CN101354327B - 测量糖化血色素的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

测量糖化血色素的系统和方法。本发明公开了用于分馏样品成份的系统和方法。一种分馏样品成份的方法包括：在毛细通道内建立溶液密度梯度(102)，将样品施加到毛细通道(104)，以及离心分离毛细通道内的样品(106)，由此通过密度来分离样品的成份(108)。

Description

测量糖化血色素的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请是于2005年10月28日提交的题为“SYSTEM ANDMETHODS FOR MEASURING GLYCATED HEMOGLOBIN”的共同在审的美国专利申请No.11/261,741的部分连续申请，该专利申请引用结合于此。
背景技术
红血球(RBC)或红细胞负责将氧传输遍布身体。具体而言，为健康红血球一部分的血色素是一种含铁的呼吸大分子，其功能是以其氧化形式将氧从肺部传送到组织位置。如所知，红血球具有能自由渗透葡萄糖的隔膜。当葡萄糖或其他糖基(sugar moiety)进入红血球时，会形成糖化血色素(GHb)。糖化血色素是指由糖基特别是葡萄糖的共价结合而形成的各种血色素衍生物。形成的糖化血色素的数量与血液中葡萄糖浓度以及暴露于葡萄糖的持续时间有关。糖化血色素的常用指数已知为HbA1c，HbA1c与总血色素的比例已知为％HbA1c。
一般而言，红血球寿命约为120天，血色素糖化的量以细胞的120天寿命为函数而变化。由于葡萄糖与血色素分子的反应缓慢且在体内通常是不可逆的，因此糖化血色素的量(HbA1c)传统上被视为过去3-4个月的血液葡萄糖浓度的精确指数。因此，糖尿病患者被建议每3-4个月检查其HbA1c值。例如，美国糖尿病协会(ADA)推荐每年进行约2至4次HbA1c测试，并进一步推荐低于7％的HbA1c水平。
通过简单的吸收或反射测量可以确定总血色素。典型地，铁被铁氰化钾还原产生高铁血红蛋白，在565nm测量该高铁血红蛋白。可以通过本领域中已知的许多方法来确定糖化血色素的数量，例如通过竞争性或免疫化验。在后一情形中，抗原在固相上不溶解，且标记抗体在存在这些抗原时被培育。抗体-抗原络合物可以通过光学或荧光方法探测。可以对约10μl的血液实施该方法。然而，该方法是使用从血液收集的随机细胞样品来实施的，因此提供了在特定时间点的平均葡萄糖调节历史的单个数据。测量平均值可能会朝较年轻的细胞倾斜，因为较年轻的细胞更为主导。然而与较年老的细胞相比，较年轻的细胞由于短暂暴露于葡萄糖而使得其血色素糖化数量的测量平均值经常被低估。因此，每3-4个月测试糖化血色素无法精确地反映某些糖尿病患者的葡萄糖调节的质量。例如，糖尿病患者可能系统性地欠调节其葡萄糖水平1-3个月，而随后在测试之前的最近30天过调节其葡萄糖水平。由于最新的红细胞对HbA1c测试的巨大影响，平均糖化血色素可能看上去在正常范围内，因此在葡萄糖调节质量上误导患者和护理者。因此，为从业者或受验者提供有关更短时间阶段内患者葡萄糖水平的更详细信息，以及提供有关依照葡萄糖调节的更精确的信息，这将是有益的。
附图说明
参考下述详细描述和图示，本公开的实施例的特征和优点将显而易见。为了简化，具有先前描述的功能的参考数字或特征在其出现的其他图示中不一定被描述。
图1为描述通常涉及细胞年龄的HbA1c水平的曲线图。
图2为描述使用基于年龄的细胞分离来测量HbA1c水平的常用方法的实施例的流程图。
图3为微流体试样(coupon)的实施例的示意性透视图。
图4为容纳通过挡板分离的第一溶液和第二溶液的毛细通道的实施例的示意图。
图5为微流体试样的另一实施例的示意性透视图。
图6为通过冻结和解冻溶液在毛细通道的实施例中建立溶液密度梯度的示意图。
图7为微流体试样的又一实施例的示意性透视图。
图8为基本上垂直取向的两个毛细通道的实施例的示意图。
