CN101334344B - 从固体、半固体制剂中分离功效成分微粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从用于药品、化妆品、食品、化学品等中乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、栓剂等固体、半固体制剂中分离功效成分微粒的方法，从而便于对功效成分进行检测分析。其中所述功效成分的微粒为不溶于水、不溶于油的粒径在2nm-200μm之间的微粒。
Description
技术领域
本发明涉及从用于药品、化妆品、食品、化学品等中乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、栓剂等固体、半固体制剂中分离功效成分微粒的方法，从而便于对功效成分进行检测分析。
背景技术
在医药、化妆品、保健食品、化学品等领域中，广泛存在乳膏体或凝胶体等膏体产品，在这些产品中有的含有微量的功效成分，这些微量功效成分微粒的检测分析是保障人民安全使用药品、护肤品及食品健康的重要环节。也是监督这些产品是否具有功效作用或是具有危害人体健康作用的主要手段。
当前状况是各类乳膏剂和凝胶剂等膏剂产品发展迅猛，应用极为广泛。但是现有技术缺少对其中一些特殊功效成分微粒的检测手段，存在一些难解决的分离难题：如对于具有特殊功效的微粒，因没有与之相应的溶剂，而致没有办法进行通过溶性分离进行检测；而且由于还需要保持功效成分微粒的生物活性，所以分离方法要限定于物理方法范围；另外，由于一些乳膏体和凝胶体中含有的功效成分微粒的含量极少，有的含量仅达几十微克，颗粒极小，甚至有的颗粒达到纳米程度。如此种种，都给从乳膏体或凝胶体以及软膏、栓剂等分离微量功效成分微粒带来了困难。也使得其后续对功效成分微粒的检测分析无法进行。
这一缺少有效分离方法的状况也导致有些乳膏剂、凝胶剂等膏剂产品的特殊功效成分微粒无法检测和分析，进而也导致无法判定该功效成分微粒是有益人的健康还是无益人的健康，或是有某种功效还是没有某种功效。
这一状况还可导致某些有前景新产品，由于无法从乳膏体或凝胶体以及软膏、栓剂中分离功效成分微粒而无法对其进行检测分析，从而导致该产品因没有有效分离检测方法而无法按国家规定要求申报审批。
发明内容
为此为了克服现有技术的不足之处，本申请人致力于解决这一现实中的难题。经过大量的实验摸索和反复验证总结出一套切实可行的分离方法，经过多项实例验证，该方法可以从固体、半固体制剂如乳膏剂中或凝胶剂中以及软膏剂、栓剂中分离出功效成分微粒，该方法的最小分离几十微克，最小分离颗粒粒径可达纳米级。
所以，本发明的提出，为乳膏剂和凝胶剂以及软膏剂、栓剂等固体、半固体中的微量功效成分微粒的分离提供了一个成熟的系统的方法。
本发明涉及从固体、半固体制剂中分离功效成分微粒的方法，其中所述功效成分的微粒为不溶于水、不溶于油的粒径在2nm-200μm之间的微粒，所述方法包括以下步骤：
(1)、用水稀释固体、半固体制剂，其中水温为20-65℃，优选36-65℃；
(2)、超声波分散固体、半固体制剂，其中输出功率为25-200w，优选75-100w，持续时间为2-20分钟，优选2-10分钟；
(3)、恒温水浴振荡固体、半固体制剂稀释液初分层，其中振荡频率为20-100r/min，优选50-80r/min，持续时间为2-20分钟，优选为10-15分钟，水浴温度为20-70℃，优选为25-65℃；
(4)、离心分层，弃去上清液，留沉淀，其中离心转数为2500-6000转/分钟，优选为2800-5500转/分钟，持续时间为2-20分钟，优选为2-10分钟；
(5)、用水稀释所得沉淀物，其中水温为20-65℃，优选为25-65℃；
(6)、离心分层，弃去上清液，留沉淀，其中离心转数为1000-6000转/分钟，优选为2800-5500转/分钟，持续时间为2-10分钟，优选为2-10分钟；
(7)、反复进行步骤(5)和(6)得固体物。
