CN101336297B - 细胞内线粒体的极化监控 - Google Patents

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Abstract

以检测活细胞内的线粒体的极化状态的变化作为课题。使用表面等离子共振装置，检测由活细胞内的线粒体的极化状态的变化引起的表面的表面等离子共振角的变化。而且，向活细胞提供一种或多种物质，检测由于线粒体的极化状态的变化引起的表面等离子共振角的变化的步骤可以是在表面等离子共振角的变化只是由于线粒体的极化状态引起的时间段检测其变化的步骤，优选，检测从提供物质时开始20分钟后，更优选30分钟过后，更为优选35分钟过后的时间段的其变化的步骤。

Description

细胞内线粒体的极化监控
技术领域
本发明涉及使用表面等离子共振(SPR)传感器，实时非标识地测定线粒体的极化状态的方法。该方法有利于与线粒体的极化状态相关的生物体现象的监控和药物开发。例如，可以在用于抗癌剂、脂肪燃烧物质、糖尿病的药物的筛选，包括老化在内的细胞活性的监控，药物的效果定量等中使用。
背景技术
线粒体是存在于包括动植物在内的所有真核细胞生物中的细胞器中的一种，它在生物体的生命维持所不可缺少的能量代谢中起着重要的作用。因此，细胞分裂时，细胞死亡时和老化过程，以及癌症，糖尿病，肥胖等各种病变中，线粒体的活动与细胞状态紧密相关，作为其中的一个指标，可以列举线粒体的极化状态的变化。如果作为例子列举，已知的是，在老化的细胞中线粒体的极化程度低，相反在细胞分裂活性高的细胞中极化程度高(Biological Signals andReceptors 2001；10：176-188)。而且，针对癌细胞给药抗癌剂时，细胞暴露于毒物时，脂肪细胞燃烧脂肪时等各种细胞应答时线粒体的极化状态呈各种形式的变化(抗癌：Apoptosis 2005；10：687-705，毒物：Hepatology  2000；31；1141-1152和Toxicological Sciences2005；86(2)：436-443，脂质代谢：Biophysical journal2002；82(1)：1673 part2和FEBS Letters 1984；170(1)：181-185)。因此，线粒体的极化状态的监控在各种病状的诊断和药剂的开发中可以作为有效指标中的一种来使用。
细胞内线粒体的极化状态的监控通常是，在细胞中一旦导入对电位应答的荧光色素，则在电位高的线粒体中凝集，荧光波长发生变化，并且用荧光显微镜，流式细胞仪或分光光度计等检测荧光强度对应于电位的变化而变化的样子的方法。
另一方面，表面等离子(surface plasmon resonance；SPR)装置是一种利用表面等离子共振现象，可以测定共振角度变化的装置。这种共振角度变化依赖于传感器部分的金膜表面附近的介电常数的变化。在SPR装置中，将对象固定在金膜上，提供与之对应的配体。生物分子具有各自的固有介电常数，然而在固定在金膜上的对象与配体发生结合时形成复合体，介电常数发生变化。因此，通过按照金属膜表面的介电常数，则可以获得与生物分子间的结合的有无，结合量，结合速度等相关的信息。
在SPR装置中，可以使用蛋白质等生物分子以及活细胞作为测定对象。
例如，特开2002-85089号公报公开了使用表面等离子体共振装置评价外部刺激对于活细胞的生理活性的方法。特征在于，该方法中，以细胞受刺激期间的信号(1次信号)，以及在1次信号后按顺序出现的2次信号作为指标，评价外部刺激的细胞活性。更具体的是，配体一旦与固定在SPR装置中的活细胞结合，基线与其量成比例上升，并稳定化(1次信号)，但当配体对于细胞具有生理活性时，观察到了与和初期信号连续的单独的结合信号明显不同的基线的上升或基线的周期的变化(2次信号)。这种2次信号由于只在添加确认了生理活性的配体时出现，因此认为反映了配体与活细胞结合所引起的某一种生物体反应，因此如果按照该方法，可以正确评价外部刺激的生理活性。而且，该方法中，优选的方式是测定除去外部刺激后出现的信号作为2次信号。作为实施例，研究了(1)CTLL-2细胞(悬浮细胞)和IL-2的反应，(2)Papilla细胞(间充质细胞)和bFGF的反应，(3)肥大细胞的针对抗原的反应。而且，就(1)而言，获得了用IL-2刺激的数分钟内获得的1次信号，以及其后出现的2次信号，添加原本不与CTLL-2细胞结合的试剂时没有观察到2次信号，由此得出结论：SPR装置捕捉到了细胞与IL-2结合时产生的任何现象；就(2)而言，注入bFGF和磷酸化抑制剂(SU4984)时，注入10分钟后信号变成平稳状态，另一方面，只注入bFGF时信号不断上升，由此得出结论这反映了由bFGF的结合引起的信号传递受到磷酸化抑制剂的抑制；就(3)而言，在用IgE致敏的肥大细胞中观察到了反映由特异性抗原抗体反应产生的活性化的强信号(2次信号)，在未致敏的肥大细胞中没有发现特征性变化，而且添加不使与IgE结合的细胞活性化的DNP-赖氨酸时，观察到了伴随DNP-赖氨酸的结合的1次信号，但没有观察到2次信号，因此得出结论，即通过该方法可以迅速测定细胞的活性化。
特开2002-85089号公报公开了通过已有的反应系中的研究产生的清楚的特定的现象，在表面等离子体共振装置中反映为2次信号。
而且，特开2005-17081号公报公开了使用SPR装置的抗癌作用物质的筛选方法。该方法是，使目的试剂作用于癌细胞，测定表面等离子体共振，在相对于表面等离子体共振的时间的变化率稳定的时间段中求出表面等离子体共振变化率，基于获得的表面等离子体共振变化率，评价目的试剂的抗癌作用的程度。在实施例中，对于具有抗增殖作用的槲皮素，求出测定开始后2700-3000秒(试剂的给药在测定开始后600秒)的5分钟内，由表面等离子体共振应答获得的弯曲的斜率，另一方面，给药48小时后通过台盼蓝染色求出对于试剂的存活率，二者中相关一致，由此得出结论，通过测定预定短时间内的表面等离子共振应答的变化率，可以定量评价细胞的存活率，即抗癌作用。
发明的内容
发明要解决的问题
