CN101378784B - 产生有机胺的超极化羧酸盐的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生成有机胺和氨基化合物的超极化的羧酸盐的动态核极化方法以及用于该方法中的组合物。DNP剂优选为稳定的氧基、硫基或碳基三苯甲基自由基。任选存在顺磁性金属离子。

Description

产生有机胺的超极化羧酸盐的方法
本发明涉及产生有机胺和氨基化合物的超极化羧酸盐的动态核极化方法以及用于该方法的组合物。
磁共振(MR)成像(MRI)已成为特别吸引医师的成像技术，因为它以非侵入性的方式获得患者的身体或其部分的图像，并且不会使得患者和医护人员暴露于中可能有害的射线诸如X-线中。由于它的高质量图像，MRI是对于软组织和器官有利的成像技术，并且它能辨别正常与病变组织，例如肿瘤和损伤。
可用或不用MR对比剂进行MRI。然而，经对比增强的MRI通常使探测更小的组织变化成为可能，成为探测早期变化如小的肿瘤或转移的强大工具。
几种对比剂已经用于MRI。可溶于水的顺磁性金属螯合剂，例如，钆螯合剂，如OmniscanTM(GE Healthcare)是广泛使用的MR对比剂。由于它们的低分子量，当将它们给予血管时，它们迅速分布于细胞外间质(即血液和组织间隙)。它们也相当迅速地从身体中清除。
另一方面，血池MR对比剂，例如超顺磁性氧化铁颗粒，滞留在血管中延长的时间。已经证明，它们在肝脏中非常有益于增强反差，但也检测出毛细血管渗透性异常，如，为肿瘤血管新生引起的肿瘤中“渗漏的”毛细血管壁。
尽管上述的对比剂具有无异议的卓越特性，但是它们的应用并非无任何风险。虽然顺磁性金属螯合剂通常具有高度稳定性常数，但在给药后毒性金属离子可能在体内释放。再有，这些类型的对比剂显示特异性差。
WO-A-99/35508公开采用高T1剂超极化的溶液作为MRI对比剂的患者的MR研究方法。术语“超极化”意指，使存在于高T1剂中的NMR活性核，即具有非零核自旋的核，优选13C-或15N-核的核极化，提高至超过在室温和1T(热力极化)发现的水平。一旦提高了NMR活性核的核极化，这些核的激发态和基态核自旋状态之间的总体粒子数差(population difference)显著增加，因此MR信号强度成百倍地放大。当使用超极化的富含13C-和/或15N-高T1剂时，它们将基本上不受背景信号影响，因为自然丰富的13C和/或15N可以忽略不计，因此图像反差将有利地大。常规MRI对比剂和这些超极化的高T1剂的主要差别是，前者的对比变化是由于影响身体中水质子的弛豫时间引起的，而后类试剂可被认为是非放射性示踪剂，因为获得的信号单独由该试剂引起。
在WO-A-99/35508中，公开了用作MR成像剂的多种可能的高T1剂，它们包括非-内源性的和内源性的化合物，如乙酸盐、丙酮酸盐、草酸盐或葡糖酸盐、糖如葡萄糖或果糖、尿素、酰胺类、氨基酸类如谷氨酸盐、甘氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸盐、核苷、维生素如抗坏血酸、青霉素衍生物和磺胺类。还声称代谢循环，诸如柠檬酸循环中的中间体如反丁烯二酸和丙酮酸是用于代谢活性的MR成像的优选成像剂。
在人和非人动物体内代谢过程起作用的超极化的MR成像剂引起人们极大的注意，因为这些超极化的成像剂可用于体内MR研究中获得有关组织代谢状态的信息，即它们用于代谢活动的体内成像。例如，组织代谢状态的信息被用于辨别健康和患病的组织。
丙酮酸盐是在柠檬酸循环和超极化的13C-丙酮酸盐转化为超极化的13C-乳酸盐中起作用的化合物，超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸可用于人体代谢过程的体内MR研究。例如，如在WO-A-2006/011810中详细描述的那样，超极化的13C-丙酮酸盐可用作体内肿瘤成像的MR成像剂，并且如在WO-A-2006/054903中详细描述的那样，用于评估心肌组织存活性。
必须强调的是，超极化成像剂的信号衰减是由于弛豫以及一给予患者身体时就被稀释。因此生物体液(如血液)中的成像剂T1值必须充分长以使试剂能够以高度超极化的状态分布至患者身体中的靶位点。除了成像剂具有高T1值外，达到高度极化水平是非常重要和有利的。
在WO-A-99/35508中公开了几种超极化技术，其中之一是动态核极化(DNP)技术，由极化剂或所谓的DNP剂，含未成对电子的化合物对样品中的MR活性核产生极化。在DNP方法中，通常以微波辐射形式提供能量，这将开始激活DNP剂。一旦衰减至基态，极化就从DNP剂的未成对电子转移至样品中的NMR活性核。一般，DNP方法中使用中度或高度磁场和非常低的温度，如，通过在液氦和约1T或更高的磁场中实施DNP方法。作为选择，可采用中度磁场和达到充分的极化增强的任何温度。DNP技术描述于，例如WO-A-98/58272和WO-A-01/96895，两者均通过引用包括在本文中。
DNP剂在DNP方法中起决定性作用，因为它的选择对可达到的极化水平起主要影响。在WO-A-99/35508中表示为“OMRI对比剂”的多种DNP剂是已知的。如在WO-A-99/35508、WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711、WO-A-98/39277和WO-A-96/39367中被描述为DNP剂的氧基、硫基或碳基稳定的三苯甲基自由基的应用，在多种不同物质中引起高水平的极化。
还发现，在DNP方法中，为了使极化从DNP剂转化至样品的NMR活性核，必须将DNP剂和样品进行紧密接触。该紧密接触可通过选择可溶解于要被极化的样品的DNP剂实现。再有，一旦冷却/冷冻，避免DNP剂/样品混合物结晶就是重要。已经发现，在冷却/冷冻时结晶的样品中的极化水平低，或者，甚至完全没有超过热力极化水平的增强，即，在启动动态核极化过程前，可能得到室温下的自然极化。还发现，可通过在冷却/冷冻时加入玻璃形成剂，如DNP剂/样品/玻璃形成剂混合物，形成非晶态固体(“玻璃”)，改善在冷却/冷冻时结晶的样品中的极化水平。
适宜的玻璃形成剂为例如丙三醇、丙二醇或乙二醇。然而，玻璃形成剂的添加通常被维持在必须的最低限度，因为该添加“稀释”样品，这对于某些应用，如使用超极化的样品作为MRI中的成像剂不利。在此情况下，必须以高浓度给予患者超极化的样品，即必须用于DNP方法的高度浓缩的样品。在本文的上下文中，将冷冻的、含样品(即DNP剂、样品和如果需要时的玻璃形成剂和/或溶剂)的组合物的质量维持在尽可能小，也是重要的，因为如果在DNP过程后采用溶解将固体超极化的组合物转化成液态，如，将其用作成像剂，大的质量将对溶解过程的效果产生不利影响。再有，如果意欲将极化的样品用作成像剂，则在给予患者成像剂之前，加入玻璃形成剂可能需要除去这些化合物。加入玻璃形成剂的另一个缺点是常常观察到极化的样品在水性载体中的溶解度下降。水性载体是意欲用作成MR像剂的超极化的样品的优选的溶解介质。
相当大量的在代谢上的活性化合物是羧酸盐，即羧酸的盐。实例是丙酮酸盐、乳酸盐、碳酸氢盐、丁二酸盐、苹果酸盐、反丁烯二酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、a-酮戊二酸盐或草酰乙酸盐。这些化合物以其钠盐的形式易于(从商业上)获得，并且它们中的大多数可溶解于水以及与DNP剂混合，以制备DNP方法所用的组合物。然而，一旦冷却/冷冻，这些混合物(没有加入玻璃形成剂)可结晶，导致极化水平太低，以致不能使用经极化的羧酸盐作为用于代谢活性的MR成像的MR成像剂。一些前述化合物如丙酮酸盐和乳酸盐可以其酸的形式被极化，因为这些酸在冷却/冷冻时不结晶，因此加入玻璃形成剂不是必须的。缺点是，DNP剂必须是稳定的并且易于在这些酸中混溶，此标准使适宜的DNP剂的范围缩窄。再有，在溶解步骤或其后的过程中，必须用碱使游离酸转化为羧酸盐。这还需要可耐强酸和碱的耗材(容器、瓶子、管道等)。
本申请人现在发现，不加入玻璃形成剂而使羧酸盐极化的方法。已经发现，不向要被极化的混合物中加入玻璃形成剂，可使有机胺和氨基化合物的羧酸盐经历动态核极化，因为这些羧酸盐在冷却/冷冻时不结晶。使用以有机胺和氨基化合物的盐的形式存在羧酸盐的优点是，完全不必向要被极化的混合物加入玻璃形成剂，因此，经极化化合物的“稀释”和从极化的样品中去除玻璃形成剂就不再是问题。因此，更高浓度的羧酸盐可用于DNP方法中。羧酸盐的直接极化的再一个优点是，可避免极化游离羧酸的间接途径以及上段中概述的这些途径的所有缺点。此导致可能使用范围更广的DNP剂，因为这些药物不再必须在酸中是稳定的。