简而言之，本发明涉及的从固体、半固体制剂中分离功效成分微粒的方法是：1、温纯水稀释膏体；2、超声波分散膏体；3、恒温水浴振荡膏体稀释液初分层；4、低中速离心稀释液再分层；5、再稀释再离心反复分层2-6次，优选4-5次，。通过这几步系统操作方法的综合使用，并按设定条件范围操作，按此分离方法均可将乳膏体中、凝胶体中以及软膏剂、栓剂中的微粒成分有效分离出来，然后再根据被检微粒特性进行常规的相应的检测分析。
本发明所述的功效成分微粒是指不溶于水不溶于油，保有生物活性的细小微粒，微粒可小至纳米级。本发明方法的最小分离量可达到微克级，即定量判定被分离微粒量不低于25ug，定性判定被分离微粒量不低于5ug。
本发明的特点
1.保持微量功效成分微粒的生物活性
由于本分离方法，完全采用物理方法，没有使用化学电学等方法，所以本方法保持了被分离膏体中原有微粒成分特性。适合膏体中含有活性微粒的分离检测。
2.精度高、适于微量微粒成分的分离
采用本发明方法分离，可有效进行乳膏体和凝胶体中微量微粒成分的精确分离，分离精度可达到分离微粒量几十微克。
3.分离方法系统规范、便于操作
本发明方法总结出规范操作程序和设置条件，可根据被分离物基质配方的特点和特性，选用设定好的操作方法和条件，均可做出理想结果。
4.常用检测设备且费用低
本发明办法使用的分离设备均为普通的国产常用设备，如：超声波破碎仪、小型离心机、水浴恒温振荡器等，只用纯水做稀释剂，无需其它特殊制剂。
5.适用于无对应相溶剂的微粒分离
在膏体中有一些微小颗粒因为没有对应相溶剂，将无法进行相溶性分离，进而无法进行下一步的检测。由于本办法采用分散分层分离方法，从而使得无相溶性溶剂的微粒的分离有了可能，而无相溶剂的微粒分离恰恰适合于本方法。
具体实施方式
实施例
实验材料
超声粉碎机，规格：CS-250，吉林通化市电子仪器厂
离心机，规格：TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂
水浴恒温振荡器，规格：SHZ-B，上海跃进医疗器械厂
实施例1诺卡乳膏剂、凝胶剂、软膏剂型和栓剂中功效成分的分离
本发明的验证实例选择沈阳胜宝康生物制药有限公司研制的含有微量功效成分的诺卡乳膏剂型、诺卡凝胶剂型、诺卡软膏剂型和诺卡栓剂型，按本发明方法，分别对这四个剂型进行微量功效成分分离实验。
1)诺卡乳膏剂中功效成分的分离
其中受检的诺卡乳膏属于水包油型乳膏剂基质，主要使用的是常用的乳化剂三乙醇胺、16/18醇、单甘脂、硬脂酸等原料，符合国家药典的要求。
而所述诺卡乳膏的关键功效成分微粒是红色诺卡氏菌细胞壁骨架，每10克含量仅为30ug。而且红色诺卡氏菌细胞壁骨架没有相应溶剂，无法进行常规分离。本实验在8g诺卡乳膏基质中加入240ug红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
本方法是将含有功效成分微粒从乳膏剂中分离出来，得到微粒成分，然后再用紫外分光光度法测定微粒成分及含量。
1)从诺卡乳膏剂中分离功效成分的具体步骤包括：
(1)取8g诺卡乳膏剂于50ml离心管；
(2)加50℃纯水搅拌稀释；
(3)通过超声分散(75-100W)3min；
(4)进行水浴恒温振荡分散10min；
(5)5000rpm离心10min，去上清留沉淀物；
(6)再加50℃纯水至50ml搅拌稀释；
(7)再5000rpm离心10min，去上清留沉淀物；
(8)转移至10ml离心管，继续加50℃纯水至10ml搅拌稀释；
(9)继续5000转离心10min，去上清留沉淀物；
(10)再一次加50℃纯水至10ml搅拌稀释；
(11)再一次5000转离心10min，去上清留沉淀物，得最终分离微粒体。
通过以上各步骤，可以将功效成分微粒与乳膏基质分离。接下对分离出的沉淀微粒，按国家药典检定方法测得，该微粒体是红色诺卡氏菌细胞壁骨架，并测检出基含量，与乳膏体中注明的功效成分微粒名称和含量相符。
2)诺卡乳膏定性分析
样品：自制诺卡乳膏，规格：每克乳膏中红色诺卡氏菌细胞壁骨架的含量5μg。
按下表配方，乳化，制备乳膏。
| C项 | 红色诺卡氏菌细胞壁骨架原液 | 诺卡乳膏加原液150μl； |
定性鉴别试验
(1)取诺卡乳膏1g，于10ml离心管用50℃纯水稀释；
