CN101332296A - 一种促进脊髓损伤功能恢复的树突状细胞疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种树突状细胞疫苗，特别涉及一种可有效促进脊髓损伤功能恢复的树突状细胞疫苗及其制备方法。

Description

一种促进脊髓损伤功能恢复的树突状细胞疫苗

技术领域

本发明涉及一种树突状细胞疫苗，特别涉及一种可有效促进脊髓损伤功能恢复的树突状细胞疫苗及其制备方法。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)在世界上总发生率20-40人/百万人/年。美国发生率为28-55人/百万人/年，每年新增病例约1万人，损伤时平均年龄为31.7岁，约有SCI病人230000人。患者个人终生花费约为50万-200万美元，每年护理与治疗总费用超过70亿美元。我国没有全面的统计，但估计不低于此水平。

脊髓急性损伤的机械性暴力包括压迫力与牵拉力。直接的压迫暴力是由于脊柱骨折与脱位、椎间盘、韧带损伤所致，引起血管损害、轴突变性崩解、神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的死亡等等。在伤后数分钟内灰质发生小的出血，在数小时内损伤迅速沿轴向蔓延至损伤处上下一段脊髓灰质。伤后数分钟脊髓肿胀压迫中央管，脊髓内压力超过血管内压力时，出现局部继发性缺血，损伤后神经源性休克加重了脊髓缺血，缺血又导致组织缺氧，使组织产生并释放毒性产物，引起了一系列的级联放大损伤效应。SCI渡过急性期后，病变与神经功能趋向稳定进入慢性期。在损伤局部出现以囊腔及胶质瘢痕形成为特征的病理变化，轴突再生失败。目前SCI治疗的策略包括7个方面：(1)桥接缺损；(2)脱髓鞘轴突的再髓鞘化；(3)提供营养因子支持；(4)克服胶质瘢痕相关的生长抑制作用；(5)建立新神经通路；(6)克服髓鞘相关的生长抑制作用；(7)保护神经元和胶质细胞阻止继发性损害。桥接脊髓缺损包括使用外周神经、胚胎脊髓组织、雪旺氏细胞、嗅神经嗅鞘细胞(olfactoryensheathing cells，OECs)、成纤维细胞，可降解人工材料或生物相容性基质，干细胞和其它的组织等。应用神经营养因子，包括：脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养蛋白3(neurotrophine-3，NF-3)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(glia derived neurotrophic factor，GDNF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)，另外基因治疗使用腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒为载体向中枢神经系统(central nervous system，CNS)细胞内载入神经营养因子基因。克服髓鞘相关的生长抑制因子，使用抗体、肽、基因突变、或提高cAMP，克服髓鞘相关的抑制因子如nogo、MAGP、OMGP。使用硫酸软骨素酶ABC，消化CSPGs氨基葡聚糖链来克服CSPG的抑制作用，即克服胶质瘢痕抑制再生的屏障作用。保护神经元和胶质细胞，防止继发性炎症、缺血、兴奋性毒性、凋亡，阻止少突胶质细胞的延迟死亡。已经证明有效的药物为类固醇激素，需要在损伤后8h内给予，作用为抑制脂质过氧化和水解，抑制细胞内Ca²⁺的蓄积，保护细胞膜，从而保护神经细胞。还有神经节苷脂(GM-1)，主要作用是保护细胞膜，减轻组织水肿，促进轴突再生，抑制一氧化氮合酶的合成，减少其对神经细胞的毒性损伤。另外，促甲状腺激素释放激素(thyrotropin releasing hormone，TRH)、尼莫地平(nimodipine)和gacycliding已经进行临床试验。

