萃取，在搅拌完成后置于旋转容器30中，以转速每分钟3000rpm的高速旋转离心方式产生悬浮液11，并在悬浮液11去除杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置(Centriprep Centrifugal Filter)40的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物12B。

根据上述实施例，其中，如图1、2所示，该离心浓缩滤膜装置40，是由一圆管形容器41、一滤液收集管42、一栓钮43及一气密盖44所构成；该圆管形容器41，用于杂质过滤后悬浮液11填装，具有满液标线410；该滤液收集管42，设在圆管形容器41内，底端内部具有滤膜膜架420，上端颈口421具有排液凹槽422；该栓钮43，锁固在圆管形容器41上部限定滤液收集管42；该气密盖44，组合在栓钮43上端；由此该离心浓缩滤膜装置40以转速每分钟3000转(3000rpm)时所产生的离心力，即可由滤膜膜架420对悬浮液11的过滤浓缩作用，能以离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物12B。

根据上述实施例，其中，通过胶体过滤分离方式来分离蛋白质分子量，可先进行硫酸铵沉淀与透析，是将已制备出的珍珠水溶性有机基质以水回溶(10mg/mL)，在冰浴下边摇晃边逐滴加入饱和硫酸铵水溶液使蛋白质沉淀。将溶液分装在50mL离心管，在4℃下高速14000rpm离心40分钟。收集沉淀溶于最少量的水，装入透析袋。将收集到的沉淀置于2L的纯水进行透析，每12小时更换缓冲液，透析48小时，之后再进行胶体过滤分离蛋白质分子量。其原理，如图3所示，硫酸铵(ammonium sulfate)：硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用，其吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。外加大量离子(如硫酸铵)，滞留的水分子会被抽出，与新加入的离子产生水合，因而暴露出蛋白质上的非极性区；蛋白质分子间，因此得以非极性基团互相结合，造成大的沉淀粒子，称为盐析。

根据上述实施例，其中，如图1、4所示，该胶体过滤分离方式，是用凝胶层析原理进行，其设备包括一胶体过滤器50，是由一管柱51内填装多孔性凝胶52颗粒，该凝胶可以是Polydextran葡聚糖胶体溶液凝结构成，利用分子流经其内部网状筛孔时，大分子只流经凝胶52与管柱51间孔隙排除在筛孔之外，因而快速流出管柱51；小分子进入凝胶52内筛孔中，在管柱51中停滞时间较长，较慢流出管柱51，因而区分出大小不同的分子；可选择不同型号的凝胶52，例如使用Sephadex G25的polydextran凝胶。Sephadex G25可区分分子量在5kDa以下，因此可以划分珍珠有机基质中分子量小于5kDa与大于5kDa的蛋白质。

珍珠粉经由饱和硫酸铵沉淀出蛋白质后，以Sephadex G25凝胶层析进行分离。缓冲溶液为10mM KH₂PO₄，每1mL收集一管，每管称之为一级分，共收集15管，即级分1～级分15。数据以SigmaPlot2000软体进行处理分析。其结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝3。*表示P<0.05。

如图5、图6、表1、表2所示，纳米珍珠粉层析出的蛋白质其级分4～级分6(占蛋白质分布比率51.6％)与级分10～级分13(占蛋白质分布比率10.3％)出现明显蛋白质分布；微米珍珠粉层析出的蛋白质其级分4～级分6(占蛋白质分布比率55.5％)出现明显蛋白质分布，其级分10之后无明显的分布，但突然在级分15出现一个较浓的蛋白质分布(4.6％)。实验至此，虽然尚未对每个层析出的级分进行SDS-PAGE凝胶电泳分析测试，但以Sephadex G25凝胶层析是根据分子量大小作为分离原理来看，用相同缓冲溶液冲洗，纳米珍珠蛋白与微米珍珠蛋白出现不一样的蛋白质浓度分布(纳米珍珠蛋白级分10～级分11出现比微米珍珠蛋白较多的分布)，显示纳米珍珠蛋白小分子的含量比微米珍珠蛋白的含量多。

表1 纳米珍珠粉蛋白以Sephadex G25凝胶进行层析后的蛋白质含量分布表

 

级分	1	2	3	4	5
						蛋白(％)	2±0.1	2.5±0.3	2.6±0.2	12.4±0.5	18.8±0.7
级分	6	7	8	9	10
						蛋白(％)	20.4±0.3	8.7±0.4	3.9±0.1	3.9±0.2	5.1±0.3
级分	11	12	13	14	15

 

蛋白(％)

5.2±0.4

4.3±0.2

4.5±0.1

3.1±0.3

2.7±0.2

数据以SigmaPlot2000软体进行处理分析。其结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝3。*表示P<0.05。