(2)超声波分散2min；
(3)50℃恒温水浴振荡分散10min；
(4)5000rpm离心10min，留沉淀，弃上清；
(5)加50℃水至10ml搅拌稀释；
(6)再5000rpm离心5min，弃上清；
(7)再加水至10ml搅拌稀释；
(8)继续5000rpm离心5min，去上清；
(9)继续加水至10ml搅拌稀释；
(10)继续5000rpm离心5min，去上清，得最终沉淀分离物；
同时做空白对照。诺卡乳膏组为1号管，空白对照组为2号管。
最后一次离心后弃去上清液，于1号、2号离心管中各加水0.8ml，混匀。分别移入相应两支试管中。向两支试管中各加入0.05％蒽酮硫酸溶液1.6ml，于625nm波长比色。
结果：1号管(诺卡乳膏)显蓝绿色，2号管(空白对照)未显色。说明1号管中含有红色诺卡氏菌细胞壁骨架。结果表明，有效成分含量为5μg/g的诺卡乳膏仍能通过上述物理方法进行分离，并做定性分析。
定量鉴别试验
按上表配方自制诺卡乳膏，不同的是C项中诺卡乳膏加原液200μl规格：每克乳膏中红色诺卡氏菌细胞壁骨架的含量25μg，其中含胞壁酸含量不低于0.42μg，糖含量不低于1.7μg。
定量鉴别步骤：
(1)取诺卡乳膏②8g，分装于8支离心管中，每管用10ml50℃纯水稀释；
(2)超声波分散2min；
(3)50℃恒温水浴振荡分散10min；
(4)5000rpm离心10min，留沉淀，弃上清；
(5)将8支离心管中的沉淀合并到1支离心管中，50℃水至10ml搅拌稀释；
(6)再5000rpm离心5min，弃上清；
(7)再加水至10ml搅拌稀释；
(8)继续5000rpm离心5min，去上清；
(9)继续加水至10ml搅拌稀释；
(10)继续5000rpm离心5min，去上清，得最终沉淀分离物；
同时做空白对照。诺卡乳膏组为1号管，空白对照组为2号管。
糖含量的测定
将分离出来的沉淀物用1.0ml蒸馏水稀释至一带塞试管中，分别加入2％蒽酮乙酸乙酯溶液0.25ml、浓硫酸2.0ml，在80℃水浴保温30分钟，立即用流水冷却至室温。在625nm波长测吸光度值。
以阿拉伯糖对照品溶液的系列浓度对其吸光度值作直线回归，将供试品溶液的吸光度值带入直线回归方程，求出其相应糖含量。
胞壁酸含量测定
将待检供试品、空白对照和对照品溶液移入试管，用移液器各加入4％硫酸铜溶液100ul，振荡20秒混匀。加入6ml浓硫酸，振荡20秒混匀(加盖)。将试管放入100℃水浴中加热10分钟，用流水冷却至室温。用移液器准确加入100μl的1.5％对羟基联苯溶液，立即振荡20秒混匀。25℃水浴中呈色30分钟后，100℃水浴90秒使液体澄清。将待检供试品、空白对照品在564nm波长处测吸光度值。
以胞壁酸对照品溶液的系列浓度对其吸光度值作直线回归，将供试品溶液的吸光度值带入直线回归方程，求出其相应胞壁酸含量。
定量分析结果
糖含量为4.2μg符合不低于1.7μg的国家标准要求，胞壁酸含量为：1.2μg符合不低于0.42μg的国家标准要求。结果表明糖含量和胞壁酸的含量都符合要求，表明效成分含量为25μg/g的诺卡乳膏仍能通过上述物理方法进行分离，并做定量分析。
2)诺卡凝胶剂中功效成分的分离
本次验证是选择诺卡凝胶剂型，该凝胶剂主要含有红色诺卡氏菌细胞壁骨架的微量微粒成分，以卡波姆940凝胶基质，混均制成的均一凝胶药物，按国家药典要求并加入适量防腐剂、保湿剂等。采用多种检验分离方法均无法有效分离功效成分微粒。如采用检验试液有干扰，加酸、碱等试剂也无法分离，还有加电解质等也无法分离。
但采用本发明方法后，凝胶剂顺利被分散、分层、分离。最终在沉淀物中得到功效成分微粒。本实验所分离8g凝胶剂含有240ug红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
从诺卡凝胶剂中分离功效成分的具体步骤包括：
(1)取8g凝胶剂，分装至8个离心管中，每支离心管放1g凝胶剂；
(2)每支离心管加水至10ml，然后搅拌稀释；
(3)超声波分散2min；
(4)振荡分散10min；
(5)3000rpm离心10min，去上清留沉淀物；