作为问题，可以列举，通过上述的荧光显微镜，流式细胞仪或分光光度计等检测线粒体的脱极化的方法由于必须导入荧光试剂，因此需要复杂的操作，并且伴随荧光试剂的导入而对细胞产生影响，荧光试剂导入量的不均一性导致再现性低，检测花费时间等。
另一方面，还存在从细胞中只分级线粒体，通过以分散于溶液中的状态的电极等，非标识地直接电位测定的方法，但由于细胞内外线粒体对于外部刺激的应答完全不同，因此并不适于作为生物体内的线粒体的应答监控法。
用于解决问题的方法
本发明人一直以来，对监控活细胞对于各种外部刺激的应答的方法进行了积极的研究。并且，通过使用表面等离子体共振角装置，发现可以检测线粒体极化状态的变化，从而完成了本发明。
本发明提供以下的发明：(1)检测活细胞内的线粒体的极化状态的变化的方法，其包括使用表面等离子体共振角装置，检测由于该活细胞的线粒体的极化状态的变化而引起的表面等离子体共振角的变化的步骤。(2)检测活细胞内的线粒体的极化状态的变化的方法，其包括向活细胞提供物质的步骤；和向活细胞提供物质后，检测由于线粒体的极化状态的变化而引起的表面等离子体共振角的变化的步骤。
发明的效果
通过本发明，清楚了线粒体的极化状态的变化可以作为表面等离子体共振角的变化加以检测。进而，清楚了可以通过控制测定时pH变化速度来控制该线粒体的极化状态的变化速度。
通过本发明，解决了在现有技术中一直成为问题的伴随荧光试剂导入而带来的复杂化，对细胞的影响和由试剂导入量的不均匀性而导致的荧光强度的低再现性的问题等。而且，可以在比现有技术更短的时间内检测线粒体的极化状态的变化。
附图的简要说明
图1是实施例中使用的装置的模式图。图2是表示使用SPR传感器，对由脂质代谢活性物质非诺贝特产生的线粒体极化状态的变化进行测定的结果的图。图3是表示采用荧光显微镜观察，对由脂质代谢活性物质非诺贝特产生的线粒体极化状态的变化进行测定的结果的图。图4是表示实施例2中SPR信号时间变化率(试剂给药后35-45分钟)和荧光强度时间变化率(试剂给药后35-45分钟)的相关性的图。图5是表示使用SPR传感器，对细胞凋亡诱导物质给药时的线粒体去极化变化进行测定的结果的图。图6是表示采用荧光显微镜观察，对细胞凋亡诱导物质给药时的线粒体去极化变化进行测定的结果的图。图7是表示SPR信号时间变化率(试剂给药后35-40分钟)和荧光强度时间变化率(试剂给药后35-40分钟)的相关性的图。图8是表示线粒体脱极化抑制时的细胞凋亡诱导物质(槲皮素)给药所导致的线粒体脱极化变化的图(荧光显微镜观察)。图9是表示线粒体脱极化抑制时的细胞凋亡诱导物质(反式-白藜芦醇(trans-Resveratrol))给药所导致的线粒体脱极化变化的图(荧光显微镜观察)。图10是表示线粒体脱极化抑制时的细胞凋亡诱导物质(槲皮素)给药所导致的线粒体脱极化变化的结果的图(SPR传感器)。图11是表示线粒体脱极化抑制时的细胞凋亡诱导物质(反式-白藜芦醇)给药所导致的线粒体脱极化变化的结果的图(SPR传感器)。图12是表示单独或联合给药细胞凋亡诱导物质(槲皮素或反式-白藜芦醇)48小时后的细胞的存活率的图(细胞数测定)。图13是表示单独或联合给药细胞凋亡诱导物质(槲皮素或反式-白藜芦醇)时的SPR共振角随时间变化的图(SPR传感器)。图14是表示单独或联合给药细胞凋亡诱导物质(槲皮素或反式-白藜芦醇)时的SPR共振角变化速度和细胞存活率之间的相关性的图。图15是表示siRNA给药48小时后的细胞存活率的图(细胞数测定)。图16是表示siRNA给药时的SPR共振角随时间变化的图(SPR传感器)。图17是表示siRNA给药时的SPR共振角变化速度和细胞存活率之间的相关性的图。图18是表示各CO2浓度条件下SPR共振角随时间变化的图(SPR感应器)。图19是表示CO2浓度与线粒体膜电位在35-40分钟时的变化速度之间的相关性的图(荧光显微镜观察)。图20是表示pH的变化速度与线粒体膜电位在35-40分钟时的变化速度之间的相关性的图(荧光显微镜观察)。
用于实施发明的最佳方式
本发明方法的“活细胞”，只要是具有线粒体的活细胞，则没有特别的限定，可以列举例如正常细胞，癌细胞，受精卵，动植物的克隆细胞，ES细胞，癌干细胞等，它们可以是培养细胞，也可以是组织来源的细胞。使用的活细胞，可以根据检测该活细胞内的线粒体的极化状态的变化的目的适当进行选择，例如在抗癌剂的评价时可以使用癌细胞和癌干细胞，脂质代谢时可以使用肝细胞，分化监控时可以使用受精卵和ES细胞，植物的反应评价时可以使用植物细胞，但并不限于这些细胞。
本发明中“检测由线粒体的极化状态的变化引起的表面等离子体共振角的变化的步骤”，可以作为在基本只由线粒体的极化状态的变化而引起的时间段内检测表面等离子体共振角的变化的步骤来实施。表面等离子体共振角的变化基本只由线粒体的极化状态的变化引起的时间段，给活细胞提供物质例如非诺贝特、槲皮素、反式-白藜芦醇、曲妥单抗时，通常是提供物质时起经过20分钟后的时间段，更优选经过30分钟后，更优选经过35分钟后的时间段。
而且，表面等离子体共振角的变化基本只由线粒体的极化状态的变化引起的时间段，是指以下时间段：在给活细胞提供被认为是到例如诱导细胞凋亡的siRNA等与线粒体的极化状态的变化相关的物质的影响出现为止所需时间的物质的情况下，给活细胞提供物质后，与线粒体的极化状态的变化相关的该物质的影响出现时(例如物质是诱导细胞凋亡的Bc1-2 siRNA时，将物质提供给活细胞开始约1分钟后)开始，经过20分钟以后，更优选经过30分钟以后，更优选经过35分钟以后的时间段。“与线粒体的极化状态的变化相关的物质的影响出现时”，根据物质的种类而不同，可以参考例如后述的实施例，通过使用现有技术的方法(例如，荧光法，活细胞数测定法)确认，从而进行确定。使用表面等离子体共振装置时，在线粒体的极化状态之外被检测到的反应中，有物质与细胞膜的结合，和伴随其的细胞膜的极化状态变化等，这些反应，由于通常在细胞外部环境的变化后30分钟左右获得物质的给药或细胞外溶液的交换等(AnalyticalBiochemistry 2002；302：28-37)，因此通过掌握在其后的时间段内的共振角变化，我们认为线粒体的极化状态变化之外的反应基本没有被检测到。而且，通过本发明人的研究，清楚了，物质给药或细胞外溶液的交换等细胞外部环境的变化后经过约30分钟以后发生的细胞内反应，pH变化速度在优选范围的情况(例如，后述的实施例1-4)中，对表面等离子体共振角的变化基本没有影响(参照实施例)。
