CN101329276A - 化学发光测量装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于兼顾向微小反应槽迅速供给试剂物质和抑制邻接反应槽之间的污染。在物质供给时和发光反应时使含有设有微小反应槽(103)的板(201)的流动池(101)的流路形状发生改变。

Description

化学发光测量装置
技术领域
本发明涉及化学发光测量装置，更详细地说，本发明涉及使基因序列解析、基因多态性解析、基因突变解析、基因表达解析等成为可能的化学发光测量装置。
背景技术
DNA碱基序列的测定中广泛使用利用凝胶电泳和荧光检测的方法。该方法中，首先制作多个要进行序列解析的DNA片段的拷贝。以DNA的5’末端为起点，制作各种长度的荧光标记片段。另外，对应于这些DNA片段的3’末端的碱基种类，预先附加荧光波长不同的荧光标记。通过凝胶电泳，以1个碱基的差别来识别长度的不同，并检测各个片段组所发出的光。由发光波长颜色来了解测定中的DNA片段组的DNA末端碱基种类。由于DNA是从短的片段组开始依次通过荧光检测部，因此通过测量荧光颜色，可以从短的DNA开始依次了解末端碱基的种类。由此来测定序列。这种荧光式DNA测序仪广泛普及，而且也广泛活跃在人类基因组解析中。根据该方法使用多根内径为50μm左右的玻璃细管、并利用末端检测等方法、增加每台的解析处理数的技术公开于非专利文献1中。
另外，以焦磷酸测序为代表的利用阶段性化学反应的序列测定法(例如专利文献1和专利文献2)从处理简便性出发而受到注目。该方法的大致情况如下所述。使引物杂交于作为靶的DNA链，在反应溶液中每次1种地依次加入4种互补链合成核酸底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，进行互补链合成反应。发生互补链合成反应时，DNA互补链延伸，作为副产物生成焦磷酸(PPi)。焦磷酸通过共存酶的作用而转变成ATP，并在萤光素和荧光素酶的共存下发生反应，从而产生发光。通过检测该光，可知加入的互补链合成底物进入了DNA链，可知互补链的序列信息，从而可知成为靶的DNA链的序列信息。
该方法可以适用于流动型解析，应用上述方法而显著增加解析处理数的技术在非专利文献2中有所报道。其中使用在一个面上具有多个微小反应槽的流动池。将使引物杂交于靶DNA链而成的相同种类的多个分子固定在直径约为35μm的琼脂糖制的1个珠粒的表面上，并将固定有该珠粒和生物发光用酶(荧光素酶)等的珠粒填充到流动池内的相同微小反应槽中。另外，按照这些珠粒不流出的方式填充有直径为0.8μm的微粒。这些珠粒的填充可以通过将含有珠粒的溶液导入流动池并用离心机使其沉降来实施。另外，解析如下进行：从流动池上游依次导入延伸反应用的4种互补链合成核酸底物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，并观测此时所产生的生物发光。
这些技术利用上述光纤面板来制作PicoTiter板，并用于流动池的一部分(例如非专利文献3)。在PicoTiter板(以下简称为板)上设置多个微小反应槽，将作为解析对象的DNA固定在珠粒上，并将该珠粒插入微小反应槽中，在微小反应槽中分别进行DNA的延伸反应和与此相伴的化学发光反应。根据该方法，如果增加微小反应槽的数量，则可以增加能够同时测量的DNA的种类，因此可以大幅度地提高生产量。但是，当高密度地配置微小反应槽以解析多个DNA时，在板内的各个微小反应槽内产生的物质、具体地说焦磷酸在宽度方向上的扩散所导致的污染成为问题，从而导致测定精度的降低。专利文献4中公开了为了抑制该邻接的微小反应槽之间的污染而使用附加有膜等的板。另外，非专利文献2中公开了下述的方法：将固定有成为解析对象的DNA的珠粒和固定有化学发光所必需的酶的珠粒先插入微小反应槽中，接着装入称为填装珠粒的起到与膜相同作用的珠粒。
另外，作为可以应用于焦磷酸测序反应的试剂，在专利文献5中公开了与上述技术不同的反应体系。该技术中，使用酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的逆反应，将AMP(三磷酸腺苷)和PPi(十水合焦磷酸)合成为ATP(腺苷三磷酸酶)，并测定ATP浓度。
非专利文献1：Anal.Chem.2000，72，3423-3430
非专利文献2：Margulies M，et al.，“Genome sequencing inmicrofabricated high-density picolitre reactors.”，Nature，Vol.437，Sep.15；2005，pp376-80和Supplementary Information s1-s3
非专利文献3：Electrophoresis 2003，24，3769-3777
专利文献1：国际公开小册子第98/13523号
专利文献2：国际公开小册子第98/28440号
专利文献3：国际公开小册子第01/020039号
专利文献4：国际公开小册子第03/004690号
专利文献5：日本特开平9-234099号公报