(6)把4支并1支，共合并成2支离心管加水至10ml搅拌稀释；
(7)再1500rpm离心5min，去上清留沉淀物；
(8)再加水至10ml搅拌稀释；
(9)继续1500rpm离心5min，去上清留沉淀物；
(10)继续加水至10ml搅拌稀释；
(11)再1500rpm离心5min，去上清留沉淀物；
(12)最后将2支合并成1支离心管加水至10ml搅拌稀释；
(13)再一次3000转离心5min，去上清，得最终微粒沉淀分离物。
接下对分离出的沉淀微粒，按药典检定方法测得，该微粒是红色诺卡氏菌细胞壁骨架，并测检含量相符。
3)诺卡软膏中功效成分微粒的分离
本实验取诺卡软膏进行分离微量功效成分微粒实验，诺卡软膏主要由凡士林、蜂蜡、硅油基质形成均一的混悬型半固体外用制剂，其主要功效成分微粒是红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
采用本发明方法，顺利将微量红色诺卡氏菌细胞壁骨架微粒分离。实验中10g诺卡软膏中含红色诺卡氏菌细胞壁骨架200ug。
从诺卡软膏剂中分离功效成分的具体步骤包括：
(1)取10g诺卡软膏于50ml离心管；
(2)加50℃纯水搅拌稀释；；
(3)超声波分散2min；
(4)恒温水浴振荡分散10min；
(5)5200rpm离心10min，弃上清留沉淀物；
(6)再加50℃纯水至50ml搅拌稀释；
(7)再5200rpm离心10min，弃上清留沉淀物；
(8)继续加50℃纯水稀释，转移至10ml离心管中，加水至10ml；
(9)再一次5200rpm离心10min，弃上清留沉淀物；
(10)再一次加50℃纯水至10ml搅拌稀释；
(11)再继续5200rpm离心10min，弃上清留沉淀，得到分离微粒体。
根据国家药典对该分离微量成分检测，证明为红色诺卡氏菌细胞壁骨架，并检测出含量相符。
4)诺卡栓剂中功效成分的分离
本实验取诺卡栓剂进行其微量功效成分分离实验，诺卡栓剂主要由三种聚乙二醇(PEG2000、PEG4000、PEG6000)基质形成的混悬型的固体制剂。其关键功效成分微粒是红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
本次实验采用本发明方法，将栓剂中微量功效成分微粒顺利分离。实验中，10g诺卡栓剂中含红色诺卡氏菌细胞壁骨架20ug。
从诺卡栓剂中分离功效成分的具体步骤包括：
(1)取10g诺卡栓剂至于50ml离心管；
(2)加50℃纯水搅拌稀释；；
(3)55℃水浴振荡分散10min；
(4)2800rpm离心10min，弃上清留沉淀物；
(5)再加50℃纯水至50ml搅拌稀释；
(6)再1200rpm离心10min，弃上清留沉淀物；
(7)继续加50℃纯水稀释，并转移至10ml离心管中，加水至10ml；
(8)继续1200rpm离心10min，弃上清留沉淀物；
(9)再一次加50℃纯水至10ml搅拌稀释；
(10)再一次2800rpm离心10min，弃上清留沉淀物，得到分离微粒体。
对于分离出微粒体按国家药典检测方法进行检测，证实该微粒确为为红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
实施例2龙骨粉乳膏中龙骨粉的分离
药用龙骨中常见的是马羊、牛、猪、鹿、象、犀、骆驼等类以及食肉动物的骨胳或牙齿，常为灰白色。龙骨被中医视为重要药物之一，李时珍的《本草纲目》《龙》一节论述龙骨″主治：心腹鬼症，精物老魅。咳逆。泄病月农血，女子漏下，症寂坚结，小儿热气惊病。
自制龙骨粉乳膏中每克含龙骨粉为≥400μg，含量低，粒径小于150μm，并且存在与乳膏体系中本试验通过物理方法分离龙骨粉乳膏中龙骨粉，并测定其含量。
实验步骤：
1.龙骨粉乳膏的制备
先将龙骨粉过100目筛网，得到≤150μm的龙骨颗粒。再按下表配方，乳化，制备乳膏。
2.稀释，取龙骨粉乳膏，按下表稀释成4个样品于10ml离心管中
| 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 空白 | |