免疫反应在SCI中的作用受到越来越多的关注。Schwartz等研究发现SCI后，免疫反应在局部组织修复和神经功能恢复中起到重要作用，并提出了保护性自身免疫反应(protective autoimmunity)的概念。这是一种T细胞介导的抗原特异性的自身免疫反应，在SCI后对局部神经组织和神经功能恢复起到保护作用，目前研究较多的自身抗原为髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)及其相关肽。树突状细胞(dendritic cells，DCs)作为是专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，能够有效地调节免疫反应的强度和反应时间。研究证实，骨髓来源的DCs负载MBP可以改善SCI实验大鼠的后肢负重功能，发挥神经保护作用。进一步研究证实，导致自身免疫性疾病、具有神经保护作用的是Th-1细胞(T helper 1 cell)，而抗原特异性免疫细胞与成年神经干细胞/前体细胞(adult neuralstem/progenitor cells，aNPCs)之间具有协同作用。

DCs在SCI中的作用获得肯定，但目前研究尚存在的一些问题：首先，研究中使用的动物模型多为脊髓切割伤模型，与临床患者多因骨折块、韧带、椎间盘或血肿压迫所致的挫伤性损伤病理类型不相符，影响着研究结果应用到临床；打击伤模型需要特殊器械，人为误差大，难以标准化；第二，MBP等制备复杂，不利于临床医生掌握和研究；第三，使用的自身抗原越来越特异化，多为某单一肽段，而SCI时体内多种组织抗原成分并存，相互作用关系复杂，可能存在多种相加或相减作用，单一抗原成分难以反映体内真实情况。因此我们采用脊髓钳夹伤模型，使用包含所有可能抗原成分的脊髓匀浆蛋白(homogenateprotein of spinal cord，hp)研究DCs在SCI中的作用，通过神经运动功能评分、病理学及免疫学方法相结合，观察其对SCI后神经功能恢复的作用，并观察局部病变范围、胶质瘢痕厚度、空洞大小及轴突再生的变化，希望能为SCI修复提供新的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种可有效促进脊髓损伤功能恢复的树突状细胞疫苗。

本发明的另一目的是提供此疫苗的制备方法。

本发明所述树突状细胞疫苗是负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞。

本发明所述脊髓损伤是各种机械性暴力(包括压迫力与牵拉力)所致脊髓的轴突变性崩解、神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的死亡等。

本发明所述树突状细胞是从体内免疫器官或/和免疫细胞中直接分离的树突状细胞以及通过骨髓、外周血单核细胞以及干细胞诱导的树突状细胞。

本发明的疫苗，制备过程简单，主要步骤是：将脊髓匀浆蛋白负载到自身树突状细胞内。

本发明的疫苗的使用方法是，制备好的疫苗通过注射输入到体内，激发机体的保护性免疫反应，促进损伤脊髓的功能恢复。

本发明的疫苗是通过以下方法制备的：

1)骨髓细胞分离，2)用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导骨髓细胞分化为未成熟树突状细胞，3)制备脊髓匀浆蛋白，4)脊髓匀浆蛋白负载到未成熟树突状细胞内。

其中步骤1中所述骨髓细胞是从人或动物的含有骨髓的骨骼中提取分离出来的。

其中步骤2中所述未成熟树突状细胞是从骨髓细胞分化而来的。

其中步骤3中所述脊髓匀浆蛋白是从同系动物的脊髓提取分离出来的。

其中步骤4中所述负载是脊髓匀浆蛋白和未成熟树突状细胞混合后共同用培养基培养一段时间，使前者被后者摄取。

本发明的疫苗经过洗涤，即可保存使用，使用前，将细胞离心分离，加入到PBS中供注射用。

本发明的疫苗具体可以采用以下方法制备：

1)、骨髓细胞的获取：取鼠股骨与胫骨，用PBS冲洗后，乙醇固定，再清洗，置RPMI1640培养液中备用；用无菌空针抽取RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲洗到培养皿中，经消毒棉球过滤；收集过滤后的含骨髓细胞RPMI 1640培养液，离心，弃上清，加入红细胞裂解液，然后加入等体积的PBS，终止裂解反应；离心，弃上清，加入RPMI 1640培养液混匀，离心，弃上清。