表2 微米珍珠粉蛋白以Sephadex G25凝胶进行层析后的蛋白质含量分布表

 

级分	1	2	3	4	5
						蛋白(％)	2.6±0.1	3.1±0.2	3.5±0.2	14.1±0.3	22.9±0.7
级分	6	7	8	9	10
						蛋白(％)	18.5±0.6	5.5±0.7	3.7±0.5	4.2±0.3	3.7±0.4
级分	11	12	13	14	15

 

蛋白(％)

3.1±0.2

3.8±0.2

3.2±0.3

3.7±0.4

4.6±0.5

数据以SigmaPlot2000软体进行处理分析。其结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝3。*表示P<0.05。

经由Sephadex G25凝胶层析处理后的SDS-PAGE图，如图7、图8所示，可经由生物活性测试，选取有效的纳米珍珠蛋白(肽)进行SDS-PAGE电泳分析分子量测试，纳米珍珠蛋白(肽)经过Sephadex G25层析后，每1mL收集一管，每管称之为一级分，共收集15管，级分1～级分15的SDS电泳图，以log(分子量)对相对移动距离作图，求得分子量。级分4～级分6的分子量约在6～10kDa，命名为级分A；级分7～级分9分子量约在4～6kDa，命名为级分B；级分10～级分13分子量约在2～3.8kDa，命名为级分C。

根据上述实施例，其中，如图1所示，纳米珍珠粉1先后两次加水搅拌使之充分萃取，以高速旋转离心方式取悬浮液11，得到珍珠粉沉淀物1A。本发明的另一实施例中，是将所述珍珠粉沉淀物加70％甲醇使之充分萃取，其中是以20g珍珠粉沉淀物以200mL的70％甲醇萃取，于4℃下搅拌12小时，再以高速3000rpm旋转离心方式取悬浮液11A，并经杂质过滤后，同样通过离心浓缩滤膜装置40的离心浓缩分离方式，可分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物12A及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物12B，萃取的有机基质甲醇液以减压浓缩机浓缩去除甲醇后再以冷冻干燥浓缩，得到珍珠粉中的非水溶性有机基质萃取物，再经凝胶层析处理，同样可得到如上所述的不同分子量级分的珍珠蛋白(肽)。

根据上述实施例，为证实本发明方法的可行及为获知纳米珍珠粉与微米珍珠粉，在同样用本发明方法所得到的珍珠有机基质，其(有效成分)效果的差别，做以下验证并得到结果：

1.纳米珍珠粉与微米珍珠粉的悬浮液，经过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离后，以SDS-PAGE验证，如图9，成功分离(区别)出分子量大于5kDa与小于5kDa的蛋白质。此可代表滤膜功能发挥。且一般微米珍珠粉萃取出的有机基质在颜色上呈现偏黄，而纳米珍珠粉萃取的有机基质在颜色上呈现乳白色；经由浓缩滤膜分离出小于5kDa的有机基质相较于大于5kDa的有机基质呈现出较为粘稠状的质感。结果显示的确可以此法萃取出珍珠中的有机基质。

2.将1mg的珍珠有机基质萃取物溶于水，以Bradford蛋白binding assay方法进行蛋白质定量。此定量方法利用Coomassie Brilliant Blue G-250会与蛋白质结合的特性，在G-250与蛋白质结合后，G-250的颜色会从红色转变成为蓝色，此时在595nm波长下，会有较高的吸收，以便检测。经由此法测定纳米珍珠水溶性有机基质萃取物的蛋白质含量，发现每1mg约含蛋白质14.43μg；而微米珍珠水溶性有机基质萃取物的蛋白质含量较少，每1mg约含蛋白质7.48μg(表3)。推测其原因为将珍珠粉纳米化后，导致碳酸钙结晶霰石薄板破裂，霰石板破裂内(intracrystalline)主要成分蛋白质释出。纳米珍珠非水溶性有机基质萃取物的蛋白质含量，发现每1mg约含蛋白质16.84μg；而微米珍珠非水溶性有机基质萃取物的蛋白质含量，每1mg约含蛋白质14.06μg(表4)，显示珍珠粉甲醇萃取物无论是纳米级或是微米级其蛋白质含量比珍珠水萃物更多。

表3 本发明方法珍珠水萃物蛋白质含量表

 

	蛋白质(μg)/有机基质(mg)	蛋白质比率(％)
			微米	7.48	0.75
纳米	14.43	1.4

表4 本发明方法珍珠甲醇萃取物蛋白质含量表

 

	蛋白质(μg)/有机基质(mg)	蛋白质比率(％)
			微米	14.06	1.4
纳米	16.84	1.68

3.珍珠有机基质对纤维母细胞增生的影响(以下实验按照表5分类代码)