使用并设有多个微小反应槽的流动型反应板的焦磷酸测序解析技术与以往的凝胶电泳相比，可以显著增大生产量。在这种情况下，检测由板上的微小反应槽中所发生的反应而产生的化学发光，从而进行DNA的解析。特别是，将作为解析对象的DNA(反应物质)固定在珠粒上，在将该珠粒插入到微小反应槽中、或者在将其直接固定在微小反应槽内部的状态下，将至少含有反应底物的试剂导入多个微小反应槽内部，从而引起反应，将由该反应产生的反应产物焦磷酸(PPi)通过连续的反应转变成ATP，接着，通过ATP、以荧光素酶为酶，使萤光素发生发光反应，并进行检测。此时，如果在各微小反应槽内生成的反应产物PPi或ATP混入到相邻的反应槽中(产生串扰)，则存在着序列测定或DNA检测的精度降低的问题。具体地说，在DNA延伸时产生的PPi扩散到邻接的微小反应槽中，产生如在邻接的微小反应槽中发生延伸反应那样的发光，从而存在发光强度发生变化的问题。
另一方面，为了抑制通过延伸反应所产生的生成产物的扩散，还可以使用膜或填装珠粒，但此时无法将DNA延伸或化学发光所必需的物质迅速地供给至微小反应槽的内部、且无法排除剩余的反应底物，即在提高DNA解析的精度的方面具有无法均匀地进行重要的DNA互补链合成反应的问题。
发明内容
本发明的目的在于兼顾向微小反应槽中迅速地供给或从其中迅速地排出含有反应底物的试剂与排除邻接反应槽之间的串扰。当迅速的反应底物的供给和剩余底物的排出或反应产物的排出无法充分地进行时，延伸反应不会在微小反应槽内均匀地进行，残留一部分未进行反应的DNA链、或在DNA互补链延伸反应中过剩的核酸底物dNTP残留在反应槽内，对之后的互补链合成反应造成不良影响，从而具有不能正确进行DNA碱基序列测定的难点。另外，为了即便对象DNA的分子数少也可进行解析，使在延伸时所产生的反应产物不扩散到微小反应槽外也是重要的。其原因在于，由于该扩散，用于发光的必要的化学物质的浓度实际上降低、从而发光强度密度降低。
本发明中，为了同时满足这些相反的要求，设置下述机构：在物质供给或排出时以及发光反应时使含有设有微小反应槽的板的流动池的流路的电导或流路的截面形状发生变化。
具体地说，在设有微小反应槽的板和与其面对面配置的透明基板(上板)之间形成流路、通过该流路将含有反应底物的溶液(试剂)供给至微小反应槽的结构的流动池中，设置使透明基板与板的间隔发生变化的机构。微小反应槽作为板上的凹陷形成。当规定流路的板与透明基板充分分离时，试剂可以在流动池中自由地流动，可以将必要的试剂供给至微小反应槽中、将不需要的化学物质从微小反应槽中排出。另一方面，通过充分地缩小板与透明基板的间隔或者将两者完全地密合，通过延伸反应产生的PPi或ATP难以扩散到微小反应槽外，或者完全不会扩散。即，通过改变流动池的规定流路厚度的板与透明基板的间隔，实现迅速的反应液供給和不需要的化学物质的排出、并抑制延伸反应时生成的物质扩散到微小反应槽之外。这里，发光反应需要荧光素酶或PPDK等酶，但该酶即便固定在反应槽中也可以混入在试剂中，可以在每次投入试剂时供给。
作为其它方法，可以在板与透明基板之间设置其它基板，通过设置使其接近微小反应槽或者使其膨胀的机构，从而可以抑制伴随延伸反应的物质从微小反应槽中的扩散。也可以在上述其它基板上设置开口部，通过对合开口部的位置与微小反应槽的位置，实现物质向微小反应槽中的供给，通过使开口部的位置离开微小反应槽的位置，抑制伴随延伸反应的化学物质的扩散。另外，还可以通过在微小反应槽和流路的临界附近设置开关阀来抑制扩散。
通过本发明，可以在核酸分析、特别是基因序列解析中实现利用了阶段反应的精度高的DNA解析。另外，由此达成解析生产量的提高和测量灵敏度的提高。特别是，测量灵敏度的提高例如在以1分子为测定对象时，在即便通过PCR(聚合酶链反应)等的扩增也无法获得充分的分子量时，也可以获得充分的灵敏度。
附图说明
图1为表示本发明的化学发光测量装置的构成例的图。
图2为表示流动池构造例的截面示意图。
图3为流动池的分解组装图。
图4为固定有试样DNA的珠粒的示意图。
图5为表示DNA的碱基序列测定顺序的流程图。
图6为发光图像的示意图。
图7为流动池的其它例的截面示意图。
图8为流动池的其它例的截面示意图。
图9为流动池的其它例的截面示意图。
图10为流动池的其它例的截面示意图。
图11为表示本发明的化学发光测量装置的构成例的图。
图12为流动池的其它例的截面示意图。
图13为流动池的其它例的示意图。
图14为流动池的其它例的示意图。
图15为流动池的其它例的截面示意图。
图16为流动池的其它例的截面示意图。
图17为流动池的其它例的截面示意图。
图18为流动池的其它例的截面示意图。
图19为流动池的其它例的截面示意图。
图20为流动池的其它例的截面示意图。
符号说明
101：流动池           102：驱动部
103：微小反应槽       105：透明基板
106：2维摄像设备      107：透镜体系
201：板               202：隔离物
203：杆               210：试剂流路
401：珠粒             402：单链化DNA
403：引物             701：透明基板
711：凸部          712：有底孔
713：凸部          803：密合层
901：上层          902：隔离物层
903：变形层        905：加压口
906：减压口        1001：电磁铁
1002：驱动部       1101：透明基板
1102：永久磁铁     1103：导销
1201：透明基板     1202：贯通孔
1203：永久磁铁     1206：挡块(stopper)