2)、骨髓细胞的诱导：将洗涤后的骨髓细胞用含小牛血清RPMI 1640培养液配制成细胞悬液，调浓度；取6孔板，加入细胞悬液，同时加入含小牛血清RPMI 1640培养液，最后加入鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，置CO2培养箱培养10天，期间，换液，同时补充等量含小牛血清RPMI 1640培养液与巨噬细胞集落刺激因子。

3)、树突状细胞的鉴定：第10天，收集非粘附细胞并离心，经流式细胞仪鉴定，本实验中所使用DCs经检测CD11c⁺细胞＞94％(见图5)。以CD11c⁺细胞圈门，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面标志检测，判定成熟度(见图6)。其中黑线为未成熟DCs，红线为LPS刺激后的成熟DCs，检测显示刺激后的DCs的特征性标记物表达明显升高。本实验中采用未成熟DCs。

4)、树突状细胞的负载：获取同系动物的脊髓，常规制备脊髓匀浆蛋白并定量，将未成熟DCs放入含脊髓匀浆蛋白的DC培养基培养共同孵育2h，新鲜DC培养基冲洗，冰上保存备用，注射前，细胞进行离心，并悬浮于PBS。

实验表明，本发明的疫苗可用于动物的促进脊髓损伤功能恢复。

根据本发明的方法制备的疫苗可以用于人类。

本发明的疫苗以从自身或同系动物提取脊髓匀浆蛋白，用自身树突状细胞负载并注射到自身体内为佳。

本发明的疫苗的优选制备方法列在实施例中。

对本发明实施例1中从小鼠得到的骨髓制备的疫苗进行测试，结果如下：

实验一、脊髓损伤小鼠各治疗组运动功能评价

成年BALB/c小鼠，使用显微外科动脉夹制作T10节段重度钳夹伤SCI模型；制备小鼠未成熟DCs、hp及hpDCs；实验动物分3组，伤后1天，BBB评分＜2分者，分别局部或腹腔注射hp(局部：40μg/5μL；腹腔：40μg/0.3mL)、DCs(局部：1×10⁶cells/5μL；腹腔：1×10⁶cells/0.3mL)或hpDCs(局部：1×10⁶cells/5μL；腹腔：1×10⁶cells/0.3mL)；各动物每周进行BBB评分，观察神经功能恢复情况。

结果表明，模型成功率86.5％，各组小鼠在伤后均出现完全性截瘫，1w左右BBB评分逐渐恢复。其中，hpDCs组小鼠恢复最快，于28dpi进入平台期，BBB评分高达14.0±2.0，最终达到16.3±2.1，显著高于hp组(10.4±1.8)和DCs组(10.0±2.0)。腹腔注射和局部注射BBB评分结果无统计学差异。结果见表1、图1。

表1小鼠BBB评分记录结果(n＝90)

*：与其它二组比较，p＜0.01。

实验二、各治疗组84dpi脊髓纵行矢状切片的病理变化观察

小鼠分别于注射后28、56、84天(days post injection，dpi)过量麻醉处死，每个时间点随机处死4只动物，先用生理盐水100ml经左心室灌注冲净血液，再用100ml 4％多聚甲醛灌注固定。以脊髓损伤区为中心取脊髓1.5cm，4％多聚甲醛液后固定，石蜡包埋，连续纵行切片(5μm)，HE染色观察损伤后损伤区病理变化及病变结构。免疫组织化学染色(IHC)与免疫荧光组织化学双标法观察损伤后胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、Nestin、神经微丝(neurofilament，NF)在损伤区表达情况，测量胶质瘢痕厚度。