表5 本发明方法实验结果数据的珍珠萃取物分类代码表

 

pearl1	水萃micro大于5kDa
		pearl2	水萃micro小于5kDa
pearl3	水萃nano大于5kDa
		pearl4	水萃nano小于5kDa

水溶性有机基质

在进行珍珠水萃物对纤维母细胞株增生率实验之前，我们已先行将珍珠水萃物以Centriprep YM3超离心滤膜，以分子量做出约略区分，把水溶性的珍珠有机基质分为大于5kDa与小于5kDa两部分。因此实验中除了设计评估微米珍珠粉与纳米珍珠粉水溶性有机基质对纤维母细胞增生率的影响，也同时设计评估相同粒子等级的珍珠粉，分子量大于5kDa的有机基质与分子量小于5kDa的有机基质对纤维母细胞增生率的影响。

如图10及表6所示为序列浓度(0、0.5、1、2、4mg/mL)的珍珠水萃取物(pearl1、2、3、4)处理人类皮肤纤维母细胞株24小时的细胞增生率变化的情形，细胞增生率变化以(％ofcontrol)表示。数据以SigmaPlot2000软体进行处理分析。数据结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝3。*表示P<0.05。结果显示珍珠水萃物pearl4，也就是萃取自纳米珍珠粉分子量小于5kDa的水溶性有机基质，在1mg/mL的浓度下，对纤维母细胞处理24小时之后产生较明显促进增生的功效，增生率提高为132％。投予珍珠水萃物pearl3(萃取自纳米珍珠粉分子量大于5kDa的水溶性有机基质)的纤维母细胞也有大约130％的增生率。

表6 珍珠水萃取物对人类皮肤纤维母细胞株24小时的细胞增生情况示意图

 

Hs68	0mg/mL	0.5mg/mL	1mg/mL	2mg/mL	4mg/mL
						pearl1	100±0	109±1.6	114±1.6	111±1.6	117.75±1.7

 

pearl2	100±0	110.7±2.1	110.2±1.7	101±0.8	102±0.8
						pearl3	100±0	113.2±1.7	130.2±1.7	120.2±2.2	119.7±1.7
pearl4	100±0	126.7±1.7	133±0.8	103.5±1.3	106.7±1.7

数据以SigmaPlot2000软体进行处理分析。数据结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝3。*表示P<0.05。

相同浓度下(1mg/mL)的微米珍珠粉有机基质，不论是珍珠水萃物pearl1(分子量大于5kDa的)或pearl2(分子量小于5kDa)其促进增生效果较不明显，其增生率分别为114％与110％。

当将投予细胞的珍珠水萃物浓度往上提高至2mg/mL与4mg/mL时，可见到原先在浓度1mg/mL下增生率提高比较明显的pearl3和pearl4增生率反而下降；pearl2也有同样情况；pearl1在浓度4mg/mL下，增生率反而提升至118％。

将此结果对照其他相关研究可以发现，软体动物贝壳有机基质萃取物对细胞增生率的影响，并非与浓度呈正比，而是会在某个浓度下使细胞增生率明显提高，当以此浓度为基准逐渐提高有机基质浓度时，细胞增生率并不会随着浓度提高而上升，甚至会因此而下降。

4.珍珠有机基质对黑色素生成的影响

水溶性有机基质

在进行评估珍珠水萃物影响酪氨酸酶(tyrosinase)活性(dopachrome生成)实验之前，我们已先行将珍珠水萃物以Centriprep YM3超离心滤膜，以分子量做出约略区分，把水溶性的珍珠有机基质分为大于5kDa与小于5kDa两部分。因此实验中除了设计评估微米珍珠粉与纳米珍珠粉水溶性有机基质对tyrosinase活性的影响，也同时设计评估相同粒子等级的珍珠粉，分子量大于5kDa的有机基质与分子量小于5kDa的有机基质对tyrosinase活性的影响。

图11及表7所示为不同时间下，浓度2mg/mL的珍珠水萃物与熊果素(Arbutin)对酪氨酸酶抑制效果的统计分析。数据以SigmaPlot2000软体进行处理分析。数据结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝3。*表示P<0.05。如结果所示，pearl3(纳米珍珠粉水萃物，大于5kDa)浓度1mg/mL，在37℃、PH6.8条件下，与20mM酪氨酸以及383units/mL酪氨酸酶反应30分钟之后，相较于空白，可减少约24％的dopachrome生成；反应1小时之后，仍可以抑制约19％的dopachrome生成。相同剂量的熊果素在反应30分钟后，其抑制能力达53％；反应1小时之后，抑制能力仍有21％。比较之后发现，pearl4在反应30分钟后，其约有熊果素五分之四的抑制能力；反应1小时之后，其抑制能力与熊果素相当。