1209：导轨         1401：基板
1402：阀           1403：电磁铁
1501：透明基板     1502：流路
1503：膜           1504：导向层
1601：珀耳帖元件   1602：空气层
1701：凝胶         1702：电极
1703：电极         1704：电源
1801：柱           1802：珠粒
2001：基板         2002：微小反应槽
2003：凝胶层       2004：基板
2005：隔离物       2006：流路
2007：下侧流路
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明。这里，以使用焦磷酸测序法的原理来测定测定对象的基因序列为例进行说明。
[实施例1]
图1为表示本发明的化学发光测量装置的构成例的图。本实施例的化学发光测量装置中，在由设有多个微小反应槽的板201和透明基板105所形成的流动池101中流入各种试剂，通过测量来自设于板201上的多个微小反应槽103的化学发光，从而测定碱基序列。本发明中，在测量化学发光时和在流动试剂以向微小反应槽供给试剂时，改变试剂流动流路的厚度，从而使流路的电导和截面形状、截面积发生变化。由此，在测量化学发光时，在抑制与邻接的微小反应槽的串扰的同时提高发光密度、从而提高发光的测量灵敏度。另外，向微小反应槽供给试剂时、或者在反应产物的洗涤除去時，提高其供给效率或者洗涤效率。
本实施例中，设置驱动部102，按照透明基板105接近板201的方式施加压缩力。由此，流路的厚度104变窄，在微小反应槽103中生成的化学物质不会流出微小反应槽之外，从而减少串扰，测量灵敏度提高。另外，在测量化学发光之前，在将含有荧光素酶等催化化学发光的酶的试剂供给至微小反应槽时，释放驱动部102的压缩力，充分地增厚流路的厚度104。由此，必要的试剂被迅速地供给至微小反应槽103中。关于流路厚度发生变化的流动池101的详细结构在后叙述。
本实施例的化学发光测量装置另外还具备：对基于碱基延伸反应的发光图像进行检测的冷却型CCD相机等2维摄像设备106；在2维摄像元件上使发光像成像的透镜体系107；分别收纳依次分注于流动池101中的作为反应底物的4种核酸底物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP等)的试剂槽108～111；收纳用于在延伸反应测定后洗涤流动池内的洗涤试剂的洗涤试剂槽112；收纳用于在洗涤后洗去池内的洗涤试剂成分残留物的调节试剂的调节试剂槽113；用于将它们选择性地注入至流动池侧的注入部(选择阀114、用于控制试剂的泵115)；废液瓶116等。
流路的厚度104在分注4种核酸底物时增厚，在核酸底物迅速地扩散到微小反应槽内、且核酸底物在微小反应槽内基本变得均匀时(开始投入核酸底物的数秒后、例如2秒钟后)，利用驱动部102挤压透明基板105、从而缩小流路厚度104。在此状态下，利用摄像元件测量化学发光，例如在15秒后完成光的蓄积，同时释放透明基板105的挤压力，从而将流路厚度104增厚。由此，追加地供给dNTP，将未延伸的DNA完全地消除。另外，为了在延伸下一个碱基之前排除微小反应槽103中的过剩dNTP，将作为dNTP分解酶的腺苷三磷酸双磷酸酶导入至微小反应槽，但此时，在增厚流路的状态下也将混有腺苷三磷酸双磷酸酶的洗涤试剂流入流路中。此时，过剩的dNTP由于流路厚度厚，因此通过扩散或流动被迅速地排出。进而，当在腺苷三磷酸双磷酸酶残留于微小反应槽中的状态下将之后的扩散底物导入微小反应槽内时，在延伸反应结束之前，由于dNTP被腺苷三磷酸双磷酸酶分解，因此在延伸反应还未完全结束时即进入下一步骤，从而解析精度降低。为了不发生这种情况，将调节试剂流入流路内，将腺苷三磷酸双磷酸酶排出。此时，也可以预先增厚流路厚度，通过扩散或流动将腺苷三磷酸双磷酸酶迅速地排出。
接着，说明上述流动池的构造例。图2为流动池101的截面示意图。流动池101使形成有多个微小反应槽103的板201与用于测量化学发光的透明基板105基本平行地面对面，由用于使试剂不会泄露地流过板201与透明基板105之间流路的具有弹性的隔离物202构成。板201与透明基板105之间的区域为试剂流路210，该流路210的厚度104可以通过安装于驱动部102上的用于加压的杆203将透明基板105向板201挤压，从而缩小。驱动部102可以为步进发动机或压电元件。
图2(a)表示未利用杆203进行加压而增厚流路的状态的流动池的截面示意图，图2(b)表示进行加压而减小流路厚度的状态的截面示意图。图2(a)的状态下，为了将试剂迅速且均匀地供给至微小反应槽103中，厚度104为0.3mm左右；图2(b)的状态下，为了抑制化学发光底物(本实施例中为PPi或ATP)扩散到微小反应槽103之外，使厚度104为数μm以下。另外，隔离物202有必要使用为具有充分弹性的橡胶材料、且化学上惰性的材料，本实施例中使用有机硅橡胶。另外，当减小厚度时，成为数μm以下的薄层，更优选按照可以完全地封闭流路的方式在板201上设置锪孔204。由此，即便橡胶的压缩变形率较低，也可以获得充分的流路厚度变化。具体地说，使用在0.1MPa下压缩20％的厚度3mm、宽度3mm、周长40cm的有机硅橡胶作为隔离物202，使锪孔204的深度为2.4mm。此时，由驱动部102向4根杆203分别施加3kg的荷重，从而可以使流路厚度104为数μm以下。