HE染色显示各组在相应时间点的病理结构基本相同。在28dpi，损伤区细胞结构混乱，丧失正常脊髓传导束的纵行排列结构，损伤区与周围分界范围不清；在56dpi，损伤区形成囊腔，边界较清楚，有条状胶质瘢痕伸入囊腔内，囊腔内有较多无定形成分及细胞成分，囊腔壁有较完整的室管膜细胞覆盖；在84dpi，损伤处囊腔边界清楚，囊壁胶质瘢痕增生，囊壁光滑，内为液体成分，损伤处形成的囊腔壁有较多新生血管。

观察小鼠SCI后84dpi切片，NF与GFAP荧光双标，以肥大的星形胶质细胞为标记，对囊腔壁胶质瘢痕的厚度进行测量，结果显示hpDCs组在损伤区范围、空洞面积、胶质瘢痕厚度等指标与DCs组相比均明显减轻；空洞面积与hp组相比也明显减轻。结果见表2、图2。

表284dpi各组损伤区范围、空洞、胶质瘢痕厚度测量

a：与DCs组相比，p＜0.05；b：与hp组相比，p＜0.05。

实验三、各治疗组脊髓纵行矢状切片的免疫组织化学及免疫荧光染色观察

各组处理同上，免疫组织化学及免疫荧光染色观察损伤后胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)、神经微丝(neurofilament，NF)、Nestin在损伤区表达情况。

结果表明，慢性脊髓损伤的囊腔周围GFAP阳性表达的星形胶质细胞肥大增生，突起丰富，构成胶质瘢痕的主要成分。与其它二组相比，hpDCs组GFAP表达出现较慢，且GFAP阳性细胞分布较稀疏，说明hpDCs可降低局部胶质细胞的反应性增生，从而可能降低局部由胶质细胞形成的物理屏障，并减少其分泌的抑制性细胞因子，因此改善神经功能；hpDCs组的Nestin阳性细胞在注射后56dpi仍可见，而其它二组在注射后28dpi基本消失，说明hpDCs可以增加局部神经内源性再生能力。NF表达可以明确地观察到损伤后轴突分布的情况，各组无显著区别。结果见图3、图4。

附图说明

图1为脊髓损伤小鼠各治疗组运动功能评价。

图2为各治疗组84dpi脊髓纵行矢状切片的胶质瘢痕厚度观察。A：hp组；B：DCs组；C：hpDCs组(红-NF，绿-GFAP)。

图3为各治疗组84dpi脊髓纵行矢状切片的GFAP阳性细胞观察。A：hp组；B：DCs组；C：hpDCs组。

图4为各治疗组84dpi脊髓纵行矢状切片的Nestin阳性细胞观察。A：hp组；B：DCs组；C：hpDCs组(红-Nestin，绿-GFAP)。

图5为DCs百分率(CD11c⁺细胞)测定。

图6为DCs表面标志物检测。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、树突状细胞疫苗制备方法的操作步骤

1、骨髓细胞的获取：取BALB/C小鼠两只，颈椎脱位处死，于75％乙醇中浸泡3min后，将小鼠固定在超净台，消毒剥开皮肤，剔去肌肉，取出股骨与胫骨，用PBS冲洗后，在75％乙醇固定3min，再以PBS清洗，置RPMI 1640培养液中备用。用镊子固定骨干，剪刀剪去骨两端，再用无菌空针抽取RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，反复2-3次，将骨髓细胞冲洗到培养皿中，最后将培养皿中含骨髓细胞的RPMI 1640培养液经消毒棉球过滤，除去其组织成分。收集过滤后的含骨髓细胞RPMI 1640培养液，1500rpm离心15min，弃上清，加入红细胞(red blood cells，RBC)裂解液4ml，裂解3min，然后加入等体积的PBS，充分混匀，终止裂解反应。900rpm离心10min，弃上清，加入RPMI 1640培养液混匀，900rpm离心10min，弃上清。