| 龙骨粉含量(μg) | 400 | 200 | 100 | 20 | 0 |
| 龙骨粉乳膏含量(g) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.05 | 1 |
| 稀释倍数 | 20 | 25 | 30 | 100 | 10 |
3.分离
(1)按上表稀释样品；
(2)超声波分散2min；
(3)50℃恒温水浴振荡分散10min；
(4)5000rpm离心10min，留沉淀，将上清转移至另一10ml离心管中；
(5)加50℃水至10ml搅拌稀释；
(6)再5000rpm离心5min，去上清，与上一次沉淀合并；
(7)再加水至10ml搅拌稀释；
(8)继续5000rpm离心5min，去上清；
(9)继续加水至10ml搅拌稀释；
(10)继续5000rpm离心5min，去上清，得最终沉淀分离物；
3.定性鉴别
龙骨粉为灰白色物质，遇水略黄，若试验组出现灰黄色沉淀物，而对照组没有沉淀物，证明沉淀物为龙骨粉。
4.定量试验
10g龙骨粉乳膏均分于10支离心管中，分离，将沉淀合并，用纯水稀释成1ml悬液，干燥，用分析天平测定每克乳膏中龙骨粉的含量。
5.结果
通过以上步骤分离后，肉眼见样品1、样品2、样品3、样品4有少量灰黄沉淀物，且沉淀物的量依次减少，空白对照组无沉淀物。因龙骨粉就是灰白略黄色的物质，与空白对照相比较可判定沉淀物就是龙骨粉。
定量试验结果：
6.结论
(1)分离结果显示有灰黄色沉淀物，证明分离出来的沉淀物就是龙骨粉。
(2)样品1、样品2、样品3、样品4中灰白略黄色沉淀物依次减少，说明与样品中龙骨粉含量的多少有关，也与试验的稀释倍数相吻合。
(3)定量试验结果龙骨粉含量为390μg/ml，与样品标注的含量(≥400μg/ml)相接近，在误差允许范围内。
实施例3纳米银凝胶中纳米银的分离
纳米银凝胶具有消炎、杀菌的作用。主要成分是凝胶中的纳米银，其直径只有8-10nm，在凝胶中的含量也仅有几百微克，因此给定性定量检验纳米银凝胶中纳米银带来了很多困难，本次试验就是想通过一些物理方法来分离出纳米银，并进行定性定量试验。
样品：纳米银抗菌水凝胶，规格：3ml/支，每毫升凝胶纳米银含量≥350μg，长春市科新生化药械研究所。
实验步骤：
1.稀释，取纳米银凝胶，按下表稀释成4个样品于10ml离心管中
| 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 空白 | |
| 纳米银含量(μg) | 350 | 175 | 87.5 | 17.5 | 0 |
| 纳米银凝胶含量(ml) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.05 | 1 |
| 稀释倍数 | 25 | 30 | 30 | 200 | 10 |
2.分离方法
(1)按上表稀释样品；
(2)超声波分散2min；
(3)振荡分散10min；
(4)3000rpm离心10min，去上清；
(5)加水至10ml搅拌稀释；
(6)再1500rpm离心5min，去上清；
(7)再加水至10ml搅拌稀释；
(8)继续1500rpm离心5min，去上清；
(9)继续加水至10ml搅拌稀释；
(10)继续1500rpm离心5min，去上清；
(11)加水至10ml搅拌稀释；
(12)继续3000转离心5min，去上清，得最终沉淀分离物。
3.定性鉴别
于离心管中加入3滴浓硝酸，充分振荡1min，再在离心管中滴加3滴稀盐酸，静止观察。
4.定量试验
10ml纳米银凝胶均分于10支离心管中，分离，将沉淀合并，用纯水稀释成1ml悬液，干燥，用分析天平测定每毫升凝胶中纳米银的含量。
5.结果
通过以上步骤分离后，肉眼见样品1、样品2、样品3有少量银灰色沉淀物，且沉淀物的量依次减少，样品4和空白对照肉眼未见沉淀物。
定性鉴别试验结果：
| 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 空白 | |
| 纳米银含量μg) | 350 | 175 | 87.5 | 17.5 | 0 |