另外，流动池101的内部供给碱基延伸和化学发光所必需的物质，由于有必要充分抑制所需化学反应以外的反应，因此板201或透明基板105的材料使用反应性低的树脂材料，例如聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等材料。
图3表示流动池的分解组装图。图2相当于图3的CC’截面图。试剂从试剂流入口301被投入，经过图中形成菱形形状的流路，将试剂供给至微小反应槽103，然后从试剂排出口302排出。
微小反应槽103的形状例如可以为圆柱状。其形状根据基板的材料或制造方法来选择。板201可以通过下述方法制作：通过切削加工在不锈钢材料上形成微小反应槽的方法；通过掩模和湿式刻蚀在硅片上形成微小反应层的方法；通过使用了粒子的喷射加工在载玻片等玻璃上形成微小反应槽的方法；通过模具的注塑成型在聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯等上形成微小反应槽的方法等，但并不限于这些材料或制作方法。
另外，具有弹性的隔离物202使用了有机硅橡胶，但也可以为含氟橡胶、アルゴ凝胶、丁基橡胶、丁腈橡胶、氯丁二烯橡胶、乙丙橡胶等。
本实施例中，将作为装置测定对象的试样DNA固定在珠粒上，按照在1个微小反应槽内不进入2个以上珠粒的方式进行测定。珠粒材料可以是氧化锆、二氧化硅、琼脂糖、各种半导体材料、各种凝胶材料等。
图4为固定有试样DNA的珠粒的示意图。在珠粒401的表面上，测定对象的单链化DNA402与作为序列解析起始位置的引物403互补地结合而成的产物固定有多个分子。另外，图4为了简单仅描绘了1组。这里，固定在1个珠粒表面上的分子有必要为1种，即为相同种类。为了在1个珠粒表面上扩增多个单一种类的分子，可以使用公知的“乳液PCR”等(例如非专利文献2)。作为DNA的固定方法，可以利用如图4(a)和(b)所示，将测定对象DNA固定在珠粒表面上，或者在扩增之后进行固定，使引物互补地结合的方法；还可以利用如图4(c)所示，将引物固定在珠粒表面上、使测定对象DNA互补地结合的方法等。
作为珠粒401的直径，对于约20～100μm进行实验，确认了效果。珠粒401直径的差别成为表面积的差别，与固定在1个珠粒表面上的分子数、即后述的测定灵敏度的差别有关，但使用冷却CCD作为相机时，上述全部情况均可测定。但是，流动池的微小反应槽的直径或深度有必要根据所用珠粒的大小来进行选择。一般来说，微小反应层的直径或深度优选为所用珠粒的1.2～1.5倍左右。即，使用约50μm的珠粒时，微小反应槽的直径和深度优选为60～75μm左右。这是能够满足进入1个微小反应层的珠粒最多为1个的条件的优选条件。
图5为表示DNA的碱基序列测定顺序的流程图。首先，在流动池的初始化中，使流动池的位置相对于CCD对准，进行像素、流动池中的微小反应槽的位置和焦距的调整，同时进行流动池的洗涤等，准备DNA的延伸反应和与之相伴的发光测量。接着，将含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP的任1种核酸底物的反应试剂流入流动池2秒钟左右，在向微小反应槽内供给这些物质后，将驱动部102驱动，压缩隔离物202，从而减小流路的厚度，或者使流路完全地消失。在利用CCD摄入发光图像的15秒钟期间内保持该状态。
将如此获得的发光图像的示意图示于图6(a)。如图所示，可以将来自各微小反应槽的发光分离后进行测量。另一方面，图6(b)表示不缩小流路进行测量时的发光图像的示意图。由于存在在通过扩散从微小反应槽流到外面后发光的PPi或ATP的成分，因此无法将来自各微小反应槽的发光分离后测量，从而成为基本相同的发光图像。即，由于串扰，邻接的微小反应槽的分离变得困难。
返回至图5，接着，为了使延伸反应完全地结束，使流动池的流路厚度返回至原本的较厚的状态、即0.3mm，保持15秒钟，将含有作为dNTP分解酶的腺苷三磷酸双磷酸酶的洗涤缓冲液持续地流入流动池中30秒钟后，除去腺苷三磷酸双磷酸酶，然后流入调节缓冲液，以使得之后的碱基延伸和化学发光高效地发生，并流入下一个含有dNTP的发光试剂，重复上述操作直至测序完成。对应于这种试剂供给操作，蓄积图像数据，通过测量使何种dNTP流入流动池时从哪个微小反应槽产生发光、或者测量为何种程度的发光，从而测定作为解析对象的碱基序列。
图7表示流动池的其它例的截面示意图。上述实施例中，通过切削加工或注塑成型而在板201上形成凹陷部以制成微小反应槽103，但这里通过相同的加工方法在板201上形成凸部711，并将设于凸部的有底孔712用作微小反应槽。另外，当微小反应槽的深度较深时，作为反应底物的dNTP的反应底物的扩散或反应产物的排出需要花费时间。因此，也在透明基板105上设置凸部713，利用凸部711、713的相向的2个孔来限制珠粒的移动。根据该结构，可以使有底孔712的深度浅于图2所示微小反应槽103的深度，由于在缩短反应底物的供给所需的扩散距离的同时增大了微小反应槽的体积，因此也可以防止延伸反应所必需的反应底物不足而反应无法完成、从而序列解析精度降低。
另外，将成为解析对象的DNA固定在珠粒上，将珠粒插入微小反应槽中，从而将解析对象DNA固定在微小反应槽中，但并非必须使用珠粒。作为成为解析对象的反应物的固定方法，可以使用通过化学键合固定在微小反应槽的内壁上的方法；使用磁珠作为珠粒，并通过磁力进行固定的方法等。