本发明中所谓“评价一种或多种物质对活细胞内的线粒体的极化状态的影响的方法”分为两种情况。一方面，是测定在细胞中给药功能未知的物质时的表面等离子体共振角的变化，评价该反应是否诱导线粒体极化状态变化的方法，另一方面是使用已知的荧光法等评价清楚了在某种细胞中是否诱导线粒体的极化状态的变化的物质在其它的细胞中诱导何种程度变化的方法。前者的情况，现有技术中，产生发现线粒体的极化状态变化以外的反应的可能性，如果按照本说明书中公开的方法，基本没有检测到线粒体的极化状态变化之外的反应。
本发明的方法，还可以利用随时间记录由表面等离子体共振传感器发出的信号时的图的斜率(相对于时间的表面等离子体共振角变化量，即变化率)，以定量对象物质(1个或多个)对线粒体的极化状态的变化的影响作为目的，来使用。此时，通过指示出表面等离子体共振角的变化基本上只由线粒体的极化状态的变化引起的时间段，且检测出的表面等离子体共振角的变化一定的时间段，即随时间记录由表面等离子体共振传感器发出的信号时的图形的斜率几乎是直线的时间段，可以利用该时间段中的图形的斜率。这种指定的时间段长度，至少为1分钟，优选3分钟以上，更优选5分钟以上，更优选10分钟以上。以更加正确定量作为目的时，该时间段中的表面等离子体共振角的变化率，可以利用在包括该时间段比其长10％以上的时间段中表面等离子体共振角的变化率的±10％以内这样的时间段的变化率。
具体而言，即使在35-40分的5分钟的情况中，计算比其长10％的时间，即5分30秒以上(例如，30-45分的10分钟内)，35-45分的10分钟的情况中计算比其长10％的时间，即11分钟以上(例如，30-50分的15分钟内)的时间段中的变化率，其变化率，对于35-40分的5分钟或35-45分的10分钟的时间段中的变化率，分别获得±10％以内时，可以选择该35-40分的5分钟或35-45分的10分钟。这样一来，本发明的一个特征是：在比以往的方法更短的时间(1小时以内)内，可以检测活细胞内的线粒体的极化状态的变化，例如被认为是在pH变化速度慢时等，缓慢检测出线粒体的极化状态的变化的情况中，参照本说明书中的记载，如果是本领域技术人员，可以确定适宜检测的时间段。
根据本发明，就对线粒体的极化状态的影响程度已经清楚的物质而言，同样预先求出表面等离子体共振角的变化率，可以与对象物质的变化率进行比较。进而，通过与同样制成的校正曲线进行比较，可以定量分析对象物质对于线粒体极化状态的影响程度。
作为可以改变活细胞内的线粒体的极化状态的物质，可以列举，例如(a)脂质代谢促进物质(脂肪燃烧物质)；(b)细胞的细胞凋亡诱导物质；(c)siRNA；(d)抗癌物质；(e)致癌物；(f)影响细胞的分裂活性的物质；(g)内分泌紊乱物质；(h)对细胞有毒性的物质等。还可以评价与这些物质相关的单剂给药的作用和多剂合用给药中的作用。而且，这些物质不限于化合物，例如可以是与细胞凋亡相关的siRNA等。评价siRNA所导致的活细胞内的线粒体的极化状态的变化时，可以考虑，参照例如后述实施例中记载的方法siRNA给药后，直至与线粒体的极化状态的变化相关的siRNA的影响出现的时间延迟。我们认为该时间延迟，受细胞的种类和作为对象的细胞的反应的种类的影响。
本发明中使用表面等离子体共振装置。
说明表面等离子体共振的原理。若说明使用棱镜的情况，表面等离子体共振是一种使用由激光等光获得的消减波通过共振激发产生金属表面等离子体的现象。通过在棱镜中引起全反射，由此可以使消减波在其反射面的对面发生。棱镜上存在薄金属层时，消减波穿过金属层共振激活金属对面的表面等离子体。作为确定引起共振的条件的要素，有形成金属层和界面的物质的介电常数等，由于介电常数等的变化伴随于分子间相互作用，因此由此可以确定共振条件。此时，由于可以引起共振的消减波的条件变化，因此通过检测相反引起共振的消减波的条件的变化，可以了解介电常数的变化，进而了解分子间的结合等。实际上，消减波的条件随入射的激光的入射角θ而变化。入射角和反射角定义为相等的相对于基板的法线的角度。发生共振现象时，消减波由于受到金属层上的物质的影响，因此导致反射光强度的急剧衰减。通过检测器检测该反射光强度的变化，通过逐渐绘制引起反射光强度衰减的入射角度(共振角)，可以了解金属层上的微小区域中的变化。表面等离子体共振的测定，除了使用棱镜使光全反射的方法之外，还可以采用使用衍射光栅利用光的衍射的方法。如果基于求出共振角的方法，如以下公式所示，相当于εs的测定对象的介电常数，按如下方式定义共振角θ。由于作为测定对象的活细胞内的线粒体的极化状态的变化导致介电常数εs的变化，因此线粒体的极化状态中由于任意刺激而存在变化时，根据介电常数εs，作为共振角θ的变化，可以通过SPR传感器检测。
sin θ = 1 n p ϵ m · ϵ s ϵ m + ϵ s
而且，对于表面等离子体共振的时间的变化的测定，可以作为表面等离子体共振角的时间变化，初期状态的表面等离子体共振角中反射光强度的时间变化等求出。求出上述的共振角的检测方式，还可以采用利用白光作为表面等离子体共振激发光源，检测分光检测光引起共振现象的波长或固定波长下的反射光强度的变化的方法。
本发明的方法中，可以使用已经存在的表面等离子体共振装置。例如，可以使用特开2005-17081号公报中公开的装置。
通过各种方法可以确认，用本发明的方法，可以检测线粒体的极化状态的变化。例如，通过研究由本发明获得的变化率和与通过现有技术的荧光法(在细胞内导入应答于电位的荧光色素，例如阳离子性喹啉蓝色素，电位高的线粒体中凝集，荧光波长变化，并且通过荧光显微镜，流式细胞仪或分光光度计等检测荧光强度根据电位变化而变化的样子的方法)获得的线粒体的极化相关的值之间的相关性，可以进行确认。更具体的方法，可以参照本发明的实施例。