| 纳米银凝胶含量(ml) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.05 | 1 |
| 稀释倍数 | 20 | 25 | 30 | 100 | 10 |
| 现象 | 白色絮状沉淀 | 白色絮状沉淀 | 白色絮状沉淀 | 白色絮状沉淀 | 无变化 |
样品1、样品2、样品3、样品4均有白色絮状沉淀产生，沉淀的量依次减少，空白对照无变化。
定量实验结果：
6.结论
(1)分离结果显示有银灰色沉淀物，定性鉴别试验的现象有白色絮状沉淀产生，而白色絮状沉淀是样品中产生氯化银的特征表现，证明分离出来的银灰色沉淀物就是纳米银。
(2)样品4分离结果肉眼未见到银灰色沉淀，是因为样品4中的纳米银含量很低，只有17.5μg，但鉴别试验有白色絮状沉淀产生，证明了样品4中有纳米银的存在。也说明本方法对主要成分含量在几十微克的样品也适用。
(3)样品1、样品2、样品3、样品4中银灰色沉淀物和白色絮状沉淀的量都是依次减少，说明与样品中纳米银含量的多少有关，也与试验的稀释倍数相吻合。
(4)定量试验结果纳米银含量为360μg/ml，与样品标注的含量(≥350μg/ml)相一致。
实施例5纳米珍珠粉乳膏中珍珠粉的分离
珍珠所含化学成分是人体内生物化学反应过程中的重要活性物质，能促进人体新陈代谢、调节生理机能，从而发挥珍珠的治疗和保健功能。因此，珍珠粉不但是一个美容养颜的佳品，更是强身健体的上好首选。
自制纳米珍珠粉乳膏中每可含珍珠粉仅为≥400μg，含量低，粒径小于80nm，并且存在与乳膏体系中，因此为测定珍珠粉的含量带来了困难，本试验通过物理方法分离纳米珍珠粉乳膏中珍珠粉，并测定其含量。
样品：自制纳米珍珠粉乳膏，规格：每克乳膏中纳米珍珠粉的含量≥400μg。
试验步骤：
1.纳米珍珠粉乳膏的制备
按下表配方，乳化，制备乳膏。
2.稀释，取纳米珍珠粉乳膏，按下表稀释成4个样品于10ml离心管中
| 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 空白 | |
| 纳米珍珠粉含量(μg) | 400 | 200 | 100 | 20 | 0 |
| 纳米珍珠粉乳膏含量 | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.05 | 1 |
| (g) | |||||
| 稀释倍数 | 20 | 25 | 30 | 100 | 10 |
3.分离方法
(1)按上表稀释样品；
(2)超声波分散2min；
(3)50℃恒温水浴振荡分散10min；
(4)5000rpm离心10min，留沉淀，将上清转移至另一10ml离心管中；
(5)加50℃水至10ml搅拌稀释；
(6)再5000rpm离心5min，去上清，与上一次沉淀合并；
(7)再加水至10ml搅拌稀释；
(8)继续5000rpm离心5min，去上清；
(9)继续加水至10ml搅拌稀释；
(10)继续5000rpm离心5min，去上清，得最终沉淀分离物；
4.定性鉴别
珍珠粉为乳白色物质，遇水略黄，若试验组出现乳白略黄色的沉淀物，而对照组没有沉淀物，证明沉淀物为珍珠粉。
5.定量试验
10g纳米珍珠粉乳膏均分于10支离心管中，分离，将沉淀合并，用纯水稀释成1ml悬液，干燥，用分析天平测定每克乳膏中珍珠粉的含量。
6.结果
通过以上步骤分离后，肉眼见样品1、样品2、样品3、样品4有少量乳白略黄的沉淀物，且沉淀物的量依次减少，空白对照组无沉淀物。因珍珠粉就是乳白略黄色的物质，与空白对照相比较可判定沉淀物就是珍珠粉。
定量试验结果：
即400μg。
7.结论
(1).分离结果显示有乳白略黄色的沉淀物，证明分离出来的沉淀物就是珍珠粉。
(2).样品1、样品2、样品3、样品4中乳白色沉淀物依次减少，说明与样品中珍珠粉含量的多少有关，也与试验的稀释倍数相吻合。
(3).定量试验结果纳米珍珠粉含量为400μg/g，与样品标注的含量(≥400μg/g)相一致。
实施例6三七粉乳膏中三七粉的分离