[实施例2]
在实施例1中，通过使隔离物发生弹性变形来改变流路的厚度，由此抑制了产物从微小反应槽的扩散，但本实施例中，通过使作为流动池上板的透明基板发生变形来使微小反应槽的正上方流路的厚度发生变化，由此获得与实施例1相同的效果。
图8表示流动池的其它例的截面示意图。本例的流动池是能够向透明基板701施加应力而使其弯折、从而在微小反应槽103的正上方缩小流路厚度的流动池。图8(a)是表示未施加应力的状态的图、图8(b)是表示施加应力而使流路的厚度变薄的状态的图。本实施例中，通过将成为上板的透明基板701的一部分薄膜化，成为利用杆203施加应力时易于变形的形状。另外，透明基板701的材料为聚碳酸酯，但也可以使用其它的透明树脂材料。特别是对应于具有微小反应槽103的区域来将透明基板701薄膜化，从而使具有微小反应槽的区域处的流路厚度在施加应力的状态下变得均匀。作为一例，使透明基板701的厚度在较厚的部分为3mm、在薄膜化的部分为1mm左右。另外，微小反应槽103的直径为10μm、深度为10μm，在其中与实施例1同样地插入固定有成为测定对象的DNA的直径为8μm的氧化锆珠粒，并进行测量。微小反应槽的配置按照微小反应槽的中心与15μm的正方格子的交点一致的方式排列4096×4096个，并配置在板上的6.144×6.144cm的区域上。
另外，作为透明基板发生变形的其它构成，可以如图9(a)所示，将对应于微小反应槽103的区域的周边部分802薄膜化；还可以如图9(b)所示，使对应于微小反应槽103的区域的周边部分802为弹性高的有机硅橡胶等材料。作为一例，如图9(a)所示将周边部分薄膜化时，具有微小反应槽的区域801处的透明基板的厚度为3mm、其周边部分802处厚度为0.5mm。另外，如图9(b)所示，当使周边部分802变为弹性高的材料时，通过热熔融粘接来粘接宽度10mm、厚度3mm的有机硅橡胶。另外，还可以利用粘接剂进行粘接来代替熔融粘接。
通过制成这种构成，具有微小反应槽的区域的刚性较高，在确保与板的密合性的同时，可以确保高的变形率，因此板上的配置有微小反应槽的区域即使在达到数cm见方时，也可以将流路厚度均匀地缩小。另外，即便在流路厚度的机械均匀性不高的状态、即在上板歪曲或具有凹凸地倾斜配置的状態下，为了更有效地抑制反应产物从微小反应槽的扩散，也可以在透明基板801的对应于微小反应槽的一侧上粘接弹性高的材料即有机硅橡胶而形成密合层803。此时，通过使隔离物202的厚度为0.5mm、使密合层803的厚度在不施加压力的状态下为0.2mm，可以使流路厚度在0.3mm和0.1μm以下的状态间反复。
上述例中，变形的驱动力是利用驱动部102产生的机械压力，但变形的驱动力也可以使用气体或液体的压力。图10表示这种例子。图10(a)表示未施加压力、流路厚度104较厚的状态，图10(b)表示施加压力而缩小流路厚度的状态。本例中，为了使透明基板为中空，制成3层构造。即，重叠上层901、隔离物层902和变形层903并进行粘接，从而形成上层901和变形层903之间的区域904为中空的透明基板。
通过从加压口905导入空气，变形层903发生变形，从而可以在具有微小反应槽103的区域处减小流路的厚度。另外，通过从减压口906抽除空气，也可以增大流路的厚度。通过重复该操作，依次进行抑制从微小反应槽103的扩散和发光试剂的有效供给。作为一例，透明基板的上层901使用厚度为3mm的丙烯酸板、隔离物层902也使用厚度为3mm的丙烯酸板。另外，变形层903使用厚度为0.5mm的透明聚丙烯膜。
变形层903也可以使用有机硅橡胶等更柔软的材料，但此时有发生流路厚度的均匀性存在问题的情况。为了提高流路厚度的均匀性，与上述实施例同样，变形层可以仅对应于微小反应槽的区域处使用厚的材料、周边部分为了易于变形而使用薄的材料；或者对应于微小反应槽的部分使用透明且硬的材料、周边部分组合使用有机硅橡胶等易于弹性变形的柔软材料。另外，为了提高变形层903与板201的密合性，与上述同样，也可以将密合层粘在一起。另外，此处为了使变形层903变形，从加压口905加入空气，但也可以使用并非空气的其它透明且惰性的液体，例如水或油等。此时，也可以使隔离物202的厚度为0.5mm，使流路厚度在0.4mm和0.1μm以下的2个状态间反复。
[实施例3]
本实施例中，并非通过透明基板和板的移动、变形，而是通过在流动池的流路内设置其它透明基板来抑制产物从微小反应槽的扩散。图11表示化学发光测量装置的系统构成例。设置电磁铁1001来取代图1的杆203、设置支撑和驱动电磁铁的驱动部1002来取代驱动部102。
图12(a)表示增厚本实施例的流动池的流路厚度的状态下的截面示意图、图12(b)表示减小流路厚度的状态下的截面示意图。在流路内设置聚丙烯制的透明基板1101，通过用厚度为0.2mm左右的聚丙烯来覆盖钕磁铁(主成分：钕、铁、硼)1102的表面，从而固定在透明基板1101上，通过改变电磁铁1001的极性，采取图12(a)的状态和图12(b)的状态的任一种。另外，按照透明基板1101仅可以在流路的厚度方向上移动的方式，贯通设于透明基板1101上的孔来设置导销1103。直径为1mm的导销1103也为聚丙烯制，且被固定在板201或上部透明基板105的任一者上。永久磁铁1102也可以使用钐钴磁铁(主成分：钐、钴、铜、铁)、铝镍钴磁铁(主成分：铝、钴、镍)、铁氧体磁铁(氧化铁、钡、锶)等。驱动部1002中通过改变在电磁铁中流过的电流的极性来改变磁铁的极性，但也可以旋转电磁铁来改变对永久磁铁起作用的磁力的方向。