图9为将样品添加到溶液密度梯度，随后通过离心作用分离样品成份的示意性描述。
图10为分离的样品成份的溶解(lysis)的示意性描述。
图11为产生电场用于细胞溶解的简单电路的电路图。
图12为结合一变压器以产生电场用于细胞溶解的电路的电路图。
图13为微流体试样的再一实施例的示意性描述，其中该试样包括滑动环用于施加电信号至该试样上的电极。
图14为锭子(spindle)的实施例的示意性透视图和微流体试样的实施例的示意性俯视图，其中该锭子包括滑动环用于通过该锭子施加电信号至该试样上的电极。
图15为通过浮置于试样上方和下方的固定电极来施加电场至微流体试样的系统的实施例的示意性描述。
图16为系统的另一实施例的示意图。
图17为系统的再一实施例的示意图。
图18为描述分馏样品成份的方法的实施例的流程图。
具体实施方式
应理解，本文披露的实施例不限于此处所讨论的具体过程和材料，且可在一定程度上变化。还应理解，本文中使用的术语是出于描述具体实施例的目的，不是旨在限制，本发明的范围由所附权利要求及其等同特征限定。
本文中将使用下述术语。
单数形式的“一”、“一个”及“该”包括复数形式的指示物，除非上下文明确表示不包含复数形式。
如此处使用的，术语“微流体试样”或“试样”是指用于离心分离和/或操纵一种或多种微流体的装置，通常是出于在离心测试状态中测试该流体或液体的目的。合适的微流体试样包括但不限于由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚碳酸脂等形成的盘状装置。然而不限于此，这些盘在外观上可以类似于例如紧凑光盘(CD)的公知光盘。还应理解，这些材料可选地包括涂层以最小化细胞的粘附和聚集。此处使用的涂层可包括但不限于聚乙二醇(PEG)、有机硅聚合物和聚二甲基硅氧烷(PDMS)，以及有机/硅酮共聚物(PEG-硅烷)。这些涂层还可包括去污剂和表面活性剂，这些去污剂和表面活性剂存在的数量足以防止粘附和聚集但不足以引起细胞溶解，除非在期望如此的场合。
如此处使用的，术语“阀门”包括无源阀门和有源阀门。有源阀门包括例如石蜡(paraffin or wax)的某种类型光学激活材料的机械阀闸、热激活阀门、机械阀门等；而无源阀门是没有移动部件的静态阀门，主要是由于其几何配置和/或尺寸而用做流体阀门，例如，其中流体动力学和/或流体上的力迫使流体通过微通道的微流体阀门等。
如此处使用的，术语“微流体的”及“微流体”应理解为是指在系统中被操纵的流体，这些系统将流体限制在至少一种尺度小于约1mm的几何通道、通路、贮存器及其他腔体中。类似地，术语“微流体通道”或“微通道”应理解为是指至少一种尺度小于约1mm的通道。
如此处使用的，术语“将...离心分离”及其相关术语“离心分离”和“被离心分离的”应理解为是指液体经历旋转存储有该液体的贮存器而引起的离心力的过程。尽管术语“离心分离”通常用于表示液体的两种或更多种成份由于离心力而被分离的过程，但是该术语的使用不限于该液体成份的任意特定分离程度。因此，液体可以被离心分离，即使当该液体尚未呈现液体成份的看得见的分离。
当提到红细胞的“分年龄组(age specific group)”时，应理解，一分年龄组内的细胞并不全部必须满足该年龄分布(age profile)，因为在一分年龄组内通常有一些细胞不符合该年龄分布。这至少部分是由于通过年龄分离细胞的通常不精确方法所引起。就可以实施完美的年龄分离这一方面而言，这种类型的分离当然落在本发明的范围之内。然而，出于实用的目的，完美的分离是不可能的。因此，术语“分年龄组”意味着与取自随机样品的红细胞样品相比，该红细胞组在特定年龄组内统计学上包括更多的细胞。
当提到诸如“液体”的流体时，应理解，该液体的所有成份不一定都是液体形式。例如，血液被视为液体，即使血液具有悬浮于其中的固态细胞成份。还应理解，本文使用的术语“液体”还包括所有成份都是液体形式的情形。