因此，从一方面看来，本发明提供产生有机胺或氨基化合物的固体超极化羧酸盐的方法，所述方法包括制备包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐和DNP剂的组合物以及对该组合物进行动态核极化。
术语“羧酸盐”表示要经动态核极化被超极化的一个或多个分子实体(如不同羧酸盐的混合物)。
术语“超极化”和“极化”在下文中可交互使用，表示核的极化水平过量。术语“超极化”和“极化”优选表示核的极化水平过量0.1％，更优选过量1％和最优选过量10％。
例如，可通过测量经超极化样品中的NMR活性核的固态NMR，确定极化水平。例如，如果超极化的样品中的NMR活性核是13C，则可获得所述样品的固态13C-NMR。固态13C-NMR测量值优选由使用低反转角(low flip angle)的单一脉冲捕获NMR序列(simplepulse-acquire NMR序列)组成。比较经超极化样品的信号强度与动态核极化过程前的样品的极化水平。然后从DNP前和DNP后的样品的信号强度的比率计算极化水平。
以类似的方法，可通过经超极化样品中的NMR活性核的液态NMR测量值，测定溶解的、经超极化样品的极化水平。再比较溶解的、经超极化样品的信号强度与溶解的、动态核极化过程前的样品的极化水平。然后从DNP前和DNP后的样品的信号强度的比率计算极化水平。
术语“有机胺或氨基化合物的羧酸盐”表示羧酸和有机胺或氨基化合物的盐，优选pH中性盐。在本发明上下文中的羧酸盐可为像例如碳酸、乙酸、棕榈酸、油酸、丙酮酸或乳酸的单羧酸的盐。在另一个实施方案中，羧酸盐可为像例如苹果酸、反丁烯二酸、丁二酸、丙二酸或柠檬酸的二或多羧酸的盐。在羧酸盐是二或多羧酸的盐时，盐可为单羧酸盐、二羧酸盐或多羧酸盐。例如，在柠檬酸，三羧酸时，羧酸盐可为(单)柠檬酸盐，即具有2个游离羧基，二柠檬酸盐，即具有1个游离羧基，或三柠檬酸盐，即没有游离羧基。如果用于本发明方法中的羧酸盐是二或多羧酸的羧酸盐，优选没有任何游离羧基的羧酸盐。
优选的羧酸盐是候选药物，小分子，如小于2000Da，或几种候选药物的混合物和经超极化的候选药物可优选用于NMR试验，例如，测定对某一受体的或在酶分析中的结合亲和力。这样的试验描述于WO-A-2003/089656或WO-A-2004/051300，且它们优选基于使用液态NMR光谱，这意味着含候选药物的超极化的固体组合物在极化后必须优选通过溶解或熔化而液化。羧酸盐可或不可为富含同位素的。
在另一个优选的实施方案中，羧酸盐是MR成像剂，并且意欲将超极化的羧酸盐用作MR成像和/或化学位移成像中的成像剂。此时，优选的羧酸盐是内源性羧酸盐，更优选在人或非人动物体内代谢过程中起作用的内源性羧酸盐。在该上下文中优选的羧酸盐是苹果酸盐、乙酸盐、反丁烯二酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、碳酸氢盐、丙二酸、丁二酸盐、草酰乙酸盐、α-酮戊二酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐和异柠檬酸盐。最优选的羧酸盐是乙酸盐、反丁烯二酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐和丙酮酸盐。
如果将在人或非人动物体内代谢过程中起作用的内源性羧酸盐用于本发明的方法中，则这些超极化的羧经超极化羧酸盐优选用作在人或非人动物体内代谢活动的体内分子MR成像和/或化学位移成像的MR成像剂。这些羧酸盐中，优选的是含经极化核的那些，它们表现出缓慢纵向弛豫，以致极化维持足够长时间以转移入人或非人动物体内而随后成像。优选的羧酸盐含具有在0.01-5T磁场强度和20-40℃范围的温度下的纵向弛豫时间常数(T1)大于10秒、优选大于30秒和更优选大于60秒的核。
一般地，意欲用作体内MR成像和/或化学位移成像的MR成像剂的羧酸盐，优选富含同位素的羧酸盐，同位素富集更优选是非零自旋核(MR活性核)的，适宜地，如果存在于有机胺或氨基化合物的羧酸盐的羧酸盐部分，是15N和/或13C，更优选13C的同位素富集。同位素富集可包括或者在羧酸盐中的一个或多个位点的选择性富集或者在所有位点的均衡富集。例如，可通过化学合成或生物标记的方法实现富集，两种方法为本领域所知，并且可依据要富含同位素的具体羧酸盐选择适宜的方法。
意欲用作MR成像剂的羧酸盐的优选的实施方案是仅在分子的一个位上富集同位素的羧酸盐，优选富集至少10％，更适宜至少25％，更优选至少75％和最优选至少90％。理想富集是100％。
同位素富集的最佳位取决于MR活性核的弛豫时间。羧酸盐优选在具有长T1弛豫时间的位上富集同位素。优选采用在羧基-C-原子、羰基-C-原子或季C-原子上富集的13C-富集的羧酸盐。
用作MR成像剂的特别优选的羧酸盐是13C-丙酮酸盐、13C-乙酸盐、13C-乳酸盐、13C-碳酸氢盐、13C-3-羟基丁酸盐、13C-反丁烯二酸盐和13C-碳酸盐，最优选13C-丙酮酸盐。13C-丙酮酸盐可在C1-位(13C1-丙酮酸盐)、在C2-位(13C2-丙酮酸盐)、在C3-位(13C3-丙酮酸盐)、在C1-和C2-位(13C1，2-丙酮酸盐)、在C1-和C3-位(13C1，3-丙酮酸盐)、在C2-和C3-位(13C2，3-丙酮酸盐)或在C1-、C2-和C3-位(13C1，2，3-丙酮酸盐)富含同位素。C1-位是13C同位素富集的优选的位置。
在另一个优选实施方案中，本发明方法的羧酸盐用于固态NMR波谱。在此可通过静态或魔角旋转(magic angle spinning)固态NMR波谱分析经超极化的固体羧酸盐。在该实施方案中，不限于具有某些特性的羧酸盐和具有羧酸基的任何大小和类型的分子可用作本发明方法中的羧酸盐。
如早先提及的，术语“有机胺或氨基化合物的羧酸盐”表示羧酸和有机胺或氨基化合物的盐。在本发明上下文中的胺可为伯胺、仲胺或叔胺。由于氮原子上的游离电子对，胺可与羧酸反应形成包含羧酸盐阴离子和季铵阳离子的盐。在本发明上下文中的氨基化合物是包含氨基的有机化合物，所述氨基可为未被取代的氨基，即-NH2，或被取代的氨基，即-NHR或-NR2，其中R表示除H之外的任何残基。氨基化合物可含其它官能团，如羟基、羧基、羰基或磺酸基。在本发明上下文中，应该选择易于与挑选的羧酸形成盐而不形成其它不需要的副产物的氨基化合物。优选的氨基化合物是胺、氨基醇(即包含羟基的氨基化合物)和氨基磺酸，最优选的氨基化合物是氨基醇。
本发明方法中的优选的有机胺或氨基化合物是低分子量的小分子。胺或氨基化合物的分子量越小，组合物中经受极化的有机胺或氨基化合物的羧酸盐的浓度越高。优选具有30-300g/mol，更优选30-200g/mol和最优选30-160g/mol分子量的有机胺和氨基化合物。适宜的低分子量有机胺是，例如，甲胺、乙胺、二乙胺、三甲胺、咪唑或乙二胺。适宜的低分子量氨基化合物是乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丙二醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、三-(羟基甲基)甲胺(TRIS)、赖氨酸、N-甲基-D-葡糖胺或N-(2-乙酰氨基)-2-氨基甲烷磺酸，在这些化合物中，优选乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丙二醇、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、N-甲基-D-葡糖胺和三-(羟基甲基)甲胺(TRIS)。
如果意欲将超极化的羧酸盐用作MR成像剂，则重要的是在将极化的组合物中要有高浓度羧酸盐，因为需要给予患者相当高浓度的经超极化羧酸盐。再有，保持将极化的组合物的质量尽可能小，同时使组合物中具有高浓度的羧酸盐是有利的。可通过选择低分子量的胺或氨基化合物再次实现这一点。如果可使将极化的组合物质量小，例如，在经超极化羧酸盐用于液体NMR或MR成像的情况下，则极化后可使经超极化组合物的溶解进行得更有效。
对于用作MR成像剂的超极化的羧酸盐，优选选择生理学上可耐受的有机胺或氨基化合物，因为这样的化合物在给予患者前不必从超极化的羧酸盐中去除，例如，被另一个生理学上可耐受的阳离子交换。在此情况下，优选生理学上可耐受的氨基化合物，在更优选的实施方案中，可使用生理学上可耐受的氨基醇、氨基羧酸或氨基磺酸，最优选生理学上可耐受的氨基醇。
优选的氨基醇是三(羟基甲基)甲胺(TRIS)和N-甲基-D-葡糖胺(葡甲胺)。两者均是熟悉的生理学上可耐受的化合物；葡甲胺在多种X-射线和MR对比剂的离子制剂中用作阳离子，而TRIS在用于或施用于人或非人动物的治疗和诊断药物的液体制剂中用作缓冲剂。