在使透明基板1101上下移动、移动透明基板1101使其接近上部透明基板105时，向微小反应槽103中供给试剂；将其移动使其接近板201时，抑制产物从微小反应槽103扩散，并在没有串扰的状态下进行测量。这样，可以使配置微小反应槽103的区域处的实际流路的厚度为0.3mm和1μm以下的2个状态。
另外，作为使用设于流路内的透明基板以使流路厚度发生变化的其它方法，还有使透明基板的中央部分为中空、向该部分施加利用空气压或水等溶液产生的压力，从而使基板厚度发生变化的方法。
[实施例4]
上述实施例中，通过在流路的厚度方向(上下方向)上移动设于流路内的透明基板来兼顾抑制从微小反应槽的扩散和迅速的试剂供给，但本实施例中通过开关微小反应槽的入口来实现上述目的。
图13(a)和图13(b)表示流动池的截面示意图。图13(a)表示微小反应槽的入口开放的状态、图13(b)表示关闭的状态。在设于流路内的聚丙烯制的透明基板1201上，对应着微小反应槽103的大小和排列而形成有多个贯通孔1202。微小反应槽103的开关通过使透明基板1201沿着板201的表面移动来进行。当按照透明基板1201的贯通孔1202与微小反应槽103的位置一致的方式移动透明基板时，开放微小反应槽103的上部，从而将碱基等试剂充分地供给至插入在微小反应槽103内部的珠粒上的DNA。相反，当按照贯通孔不会到达微小反应槽103上的方式移动透明基板1201时，微小反应槽103成为被盖住的状态，从而可以抑制通过反应所产生的化学物质扩散到微小反应槽103之外。
该透明基板1201的移动如下进行：在透明基板1201的端部区域上固定永久磁铁1203，从电磁铁1204、1205向该永久磁铁1203作用磁力。例如，在开放微小反应槽的入口时，使具有永久磁铁1203的区域处的磁场方向如箭头1207所示，将透明基板1201压向右侧的挡块1206，从而使贯通孔1202位于微小反应槽103上；在关闭微小反应槽103的入口时，使磁场如箭头1208所示为相反方向，按照透明基板1201挤压相反侧的挡块1206的方式移动，从而使贯通孔1202离开微小反应槽103上。从箭头1207向箭头1208的磁场方向切换可以如下实现：从电磁铁1204的N极为图中朝上的方向、电磁铁1205的N极为图中朝下的方向的状态，使2个电磁铁1204、1205的极性相反，从而实现。另外，为了防止透明基板1201离开板201、或贯通孔1202相对于微小反应槽103发生位置偏离，如图13(c)所示，沿着透明基板1201的侧部设置导轨1209。结果，可以确保板201与透明基板1201之间的距离为1μm以下，使透明基板1201在左右移动15μm，从而实现微小反应槽103的开关。
图14表示具有实现微小反应槽的开关的其它机构的流动池的示意图。准备由有机硅橡胶等柔软材料构成、且在对应于微小反应槽103的位置上具有阀1402的基板1401，并将其固定在板201的表面上。通过利用磁力来开关阀1402，可以兼顾抑制在微小反应槽103产生的化学物质的扩散和向微小反应槽103的迅速的试剂供给。在制作基板1401时，使有机硅橡胶对应着微小反应槽的开口部，通过压模而形成圆形切口。但是，在对应于阀1402的合叶的位置上不形成切口。另外，将在ZnO中掺杂有Mn的材料粉碎成数μm以下直径的珠粒状而制作透明磁性体，将该透明磁性体与有机硅橡胶混合后进行成型，从而使阀1402带有磁性。向电磁铁1403沿恒定方向流入电流时，则阀1402被牵引至上方，阀打开；当使电流向相反方向流动时，则阀关闭。这样，兼顾了迅速的试剂供给和抑制反应产物的扩散。
[实施例5]
本实施例为为了改变流动池的流路厚度104而使用体积能够变化的凝胶的例子。图15表示流动池的截面示意图。图15(a)表示流路厚度较厚的状态、图15(b)表示减小流路厚度的状态。
本实施例中，用体积能够膨胀的凝胶来构成与设有微小反应槽103的板201相向的透明基板1501。凝胶可以使用丙烯酰胺凝胶。该凝胶在降低温度、或者使用丙酮水溶液作为凝胶的溶剂以提高丙酮浓度时，在某个温度或者某个丙酮浓度下发生凝胶体积急剧膨胀的体积相转变。本实施例中，利用该凝胶的体积膨胀来使流路厚度104发生变化。本实施例中，透明基板1501的大部分为丙酮水溶液中的丙烯酰胺凝胶。为了丙酮水溶液溶剂不与流过流路的试剂混在一起，凝胶用聚丙烯等所构成的厚度为0.5mm左右的薄且透明的膜1503覆盖。膜1503也可以用聚氯乙烯等其它具有柔软性的树脂材料形成。另外，由于凝胶的体积基本各向同性地膨胀，因此为了通过凝胶的膨胀而有效地使流路厚度发生变化，用透明的聚碳酸酯制的导向层1504形成与流路相反侧的透明基板1501的上表面和侧面，从而防止流路侧以外的面的变形。由此，在保持具有微小反应槽103的区域的凝胶的平面形状而反复引起体积变化时，通过透镜效果，可以防止来自微小反应槽103的发光像失真或焦距偏离。
为了使丙酮浓度在透明基板1501中的整个凝胶中均匀且迅速地变化，设置了使丙酮水溶液流动的流路1502。由于丙酮等低分子透过凝胶中，因此在透明基板1501的大小不怎么大时，该流路并非必须。决定向微小反应槽103供给试剂时的流路厚度的隔离物202的厚度为1mm、通过凝胶的体积膨胀，可以使流路厚度基本为0。按照丙酮水溶液中的丙酮浓度在增大流路厚度时为20％以下、在减小流路厚度而完全闭合时为60％以上的方式，从流路1502供给丙酮水溶液。