依据本发明的实施例，糖化血色素的测量方法包括步骤：建立红细胞的多个分年龄组，以及测量至少一个所述组的HbA1c水平。在另一实施例中，糖化血色素的测量系统包括：配置成将红细胞分离成多个分年龄组的分离装置，以及配置成测量至少一个这些组的HbA1c水平的测量装置。在这些实施例中，通过另外确定总血色素也可以计算％HbA1c。本文所披露的方法和系统的实施例提供了解决与测量3-4个月时间段的平均糖化血色素水平相关联的问题的方案。
从图1可以看出，约50％的HbA1c是由年龄为30天以下的红细胞提供，约25％的HbA1c是由年龄为30至60天的红细胞提供，约25％的HbA1c是由年龄为60至120天的红细胞提供。因此，在测量典型血液样品的HbA1c水平时，获得总体HbA1c指数的倾斜图像。
因此依据本公开，已经意识到，期望获得有关红细胞分年龄组的HbA1c水平的信息，而不是获得几个月时间段内的平均HbA1c水平的信息。换言之，除了获得通常与血液样品中未糖化血色素有关的HbA1c值之外，更有益的是从未糖化血色素得知与红细胞的离散年龄组相关的血液样品的HbA1c水平，提供个体的血糖历史的更精确的图像。在一个特定实施例中，使用一种容易使用的且可以置于家中或医生办公室的小且便携的装置来实施该分析，这也是有益的。还期望这种装置能够使用最小体积的血液例如小于50μl(约1至2滴)来工作。依据本公开的各个方面，可以实现一个或多个这些期望特征。
已经意识到，在测量血液中HbA1c水平之前基于预定物理性能来分离细胞，这可以提供在红细胞的完整寿命内有关患者依从的更精确图像。换言之，由于红细胞样品包含年轻和年老的血细胞，且由于年轻血细胞与年老血细胞相比对HbA1c水平的贡献更大，通过依据细胞的年龄沿一梯度分离这些细胞且随后进行一个或多个HbA1c分析，则可以获得3-4个月时间段的HbA1c水平的更精确且时间敏感的图像。
可以使用许多技术来实施红细胞根据年龄的分离。一种技术为逆流离心分离(淘析)，这种技术将直径或尺寸较小的粒子与直径或尺寸较大的粒子分离。对于红细胞的情形，已知尺寸支配着沉淀和流动之间的平衡。因此，尽管年老的红细胞比年轻的红细胞小且致密，年老的红细胞在离心分离期间首先洗提。其他技术可以依赖于细胞年龄的其他化学或物理指示器，包括隔膜蛋白质比例以及流变性能。这些在后的因素会对细胞的电性能改变有贡献。具体而言，电不透明度(射频阻抗与直流阻抗的比例)差异也与红细胞年龄有关。鉴于此，细胞的介电性能也与其年龄相关联，这意味着细胞可以基于其不同的介电性能而被微观分离。包括使用显微镜在内的分离细胞的其他微观手段可以依赖于细胞密度和/或机械/流变性能，例如弹性和形变度。具体而言，微通道装置可以用于基于红细胞的年龄来分离红细胞群。因此，存在许多基于年龄来分离红细胞的方法。这些分离可以依据本公开的方面出于确定HbA1c水平的目的基于细胞年龄来实施。
此外，应理解，需要采取预防措施来最小化会导致细胞应力的条件，因为细胞应力会降低分离的效率。这些预防措施包括但不限于在缓冲剂中使用诸如肝磷脂或EDTA的抗凝结剂、避免过大的向心力、避免过大的温度偏差等等。
说明本公开的选定方面的一般方案示于图2，其中血液样品首先基于年龄被分离，例如从年轻到年老的梯度或者相反。可以通过统计学上在年龄方面可能比较接近的细胞分组(基于尺寸、密度、介电响应等中的一个或多个)，由此定义得到的细胞梯度。随后可以分别评估各组的HbA1c水平。组的数目可以仅为两组(例如，年龄为小于1至3个月的细胞与年龄大于1至3个月的细胞相比较)，以及从业者认为合适的许多不同的组(例如，3-10或更多的组)。备选地，在该年龄梯度任意一端或中间的一个或多个离散组可以被评估。
应注意，本文描述的细胞分离不一定导致细胞组的完全分离，因为细胞可以沿一梯度排列。此外，注意，当使用物理的细胞性能来近似年龄时，某些细胞会具有不符合用于沿该细胞梯度来排列细胞的物理性能的统计学分布。然而，这些标记趋于精确，因此细胞年龄不符合用于分离细胞的物理分布的异常变得不显著。此外，即使这种基于年龄的梯度不完全精确，只要与随机血液样品相比该梯度提供了年龄关联性更强的年龄相关的细胞排列，则本文披露的方法提供了用于测量HbA1c水平的优点。