优选的氨基磺酸是包含羟基的那些氨基磺酸，优选N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)，更优选N-三(羟基甲基)-2-氨基乙烷磺酸(TES)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪-3-丙烷-磺酸(HEPPS)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、1，4-哌嗪-二-乙烷磺酸(PIPES)、N，N-二(2-羟基乙基)-2-氨基-乙烷磺酸(BES)和3-(N-吗啉代)丙烷-磺酸(MOPS)。
在本发明方法的优选实施方案中，使用有机胺或氨基化合物的pH中性羧酸盐。为了得到这样的pH中性羧酸盐，将有机胺或氨基化合物与羧酸合并，所述羧酸以所有存在于羧酸中的羧基均转化为羧酸盐的摩尔比率，即以产生有机胺或氨基化合物的pH中性羧酸盐的摩尔比率使用。如果例如使丙酮酸和氨基醇TRIS反应，1∶1摩尔比率的丙酮酸与TRIS将导致约pH 5的TRIS-丙酮酸盐。因此，必须使用稍微过量的TRIS以获得pH中性TRIS-丙酮酸盐。
为了得到用于本发明方法的有机胺或氨基化合物的羧酸盐，例如通过将有机胺或氨基化合物加入羧酸中，使有机胺或氨基化合物与羧酸合并。应该缓慢地将有机胺或氨基化合物加入到含羧酸的反应容器中。可搅拌该反应混合物以确保化合物充分混合并可使反应容器冷却。在另一个实施方案中，可将有机胺或氨基化合物和羧酸加至DNP剂溶液中，优选DNP剂的水溶液中。再有，可将羧酸和/或有机胺或氨基化合物溶解于溶剂，如，水中；然而，溶剂的量应该保持最少。也可通过使溶液从2个容器流至确保混合的T形管(T-piece)将溶解的羧酸和有机胺或氨基化合物混合。如果需要，可使用将溶液通过管/线从容器泵入T形管的方法。在又一个实施方案中，羧酸的盐，如钠盐可溶解于溶剂如水中，并且可通过荷载有机胺或氨基化合物的季铵盐的离子交换柱。当将同位素标记的羧酸盐用于本发明方法时，此方法可更为便利，因为这些钠盐更常易于从商业上获得而游离羧酸则不然。再有，因为避免化合物的产热和延长时间的接触，不需要的副产物的形成大大减少。为了保持溶剂的量最少，可在生成羧酸盐后采用本领域已知的方法蒸发溶剂至需要的体积。
在优选的实施方案中，要被极化的组合物是液体组合物，更优选是溶解的组合物，即有机胺或氨基化合物的羧酸盐和DNP于溶剂或溶剂混合物的溶液。本文中之前的术语“溶剂”表示溶剂和溶剂混合物。选择溶剂，使羧酸盐和DNP剂可溶解于所述溶剂。再有，如果超极化的羧酸盐用作MR成像剂时，则溶剂优选生理学上可耐受的溶剂，如药学上可接受的水性载体，如，缓冲溶液或盐水或更优选水。在优选的实施方案中，保持溶剂至必须导致组合物溶解的最少量。
本发明方法中将极化的组合物还包含在DNP方法中必须的DNP剂。为了实现将极化的羧酸盐中的高极化水平，DNP剂必须在羧酸盐中是稳定的和可溶(溶解)的。在本上下文中，稳定的三苯甲基自由基是优选的DNP剂并且这样的稳定的氧基、硫基或碳基三苯甲基自由基，例如在WO-A-99/35508、WOA-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711、WO-A-96/39367、WO-A-98/39277和WO-A-2006/011811中描述。
DNP剂的最佳选择取决于几个方面。如之前提及的，DNP剂和羧酸盐必须紧密接触以在羧酸盐中生产最佳极化水平。因此，在优选的实施方案中，DNP剂在羧酸盐中是可溶(溶解)的。如果要极化的羧酸盐是亲脂性的(亲水性的)化合物，则DNP剂应该也是亲脂性(亲水性)的。如果DNP剂是三苯甲基自由基，则所述三苯甲基自由基的亲脂性或亲水性可受适宜的或亲水性基团的选择的影响。再有，DNP剂在存在羧酸盐下必须是稳定的。因此，如果羧酸盐包含反应性基团，则应该使用对这些反应性基团相对惰性的DNP剂。从之前所述得知，显然DNP剂的选择高度依赖于样品的化学性质。
在依据本发明方法的优选实施方案中，羧酸盐是丙酮酸盐，更优选的13C-丙酮酸盐和最优选的13C1-丙酮酸盐而有机胺或氨基化合物是TRIS或葡甲胺。在此情况下，DNP剂优选下式(1)三苯甲基自由基
Figure S2006800464616D00111
其中
M表示氢或一个当量的阳离子；和
R1相同或不同，表示直链或支链C1-C6-烷基、C1-C6-羟基烷基或基团-(CH2)n-X-R2，其中n是1、2或3；
X是O或S和R2是直链或支链C1-C4-烷基。
在优选的实施方案中，M表示氢或一个当量的生理学上可耐受的阳离子。术语“生理学上可耐受的阳离子”表示被人或非人动物活体耐受的阳离子。优选地，M表示氢或碱性阳离子、铵离子或有机胺离子，例如葡甲胺。最优选，M表示氢或钠。
在更优选的实施方案中，R1是相同的，更优选为直链或支链C1-C4-烷基，最优选甲基、乙基或异丙基或C1-C4-羟基烷基，最优选羟基甲基或羟基乙基。
在更优选的实施方案中，R1相同或不同，优选相同并表示-CH2-OCH3、-CH2-OC2H5、-CH2-CH2-OCH3、-CH2-SCH3、-CH2-SC2H5或-CH2-CH2-SCH3，最优选-CH2-CH2-OCH3。
按照在WO-A-88/10419、WO-A-90/00904、WO-A-91/12024、WO-A-93/02711、WO-A-96/39367、WO-A-98/39277和WO-A-2006/011811中的详述可合成这样的三苯甲基自由基。
可通过将羧酸盐，如果需要溶解于溶剂，优选于水中，与DNP剂混合形成均匀的混合物，获得包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐和DNP剂的组合物。在另一个实施方案中，DNP剂溶解于溶剂，优选水中，并将羧酸和有机胺或氨基化合物，优选以交互的部分加至该溶液中，原位形成羧酸盐。通过本领域已知的几种方法，诸如搅拌、旋转或超声，可促进化合物的密切混合。
在优选的实施方案中，用于本发明方法的组合物还包含顺磁性金属离子。优选在要极化的组合物中存在顺磁性金属离子，因为它导致羧酸盐极化水平提高。
包含在用于本发明方法的组合物中的顺磁性金属离子是原子序号58-70的镧系金属或原子序号21-29、42或44的过渡金属的顺磁性金属离子。一种或不同种金属的顺磁性金属离子可用于本发明方法。优选地，使用一种金属的顺磁性金属离子。适宜的顺磁性离子包括例如Cr3+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Nd3+、Sm3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+和Yb3+。在优选的实施方案中，顺磁性金属离子选自Cr3+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Gd3+和Tb3+，在更优选的实施方案中，选自Cr3+、Mn2+、Fe3+和Gd3+。
适宜地，采用呈螯合的形式或它们的盐的形式的顺磁性金属离子。
如果意欲将要极化的羧酸盐施用于固态NMR，则优选使用其盐的形式的顺磁性金属离子。适宜的盐是例如，CrCl3、MnCl2、FeCl2、FeCl3、GdCl3或顺磁性金属羧酸盐，优选羧酸盐是被极化的那些盐。因此，如果要极化的羧酸盐是乙酸盐，则顺磁性金属离子将优选为顺磁性金属乙酸盐，例如Fe(III)乙酸盐。同样地，如果要极化的羧酸盐是丙酮酸盐，则顺磁性金属离子将优选为顺磁性金属丙酮酸盐，例如Gd(III)丙酮酸盐。选择可溶于羧酸盐或羧酸盐的溶液的盐是有优势的。在另一个实施方案中，可加入螯合形式的顺磁性金属离子。
对于在人或动物活体中的液态NMR或用作成像剂，通过本发明方法获得的固体超极化的羧酸盐必须溶解或熔化以形成溶液或液体。然而，在这样的溶液或液体中的游离顺磁性离子剧烈缩短样品中的极化核的T1弛豫时间，即加速极化的自然衰减，并因此，缩短羧酸盐提供高MR信号强度的时间。另一方面，如果意欲将要极化的羧酸盐用作在人或动物活体中的成像剂，如果不从最终可注射物中去除的话，则游离顺磁性金属离子常常不是生理上耐受的或生理上耐受度差，因此，具有不需要的作用，如，毒性作用。
为了克服游离顺磁性金属离子的上述作用，可采用呈螯合形式的顺磁性金属离子。其优点是不必在作用的高时间压力(time pressure)下从液体超极化的羧酸盐中去除顺磁性螯合剂，以避免如上所讨论的T1缩短。通过使用依据本发明方法的有机胺或氨基化合物的羧酸盐而不是使游离羧酸极化，也可能使用相当广泛的顺磁性螯合剂，由于螯合剂中通常存在的氮原子和羧基的质子化作用，大多数螯合剂在游离羧酸中不稳定。