凝胶材料除了丙烯酰胺凝胶之外还可以使用异丙基丙烯酰胺凝胶。另外，当将甲基丙烯酰基氨基丙基三甲基氯化铵(MAPTAC)与丙烯酸以7∶12共聚而成的凝胶用于图15中的透明基板1501时，通过使pH由7变至9，可以使体积膨胀。为了改变pH，从流路1502交替流入pH不同的2种缓冲液，从而交替改变流路厚度104。另外，并非改变pH而是改变离子强度也可以使体积发生变化。
改变凝胶的温度而引起凝胶的体积变化、从而改变流路厚度104的流动池的例子示于图16的截面示意图。图16(a)表示流路厚度较厚的状态、图16(b)表示减小流路厚度的状态。
凝胶材料为丙烯酰胺凝胶，在将丙酮水溶液浓度设定为大于60％左右的状态下，使凝胶1501的温度如跨过临界温度30℃那样从40℃变化至20℃。为了引起该温度变化，配置了珀耳帖元件(电子冷却元件)1601。珀耳帖元件按照不干涉发光测量的方式配置在凝胶1501的边缘部。另外，在凝胶和聚丙烯制的膜1503之间设置空气层1602作为隔热区域，以使得能够独立地控制凝胶温度和流过流路的试剂的温度。
另外，还可以通过施加电场而使体积发生变化，由此改变流路厚度。图17表示此时的流动池的截面示意图。图17(a)表示流路厚度较厚的状态、图17(b)表示减小流路厚度的状态。
凝胶使用将丙烯酰胺凝胶部分水解而成的凝胶。具体地说，通过将丙烯酰胺凝胶与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺进行自由基聚合来调制凝胶，在N，N，N’，N’-四亚甲基二胺的1.2％溶液中水解1个月以上，由此获得约20％的丙烯酰胺基取代成丙烯酸的高分子凝胶。将其作为透明基板的凝胶1701来利用。测量化学发光一侧的电极1702使用透明电极、相反侧的电极1703使用铂电极。板201的厚度为5mm左右，以使得从电源1704向电极1702、1703之间施加1V左右的电压，可以获得流路高度104的充分变化。另外，该材料使用不会屏蔽电场的树脂材料(聚丙烯等)，不使用金属材料。
[实施例6]
为了不使反应产物扩散而特别将微小反应槽完全关闭时，由于停止了由外部供给反应所必需的反应底物，因此作为反应底物的dNTP不足，也有DNA未完全延伸的情况。以下示出用于不使上述情况发生的微小反应槽的构造例。
图18表示本实施例的流动池的截面示意图。按照使表面上固定有DNA的珠粒1802能够在微小反应槽103中悬浮地保持的方式，在微小反应槽103中设置柱1801。通过该构造，与没有柱的情况相比，可以增大微小反应槽103中的含有dNTP的试剂溶液量。由此，DNA的延伸不会变得不充分。而且，在圆柱形状的微小反应槽中，接近反应槽底面一侧的珠粒表面处dNTP浓度降低的可能性高。但是，通过设置柱1801，由于dNTP的浓度低的部分会离开珠粒表面，因此在此意义上也可以降低DNA的延伸变得不充分的概率。
另外，不仅不会使DNA的延伸变得不充分，而且向微小反应槽中依次投入dNTP以使其发生延伸反应时，必须要提高缓冲液的交换效率，以便前一个dNTP不会在下一个dNTP反应时残留，将有效进行上述情况的流动池的截面构造示于图19的示意图中。
该例中，不仅在板201上设置对应于微小反应槽103的凹陷部，而且在透明基板105上也设置凹陷部。图19表示减小流路厚度104的状态，此种情况下，微小反应槽103可以确保蓄积充分的反应底物的溶液体积。另一方面，在增大流路厚度、将反应底物供给至微小反应槽、特别是珠粒1802上的DNA时，由于微小反应槽103的深度较浅，因此可以迅速地供给底物。另外，相反也可以迅速地排出。即，缓冲液交换效率较高。但是，必须按照透明基板105的凹陷部与板201的凹陷部一致的方式进行上下移动。
而且，寻求DNA延伸反应的效率和缓冲液交换效率的提高的其它流动池构造的截面示意图示于图20中。该例中，微小反应槽2002由形成在基板2001上的贯通孔构成。在该贯通孔的底部设置使丙烯酰胺凝胶等反应底物透过的凝胶层2003，在关闭微小反应槽2002的上部入口时也可通过使反应底物透过的凝胶层2003来供给dNTP，从而防止DNA延伸不足。另外，在排出dNTP时，在提升透明基板105而增大流路2006的厚度的状态下，从下侧流路2007侧流入洗涤溶液，从而可以将剩余的dNTP迅速地从微小反应槽2002中排出。另外，下侧流路2007是形成在基本平行于设有贯通孔的基板2001而配置的基板2004之间的流路，其厚度通过隔离物2005，例如可以达到厚度为1mm。

Claims (19)

1.化学发光测量装置，其特征在于，其具有：设有多个反应槽的板；与所述板面对面且在与所述板之间形成流路的透明基板；向所述流路中选择性地注入反应底物和洗涤液的注入部；通过所述透明基板对下述发光进行摄像的摄像体系，所述发光由保持于设置在所述板上的多个反应槽内的反应物质与通过所述流路供给的所述反应底物之间的化学反应所产生；以及使所述流路的电导或流路截面形状发生变化的流路控制机构。
2.权利要求1所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述流路控制机构是使所述板和所述透明基板之间的间隔发生变化的机构，在所述流路中注入反应底物或洗涤液时扩大所述间隔，在利用所述摄像体系进行摄像时缩小所述间隔。