如前文在美国专利公开No.US 2007/0099301(引用结合于此)中所描述，将感兴趣的红细胞依据其尺寸和/或密度的函数使用例如逆流离心分离来分离。然而，使用密度梯度离心分离为红细胞的分离提供了另外的优点。本公开因此提供了用于分馏样品成份的系统和方法，包括在毛细通道内建立溶液密度梯度，将样品应用于该毛细通道，离心分离该毛细通道中的样品，以及通过密度来分馏该样品的成份。该方法可以用于测量分年龄组的红细胞的HbA1c水平。
密度梯度离心分离可包括差速区带(rate zonal)离心分离或者等密度离心分离。差速区带离心分离典型地采用密度小于感兴趣样品的溶液梯度。这种情况下，可以通过对样品离心分离特定时间长度来实现样品的分馏。备选地，等密度离心分离利用具有宽的密度范围的溶液梯度，其密度范围典型地宽于感兴趣样品的密度范围。在等密度离心分离期间，细胞通常迁移到其等密度点，由此建立在平衡时基于细胞密度的分馏。
可以由溶剂和溶质的任何恰当组合来制备所期望的密度梯度溶液，只要得到的溶液与感兴趣的样品兼容即可。在所披露的方法的一个实施例中，用于分馏红细胞的密度梯度溶液可以使用例如碘克沙醇(OPTIPREPTM)或碘海醇(OMNIPAQUETM)等的密度梯度试剂而方便地制备。这些密度梯度试剂的溶液具有低的克分子渗透压浓度及合适的密度以用于分馏红细胞。
选定的密度梯度试剂可通过任一各种方便的方法形成期望的密度梯度。例如，可以使用一个或多个冻结-解冻周期来处理均匀溶液密度的溶液。一般而言，施加于溶液的冻结-解冻周期数目增大会导致在顶部的梯度明显较不致密。以这种方式产生的梯度可具有近似线性的密度梯度。备选地，也可以产生其他非线性密度分布。梯度形成的这种冻结-解冻周期方法可以产生完全可再现的密度梯度分布。
为了兼顾经济和效率，会期望利用需要小体积的溶剂和/或小体积的样品的方法，例如使用微流体装置的方法。微流体装置是利用小体积的流体例如小至几纳升的流体的装置。微流体装置可以使用各种通道、贮存器、腔体、和/或具有各种几何的阀门来制备、传输和/或分析样品。微流体装置可依靠各种力来传输流体通过该装置，包括注射、泵浦、施加的吸力、毛细作用、渗透作用、热膨胀和收缩、离心力等。在一种非限制性示例中，期望的微流体装置配置成通过离心分离机被旋转，且离心力被用于按预期传输期望的流体通过该微流体装置。
微流体试样可包括微制作以限定用于感兴趣的分析的各种期望通道、井和/或腔体的基板。微流体试样的通道和元件可以制作于基板表面上，且随后，盖附着在基板表面上。通常，所述盖是透明的，使得可以通过视觉观察或者通过光学探测和分析来确定流体传输经过该微流体装置。
示例性微流体试样10示意性示于图3。微流体试样10形式为盘的形式，且包括多个按径向图案取向的毛细通道12。微流体试样10配置成使得可以在一个或多个通道12内建立密度梯度。通道12的开口端(朝向旋转轴方向的端部)可以用一个或多个密封件14来密封。依据微流体试样10的一个方面，如图3所示，单个密封件14覆盖各个通道12的开口端。备选地，每个通道12可以用独立的帽或盖密封。密封件14可结合许多密封机制中的任意一种，包括一次或多次使用的插塞或帽，或者粘合盖。密封件14通常在将感兴趣的样品即将施加到通道12之前被除去。
每个毛细通道12的入口可以是单独或共享的贮存器。该贮存器可以配置成接收纯血液样品或其他含红细胞的样品、缓冲的血液样品、或者诸如缓冲液的非血液样品。可用于所披露方法的缓冲剂包括磷酸盐缓冲的盐水(PBS)、PBS的衍生物、以及其他生物兼容的缓冲制剂。
每个毛细通道12配置成有利于在通道12内形成溶液密度梯度。依据微流体试样10的一个方面，通道12配置成通过两种或多种单独溶液的离心分离来建立密度梯度。依据微流体试样10的另一方面，通道12配置成通过一个或多个冻结-解冻周期来建立密度梯度。然而应理解，在微流体试样10的至少一个通道12内建立溶液密度梯度的所有方法都是用于本公开的目的的合适方法。