通过使用呈其盐形式的顺磁性金属离子并且在溶解或熔化超极化的羧酸盐后迅速去除顺磁性金属离子，可进一步克服上述作用。去除顺磁性金属离子的方法在本申请书中稍后公开。
在另一个实施方案中，可通过使用呈其盐形式的顺磁性金属离子和加入螯合剂至溶解媒介以快速络合游离顺磁性金属离子，克服上述作用。在此情况下，应该选择在溶解媒介中可溶的和稳定的并且与游离顺磁性金属离子快速形成稳定的络合物的螯合剂。
如上所陈述，顺磁性金属离子可以螯合形式用于本发明方法中。本文术语“顺磁性螯合物”还表示呈螯合形式的顺磁性金属离子，即顺磁性金属离子的络合物和螯合剂。
多种已知螯合剂适合于此目的。一般，可使用通常含杂原子如N、O、P或S的环状和非环状螯合剂，优选环状螯合剂。适宜的非环状螯合剂是，例如DTPA及其化合物，例如，DTPA-BMA、DTPA-BP、DTPA-BMEA、EOB-DTPA、BOPTA和MS-325；EDTA及其化合物，例如，EDTA-BMA、DPDP、PLED、HPTA；酰胺或二酰胺及其化合物，例如，TOGDA、穴状配体(cryptands)或磺酸盐。适宜的环状螯合剂是，例如，PCTA-[12]、PCTP-[12]、PCTP-[13]、DOTA、DO3A及其化合物，例如，HP-DO3A和DO3A-丁三醇(butriol)。DOTA、DO3A及其化合物是优选的环状螯合剂。这些螯合剂是本领域已知的并且熟练的技术人员能够找到有关这些螯合剂及其制备的大量文献。
在另一个实施方案中，使用相对惰性的化学实体的螯合剂，例如富勒烯(fullerenes)或沸石。装入或包囊顺磁性金属离子的这样的螯合剂是优选的，如果要极化的羧酸盐包含能与，例如，像前段提及的那些更具反应性的螯合剂反应的反应性官能团。
在本发明方法中，顺磁性螯合物可或者是单体顺磁性螯合物，即由螯合剂和单个顺磁性金属离子组成的化学实体，或者是多聚体顺磁性螯合物，即由两个或更多个亚单位组成的化学实体，其中每个亚单位由螯合剂和单个顺磁性金属离子组成。三聚体顺磁性螯合物的实例是1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基苯基)-[1，3，5]三嗪烷(triazinane)-2，4，6-三酮，由三嗪三酮核与连接所述核的3个亚单位组成的顺磁性螯合物，其中每个亚单位包含作为顺磁性金属离子的Gd3+和作为螯合剂的DO3A衍生物。此三聚体顺磁性螯合物的合成在本申请的实施例部分中描述。
如之前描述的DNP剂那样，要极化的羧酸盐必须与顺磁性金属离子紧密接触，以下，除了另外说明或特指，术语“顺磁性金属离子”用于指以其盐和顺磁性螯合物两者存在的顺磁性金属离子。如果羧酸盐呈溶液(即溶解于溶剂如水中)，优选使用可溶于经溶解羧酸盐中的顺磁性金属离子。因此，如同与DNP剂的那样，顺磁性金属离子和羧酸盐优选形成均匀的混合物。如果要极化的羧酸盐是亲脂性(亲水性的)化合物，则顺磁性螯合物也应该是亲脂性(亲水性)的。顺磁性螯合物的的亲脂性或亲水性可例如受包含适宜的亲脂性或亲水性残基的螯合剂的选择的影响。再有，优选的是，在羧酸盐的存在下，顺磁性螯合物是稳定的，因为络合物离解(去螯合)将导致游离顺磁性离子对如上述的经液化的经超极化羧酸盐中的极化衰减和因此的极化水平具有损害的结果，除非在固体经超极化羧酸盐被液化后，迅速去除游离顺磁性金属离子。如果要极化的羧酸盐包含反应性基团，应该使用对这些反应性基团相对惰性的顺磁性金属离子。从之前所述得知，显然顺磁性金属离子的选择高度依赖于羧酸盐的化学性质及其最终用途(固体NMR、液体NMR或显像剂)。
本发明的另一个方面是生成液体经超极化羧酸盐的方法，该方法包括制备包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂和任选顺磁性金属离子的组合物，对该组合物实施动态核极化，使该组合物液化和任选从液化的组合物中去除DNP剂。
为了实施依据本发明的方法，第一步是制备包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂和任选顺磁性金属离子的组合物。
如果用于本发明方法的羧酸盐是溶液，如，溶解于溶剂，优选水性载体或水，则溶解的羧酸盐与经选择的DNP剂，优选三苯甲基自由基和任选与顺磁性金属离子合并形成组合物，其中诸化合物紧密接触。更优选地，经选择的DNP剂和顺磁性金属离子可溶于溶解的羧酸盐中。可通过本领域已知的几种方法，诸如搅拌、旋转或超声，进一步促进密切混合。在另一个实施方案中，制备在溶剂，优选水中的DNP剂溶液，并且交互加入羧酸和有机胺或氨基化合物的份量，以原位形成有机胺或氨基化合物的羧酸盐。任选加入顺磁性金属离子并使其溶解于含DNP剂和羧酸盐的溶液中。在又一个实施方案中，制备顺磁性金属离子的溶液，优选水溶液，并交互加入羧酸和有机胺或氨基化合物的份量，以原位形成有机胺或氨基化合物的羧酸盐。随后加入DNP剂并使其溶解于含顺磁性金属离子和羧酸盐的溶液中。在另一个实施方案中，同时或者陆续使DNP剂和顺磁性金属离子溶解于溶剂，优选水中，并交互加入羧酸和有机胺或氨基化合物份量，以原位形成有机胺或氨基化合物的羧酸盐。
如果三苯甲基自由基被用作DNP剂，则组合物中这样的三苯甲基自由基的适宜浓度是5-25mM，优选10-20mM。如果将顺磁性金属离子加至组合物中，则组合物中这样的顺磁性金属离子的适宜浓度是0.1-6mM(金属离子)，而0.5-4mM的浓度是优选的。
在已经制备组合物后，将所述组合物冷却/冷冻。可通过本领域已知的方法，如，通过在液氮中冷冻组合物或通过简单地将组合物放在液氦将冷冻的DNP极化器中，实现冷却/冷冻。
冷却/冷冻前可对组合物除气。可通过鼓泡氦气通入组合物(如2-15min一个时间周期)实现除气，但可通过其它已知普通方法实现除气。
DNP技术，例如在WO-A-98/58272和WO-A-01/96895中描述，此两个文献通过引用结合于本文中。通常，如，通过在液氦和约1T或更高的磁场中实施DNP方法，在DNP方法中采用中或高磁场以及非常低温度。作为选择，可采用实现增强充分极化的中磁场和任何温度。在优选的实施方案中，在液氦和约1T或更高的磁场中实施DNP方法。适宜的极化装置(＝极化器)在例如WO-A-02/37132中描述。在优选的实施方案中，极化装置包括低温恒温器和极化设备，如，通过波导管连着被磁场产生装置诸如超导磁体环绕的中心孔腔(bore)中的微波源的微波室。孔腔垂直向下延伸到至少的接近超导磁体的P区水平，此处磁场强度对于样品核的极化的发生足够高，如，在1和25T之间。探头的孔腔(＝要极化的组合物)优选可密封的并且可抽空至低压，如，大约1mbar或更低的数量级的压力。探头引入工具，诸如可移动的传送管可包含在孔腔内，并且可将此管从孔腔顶向下插入至微波室内P区中的位置。通过液氦将P区冷却足以低以至发生极化的温度，优选约0.1-100K，更优选0.5-10K，最优选1-5K数量级的温度。探头传导工具优选在其上端以任何适宜的方式是可密封的，以保持孔腔中部分真空。探头固定容器，诸如探头固定帽，可为可移动地装在探头传导工具的低端内。探头固定容器优选由轻质材料制备，所述材料具有低的比热容和良好的低温特性，诸如，KelF(聚氯三氟乙烯)或PEEK(聚醚醚酮)，并且可将其设计为可持有多于一个探头的方式。
将探头插入探头固定容器中，淹没在液氦中并用优选于200mW下约94GHz频率微波辐照。根据要极化的样品，例如，可通过在微波辐照过程中获取探头的固态NMR信号，监测极化水平。一般，在显示NMR信号对时间的图中得到饱和曲线。因此，可能测定何时达到最佳极化水平。
如果意欲将极化的羧酸盐用作MR成像剂，则或者在DNP过程后通过将其溶解在适当的溶剂或溶剂混合物，如，生理学上可耐受的和药学上可接受水性载体如水、缓冲溶液或盐水中，或者通过将其熔化，将含羧酸盐的组合物从固体超极化的状态转化至液体超极化的状态(即液化的)。溶解是优选的并且溶解过程和适宜的装置因此在WO-A-02/37132中有详细描述。熔化过程和适宜的熔化装置，例如在WO-A-02/36005中描述。
在优选的实施方案中，将含超极化的有机胺或氨基化合物的羧酸盐的固体组合物溶解于水或缓冲水溶液中。在进一步优选的实施方案中，羧酸盐是缓冲剂化合物如TRIS、TRICIN或氨基磺酸如ACES、PIPES、BES、MPOS、HEPES、TES或HEPPS(所有提及的缓冲剂化合物是在本发明定义内的有机氨基化合物)的羧酸盐，以及将固体组合物溶解于水将产生羧酸盐的缓冲溶液。