2、骨髓细胞的诱导：将洗涤后的骨髓细胞用含小牛血清RPMI 1640培养液配制成1ml的细胞悬液，细胞计数，调浓度至1×10⁶个/ml。取6孔板，加入细胞悬液0.5ml/孔，同时加入含小牛血清RPMI 1640培养液2ml/孔，最后加入浓度为5mg/ml的鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(mouse Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，mGM-CSF)10μl/孔(终浓度为20μg/ml)。置CO₂培养箱37℃培养10天，并在第3、6、8天换液，同时补充等量含小牛血清RPMI 1640培养液与mGM-CSF。

3、树突状细胞的鉴定：第10天，收集非粘附细胞并离心，经流式细胞仪鉴定，本实验中所使用DCs经检测CD11c⁺细胞＞94％(见图5)。DCs分为两组，一组为未成熟DCs，另一组为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激24h(1μg/ml)后的成熟DCs。以CD11c⁺细胞圈门，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面标志检测，判定成熟度(见图6)。其中黑线为未成熟DCs，红线为LPS刺激后的成熟DCs，检测显示刺激后的DCs的特征性标记物表达明显升高。本实验中采用未成熟DCs。

4、树突状细胞的负载：获取同系动物的脊髓，常规制备脊髓匀浆蛋白并定量，将未成熟DCs放入含脊髓匀浆蛋白(1μg/μl)的DC培养基培养(不添加细胞因子mGM-CSF，细胞浓度为2×10⁶/ml)共同孵育2h，新鲜DC培养基冲洗，冰上保存备用。注射前，细胞进行离心，并悬浮于PBS(5×10⁵/5μl PBS供局部注射，1×10⁶/0.3ml PBS供腹腔注射)。

Claims (10)

1.一种促进脊髓损伤功能恢复的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗是负载脊髓匀浆蛋白的未成熟树突状细胞。

2.权利要求1的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述未成熟树突状细胞是从体内免疫器官或/和免疫细胞中直接分离的树突状细胞以及通过骨髓、外周血单核细胞以及干细胞诱导的树突状细胞。

3.权利要求1的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述脊髓损伤是各种机械性暴力所致脊髓的轴突变性崩解、神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的死亡。

4.一种促进脊髓损伤功能恢复的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

1)骨髓细胞分离，2)用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子诱导骨髓细胞分化为未成熟树突状细胞，3)制备脊髓匀浆蛋白，4)脊髓匀浆蛋白负载到未成熟树突状细胞内。

5.权利要求4的制备方法，其特征在于，

其中步骤1中所述骨髓细胞是从人或动物的含有骨髓的骨骼中提取分离出来的。

其中步骤2中所述未成熟树突状细胞是从骨髓细胞分化而来的。

其中步骤3中所述脊髓匀浆蛋白是从同系动物的脊髓提取分离出来的。

其中步骤4中所述负载是脊髓匀浆蛋白和未成熟树突状细胞混合后共同用培养基培养一段时间，使前者被后者摄取。

6.权利要求4的制备方法，其特征在于，步骤如下

1)、骨髓细胞的获取：取鼠股骨与胫骨，用PBS冲洗后，乙醇固定，再清洗，置RPMI 1640培养液中备用；用无菌空针抽取RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲洗到培养皿中，经消毒棉球过滤；收集过滤后的含骨髓细胞RPMI 1640培养液，离心，弃上清，加入红细胞裂解液，然后加入等体积的PBS，终止裂解反应；离心，弃上清，加入RPMI 1640培养液混匀，离心，弃上清。

2)、骨髓细胞的诱导：将洗涤后的骨髓细胞用含小牛血清RPMI 1640培养液配制成细胞悬液，调浓度；取6孔板，加入细胞悬液，同时加入含小牛血清RPMI 1640培养液，最后加入鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，置CO2培养箱培养10天，期间，换液，同时补充等量含小牛血清RPMI 1640培养液与巨噬细胞集落刺激因子。