而且，例如，如后述的实施例3和4中记载的，在使细胞凋亡诱导物质作用的细胞中，可以发现由本发明获得的线粒体的极化状态的变化率与通过以往的方法即活细胞数测定法计算出来的细胞的存活率之间的相关关系。由此，根据本发明的方法，通过以往的活细胞数测定法可以简单评价细胞凋亡诱导物质的作用。例如，如果参照后述的实施例进行说明，评价细胞凋亡诱导物质的作用时，若按照以往的活细胞数测定方法，则需要细胞凋亡诱导物质和细胞共培养48小时以上的步骤和染色细胞判别活细胞和死细胞后，用血细胞计数器进行测定的步骤，与之相对，若按照本发明的方法，可以(不对细胞染色)不标识通常在1小时以内求出结果。
本发明的方法使用活细胞，而其中该活细胞的细胞外溶液可以是测定期间细胞可以存活的溶液，作为这种溶液，可以列举例如细胞的培养基，缓冲液，生理盐水和蔗糖溶液，但并不限于此。优选，细胞外溶液为细胞的培养基。
本发明的方法，通过检测时的活细胞的细胞外溶液的pH的调控，可以调控活细胞中线粒体的极化状态(线粒体膜电位)的变化速度。更具体的是，通过使细胞外溶液的pH变高或变低，可以加速活细胞内的线粒体的极化状态的变化速度，此时，pH的变化速度越快，线粒体的极化状态的位变化速度则更快。pH的变化速度为每单位时间的pH的变化率，可以根据测度前后的细胞外溶液的pH值和测定时间计算。更具体的是，可以按后述的实施例5记载的方式计算。
一般测定线粒体的极化状态变化的实验系统，CO2浓度为5％的状态的pH变化速度(本实施例5中为pH0.004/min)，利用不受周围空气中的CO2浓度影响的组成的细胞外溶液时的pH变化速度等pH基本保持一定的条件，如果形成线粒体的极化状态的变化不加速的状态，在其之上的pH变化速度的条件下线粒体的极化状态的变化加速。pH变化速度和线粒体膜电位的变化速度之间的关系根据细胞的种类和刺激的种类而多少有些差异，pH变化速度越快，线粒体膜电位的变化速度则越快，因此可认为其在线粒体的极化状态的变化的检测中是优选的。可以认为优选的pH的范围根据细胞等多少有所不同。
上述线粒体的极化状态的变化不加速的状态下，达到表面等离子体共振角的变化基本只由线粒体的极化状态的变化引起的时间段时为2小时以上，与之相对，通过这种细胞外溶液的pH的调控，可以将其时间缩短30分钟左右。细胞外溶液的pH的调控，例如细胞外溶液的pH变化速度可以调整为pH 0.005/min以上，更优选pH 0.01/min以上，更优选pH 0.02/min以上，但必须是活细胞可以存活的范围的变化速度。细胞外溶液的pH的调控，考虑对活细胞的影响，本领域技术人员可以采用公知的方法，例如，可以通过将细胞外溶液慢慢置换为pH不同的溶液，在细胞外溶液中添加pH不同的溶液，控制细胞外溶液外部的CO2浓度等方法进行。更具体的方法，可以参照本发明的实施例。
用于实施发明的优选方式检测本发明的活细胞内的线粒体的极化状态的变化的方法，可以用于评价与线粒体的极化相关的活细胞的性质，例如分裂活性，老化状态或恶性(是癌细胞还是正常细胞)。此时，在统一条件(细胞系，培养液体系，光学条件等)的细胞间，通过比较由表面等离子体共振法获得的值，可以评断目的活性或作用的程度。
本发明的方法可用于评价一种或多种物质对于活细胞的与线粒体的极化相关的作用，例如脂肪燃烧作用，细胞凋亡诱导作用，毒性或内分泌紊乱作用。
细胞的分裂活性的评价：在选择人工受精和动植物克隆中优良细胞时，选择分裂活性高的细胞十分重要，由于线粒体的极化状态与细胞的分裂活性紧密相关，因此通过使用本发明在非标识下监控线粒体的极化状态，可以在上述用途中非侵袭性地选择优良的细胞(参照Cancer Research1998；58(13)：2869-2875)。细胞的老化状态的评价在老化状态的细胞中，分裂活性低，由于线粒体的极化状态与其相关，因此可以根据线粒体的极化状态监控来监控细胞的老化状态。而且，可以应用于使细胞活性化，抑制老化的药物的筛选中(参照Biological Signals and Receptors 2001；10：176-188)。脂肪燃烧物质(减肥药)的筛选：由于现已清楚了过度的脂肪的积累不止是肥胖的症状，也会引起糖尿病，脑中风，动脉硬化等疾病，因此脂肪燃烧物质作为抗肥胖药物的利用价值非常高。而且，由于现已清楚了脂肪燃烧通过褐色脂肪组织和肝细胞进行，脂肪燃烧时引起肝细胞内线粒体的极化·脱极化，因此通过褐色脂肪细胞的线粒体极化状态监控可以筛选脂肪燃烧物质(参照Biophysical journal 2002；82(1)：1673 part 2和FEBS Letters1984；170(1)：181-185)。癌症的诊断：由于已知癌化细胞中，与正常细胞比较，线粒体的极化状态显著不同，因此可以应用于正常细胞与癌细胞的判断中(参照CancerResearch 2005；65(21)：9861-9867)。抗癌剂的筛选：在通过细胞凋亡的诱导而显示抗癌作用的抗癌剂中，已知引起线粒体的脱极化等抗癌剂在作用于癌细胞的过程中引起线粒体的极化状态的变化。而且，根据其脱极化的程度可以评价抗癌作用。因此，根据在对癌细胞给药抗癌剂候选物质时的线粒体极化状态的监控，可以筛选抗癌剂(参照Apoptosis 2005；10：687-705)。而且，例如这种抗癌剂候选物质的联合给药所产生的协同效果的判断也可以通过线粒体极化状态的监控来进行。