在使用两种(或多种)具有不同密度的单独溶液来建立密度梯度的情形中，这些溶液通常保持隔离直至期望形成梯度。例如，这两种溶液可存在于毛细通道12内，但是可以通过阀门或临时挡板来保持隔离。
隔离两种不同溶液的挡板可以是物理地防止两种溶液混合的物理挡板。这种挡板应可以容易地去除而不干扰毛细通道12收纳密度梯度的能力。例如，该挡板可以是石蜡插塞的形式。石蜡插塞可以物理地隔离存在于毛细通道12内的两种或多种溶液，但是在该石蜡插塞熔化时，这些溶液随后混合，从而能形成期望的密度梯度。在挡板可以通过加热来去除的情形中，该挡板可以通过电阻加热、光学加热、超声加热、或者其他加热手段来熔化。
备选地，该挡板可以是毛细通道12的区域，其中通道12的壁经处理以排斥毛细通道12内的溶液。例如，在每种溶液为水溶液的情形中，该挡板区域可以被处理，使得通道12的壁是疏水的。这种“液体阀门”可以包含具有疏水性的区域，其与毛细尺寸、施加的离心分离力、以及流体表面张力中的一种或多种匹配从而提供阀门机制。也就是说，没有离心分离时，该两种或多种溶液仍是隔离的，而在进行离心分离时，“上”溶液(朝向旋转轴)藉由所施加的力而被迫通过疏水区域。
图4描述了一种示例性毛细挡板24。在配备有密封件18的毛细通道16中，具有第一密度的第一溶液20通过挡板24与具有第二密度的第二溶液22隔离，其中该挡板或者为物理挡板或者为疏水流体阀门。在通过加热或者离心分离来激励以打开挡板24之后，毛细通道16的进一步离心分离提供了一种呈现密度梯度的溶液26。
尽管也可以不进行离心分离来建立期望的梯度，该过程要花费显著更长的时间。作为内部控制，一种或多种用于制备密度梯度的这些溶液可以结合密度标准或控制。例如，在建立该密度梯度之前，在毛细通道12、16中可存在具有已知密度的有色小珠。
作为离心分离的备选，通过使溶液经历一个或多个冻结-解冻周期可建立密度梯度。尽管一个周期可能足以获得期望的梯度，某些实施例需要反复的冻结-解冻周期以获得该梯度。与使用的周期数目无关，但应理解，周期通常应受控制。由于毛细通道12、16优选地在冻结-解冻周期时基本上是直立的，微流体试样10将具有有限数目的毛细通道12、16，或者有限数目的现有通道12、16可被使用。此外，由于通常使用单一溶液，毛细通道12、16无需包括挡板24。这种微流体试样30的示例示于图5，其具有单个毛细通道32和密封件34。
在本实施例中，毛细通道32容纳具有恰当密度的单一溶液。使通道32在基本上垂直取向的情况下冻结和解冻试样30，该溶液可以建立密度梯度36，如图6所示。
可以使用各种合适的溶液中的任意一种例如蔗糖来建立合适的密度梯度。依据该方法的一个方面，使用了碘化造影剂的溶液。具体而言，造影剂碘克沙醇和/或碘海醇可用于制备期望的密度梯度，已知这些造影剂在分馏红细胞方面是有效的。此外，这些造影剂是水溶性的，化学稳定的，生物惰性的，低粘稠度，且呈现低的克分子渗透压浓度。
可以作为微流体试样10、30的制造和供应过程中的一部分来执行该必需的冻结-解冻周期，和/或可以在测试场合执行该冻结-解冻周期。
现在一起参考图7和8，尽管毛细通道42在冻结-解冻周期时应保持基本上直立，微流体试样40可以工程设计成使得一次可以利用试样40上的超过一个的毛细通道42。如图7所示，微流体试样40示为具有两个微流体通道42和一个密封件44。试样40和通道42应具有这样的几何和配置，使得当试样40直立和竖着被存储时可以在每个通道42内建立梯度，如图8所示。通常，这要求该两个以上的通道42之间被锐角分离，其中该角度足够小使得可以在每个通道42内建立梯度。可以使用多个通道42从而提供测试冗余，或者使用不同的溶液密度来测试细胞的不同部分。
应理解，当载入到离心分离机内时，试样10、30、40可以不对称地称重。在这些实施例中，试样10、30、40或者可结合装置以平衡试样10、30、40，或者允许手动平衡，使得离心分离仍可以无危险地实施。