3)、树突状细胞的鉴定：第10天，收集非粘附细胞并离心，经流式细胞仪鉴定，本实验中所使用DCs经检测CD11c⁺细胞＞94％(见图5)。以CD11c⁺细胞圈门，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面标志检测，判定成熟度(见图6)。其中黑线为未成熟DCs，红线为LPS刺激后的成熟DCs，检测显示刺激后的DCs的特征性标记物表达明显升高。本实验中采用未成熟DCs。

4)、树突状细胞的负载：获取同系动物的脊髓，常规制备脊髓匀浆蛋白并定量，将未成熟DCs放入含脊髓匀浆蛋白的DC培养基培养共同孵育2h，新鲜DC培养基冲洗，冰上保存备用，注射前，细胞进行离心，并悬浮于PBS。

7.权利要求4的制备方法，其特征在于，步骤如下

(1)骨髓细胞的获取：

取小鼠两只，颈椎脱位处死，于75％乙醇中浸泡3min后，将小鼠固定在超净台，消毒剥开皮肤，剔去肌肉，取出股骨与胫骨，用PBS冲洗后，在75％乙醇固定3min，再以PBS清洗，置RPMI 1640培养液中备用。用镊子固定骨干，剪刀剪去骨两端，再用无菌空针抽取RPMI 1640培养液冲洗骨髓腔，反复2-3次，将骨髓细胞冲洗到培养皿中，最后将培养皿中含骨髓细胞的RPMI 1640培养液经消毒棉球过滤，除去其组织成分，收集过滤后的含骨髓细胞RPMI 1640培养液，1500rpm离心15min，弃上清，加入红细胞裂解液4ml，裂解3min，然后加入等体积的PBS，充分混匀，终止裂解反应，900rpm离心10min，弃上清，加入RPMI 1640培养液混匀，900rpm离心10min，弃上清；

(2)骨髓细胞的诱导：

将洗涤后的骨髓细胞用含小牛血清RPMI 1640培养液配制成1ml的细胞悬液，细胞计数，调浓度至1×10⁶个/ml，取6孔板，加入细胞悬液0.5ml/孔，同时加入含小牛血清RPMI 1640培养液2ml/孔，最后加入浓度为5mg/ml的鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子10μl/孔终浓度为20μg/ml，置CO₂培养箱37℃培养10天，并在第3、6、8天换液，同时补充等量含小牛血清RPMI 1640培养液与mGM-CSF；

(3)树突状细胞的鉴定：

第10天，收集非粘附细胞并离心，经流式细胞仪鉴定，本实验中所使用DCs经检测CD11c⁺细胞＞94％，DCs分为两组，一组为未成熟DCs，另一组为脂多糖刺激24h(1μg/ml)后的成熟DCs，以CD11c⁺细胞圈门，作I-A/I-E、CD40、CD80、CD86表面标志检测，判定成熟度，其中黑线为未成熟DCs，红线为LPS刺激后的成熟DCs，检测显示刺激后的DCs的特征性标记物表达明显升高，本实验中采用未成熟DCs；

(4)树突状细胞的负载：

获取同系动物的脊髓，常规制备脊髓匀浆蛋白并定量，将未成熟DCs放入含脊髓匀浆蛋白1μg/μl的DC培养基培养(不添加细胞因子mGM-CSF，细胞浓度为2×10⁶/ml)共同孵育2h，新鲜DC培养基冲洗，冰上保存备用，注射前，细胞进行离心，并悬浮于PBS(5×10⁵/5μl PBS供局部注射，1×10⁶/0.3ml PBS供腹腔注射)。

8.用权利要求1的树突状细胞疫苗制备一种促进脊髓损伤功能恢复的疫苗。

9.权利要求1的疫苗的使用方法，其特征在于，注射到自身体内。

10.权利要求9的使用方法，其特征在于，注射前，细胞进行离心，并悬浮于PBS供注射。

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