RNAi的评价：RNAi(RNAinterference；RNA干扰)是一种导入于细胞的双链RNA分解具有与之互补的碱基序列的mRNA的现象，利用这种现象通过人工导入双链RNA，可以抑制任意基因的表达。RNAi中，尤其是对于认为对线粒体的脱极化有影响的RNAi的效果的判断，可以通过线粒体极化状态的监控进行。作为这种RNAi，可以列举例如与细胞的细胞凋亡、细胞分裂活性、老化、肥胖、与肥胖相关的糖尿病、脑中风、动脉硬化、褐色脂肪细胞、肝细胞等相关的RNAi，但不限于这些(与RNAi相关：参照Nature 2001；411：494-498)。环境监控：现已清楚了，已知为环境激素的双酚A等内分泌紊乱物质中，根据其种类，浓度等对于特定的细胞诱导增殖和细胞凋亡，通过线粒体的极化状态的监控可以检测上述细胞增殖中细胞分裂和细胞凋亡，因此可以应用于检测环境中的内分泌紊乱物质和它们的影响(参照Archives of Toxicology 2000；74(2)：99-105，和Journal ofBiological Chemistry 2005；280(7)：6181-6196)。毒性评价：一般所知的是毒性物质对活细胞的给药引起线粒体突然的脱极化，存在这样的例子即通过用荧光试剂监控线粒体极化状态进行各种物质的毒性评价。使用本发明就可以非标识下简便地进行毒性评价(参照Hepatology 2000；31；1141-1152和Toxicological Sciences2005；86(2)：436-443)。检测本发明的活细胞内的线粒体的极化状态的变化的方法可以用于评价，筛选候选活细胞群的分裂活性、老化状态或恶性(是癌细胞，还是正常细胞)。
而且，本发明的方法可以用于筛选候选物质(例如，用于处置与线粒体的极化相关的疾病或状态的药物候选化合物)。这种筛选方法具体包括以下步骤：向活细胞提供候选物质的步骤；将物质提供给活细胞后，检测引起线粒体的极化状态的变化的表面共振角的变化的步骤；表面共振角的变化基本只因线粒体的极化状态的变化引起的时间段(例如，提供物质时开始经过20分钟过后)，指示检测的表面等离子体共振角的变化稳定(即用表面等离子体共振传感器随时间记录时图的斜率基本为直线)的时间段，求出该时间段内表面等离子体共振角的变化率的步骤；和基于获得的表面等离子体共振角变化率选择候选物质的步骤。
作为与线粒体的极化相关的疾病或状态的具体例子，可以列举与细胞的分裂活性相关的疾病或状态，老化、肥胖或与肥胖相关的糖尿病、脑中风或动脉硬化、褐色脂肪细胞或肝细胞中与线粒体的极化相关的疾病或状态，癌症和与细胞凋亡相关的疾病或状态。
实施例
以下，表示的是线粒体极化状态监控的实施例。
装置：SPR信号的测定和荧光显微镜观察，在测定对象-活细胞的上部通过荧光显微镜，下部用具有SPR传感器的装置进行。模式图示于图1。SPR传感器用克雷兹曼(kretschmann)配置的光学系统，以BK7(折射率1.51)作为棱镜，使用半导体激光器(波长670nm，功率3mW，光束径1mm)，使用硅光电二极管检测器作为检测器。测定只要不是特别说明，都是在大气下(O2z：20％，CO2：0.035％)下进行。
荧光显微镜观察，使用Axioplan 2(Carl Zeiss)作为显微镜，使用75W氙灯作为光源，使用NTE/CCD DetectorMicroMAX-512BFT(Princeton Instruments)。而且图像的获得和分析通过荧光分析软件MetaFluor Imaging System Ver.4.6.5(UniversalImaging)进行。
实施例1
脂质代谢促进物质的评价采用人肝脏癌细胞HepG-2作为供试细胞。37℃，5％的CO2的浓度下，以含有100μM非必需氨基酸，50单位/ml青霉素，50μg/mL链霉素，10％FBS(v/v)的液体培养基EMEM作为完全培养基，将完全培养基用于前培养后的实验中。而且，作为脂质代谢促进物质，使用非诺贝特(Fenofibrate，2-[4-(4-氯苯甲酰基)苯氧基]-2-甲基丙酸异丙醇酯)，对25和50μM添加时的脂质代谢活性进行评价。使用DMSO(二甲基亚砜)作为溶剂(向培养基中添加后的最终浓度为含有0.1％(v/v)DMSO)。并且，作为对照，只添加DMSO使终浓度为0.1％(v/v)。
1.通过SPR进行的脂质代谢活性评价供试细胞在前培养后，从培养皿上剥离，将细胞浓度调整成在完全培养基中2×106细胞/mL，将100μL该细胞悬浮液滴落于基板上，37℃，5％CO2浓度下培养18小时。18小时后，将基板置于SPR传感器上的棱镜上，用5mL的EMEM填满于基板上，开始测定。测度开始10分钟后，更换为含有非诺贝特的培养基，再继续进行50分钟测定。其结果是，如图2所示，尤其是添加试剂后约20分钟左右，发现了脂质代谢的活性化所引起的线粒体的极化所导致的SPR信号的变化(-)。
2.通过荧光试剂JC-1进行的线粒体极化状态的监控供试细胞在前培养后，从培养皿上剥离，将细胞浓度调整成在完全培养基中2×106细胞/mL，将100μL该细胞悬浮液滴落于基板上，37℃，5％CO2浓度下培养18小时。18小时后，更换为含有2.5μM JC-1碘化物的EMEM100μL(含有终浓度为0.1％的DMSO)后，在CO2培养箱内(37℃，5％CO2浓度)放置20分钟。20分钟后，为了除去含有JC-1碘化物的培养基，用EMEM更换基板上的培养基后，将其置于装置测定部上，用5mL的EMEM填满，37℃下进行测定。荧光强度观察以观察倍率630倍进行。通过激发滤光片传送485±20nm，荧光检测时采用515-565nm传送的滤光片组，以及575-640nm传送的滤光片组。测度开始10分钟后，除去EMEM，更换为含有非诺贝特的培养基再继续进行测定。作为对照，使用含有0.1％(v/v)DMSO的培养基。其结果是，如图3所示，尤其是添加试剂后约20分钟左右，发现了脂质代谢的活性化所引起的线粒体的极化所导致的荧光的增加。而且，如图4所示，可以发现SPR信号的时间变化率和线粒体的极化程度相关性高(r＝0.990)，表明SPR信号变化由线粒体的极化状态的变化引起。
实施例2
[细胞凋亡诱导物质的评价]
使用人胰腺癌细胞MIA PaCa-2作为供试细胞。37℃，5％CO2浓度下，用含有100μM非必需氨基酸，50单位/mL青霉素，50μg/mL链霉素，10％FBS(v/v)的的液体培养基EMEM培养。
而且，作为细胞凋亡诱导物质，使用槲皮素和反式-白藜芦醇，使用非细胞凋亡诱导物质芦丁(Rutin)作为阴性对照。对于使用时的最终浓度10，25，50，100μM，分别制备1000倍浓度溶液(10，25，50，100mM)的二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，制成原料。