通常，在一个或多个通道内建立密度梯度时，与用于建立该梯度的方法无关，对感兴趣的样品的分析可以按照类似的方式实施。然而，备选地，样品可以添加到毛细通道12、16、32、42，且溶液密度梯度可以与分馏样品成份同时形成。
现在参考图9，在已经建立梯度且密封件48已经移除之后，感兴趣的样品52可以施加到毛细通道50的顶部。由于红细胞的分离是一种平衡过程，血细胞可以沿该梯度的任一点被施加。然而，该梯度的一端(例如，顶部)通常是施加样品的方便位置。施加区域还可包括溢出贮存器(未示出)，从而防止过量的样品(例如，血液和细胞)施加到该梯度。在施加样品之后，梯度列经历附加的离心分离，直到获得样品成份的期望的分离梯度54。
在获得样品成份的密度梯度之后，样品可以经历各种分离后(post-separation)工序的任意一种。例如，样品成份可以被溶解用于进一步分析。图10描述了在已经实现样品分馏之后的细胞溶解步骤。该溶解被描述为发生在毛细通道50自身内，通过施加强电场到毛细通道50可以方便地实现这一点。已知在存在电场时，细胞会经历电穿孔，或者完全溶解，视所施加电场的强度和频率而定。细胞溶解需要至少约100KV/m的场梯度，然而该阈值至少部分地视信号频率及细胞悬浮于其中的介质而变化。直流场也可以用于样品的溶解，但是直流场会导致不期望的效应，例如介质和细胞中的电泳和焦耳加热。此外，当电极与介质绝缘时，直流或低频场能够或者不能够产生充分的场梯度，因为许多电压将降落在绝缘层两端。因此，有利地使用具有足够高频率的交流场以避免这些问题。
用于施加电场的电极的紧密间隔可以大幅减小所需的电极源电压的幅值。如果电极内建在微流体试样10、30、40自身内，使得电极置于毛细通道12、16、32、42、50的对立侧上，则得到的电极间隔近似等于或略微大于毛细通道宽度。由于红细胞通常直径约为7μm或8μm，毛细通道可以窄至约100μm而无堵塞的危险，特别是如果诸如肝磷脂或EDTA的抗凝血剂添加到溶液。电极间隔为100μm时，20Vrms的源电压将产生约200KV/m的场梯度，忽略了由于存在任何中间绝缘层而引起的电压降落。
此外，在通过光学问询(interrogation)来执行样品分析的情况下，可以使用诸如氧化铟锡(ITO)的光学透明材料来制造电极。
可以使用模拟振荡器(离散或集成的)或者数字函数发生器，或者其他方法来产生中频(300KHz至3MHz)信号以有效地溶解细胞。实施简单的振荡器电路是相对成本有效的。然而，数字电路可以提供增强的灵活性。此外，取决于振荡器架构，期望使用输出缓冲器级从而获得期望的电压电平。
与图11的电路60相似的简单电路能够使用现货供应的集成部件来产生高达若干MHz的20Vrms信号。如果要求更宽的电极间隔，则通过添加升压变压器可以获得显著更高的输出电压(例如，高达1000Vrms)，如图12的电路62所示。离散电子解决方案也可以提供宽范围的输出电压，但是这些电路与集成解决方案相比更难以实施。折衷的选择是使用例如自举(bootstrapped)运算放大器电路的混合方案，其尽管比完全集成设计更复杂，但是与离散实施相比设计和表征较简单。仔细选择元件，混合电路可以用于产生具有合理频率响应的高达几百伏特的输出信号。
期望将电极与介质绝缘以防止不希望的化学反应。然而应理解，某些电场浪费在这种绝缘边界上。电极和介质之间的绝缘挡板将表现为与挡板材料的介电常数成正比且与挡板厚度成反比的串联电容，且损耗在该挡板上的信号电压与挡板电容和信号频率均成反比。绝缘挡板因此应该尽可能薄以最大化挡板电容，最大化存在于介质中的电场，并允许低频信号更好地穿透该挡板。这种挡板包括氮化硅和碳化硅。在本文披露的实施例中，已经制作和使用了30-40nm的氮化硅绝缘挡板。
依据所披露方法的一个方面，有利地在离心分离样品的同时施加一溶解电场。为了将电压传送到旋转的微流体试样10、30、40上的电极，可以使用某种类型的滑动环和电刷系统。例如，如图13所描述，微流体试样66包括毛细通道(未示出)及关联的电极68。试样66包括与溶解电极68电连通且也与试样电刷72电连通的两个滑动环70。溶解电压可以施加到电刷72，即使在试样66旋转时，使得在毛细通道(未示出)形成施加的电场。使用任何滑动环系统，可能存在偶发的接触损耗，因此也可以与所披露的滑动环系统相结合地使用例如大的接触区域、导电油脂等的附加预防措施。