三七为五加科人参属植物，是中国特有的名贵中药材，也是我国最早的药食同源植物之一，三七自古以来就被公认为具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效，具有“金不换”、“南国神草”之美誉。
自制三七粉乳膏中每克含三七粉仅为≥400μg，含量低，粒径小于150μm，并且存在与乳膏体系中，因此为测定三七粉的含量带来了困难，本试验通过物理方法分离三七粉乳膏中三七粉，并测定其含量。
样品：自制三七粉乳膏，规格：每克乳膏中三七粉的含量≥400μg。
实验步骤：
1.三七粉乳膏的制备
先将三七粉过100目筛网，得到≤150μm的三七粉颗粒。按下表配方，乳化，制备乳膏。
2.稀释，取三七粉乳膏，按下表稀释成4个样品于10ml离心管中
| 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 空白 | |
| 三七粉含量(μg) | 400 | 200 | 100 | 20 | 0 |
| 三七粉乳膏含量(g) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.05 | 1 |
| 稀释倍数 | 20 | 25 | 20 | 150 | 10 |
3.分离方法
(1)按上表稀释样品；
(2)超声波分散2min；
(3)50℃恒温水浴振荡分散10min；
(4)5000rpm离心10min，留沉淀，将上清转移至另一10ml离心管中；
(5)加50℃水至10ml搅拌稀释；
(6)再5000rpm离心5min，去上清，与上一次沉淀合并；
(7)再加水至10ml搅拌稀释；
(8)继续5000rpm离心5min，去上清；
(9)继续加水至10ml搅拌稀释；
(10)继续5000rpm离心5min，去上清，得最终沉淀分离物；
4.定性鉴别
三七粉为青黄色物质，若试验组出现青黄色沉淀物，而对照组没有沉淀物，证明沉淀物为三七粉。
5.定量试验
10g乳膏三七粉均分于10支离心管中，分离，将沉淀合并，用纯水稀释成1ml悬液，干燥，用分析天平测定每克乳膏中三七粉的含量。
6.结果
通过以上步骤分离后，肉眼见样品1、样品2、样品3青黄色沉淀物，且沉淀物的量依次减少，样品4和空白对照组无沉淀物。因三七就是青黄色物质，与空白对照相比较可判定沉淀物就是三七粉。
定量试验结果：
7.结论
(1).分离结果显示有青黄色的沉淀物，证明分离出来的沉淀物就是三七粉。
(2).样品1、样品2、样品3青黄色沉淀物依次减少，说明与样品中三七粉含量的多少有关，也与试验的稀释倍数相吻合。样品4未见沉淀物，是因为三七的含量很低，肉眼无法看到。
(3).定量试验结果三七粉含量为370μg/g，与样品标注的含量(≥400μg/g)相接近，在误差允许范围内。
实施例7赭石粉乳膏中赭石粉的分离
赭石呈红褐色，具有味苦，寒，归心，肝经。代赭石具有平肝潜阳，重镇降逆，凉血止血的功能。用于眩晕耳鸣，呕吐，噫气，呃逆，喘息，以及血热所致的吐血，衄血。
但用量较大有砷中毒的可能性。自制赭石粉乳膏中每克含赭石粉仅为≥400μg，含量较低，粒径小于150μm，可避免用量较大引起砷中毒。但含量低，并且存在于乳膏体系中，因此为测定赭石的含量带来了困难，本试验通过物理方法分离赭石粉乳膏中赭石粉，并测定其含量。
样品：自制赭石粉乳膏，规格：每克乳膏中赭石粉的含量≥400μg。
步骤：
1.赭石粉乳膏的制备
先将赭石粉过100目筛网，得到≤150μm的赭石颗粒。再按下表配方，乳化，制备乳膏。
2.稀释，取赭石粉乳膏，按下表稀释成4个样品于10ml离心管中
| 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 空白 | |
| 赭石粉含量(μg) | 400 | 200 | 100 | 20 | 0 |
| 赭石粉乳膏含量(g) | 1 | 0.5 | 0.25 | 0.05 | 1 |
| 稀释倍数 | 15 | 25 | 30 | 100 | 10 |
3.分离方法
(1)按上表稀释样品；
(2)超声波分散2min；