1.SPR信号测定将粘附了细胞的基板置于由匹配液(matching fluid)(折射率1.51)介导的SPR传感器的棱镜上，用5mL的EMEM填满基板，开始SPR信号测定。测定开始10分钟后，一旦除去EMEM，立即更换为含有100μM的槲皮素，反式-白藜芦醇，芦丁或曲妥单抗(Herceptin)中任一种的新的5mL EMEM(含有终浓度为0.1％(v/v)的作为苯酚成分的溶剂使用的DMSO)，或者更换为只含有0.1％的DMSO的5mL EMEM作为对照后，继续测定50分钟。其结果是，如图5所示，尤其是给药后35分钟以后，发现了由细胞凋亡诱导物质导致的线粒体的脱极化所引起的SPR信号的变化(+)。
2.通过荧光试剂JC-1进行的线粒体极化状态的监控从培养皿上剥离后，用液体培养基制成细胞悬浮液，用液体培养基将细胞浓度适当调整成2×106细胞/mL。调制后，将100μL该细胞悬浮液滴落于基板上，37℃，5％CO2浓度下培养20小时。
20小时后，用5mL的PBS清洗基板，除去没有与培养基粘着的细胞。滴落100μL含有5μM作为线粒体的极化状态检测用荧光指示剂的JC-1碘化物的EMEM，含有终浓度0.1％的DMSO在CO2培养箱内(37℃，5％CO2浓度)放置30分钟。30分钟后，用5mL的PBS清洗基板，将其装置测定部上，用5mL的EMEM填满，37℃下进行测定。荧光强度观察以观察倍率200倍进行。通过激发滤光片传送485±20nm，荧光检测时采用515-565nm传送的滤光片组，以及575-640nm传送的滤光片组。测度开始10分钟后，除去EMEM，更换为含有100μM槲皮素或反式-白藜芦醇的5mL新EMEM(含有终浓度为0.1％(v/v)的作为溶剂使用的DMSO)或更换为只含有0.1％DMSO的5mL EMEM作为对照后，再继续进行测定50分钟。其结果是，如图6所示，确认了由各种细胞凋亡诱导物质所导致的时间依赖性的线粒体脱极化的样子。
而且，为了确认实施例1-3中所示的通过SPR传感器获得的信号的改变是源于线粒体的脱极化，以实施例3为例，试剂给药后试剂立即与细胞膜表面的结合和细胞膜的极化状态变化等线粒体极化状态监控中不好的细胞应答集中后，比较5分钟左右(实施例3中，试剂给药后35-40分钟)的SPR信号的变化量与相同时间段通过荧光标识获得的线粒体极化状态变化量，如图7所示，获得了非常高的相关性(r＝0.936)。
3.通过线粒体脱极化抑制进行的细胞凋亡抑制试验进而，为了确认SPR信号的变化检测出了线粒体的极化状态的变化，使用抑制用槲皮素和反式-白藜芦醇在癌细胞中诱导细胞凋亡时的线粒体脱极化的试剂，进行确认。线粒体的供试细胞MIA PaCa-2与上述条件相同，37℃，5％CO2浓度下在基板上培养20小时、作为细胞凋亡抑制剂，使用结合于线粒体膜上，进行线粒体膜的脱极化、细胞色素c释放的抑制的Bcl-xL BH4(4-23)(人)，细胞-渗透(Cell-Permeable)(以下表示为TAT-BH4)。测定开始15分钟前，除去基板上的液体培养基，更换为含有100nm的抑制剂的100μL EMEM，37℃，5％CO2浓度下温育15分钟，将抑制剂导入于细胞内。或者，作为对照，更换为含有等量的作为抑制剂的溶剂使用的PBS(-)的100μLEMEM。将粘附了细胞的基板置于装置测定部上，用5mL的EMEM填满，与上述方法同样方式开始荧光强度测定和SPR信号测定。测度开始10分钟后，一旦除去EMEM，立即更换为含有100μM的槲皮素，反式-白藜芦醇中任一种的新的5mL EMEM(含有终浓度为0.1％(v/v)的作为苯酚成分的溶剂使用的DMSO)，或者更换为只含有0.1％的DMSO的5mL EMEM作为对照后，继续50分钟测定。其结果是，与如图8和9所示的通过荧光标记确认的线粒体的脱极化抑制的样子相同，如图10和11所示，即使在SPR信号变化中也确认了信号变化受到抑制，确认了通过SPR传感器检测出的信号是线粒体的极化状态的变化。
实施例3
[多剂联用效果的评价]评价细胞凋亡诱导物质(抗癌作用物质)的多剂联用所产生的协同效果。作为抑制具有该协同效果的物质，采用了槲皮素和反式-白藜芦醇。对于二者的多剂联用所产生的在细胞凋亡中的协同效果，已在Mouria，M等人的Food- derived polyphenols inhibit pancreaticcancer growth through mitochondrial cytochrome c release and
1.通过根据细胞数测定计算出的存活率进行多剂联用的评价(标准法)多剂联用所产生的效果的评价，通过以下方法进行，即共同培养供试剂和细胞，计算由于细胞凋亡而减少的细胞数。使用人胰腺癌细胞MIA PaCa-2作为供试细胞。使用含有10％FBS(v/v)、50单位/ml青霉素，50μg/mL链霉素，100μM非必需氨基酸EMEM(Eagles’minimumessential medium，Eagle’s最小限度基本培养基)，制成5×104细胞/mL的细胞悬浮液，以每5mL一个平均分注于6cm培养皿中，于37℃，5％CO2浓度下前培养。24小时后，更换为除了上述培养基还含有25μM槲皮素、25μM反式-白藜芦醇或者25μM槲皮素和25μM反式-白藜芦醇中任一种的新的5mLEMEM(含有终浓度为0.1％(v/v)的作为苯酚成分的溶剂使用的DMSO)，或者更换为作为对照的只含有0.1％(v/v)的DMSO的5mL EMEM，进行培养。更换培养基48小时后，台盼蓝染色后，用血细胞计数器计算细胞数，对于各条件以对照的细胞数为100进行比较。
2.SPR信号测定装置采用上述SPR传感器(角度调节型)，于37.0℃温调下进行SPR共振角测定。与存活率测定相同，调制2×106细胞/mL的细胞悬浮液，将100μL该细胞悬浮液滴落于SPR测度用金基板上，37℃，5％CO2浓度下培养20小时。20小时后，将基板置于SPR传感器上的棱镜上，用5mL的EMEM填满于基板上，开始测定。测度开始10分钟后，更换为含有25μM槲皮素、25μM反式-白藜芦醇或者25μM槲皮素和25μM反式-白藜芦醇中任一种的新的5mLEMEM(含有终浓度为0.1％(v/v)的作为苯酚成分的溶剂使用的DMSO)，或者更换为作为对照的只含有0.1％的DMSO的5mL EMEM，再继续进行50分钟SPR共振角变化的测定。