在后继步骤中，可将DNP剂和任选存在的顺磁性金属离子从液化的组合物中去除。如果意欲将经超极化羧酸盐用作人或动物活体中MR成像剂或作其它应用，则DNP剂，优选三苯甲基自由基和顺磁性金属离子优选从液化的组合物中去除。
可用于部分、充分或完全去除三苯甲基自由基和顺磁性金属离子的方法是本领域已知的。通常，可适用的方法取决于三苯甲基自由基和顺磁性金属离子的性质。一旦固体经超极化的组合物溶解，三苯甲基自由基和/或顺磁性金属离子就会沉淀，并因此可通过过滤轻易从液体中分离。
如果没有发生沉淀，则可通过色谱分离技术，如，液相色谱如反相色谱、离子交换色谱、(固相)萃取法或本领域已知的其它色谱分离技术，去除三苯甲基自由基和顺磁性金属离子。一般，优选采用在一个步骤中能够去除三苯甲基自由基和顺磁性金属离子两者的方法，因为由于T1弛豫液体羧酸盐中的极化衰减。越快和越有效地从液体羧酸盐中去除不需要的化合物，保留羧酸盐中的极化水平越高。因此，不但从羧酸盐、三苯甲基自由基和顺磁性金属离子之间紧密接触来看，而且从快速去除来看，选择具有相似的化学性质的三苯甲基自由基和顺磁性金属离子，如，两者均是亲脂性或亲水性的化合物，是有益的。如果例如使用亲脂性三苯甲基自由基和亲水性顺磁性螯合物，可在单个色谱柱上通过反相液相色谱去除两种化合物。
如果游离顺磁性金属离子存在于液化的组合物(如由于使用顺磁性金属盐)中，则优选使用如由O.Vigneau等，Anal.Chim.Acta 435(1)，2001，75-82中公开的阳离子交换柱或离子印迹化树脂去除这些离子。另一个可能的方法是如由A.Sorin等，J.Membrane Science 267(1-2)，2005，41-49公开的，通过在荷电的有机膜上选择性络合游离顺磁性金属离子的纳滤膜技术(nano-filtration)。再有，以类似于由S.Donald等.J.Inorg.Biochem.56(3)，1994，167-171公开的亲和色谱法，可从液化的组合物中去除游离顺磁性金属离子。
因为三苯甲基自由基具有特征性UV/可见吸收光谱，有可能使用UV/可见光吸收检测作为一个方法，检验在去除三苯甲基自由基后液体组合物中它们的存在。为了获得定量结果，即存在于液体组合物中的三苯甲基自由基的浓度，可对光谱仪进行校准，这样从液体组合物的样品在特定波长的吸收值得到样品中相应的三苯甲基自由基浓度。如果将液体经超极化羧酸盐用作人或非人动物体的体内MR成像的成像剂，则去除三苯甲基自由基是特别优选的。
在去除顺磁性金属离子(如果已经存在于经极化的组合物中)和/或三苯甲基自由基后，可检验液体样品的残余顺磁性金属离子和/或三苯甲基自由基。
荧光或UV/可见光吸收检测可被用作检核是否存在顺磁性螯合物的方法，前提条件是螯合物中含(强)发色团。检核是否存在顺磁性螯合物的另一个方法是电化学检测，前提条件是螯合物中存在电活性部分。
如果顺磁性金属盐用于组合物中，可用荧光检测去检验从液体组合物去除它们后的游离顺磁性金属离子。如果例如使用Gd3+-盐，则激发波长275nm的荧光和发射波长314nm的监测荧光可用作检测具有高度特异性的游离Gd3+的方法。再有，可通过与比色剂PAR(4-(2-偶氮)-间苯二酚)络合后用530-550nm可见光吸收检测游离Gd3+。适宜于其它顺磁性金属离子的其它比色剂为本领域已知并且可以同样的方式使用。
在依据本发明方法的优选实施方案中，组合物包含13C-丙酮酸盐，优选TRIS或葡甲胺的13C1-丙酮酸盐、三苯甲基自由基，优选式(1)三苯甲基自由基以及或者包含作为顺磁性金属离子的Gd3+的顺磁性螯合物或者Gd3+-盐如GdCl3或Gd-丙酮酸盐。通过优选将Gd-螯合物或Gd-盐溶解于溶剂，优选水中，优选以交互加入13C1-丙酮酸和TRIS或葡甲胺份量于所述溶液中，制备组合物。在后续的步骤中，将式(1)三苯甲基自由基加至溶液中并且将如此得到的组合物冷却/冷冻。动态核极化后，将固体经超极化的组合物溶解于水性载体，优选水中。
如果已经将Gd3+-盐用作顺磁性金属离子，则重要的是尽可能快地从溶解的13C-丙酮酸盐中去除Gd3+离子。适宜的方法是，通过使用如由O.Vigneau等，Anal.Chim.Acta 435(1)，2001，75-82中公开的阳离子交换柱或离子印迹化树脂去除这些离子。另一种可能的方法是如由A.Sorin等，J.Membrane Science 267(1-2)，2005，41-49公开的，通过在荷电的有机膜上选择性络合游离Gd3+的纳滤膜技术。再有，如由S.Donald等.J.Inorg.Biochem.56(3)，1994，167-171公开的，通过亲和色谱法可去除游离Gd3+。在另一个实施方案中，溶解介质包含能够络合游离Gd3+离子的一种或多种化合物，如，螯合剂如ETDA、DTPA或其化合物如DTPA-BMA。如在下一段中描述的，可从溶解的13C-丙酮酸盐中去除如此得到的Gd-螯合物。
如果已经将Gd-螯合物用作顺磁性金属离子，和式(1)三苯甲基自由基，则可通过使用反相液相色谱，在使式(1)三苯甲基自由基去除的同时，去除螯合物。
用于检验经纯化的溶解的羧酸盐中残留游离Gd3+、Gd-螯合物和式(1)三苯甲基自由基的适宜的方法在第22/23页描述。
依据本发明方法生成的液体超极化的13C-丙酮酸盐可用作“常规的”MR成像剂，即为解剖学成像提供极好的对比增强值。依据本发明方法生成的液体超极化的13C-丙酮酸盐的再一个优点是，丙酮酸盐是即使在更高浓度下人体也耐受良好的内源性化合物。作为柠檬酸循环中的前体，丙酮酸盐在人体中起重要的代谢作用。丙酮酸盐转化成不同的化合物：其转氨作用产生丙氨酸，经由氧化去羧基作用，丙酮酸盐转化成乙酰-CoA和碳酸氢盐，丙酮酸盐的还原生成乳酸盐和其羧基化生成草酰乙酸盐。
再有，超极化的13C-丙酮酸盐转化为经超极化13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐(仅就13C1-丙酮酸盐、13C1，2-丙酮酸盐或13C1，2，3-丙酮酸盐而言)和超极化的13C-丙氨酸，可被用于人体代谢过程的MR研究。13C-丙酮酸盐在人全血中于37℃具有42秒的T1弛豫，然而，已发现超极化的13C-丙酮酸盐转化为超极化的13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸足够迅速，以致能检测来自13C-丙酮酸盐母体化合物及其代谢物的信号。丙氨酸、碳酸氢盐和乳酸盐的量取决于被研究组织的代谢状态。超极化的13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸的MR信号强度与在检测时剩下的这些化合物的量和极化的程度相关，因此，通过监测超极化的13C-丙酮酸盐向经超极化的13C-乳酸盐、超极化的13C-碳酸氢盐和超极化的13C-丙氨酸的转化，可能使用非侵入性MR成像研究人或非人动物体内代谢过程。
已经发现，由不同丙酮酸盐代谢物引起的MR信号振幅依组织类型的不同而异。由丙氨酸、乳酸盐、碳酸氢盐和丙酮酸盐形成的独特的代谢峰图案可用作被检查组织的代谢状态的指纹图，并且因此考虑健康组织和肿瘤组织之间的区别。此使得依据本发明的组合物成为体内MR肿瘤成像的卓越药物。丙酮酸盐在肿瘤成像的应用已经在WO-A-2006/011810中详细描述。
再有，超极化的13C-丙酮酸盐在心脏成像的应用已在WO-A-2006/054903中描述。
本发明的另一个方面是包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂，优选三苯甲基自由基和任选顺磁性金属离子的组合物。在优选的实施方案中，该组合物包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂，优选三苯甲基自由基和顺磁性金属离子。
本发明的又一个方面是用于动态核极化的、包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂优选三苯甲基自由基和任选顺磁性金属离子的组合物。在优选的实施方案中，该组合物包含用于动态核极化的有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂优选三苯甲基自由基和顺磁性金属离子。
本发明的又一个方面是包含有机胺或氨基化合物的经超极化羧酸盐的组合物，该组合物通过动态核极化获得。
本发明的又一个方面是包含用作MR成像剂的有机胺或氨基化合物的经超极化羧酸盐的组合物，该组合物通过动态核极化获得。