备选地，如图14所示，可以通过结合到锭子76的滑动环77来施加电场，其中微流体试样74在该锭子76上旋转。在图14，包含毛细通道(未示出)和关联电极75的微流体试样74示为具有互补锭子76。锭子76可以配置成包含位于锭子76内部的信号发生电路，使得直流功率传递经过滑动环77。当在锭子76上旋转试样74时，溶解信号可以通过位于试样74下侧上的固定接头78传递到试样74。锭子76可包含一个或多个对准特征79，从而保证锭子76上的试样接头80与试样74下侧上的固定接头78之间的恰当的电接触。锭子76内部存在足够大量的存储电容器和电源滤波，这可以帮助消除对减小由于锭子电刷81引起的噪声的需要。依据所披露的锭子76的另一方面，可以使用同心圆环接头(未示出)来替代固定的试样接头80，由此消除了对对准特征79的需要以保证电接触。
在又一配置中，如图15所示，可以使用浮置在微流体试样C上方和下方的固定电极A和B来施加电场，由此产生与试样C垂直的电场。然而，电极A和B与介质之间的间隙大，需要高的电压以在梯度介质内产生足够的场强度。
在样品被分离和溶解之后，样品成份可以通过溶解血细胞探测领域中公知的任意方法被探测。例如，如图16所示，含有梯度溶解血细胞的梯度毛细通道82包含沿着该梯度微通道的多个电阻器83，其中通过单独的阀门88来访问相关的探测器区域84和出口86。各种有源和无源阀门可以用于此目的，如上文所述及本领域所公知的。具体而言，使用具有较低熔点的石蜡插塞可以用于在至少部分移除该插塞时形成至探测器区域84的入口。在本实施例中，电阻器83可以被加热以形成气泡，这些气泡用于至少部分隔离该溶解血细胞组，且还提供原动力使溶解血细胞移动经过阀门88进入探测器区域84用于随后的HbA1c测量。
依据本公开的另一方面，图1 7描述了容纳血细胞梯度的一种备选梯度毛细通道90。本实施例中的毛细通道90连接到粒子探测器92。一旦血细胞被探测到到达粒子探测器92，各个阀门94可被开启以将血细胞接收到相应的溶解微通道96，血细胞在该微通道96中可以通过任一上述方法被溶解，且相应的HbA1c测量可以在单独的探测器区域98中进行。溶解微通道96可以配置成在细胞回流时或者通过使用结合图16所述的电阻器83来接收血细胞。在本实施例中，每个溶解微通道96可以耦合到分析腔体(未示出)，如前文所述。
微流体试样10、30、40、66、74的实施例可以用于通过样品成份的密度来分馏样品成份的方法，如图18的流程图100所示。该方法可包括：在毛细通道内建立溶液密度梯度102；将样品施加到毛细通道104；在毛细通道内离心分离该样品106；以及通过密度分馏该样品的成份108。在一个实施例中，该方法是用于测量糖化血色素。在本实施例中，样品可包含红细胞，且离心分离样品可建立红细胞的多个分年龄组。该方法还可包括测量该红细胞的分年龄组的至少一个组的HbA1c水平。
尽管已经参考前述工作原理示出和描述了本发明的实施例，但是本领域技术人员应理解，在不背离由下述权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种形式和细节上的变化。可以想到开口、柄、以及夹板主体的各种配置，以及封装结与夹板的开口和柄之间的各种可能的相互作用。本发明旨在包含所有这些备选、改进和变型，包括本文所披露的各种元件、特征、功能和/或性能的所有新颖的非显而易见的组合及子组合。

Claims (13)

1.一种分馏样品的成份的方法，包括：
a)通过在毛细通道(12，16，50)内组合至少两种不同溶液(20，22)并离心分离组合的溶液来在毛细通道内建立溶液密度梯度(102)；
b)将所述样品施加到所述毛细通道(104)；及