结果根据细胞数计数计算出的对照为100时的存活率示于图12。在只给药槲皮素或反式-白藜芦醇的条件下，存活率分别为76.1％，56.2％，而在二者联合给药的条件下，细胞存活率为17.8％，获得了二者的抗癌作用效果之和(相当于32.3％的存活率)以上的抗癌作用效果。由此，确认了槲皮素和反式-白藜芦醇联用产生了抗癌作用的协同效果。
单独以及联合给药槲皮素和反式-白藜芦醇时的SPR共振角随时间变化测定的结果示于图13。槲皮素、反式-白藜芦醇单独给药时，给药后50分钟时SPR共振角变化为0.05°左右，二者联合给药时，观察到0.2°以上的共振角变化。如实施例2所示，通过槲皮素和反式-白藜芦醇给药获得的SPR共振角变化为对于癌细胞的细胞凋亡诱导时的线粒体膜电位的变化(脱极化)。通过本实施例，即使在联合给药两种物质时，也显示出了可以检测到与对于癌细胞的细胞凋亡诱导的协同效果相对应的线粒体膜电位的变化。
进而，根据图13中所示的SPR共振角变化，为了求出与标准法的(通过细胞数测定计算出的存活率)结果的相关性，试剂给药后，根据35-40分钟的SPR共振角变化计算SPR共振角变化速度(deg/sec)。该值表明了与通过标准法求出的存活率之间的相关性(图14)。通过用SPR法进行的活细胞的线粒体膜电位变化测定，即使在两种试剂联用产生协同效果时，也可以迅速且定量地预测抗癌作用的效果。
实施例4
[RNA干扰(RNA interference：RNAi)的评价]通过小干扰RNA(siRNA)评价了RNA干扰(RNAinterference：RNAi)。通过RNAi敲除细胞内在细胞凋亡抑制中起作用的分子Bc1-2，诱导细胞凋亡。通过SPR监控此时线粒体极化状态的变化，根据其变化率评价siRNA的有效性。对于Bc1-2的通过siRNA的细胞凋亡诱导，已经在Feng，L.F.等人的Bc1-2 induced apoptosisand increased sensitivity to 5-f luorouracil and HCPT in HepG2cells.J.Drug Targeting 14，21-26(2006)中。
1.通过根据细胞数测定计算出的存活率进行的siRNA的有效性评价(标准法)siRNA的有效性评价，通过以下方法进行，即计算敲除了Bc1-2所产生的结果-由于细胞凋亡而减少的细胞数。使用人胰腺癌细胞MIAPaCa-2作为供试细胞。使用含有10％FBS(v/v)、50单位/ml青霉素，50μg/mL链霉素，100μM非必需氨基酸EMEM，制成1×104细胞/mL的细胞悬浮液，以每1mL一个平均分注于24孔板上，于37℃，5％CO2浓度下前培养。24小时后，更换为除了上述培养基还含有50nM、100nM的Bc1-2 siRNA(序列参照Genes Dev.17(7)832-837(2003))的1mLEMEM或者作为对照更换为含有与导入siRNA时浓度相同的siRNA导入时使用的转染试剂的1mL EMEM，进行培养(按照试剂盒的说明使用CellSignaling Technology公司SignalSilence TMBc1-2 siRNA试剂盒(人特异性))。更换培养基48小时后，台盼蓝染色后，用血细胞计数器计算细胞数，对于各条件以对照的细胞数为100进行比较。
2.SPR信号测定装置采用角度调节型SPR传感器，于37.0℃温调下进行SPR共振角测定。与存活率测定相同，调制2×106细胞/mL的细胞悬浮液，将100μL该细胞悬浮液滴落于SPR测度用金基板上，37℃，5％CO2浓度下培养20小时。20小时后，更换为含有50nM、100nM的Bc1-2 siRNA或者作为对照的siRNA导入时使用的转染试剂的新的5mL EMEM，再继续进行1小时，为了通过转染缓冲液的共存使干扰平静，并且考虑到试剂给药后直至以线粒体膜电位达到检测敏感度的程度的大小，频率发生的时间延迟，在37℃，5％CO2浓度下静置后，测定50分钟供试细胞的应答作为SPR共振角变化。
结果标准法的结果(根据细胞数计数计算出的对照为100时的存活率)示于图15。相对于对照条件，给药50nm Bc1-2 siRNA的条件下，存活率为80％，100nm为70％左右，确认了siRNA导致的通过细胞凋亡诱导而细胞数减少。
给药各浓度siRNA或只给药转染试剂1小时后开始的SPR共振角随时间变化测定的结果示于图16。任一条件下，均观察到测定开始后15分钟左右开始稳定的SPR共振角变化，在给药50nM或100nMBc1-2 siRNA的条件下，确认了表示线粒体膜电位变化(脱极化)的SPR共振角的增加。由此表明通过用RNAi敲除细胞凋亡抑制因子Bc1-2，可以检测诱导的细胞凋亡作为线粒体膜电位的变化。
而且，根据图16中所示的SPR共振角变化，为了求出与标准法的(通过细胞数测定计算出的存活率)结果的相关性，试剂给药后，根据35-40分钟的SPR共振角变化计算SPR共振角变化速度(deg/sec)。该值表明了与通过标准法求出的存活率之间的相关性(图17)。根据以上结果，通过用SPR法可以迅速且定量地评价RNAi。
实施例5
[线粒体膜电位变化加速法]公开了通过测定中使用的细胞外溶液的pH的调控，调控活细胞中的线粒体膜电位变化速度的方法。pH变化通过以下方式进行，即通过调控细胞外溶液(缓冲液)外部的大气中的CO2浓度的控制使细胞外溶液的平衡发生变化。
装置采用上述SPR传感器(荧光显微镜附带，角度调节型)，于37.0℃温调下进行。使用人胰腺癌细胞MIA PaCa-2作为供试细胞。37℃，5％CO2浓度下，用含有100μM非必需氨基酸，50单位/mL青霉素，50μg/mL链霉素，10％FBS(v/v)的的液体培养基EMEM培养。在线粒体膜电位变化的诱导中，使用细胞凋亡诱导试剂反式-白藜芦醇。测定时的pH的变化CO2浓度和O2浓度的调控，通过流量计调节各种气体的流量来进行。