本发明的又一个方面是包含有机胺或氨基化合物的经超极化羧酸盐、DNP剂，优选三苯甲基自由基和任选顺磁性金属离子的组合物，该组合物通过动态核极化获得。在优选的实施方案中，该组合物包含有机胺或氨基化合物的经超极化羧酸盐、DNP剂优选三苯甲基自由基和顺磁性金属离子，该组合物通过动态核极化获得。
                        实施例
实施例1含13C1-丙酮酸钠、三苯甲基自由基和水的组合物的动态核极化(对照实例)
将128.3mg的13C1-丙酮酸钠溶解于244.1mg水中。加入在WO-A-98/39277的实施例7中描述制备的三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙基)苯并[1，2-d：4，5d′]双(1，3)二硫醇-4-基)甲基钠盐，生成于三苯甲基自由基中的15.2mM组合物。将该组合物置于探头帽上并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K下，微波辐照(93.950GHz)下，使组合物极化。2.5小时后，停止极化。
通过固态13C-NMR测定固态极化。固态13C-NMR检测由采用低偏转角的简易脉冲获得NMR序列(pulse-acquire NMR sequence)组成。比较动态核极化的样品的信号强度与热力极化的样品(即启动动态核极化程序前的室温下样品的自然极化)的信号强度。从热力极化样品与动态核极化样品的信号强度的比率计算极化。结果，组合物的固态极化与组合物的热力极化相同，意味着存在于组合物中的13C核的核的自旋极化未能被DNP极化加强。
实施例2含13C1-丙酮酸钠、三苯甲基自由基、玻璃形成剂和水的组合物的动态核极化(对照实例)
将128.3mg的13C1-丙酮酸钠溶解于244.1mg水中，并加入309.3mg丙三醇使总体积为540μl。加入11.2mg的实施例1的三苯甲基自由基以生成于三苯甲基自由基中的15.2mM组合物。组合物含14.6％(w/w)的丙酮酸盐，这是可得到的最浓缩的丙酮酸钠混合物。将一份102.4μl的组合物置于探头帽中并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K下，微波辐照(93.950GHz)下，使组合物极化。2.5小时后，停止极化，并将固体组合物溶解于每升含100mg EDTA的水中。
通过液态13C-NMR于400MHz测定液态极化为9.6％。因此，通过加入玻璃形成剂，存在于组合物中的13C核的核的自旋极化可被DNP极化加强。
实施例3含TRIS-13C1-丙酮酸盐、三苯甲基自由基和水的组合物的动态核极化
将78.4mg(0.65mmol)TRIS与64.3mg13C1-丙酮酸(纯度90％，0.65mmol)在51.3mg水中混合，形成澄清的160μl体积溶液。加入实施例1的三苯甲基自由基，以产生于三苯甲基自由基中的15.5mM的组合物。该组合物含30％(w/w)的丙酮酸盐。将一份136.6mg的组合物置于探头帽中并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.950GHz)下，使组合物极化。2.5小时后，停止极化，并将固体组合物溶解于每升含100mg EDTA的水中。
通过液态13C-NMR于400MHz测定液态极化为10.5％。因此，通过制备TRIS-13C1-丙酮酸盐，存在于组合物中的13C核的核的自旋极化可被DNP极化加强至约与实施例2组合物中的相同的水平。然而，实施例3的组合物包含多于双倍量的丙酮酸盐，并且如果意欲将丙酮酸盐用作MR成像剂，不可加入在给予患者前必须去除的玻璃形成剂。
实施例4 1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]triazinane-2，4，6-三酮(10)的Gd-螯合物的合成
4a)2-甲基-4-硝基苯基异氰酸酯(1)的制备
将2-甲基-4-硝基苯胺(35.0g，230mmol)溶解于乙酸乙酯(400ml)中并冷却至0℃。用30分钟逐滴加入碳酰氯(180ml，20％于甲苯中)，随后立即白色盐沉淀。在末次加液后，使温度缓慢回升至室温，然后将反应混合物回流(～100℃)。回流2小时30分钟，此后在温度降至80℃之前蒸馏出200ml溶剂，并逐滴加入碳酰氯(140ml，20％于甲苯中)。在末次加液后，使反应溶液回流3小时，使之冷却至室温并浓缩至干。将棕色/黄色原料溶解于乙醚(250ml)中，过滤和浓缩，得到棕色粉末(36g，88％)。
4b)1，3，5-三-(4-硝基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷(triazinane)-2，4，6-三酮(2)的制备
向于250ml烧瓶中的2-甲基-4-硝基苯基异氰酸酯(36.0g)中加入DMSO(50ml)，且用经塑料夹固定就位的玻璃塞将该烧瓶密封。立即该烧瓶放入加热至85℃的油浴中，并将深棕色反应溶液加热16小时30分钟。移开油浴并使反应溶液冷却至室温，然后将其倾入水(800ml)中，超声处理，并滤去沉淀。将乙醇(500ml)加至滤饼并回流4小时，然后使之冷却至室温，滤掉产物得到灰白色粉末(28.1g，78％)。
4c)1，3，5-三-(4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(3)的制备
将1，3，5-三-(4-硝基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(2.86g，5.4mmol)溶解于THF(70ml)中。加入HCl(4.5ml，6M)、水(18ml)和Pd/C(0.6g，10％)。将反应容器抽真空并在3个周期中填充氩气，随后在帕尔氢化装置(Parr hydrogenation apparatus)(60psi)上氢化。2小时后，用隔膜泵抽去过量的氢并滤去Pd/C(10％)。将澄清的反应溶液浓缩直至再没有残留THF，用NaHCO3(～3.7g)将pH调节至7。用乙酸乙酯(3×100ml)提取水相，并用MgSO4干燥合并的有机相，过滤和浓缩得到棕色粉末。将该粗产物用甲醇再结晶得到灰白色粉末样产物(1.9g，80％)。
Figure S2006800464616D00251
4d)1，3，5-三-(4-甲酰氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(4)的制备
将甲酸(175ml)放进冰冷的500ml圆底烧瓶中。加入乙酐(15ml，0.16mol)且将该黄色溶液于0℃、氩气氛下搅拌1小时。将三胺3(8.7g，0.020mol)加至该溶液中并移去冰浴。室温、氩气氛下搅拌30分钟后，HPLC显示完全反应。真空下去除溶剂，将棕色、粘性残余物悬浮于H2O并滤去。然后用H2O彻底清洗保证去除所有的酸。产物为淡棕色固体(10.2g，99％)。
Figure S2006800464616D00261
4e)1，3，5-三-(N-甲酰-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(5)的制备
将所有玻璃器皿在烤箱中干燥并将DMF干燥通过分子筛。将Li(Me3Si)2N(116ml，0.116mol，1M于正己烷中)加至500ml圆底烧瓶中的4(10.2g，0.0193mol)的DMF-溶液(115ml)。将由浅棕色溶液转变为砖红色浆液的反应混合物于氩气氛下搅拌1小时。加入碘甲烷(12.2ml，0.196mol)，将反应混合物搅拌2小时或直至HPLC上显示完全甲基化。然后在旋转蒸发器上去除正己烷，并将残余物倾入剧烈搅拌下的NaH2PO4(1300ml，100mM)溶液中。滤出形成的沉淀5为浅白色固体(6.7g，60％)。
Figure S2006800464616D00263
4f)1，3，5-三-(N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(6)的制备
将二氧杂环己烷(52ml)、HCl(52ml，6M)和5(6.5g，11mmol)于250ml圆底烧瓶中混合以形成浅白色浆液。于氩气氛下将该反应混合物加热至回流30分钟。将此时的黄色溶液冷却至室温，然后在旋转蒸发器上去除溶剂。然后将橙色残余物溶解于500ml H2O中，并于剧烈搅拌下用NaHCO3(饱和)溶液中和。滤去形成的沉淀并用H2O洗涤数次，得到苍白色固体(4.7g，84％)。
Figure S2006800464616D00271
4g)1，3，5-三-(N-氯乙酰-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(7)的制备