c)离心分离所述毛细通道内的所述样品(106)，由此通过密度来分离所述样品的成份(108)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品(52)包括红细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述两种不同溶液(20，22)是通过所述毛细通道(12，16，50)内的挡板(24)来隔离的。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述挡板(24)为石蜡插塞，且组合所述溶液包括通过加热石蜡来移除所述插塞。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述挡板(24)为所述毛细通道(12，16，50)的疏水区域，且组合所述溶液(20，22)包括离心分离所述毛细通道(12，16)。
6.一种分馏样品的成份的方法，包括：
a)通过毛细通道(12，16)内的溶液的至少一个冻结-解冻周期来在所述毛细通道内建立溶液密度梯度(102)；
b)将所述样品施加到所述毛细通道(104)；及
c)离心分离所述毛细通道内的所述样品(106)，由此通过密度来分离所述样品的成份(108)。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述样品(52)包括红细胞，且分馏所述样品的成份包括在所述溶液密度梯度(26，36，54)中建立红细胞的多个分年龄组，所述方法还包括：溶解所述红细胞的分年龄组中的至少一组的红细胞；以及测量所述红细胞的分年龄组中的该至少一组的HbA1c水平。
8.如权利要求7所述的方法，其中溶解红细胞包括施加电场到红细胞。
9.一种用于执行样品的密度梯度分馏的微流体试样(10，30，40)，包括：至少一个毛细通道(12，16，50)，所述至少一个毛细通道(12，16，50)封闭能够形成溶液密度梯度(26，36，54)的溶液；以及样品井，与所述至少一个毛细通道连通，所述样品井配置成在所述至少一个毛细通道包含已形成溶液密度梯度的溶液后将样品添加到所述至少一个毛细通道；其中所述微流体试样(10)适合于在离心分离机中旋转组合的至少两种不同溶液以在所述至少一个毛细通道(12)内形成溶液密度梯度。
10.如权利要求9所述的微流体试样(10，30，40)，其中所述微流体试样为微流体盘，在盘上径向地布置有多个毛细通道(12，16，50)，所述微流体试样还包括邻近所述毛细通道(12，16，50)中的所述至少一个毛细通道的一对电极(68)，其中该对电极(68)配置成施加电场到所述至少一个毛细通道(12，16，50)的容纳物。
11.如权利要求9所述的微流体试样，其中所述至少一个毛细通道(12，16，50)封闭通过挡板(24)隔离的所述至少两种不同溶液(20，22)，且其中所述溶液被选择为在组合并离心分离时形成溶液密度梯度(26，36，54)。
12.如权利要求11所述的微流体试样，其中所述至少一个毛细通道(12，16，50)封闭在暴露于一个或多个冻结-解冻周期时能够形成溶液密度梯度(26，36，54)的溶液。
13.一种用于测量糖化血色素的系统，包括：微流体试样(10，30，40)，所述微流体试样被配置成在离心分离机内被旋转；位于所述微流体试样上的至少一个毛细通道(12，16，50)，其封闭在离心分离时能够形成溶液密度梯度(26，36，54)的溶液；样品井，其与所述毛细通道(12，16，50)连接并配置成用于在所述至少一个毛细通道包含已形成溶液密度梯度的溶液后将包含红细胞的样品添加到所述至少一个毛细通道(12，16，50)；离心分离机，适合于旋转所述微流体试样(10，30，40)并将红细胞分离为分年龄组；以及测量装置，配置成测量所述分年龄组中的至少一组的HbA1c水平，其中所述微流体试样(10)适合于在离心分离机中旋转组合的至少两种不同溶液以在所述至少一个毛细通道(12)内形成溶液密度梯度。
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