(3)50℃恒温水浴振荡分散10min；
(4)5000rpm离心10min，留沉淀，将上清转移至另一10ml离心管中；
(5)加50℃水至10ml搅拌稀释；
(6)再5000rpm离心5min，去上清，与上一次沉淀合并；
(7)再加水至10ml搅拌稀释；
(8)继续5000rpm离心5min，去上清；
(9)继续加水至10ml搅拌稀释；
(10)继续5000rpm离心5min，去上清，得最终沉淀分离物；
4.定性鉴别
赭石为红褐色物质，若试验组出现红褐色沉淀物，而对照组没有沉淀物，证明红褐色沉淀物为赭石。
5.定量试验
10g赭石粉乳膏均分于10支离心管中，分离，将沉淀合并，用纯水稀释成1ml悬液，干燥，用分析天平测定每克乳膏中赭石粉的含量。
6.结果
通过以上步骤分离后，肉眼见样品1、样品2、样品3、样品4有少量红褐色沉淀物，且沉淀物的量依次减少，空白对照组无沉淀物。因赭石就是红褐色物质，与空白对照相比较可判定红褐色就是赭石。
定量试验结果：
7.结论
(1).分离结果显示有红褐色沉淀物，证明分离出来的沉淀物就是赭石粉。
(2).样品1、样品2、样品3、样品4中红褐色沉淀物依次减少，说明与样品中赭石粉含量的多少有关，也与试验的稀释倍数相吻合。
(3).定量试验结果赭石粉含量为420μg/ml，与样品标注的含量(≥400μg/ml)相一致。
Claims (10)
1.从固体、半固体制剂中分离功效成分微粒的方法，其中所述功效成分的微粒为不溶于水、不溶于油的粒径在2nm-200μm之间的微粒，所述方法包括以下步骤：
(1)、用水稀释固体、半固体制剂，其中水温为20-65℃；
(2)、超声波分散固体、半固体制剂，其中超声波粉碎机的输出功率为25-200w，持续时间为2-20分钟；
(3)、恒温水浴振荡固体、半固体制剂稀释液的初分层，其中振荡频率为20-100r/min，水浴温度为20-70℃，持续时间为2-20分钟；
(4)、离心分层，弃去上清液，留沉淀，其中离心转数为2500-6000转/分钟，持续时间为2-20分钟；
(5)、用水稀释所得沉淀物，其中水温为20-65℃；
(6)、离心分层，弃去上清液，留沉淀，其中离心转数为1000-6000转/分钟，持续时间为2-10分钟；
(7)、反复进行步骤(5)和(6)得固体物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体、半固体制剂选自乳膏剂、凝胶剂、栓剂、散剂、丸剂、含金属或者非金属的颗粒剂、胶囊剂、片剂或糊剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中功效成分微粒的粒径在8nm-150μm之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)的水温为36-65℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中超声波粉碎机的输出功率为75-100w，持续时间为2-10分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中振荡频率为50-80r/min，水浴温度为25-65℃，持续时间为10-15分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中离心转数为2800-5500转/分钟，持续时间为2-10分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(5)中的水温为25-65℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(6)中的离心转数为1200-5500转/分钟，持续时间为5-10分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其中反复进行步骤(5)和(6)的次数为2-6次。
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