1.SPR信号测定SPR信号测定是将粘附了细胞的基板置于由匹配油(matchingoil)(折射率1.51)介导的SPR传感器的棱镜上，用5mL的EMEM填满基板，开始SPR信号测定。测定开始10分钟后，一旦除去EMEM，立即更换为含有100μM的反式-白藜芦醇的新的5mL EMEM后，继续50分钟测定。测定分别在空气下(大气下，O2：20％，CO2：0.035％)、2.5％的CO2下，或者5.0％的CO2下进行。CO2浓度的调节通过用流量计混合空气(大气)和由CO2泵输送的CO2气体来进行。结果示于图18。
2.通过荧光试剂JC-1进行的线粒体极化状态的监控从培养皿上剥离后，用液体培养基制成细胞悬浮液，用液体培养基将细胞浓度适当调整成2×106细胞/mL。调制后，将100μL该细胞悬浮液滴落于基板上，37℃，5％CO2浓度下培养20小时。20小时后，用5mL的PBS清洗基板，除去没有与培养基粘着的细胞。滴落100μL含有5μM作为线粒体的极化状态检测用荧光指示剂的JC-1碘化物的EMEM(含有终浓度为0.1％的DMSO)，在CO2培养箱内(37℃，5％CO2浓度)放置30分钟。30分钟后，用5mL的PBS清洗基板，将其装置测定部上，用5mL的EMEM填满，37℃下进行测定。与上述1.的情况一样，分别在大气下(大气下，O2：20％，CO2：0.035％)、2.5％的CO2下，或者5.0％的CO2下进行测定。荧光强度观察以观察倍率200倍进行。通过激发滤光片传送485±20nm，荧光检测时采用575-640nm传送的滤光片组。测度开始10分钟后，除去EMEM，更换为含有100μM反式-白藜芦醇的5mL新EMEM(含有终浓度为0.1％(v/v)的作为溶剂使用的DMSO)，再继续进行测定50分钟。试剂给药后试剂立即与细胞膜表面的结合和细胞膜的极化状态变化等线粒体极化状态监控中不好的细胞应答集中后，观察5分钟左右(实施例5中，试剂给药后35-40分钟)的由荧光标识获得的线粒体极化状态变化。从各时间中荧光观察图像中，计算对应于线粒体膜电位大小的荧光强度的积算值。求出的累积值的随时间变化(线粒体膜电位的35-40分钟时变化速度)和CO2浓度之间的关系示于图19。
结果如图18所示，其结果是，按空气(大气下，O2：20％，CO2：0.035％)＞2.5％CO2＞5.0％CO2的顺序，随CO2浓度变高，作为SPR共振角变化的增加检测到的线粒体膜电位的减少加速。如图19所示，使用荧光试剂的线粒体膜电位变化测定中，结果也相同。测度开始前，细胞外溶液培养基(缓冲液)的pH为7.3，与之相对，继续50分钟测定结束时，培养基在大气下pH为8.4左右，在2.5％CO2下pH为7.8左右，在5％CO2下pH为7.5左右。pH的变化呈直线。如果根据该结果结算培养基的pH变化速度，在大气下为约pH 0.022/min，在2.5％ CO2下为约pH 0.01/min，在5％CO2下为约pH 0.004/min。pH的变化速度与线粒体膜电位的35-40分时的变化速度之间的关系示于图20。图20示出了pH的变化速度与线粒体膜电位的变化速度之间的相关性。一般测定线粒体的极化状态变化的实验系统即CO2浓度为5％的状态的pH变化速度(本实施例5中为pH 0.004/min)的条件，若形成线粒体膜电位的变化不加速的状态，则在其之上的pH变化速度的条件下线粒体膜电位变化加速。pH变化速度和线粒体膜电位的变化速度之间的关系根据细胞的种类和刺激的种类而多少有些差异，pH变化速度越快，线粒体膜电位的变化速度则越快，因此可认为其在线粒体的极化状态的变化的检测中是优选的。

Claims (10)

1.一种检测活细胞中线粒体的极化状态变化的方法，其包括使用表面等离子体共振装置，检测该活细胞的线粒体的极化状态的变化所引起的表面等离子体共振角的变化的步骤。
2.一种检测活细胞中线粒体的极化状态变化的方法，其包括向活细胞提供一种或多种物质的步骤；
和向活细胞提供物质后，检测线粒体的极化状态的变化所引起的表面等离子体共振角的变化的步骤。
3.权利要求2中记载的方法，所述检测线粒体的极化状态的变化所引起的表面等离子体共振角的变化的步骤是在表面等离子体共振角的变化只因线粒体的极化状态的变化引起的时间段检测其变化的步骤。
4.权利要求2中记载的方法，所述检测线粒体的极化状态的变化所引起的表面等离子体共振角的变化的步骤是在提供物质时开始经过20分钟后的时间段检测其变化的步骤。
5.权利要求3或4中记载的方法，还进一步包括：指定出检测出的表面等离子体共振角的变化一定的时间段，即1分钟以上的时间段，求出该时间段的表面等离子体共振角的变化率的步骤。
6.权利要求5中记载的方法，所述指定的时间段中，在该时间段内表面等离子体共振角的变化率在包括该时间段比其长10％以上的时间段内的表面等离子体共振角的变化率的±10％以内。
7.权利要求5中记载的方法，包括将求出的变化率与赋与对线粒体的极化状态的影响程度已经清楚的物质同样地求出的表面等离子体共振角的变化率相比较的步骤。
8.权利要求1或2中记载的方法，所述活细胞为培养的癌细胞。
9.权利要求1或2中记载的方法，所述活细胞内的线粒体的极化状态的变化是在以下(a)-(h)中的1个以上步骤后检测的：
(a)向活细胞提供脂质代谢促进物质的步骤；
(b)向活细胞提供细胞的凋亡诱导物质的步骤；
(c)向活细胞提供siRNA的步骤；
(d)向活细胞提供抗癌物质的步骤；
(e)向活细胞提供致癌物质的步骤；
(f)向活细胞提供对细胞的分裂活性有影响的物质的步骤；
(g)向活细胞提供内分泌紊乱物质的步骤；
(h)向活细胞提供细胞毒性物质的步骤。
10.根据权利要求1或2记载的方法，前述检测表面等离子体共振角的变化的步骤中，细胞外溶液的pH的变化速度在pH0.005/min以上。
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