3.权利要求2所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述流路控制机构在利用所述摄像体系进行摄像时，使所述间隔实质上为零。
4.权利要求2所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述多个反应槽被配置于所述板与所述透明基板之间的具有弹性的隔离物所包围，所述流路控制机构通过挤压所述透明基板来压缩所述隔离物，从而缩小所述间隔。
5.权利要求1所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述透明基板可以变形，所述流路控制机构控制施加在所述透明基板上的应力，在向所述流路中注入反应底物或洗涤液时，扩大与所述板的设置了所述多个反应槽的区域相对应的部分和所述板之间的间隔，在利用所述摄像体系进行摄像时缩小所述间隔。
6.权利要求1所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述透明基板具有中空室和与所述流路连接的透明膜，所述流路控制机构通过使流体从所述中空室流出或流入至所述中空室，从而在向所述流路中注入反应底物或洗涤液时，使所述透明膜从所述板的表面离开，在利用所述摄像体系进行摄像时，使所述透明膜接近于所述板的表面。
7.权利要求1所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述透明基板含有体积可以变化的凝胶，所述流路控制机构控制所述凝胶的体积，在向所述流路中注入反应底物或洗涤液时扩大所述板与所述透明基板之间的间隔，在利用所述摄像体系进行摄像时缩小所述间隔。
8.权利要求1所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述反应槽为在所述板的表面上加工而成的凹陷。
9.权利要求8所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述透明基板在与设置在所述板上的所述多个反应槽相向的位置上分别设有凹陷。
10.权利要求1所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述反应物质固定在珠粒的表面上，并收纳在所述反应槽中。
11.权利要求10所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述反应槽具有从底部突出的突起。
12.权利要求1所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述板设置在透过所述反应底物和所述洗涤液的基板上，所述反应槽为设置于所述板上的贯通孔，所述基板的与连接于所述板上的一侧相反侧的面与第2流路连接。
13.化学发光测量装置，其特征在于，其具有：设有多个反应槽的板；与所述板面对面且在与所述板之间形成流路的透明基板；向所述流路中选择性地注入反应底物和洗涤液的注入部；通过所述透明基板对下述发光进行摄像的摄像体系，所述发光由保持于设置在所述板上的多个反应槽内的反应物质与通过所述流路供给的所述反应底物之间的化学反应所产生；配置在所述流路内的流路内基板；以及驱动所述流路内基板的驱动部，其中，所述驱动部在向所述流路中注入反应底物或洗涤液时，使所述流路内基板移动至将所述多个反应槽的上部开口开放的位置上，在利用所述摄像体系进行摄像时，使所述流路内基板移动至将所述多个反应槽的上部开口遮蔽的位置上。
14.权利要求13所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述流路内基板为透明板，所述驱动部沿垂直于所述板的表面的方向来驱动所述流路内基板。
15.权利要求14所述的化学发光测量装置，其特征在于，在所述流路内基板上固定有强磁性体，所述驱动部通过磁力来驱动所述流路内基板。
16.权利要求13所述的化学发光测量装置，其特征在于，所述流路内基板为具有与所述多个反应槽的位置相对应的贯通孔的透明板，所述驱动部沿平行于所述板的表面的方向来驱动所述流路内基板。
17.权利要求16所述的化学发光测量装置，其特征在于，在所述流路内基板上固定有强磁性体，所述驱动部通过磁力来驱动所述流路内基板。
18.化学发光测量装置，其特征在于，其具有：设有多个反应槽的板；与所述板面对面且在与所述板之间形成流路的透明基板；向所述流路中选择性地注入反应底物和洗涤液的注入部；通过所述透明基板对下述发光进行摄像的摄像体系，所述发光由保持于设置在所述板上的多个反应槽内的反应物质与通过所述流路供给的所述反应底物之间的化学反应所产生；开关所述多个反应槽的上部开口的可动阀；以及驱动所述可动阀的驱动部，其中，所述驱动部在向所述流路中注入反应底物或洗涤液时，按照所述可动阀将所述多个反应槽的上部开口开放的方式来驱动所述可动阀，在利用所述摄像体系进行摄像时，按照所述可动阀将所述反应槽的上部开口遮蔽的方式来驱动所述可动阀。
19.权利要求18所述的化学发光测量装置，其特征在于，在所述可动阀上固定有透明强磁性体，所述驱动部通过磁力来驱动所述可动阀。
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