在100ml圆底烧瓶中，将6(4.6g，9.5mmol)溶解于DMA(15ml)并于0℃、搅拌下加入氯乙酰氯(2.6ml，33mmol)。于RT、氩气氛下搅拌反应物30分钟，或直至HPLC上显示完全氯乙酰化。然后将该浆液倾入在剧烈机械搅拌下的、有水(500ml)的大口烧杯中。滤去形成的沉淀，并在0.3mbar下真空干燥(6.3g)。将浅白色固体溶解于70ml乙腈中，并在剧烈机械搅拌下倾入500ml H2O中。滤出形成的沉淀并将其置于干燥器中干燥(6.1g，89％)。
Figure S2006800464616D00281
4h)1，3，5-三-(N-(DO3A叔丁酯-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(8)的制备
在50ml圆底烧瓶中，将7(0.50g，0.70mmol)与DO3A叔丁酯(2.5g，4.2mmol)、二异丙基乙基胺(910μl，5.2mmol)和乙腈(15ml)悬浮在一起。经超声处理后，于75℃、氩气氛下搅拌该反应混合物直至LC/MS显示完全偶合。然后在旋转蒸发器上去除溶剂，粗产物(2.9g)用于后续反应。
Figure S2006800464616D00291
4i)1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮(9)的制备
将粗产物8(1.9g)溶解于TFA(130ml)和CH2Cl2(130ml)中并于50℃、氩气氛下搅拌。搅拌溶液1小时或直至LC/MS显示完全去保护。然后在旋转蒸发器上去除溶剂，残余物于真空下干燥过夜。然后将粗产物(2.4g)用于最后步骤。
Figure S2006800464616D00292
4j)1，3，5-三-(N-(DO3A-乙酰氨基)-N-甲基-4-氨基-2-甲基-苯基)-[1，3，5]三嗪烷-2，4，6-三酮的钆螯合物(10)的制备
搅拌下，将粗产物9(2.4g)溶解于水中并加入Gd(OAc)3(1.4g，4.2mmol)。然后抽真空(0.3mbar)，用LC/MS连续监测该反应。当检测到完全络合时，则真空去除溶剂。然后用制备型HPLC纯化3.1g粗产物(410mg，42％自7)。
实施例5三苯甲基自由基三-(8-羧基-2，2，6，6-(四(甲氧基乙基)苯并-[1，2-4，5′]双-(1，3)二硫醇-4-基)甲基钠盐的合成
于氩气氛下，将依据WO-A1-98/39277的实施例7已经合成的10g(70mmol)的三-(8-羧基-2，2，6，6-(四(羟基乙基)苯并-[1，2-4，5′]-双-(1，3)-二硫醇-4-基)甲基钠盐悬浮于280ml二甲基乙酰胺中。先后加入氢化钠(2.75g)和碘甲烷(5.2ml)，使该稍微放热的反应进行1小时，于34℃水浴中进行60分钟。以每一化合物相同的量重复两次加入氢化钠和碘甲烷，末次加料后，于室温下搅拌该混合物68小时，然后将其倾入500ml水中。用40ml 1M NaOH(aq)调节pH达pH＞13，于环境温度下搅拌该混合物15小时，以水解形成的甲酯。然后用50ml 2MHCl(aq)使该混合物酸化达pH约为2，并用乙酸乙酯(500ml和2×200ml)提取3次。合并的有机相经Na2SO4干燥，然后蒸发至干。然后用制备型HPLC、用乙腈/水作为洗脱剂纯化粗产物(24g)。蒸发收集的馏份以去除乙腈。用乙酸乙酯提取残余的水相，并将有机相经Na2SO4干燥，然后蒸发至干。将水(200ml)加至残余物中，用0.1M NaOH(aq)小心调节pH至7，残余物在该过程中缓慢溶解，中和后，将水溶液进行冷冻干燥。
实施例6含13C1-丙酮酸、三苯甲基自由基、Gd-螯合物和水的组合物的动态核极化(对照实例)
通过将实施例5的三苯甲基自由基溶解于13C1-丙酮酸中，制备于三苯甲基自由基中的43mg，18.9mM的组合物。加入实施例4的Gd-螯合物以产生于实施例4的Gd-螯合物中的0.63mM组合物，即于Gd3+中的1.89mM的组合物。将组合物混匀，置于探头帽上并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.950GHz)下，使组合物极化。2小时后，停止极化，采用依据WO-A-02/37132的溶解装置将组合物溶解于氢氧化钠和TRIS水溶液中，以提供经超极化13C1-丙酮酸钠盐的中性溶液，其于40mM TRIS缓冲液中的丙酮酸盐总浓度约为78mM。
通过液态13C-NMR于400MHz测定的液态极化为44.7％。
实施例7含TRIS-13C1-丙酮酸盐、三苯甲基自由基、Gd-螯合物和水的组合物的动态核极化
用水将11.7mg 10mM实施例4的Gd-螯合物溶液稀释至40.1mg总重量。向该溶液中加入79.0mg(0.65mmol)TRIS和57.6mg13C1-丙酮酸(90％纯度，0.65mmol)。搅动该混合物直至得到160μl体积的澄清溶液。将3.47mg的实施例1的三苯甲基自由基溶解于该溶液中，生成三苯甲基自由基中的15mM组合物。该组合物含29％(w/w)丙酮酸盐，且是于实施例4的Gd-螯合物中的0.7mM组合物，即于Gd3+中的2.1mM组合物。将一份137.4mg的组合物置于探头帽中并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.950GHz)下，使组合物极化。2.5小时后，停止极化，并将固体组合物溶解于每升含100mg EDTA的水中。
通过液态13C-NMR于400MHz测定的液态极化为36.9％。得到36.9％的液态极化。因此，通过极化TRIS-丙酮酸盐而不是丙酮酸，存在于组合物中的13C核的核的自旋极化可被DNP极化增强到在丙酮酸中得到的极化的约4/5。然而，由于可避免在纯丙酮酸中的高度酸性条件，并且也使丙酮酸与Gd-螯合物和/或三苯甲基自由基反应形成组合物中不需要的副产物而不再成为问题，更宽泛范围的Gd-螯合物和三苯甲基自由基可用于要极化的组合物中。
实施例8含TRIS-13C1-D2-反丁烯二酸盐、三苯甲基自由基和水的组合物的动态核极化
通过将依据WO-A-97/09633中的实施例29合成的三苯甲基自由基三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基苯并[1，2-d：4，5-d′]-双-(1，3-二硫醇-4-基)甲基钠盐溶解于0.21mmol 13C1-D2-反丁烯二酸和溶解于17μl水中的0.24mmol TRIS的混合物中，制备三苯甲基自由基中的10mM的组合物。通过旋涡、光加热和超声联合处理，使该组合物混匀，将组合物置于探头帽并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.890GHz)下，使组合物极化。3小时后，停止极化。
通过如实施例1中所述进行的固态13C-NMR，测定固态极化为220(积分/mmol-13C)。
实施例9含TRIS-13C1-D2-反丁烯二酸盐、三苯甲基自由基、Gd-螯合物和水的组合物的动态核极化
在另一个实验中，通过将依据WO-A-97/09633中的实施例29合成的三苯甲基自由基三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基苯并[1，2-d：4，5-d′]-双-(1，3-二硫醇-4-基)甲基钠盐溶解于0.21mmol 13C1-D2-反丁烯二酸和溶解于17μl水中的0.24mmol TRIS的混合物中，制备三苯甲基自由基中的10mM组合物。再有，加入实施例4的Gd-螯合物以生成于Gd-螯合物中的0.7mM组合物，即于Gd3+中的2.1mM的组合物。通过旋涡、光加热和超声联合处理，使该组合物混匀，将组合物置于探头帽并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.890GHz)下，使组合物极化。3小时后，停止极化。
通过如实施例1b中所述的固态13C-NMR，测定固态极化为630(积分/mmol-13C)。
实施例10a经超极化的TRIS-13C1-反丁烯二酸盐溶液的生成
采用依据WO-A-02/37132的溶解装置将实施例8的经极化固体组合物溶解于氢氧化钠水溶液，以提供经超极化的TRIS-13C1-反丁烯二酸盐的中性溶液，其于40mM TRIS缓冲液中的反丁烯二酸盐总浓度约为40mM。
通过液态13C-NMR，于400MHz测定液态极化为9％。
实施例10b经超极化的TRIS-13C1-反丁烯二酸盐溶液的生成