表7 珍珠水萃取物与熊果素对酪氨酸酶抑制效果统计表

 

Inhibition(％)	pearl1	pearl2	pearl3	pearl4	Arbutin
						0min	0±0	0±0	0±0	0±0	0±0
5min	9.7±0.1	6.8±0.1	17.6±0.7	10.5±0.8	36.5±1.9
						10min	14.3±1.1	12.3±0.4	20.8±1.3	13.8±0.7	48.6±0.7
15min	15.2±0.1	14.2±0.4	23.5±1.5	15.7±0.8	54.3±1.0
						30min	13.6±0.5	14.0±0	24.7±1.0	14.3±0.4	54.7±0.9

 

45min

5.7±0

11.5±0.3

20.9±0.9

9.2±0.6

37.1±1.3

 

60min

2.8±0.2

7.72±0.2

19.3±0.5

4.7±0.6

21.6±1.9

数据以SigmaPlot2000软体进行处理分析。数据结果以平均值±标准偏差(mean±SD)表示，n＝3。*表示P<0.05。

水萃物pearl1、pearl2、pearl4在反应30分钟后，抑制酪氨酸酶活性14％～15％，约是熊果素抑制能力的七分之二；反应1小时之后，抑制酪氨酸酶活性约为2％～7％。

因此，依上述验证结果，如图1，本发明方法所得到的第一珍珠有机基质萃取物12A及第二珍珠有机基质萃取物12B(这二者均既指水萃取物，也指甲醇萃取物，其测试评估方法相同)，如图12，可以在通过一项生物活性评估流程后，确定其有效成分具有显着效果；而这项生物活性评估流程，包括：

1.蛋白质浓度测定，以Bradford assay测定蛋白质含量为每1mg萃取物约含蛋白质14.43μg。

2.酪氨酸酶抑制能力评估，与市售美白成分相比测定对酪氨酸酶抑制能力，证实其阻断Melanin(黑色素)生成途径，提高酪氨酸酶活性的抑制能力；

3.细胞增生评估，以人类纤维母细胞株，进行MTT以及胶原蛋白测定，证实可提高人类皮肤纤维母细胞的增生；

4.紫外线吸收能力评估，测定对UVA、UVB的最大吸收波长；

除此之外，第一珍珠有机基质萃取物12A及第二珍珠有机基质萃取物12B，在利用胶体过滤分离法分离(区分)后，如图13所示，其分子量分级的珍珠蛋白13A及分级的珍珠肽13B，可再次进行生物活性测试，得到具有更显着效果的单一成分，并可以由SDS-PAGE电泳图，HPLC分析图谱，MALDI-TOF质谱鉴定图作为鉴定。

由此可见，纳米珍珠粉的有机基质(有效成分)，能便利的由本发明方法加以萃取，并可进一步将其分离出分子量分级的珍珠蛋白与分级的珍珠肽，且可再经由生物活性测试得到更具显着效果的单一成分，并仅须图谱等鉴定流程的建立，即可大量提供化妆品、食品等产业，作符合经济效益的最佳利用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，其特征在于取纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取，总共加水的量要使珍珠粉重量与水体积之比为1∶10，在室温下用搅拌机进行12小时的搅拌，使珍珠粉在水中充分萃取后置于旋转容器中；再以转速3000rpm的高速旋转离心方式取悬浮液，经杂质过滤后，通过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离方式，分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物；分别将第一及第二珍珠有机基质萃取物，利用胶体过滤分离方式，分离出分子量分级的珍珠蛋白及分级的珍珠肽。

2.根据权利要求1所述的纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，其特征在于进行胶体过滤并结合SDS-PAGE电泳。

3.根据权利要求1所述的纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，其特征在于所述纳米珍珠粉先后两次加水搅拌使之充分萃取后，以高速旋转离心方式取悬浮液，其珍珠粉沉淀物，再以70％甲醇搅拌萃取，以高速旋转离心方式取悬浮液，并经杂质过滤后，同样通过离心浓缩滤膜装置的离心浓缩分离方式，可分离出分子量大于5kDa的第一珍珠有机基质萃取物及分子量小于5kDa的第二珍珠有机基质萃取物。

4.根据权利要求3所述的纳米珍珠有机基质萃取与分子量分级的方法，其特征在于所述珍珠粉沉淀物于70％甲醇中搅拌，加70％甲醇的量要使珍珠粉沉淀物重量与70％甲醇体积之比为1∶10，在4℃的环境温度下搅拌12小时，使珍珠粉中的非水溶性有机基质在甲醇中充分萃取。 

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