采用依据WO-A-02/37132的溶解装置将实施例9的极化的固体组合物溶解于氢氧化钠水溶液，以提供经超极化的TRIS-13C1-反丁烯二酸盐的中性溶液，其于40mM TRIS缓冲液中的反丁烯二酸盐总浓度约为40mM。
通过液态13C-NMR于400MHz测定液态极化为23％。
实施例11含TRIS-13C1-乙酸盐、三苯甲基自由基和水的组合物的动态核极化
通过将依据WO-A-97/09633中的实施例29合成的三苯甲基自由基三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基苯并[1，2-d：4，5-d′]-双-(1，3-二硫醇-4-基)甲基钠盐溶解于0.199mmol TRIS-13C1-乙酸盐和13μl水的混合物中，制备三苯甲基自由基中的10mM的组合物。通过旋涡、光加热和超声联合处理，使该组合物混匀，将组合物置于探头帽并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.890GHz)下，使组合物极化。3小时后，停止极化。
通过如实施例1中所述进行固态13C-NMR，测定固态极化为195(积分/mmol-13C)。
实施例12含TRIS-13C1-乙酸盐、三苯甲基自由基、Gd-螯合物和水的组合物的动态核极化
通过将依据WO-A-97/09633中的实施例29合成的三苯甲基自由基三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基苯并[1，2-d：4，5-d′]-双-(1，3-二硫醇-4-基)甲基钠盐溶解于0.199mmol TRIS-13C1-乙酸盐和13μl水的混合物中，制备三苯甲基自由基中的10mM的组合物。再有，加入实施例4的Gd-螯合物以生成于Gd-螯合物中的0.2mM组合物，即于Gd3+中的0.6mM的组合物。通过旋涡、光加热和超声联合处理，使该组合物混匀，将组合物置于探头帽并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.890GHz)下，使组合物极化。3小时后，停止极化。
通过如实施例1中所述的固态13C-NMR，测定固态极化为450(积分/mmol-13C)。
实施例13含TRIS-13C1-谷氨酸盐、三苯甲基自由基、Gd-螯合物和水的组合物的动态核极化
通过将依据WO-A-97/09633中的实施例29合成的三苯甲基自由基三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基苯并[1，2-d：4，5-d′]-双-(1，3-二硫醇-4-基)甲基钠盐溶解于0.06mmol13C1-谷氨酸盐、74μmol TRIS和7μl水的混合物中，制备三苯甲基自由基中的16mM的组合物。再有，加入实施例4的Gd-螯合物以生成Gd-螯合物中的0.3mM组合物，即于Gd3+中的0.9mM的组合物。通过旋涡、光加热和超声联合处理，使该组合物混匀，将组合物置于探头帽并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.890GHz)下，使组合物极化。3小时后，停止极化，采用依据WO-A-02/37132的溶解装置将组合物溶解于水溶液中，以提供总浓度约为10mM的超极化的TRIS-13C-谷氨酸盐中性溶液。
通过液态13C-NMR于400MHz测定的液态极化为25％。
实施例14含TRIS-13C1-天冬氨酸盐、三苯甲基自由基、Gd-螯合物和水的组合物的动态核极化
通过将依据WO-A-97/09633中的实施例29合成的三苯甲基自由基三-(8-羧基-2，2，6，6-四(羟基乙氧基)甲基苯并[1，2-d：4，5-d′]-双-(1，3-二硫醇-4-基)甲基钠盐溶解于0.058mmol13C1-天冬氨酸盐、72μmolTRIS和7μl水的混合物中，制备三苯甲基自由基中的16mM的组合物。再有，加入实施例4的Gd-螯合物以生成于Gd-螯合物中的0.3mM组合物，即于Gd3+中的0.9mM的组合物。通过旋涡、光加热和超声联合处理，使该组合物混匀，将组合物置于探头帽并插入DNP极化器中。于DNP条件下，于3.35T磁场中1.2K，微波辐照(93.890GHz)下，使组合物极化。3小时后，停止极化，采用依据WO-A-02/37132的溶解装置将组合物溶解于水溶液中，以提供总浓度约为10mM的超极化的TRIS-13C1-天冬氨酸盐中性溶液。
通过液态13C-NMR于400MHz测定的液态极化为16％。

Claims (18)

1.包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂和任选的顺磁性金属离子的组合物，其中，所述羧酸盐是内源性的并且是富含13C的，所述有机胺或氨基化合物是生理学上可耐受的氨基醇且分子量为30-300g/mol，所述有机胺或氨基化合物的羧酸盐是羧酸与有机胺或氨基化合物的盐。
2.依据权利要求1的组合物，其用于动态核极化。
3.依据权利要求1或2的组合物，其中所述组合物是液体组合物。
4.依据权利要求1或2的组合物，其中所述DNP剂是稳定的基于氧、基于硫或基于碳的三苯甲基自由基。
5.依据权利要求4的组合物，其中所述三苯甲基自由基是式(1)的基团
Figure FSB00000931383200011
其中
M表示氢或一个当量的阳离子；和
R1相同或不同，表示直链或支链C1-C6-烷基、C1-C6-羟基烷基或基团-(CH2)n-X-R2，其中n是1、2或3；
X是O或S和R2是直链或支链C1-C4-烷基。
6.依据权利要求1或2的组合物，其中所述组合物包含顺磁性金属离子。
7.依据权利要求6的组合物，其中所述顺磁性金属离子可溶于羧酸盐。
8.依据权利要求1或2的组合物，其中所述组合物是溶解于溶剂或溶剂混合物中的组合物。
9.依据权利要求1或2的组合物，其中所述羧酸盐是在人或非人动物体内代谢过程中起作用的内源性羧酸盐。
10.依据权利要求1或2的组合物，其中所述羧酸盐是在羧基-C-原子、羰基-C-原子或季C-原子处富含13C的化合物。
11.依据权利要求1或2的组合物，其中所述组合物包含原子序号58-70的镧系金属或原子序号21-29、42或44的过渡金属的顺磁性金属离子。
12.依据权利要求6的组合物，其中所述顺磁性金属离子可溶于溶解于溶剂或溶剂混合物中的羧酸盐中。
13.包含有机胺或氨基化合物的超极化羧酸盐的组合物，所述组合物通过动态核极化获得，其中，所述羧酸盐是内源性的并且是富含13C的，所述有机胺或氨基化合物是生理学上可耐受的氨基醇且分子量为30-300g/mol，所述有机胺或氨基化合物的超极化羧酸盐是羧酸与有机胺或氨基化合物的盐，所述组合物通过对权利要求1所述组合物实施动态核极化获得。
14.权利要求13的组合物，其用作MR成像剂。
15.用于产生有机胺或氨基化合物的固体超极化羧酸盐的方法，所述方法包括制备包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂以及任选的顺磁性金属离子的组合物，并对所述组合物实施动态核极化，其中，所述羧酸盐是内源性的并且是富含13C的，所述有机胺或氨基化合物是生理学上可耐受的氨基醇且分子量为30-300g/mol，所述有机胺或氨基化合物的羧酸盐是羧酸与有机胺或氨基化合物的盐。
16.用于产生有机胺或氨基化合物的液体超极化羧酸盐的方法，所述方法包括制备包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂以及任选的顺磁性金属离子的组合物，对所述组合物实施动态核极化，使所述组合物液化和任选从液化的组合物中去除DNP剂和/或顺磁性金属离子，其中，所述羧酸盐是内源性的并且是富含13C的，所述有机胺或氨基化合物是生理学上可耐受的氨基醇且分子量为30-300g/mol，所述有机胺或氨基化合物的羧酸盐是羧酸与有机胺或氨基化合物的盐。
17.依据权利要求15或16的方法，其中所述DNP剂是三苯甲基自由基。
18.用于产生有机胺或氨基化合物的液体超极化羧酸盐的方法，所述方法包括制备包含有机胺或氨基化合物的羧酸盐、DNP剂以及任选的顺磁性金属离子的组合物，对所述组合物实施动态核极化，通过溶解使所述组合物液化和任选从液化的组合物中去除DNP剂和/或顺磁性金属离子，其中，所述羧酸盐是内源性的并且是富含13C的，所述有机胺或氨基化合物是生理学上可耐受的氨基醇且分子量为30-300g/mol，所述有机胺或氨基化合物的羧酸盐是羧酸与有机胺或氨基化合物的盐。
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