CN101320044A - 检测人尿微量白蛋白的共振散射光谱法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速灵敏的检测人尿微量白蛋白的共振散射光谱法，该方法首先制备已知浓度的Malb的检测体系，求得其共振散射光谱I610nm，再以Malb为空白，并测定空白值(I610nm)b，计算ΔI＝I610nm－(I610nm)b，以加入的Malb溶液浓度为横坐标，以ΔI为纵坐标，绘制工作曲线，再制备检测样品的被测体系，求得被测样品的ΔI，根据工作曲线，求得样品的Malb浓度。本发明的优点是仪器简单，操作简便，菲林试剂稳定，适宜存放，胶体金制备简单，催化性能好，快速、灵敏度高。
Description
技术领域：
本发明涉及人尿微量白蛋白的测定方法，具体是检测人尿微量白蛋白的共振散射光谱法。
背景技术：
纳米金具有制备容易、电子密度高、光学和电学性质独特、生物相容性好等特点，已用于蛋白质标记、核酸标记、生物传感器、生物芯片等方面的研究。近来人们发现，金纳米颗粒具有很强的催化活性，在生化分析中具有广阔的应用前景。共振散射光谱法具有灵敏、简单、快速等特点，已应用于蛋白质、核酸、无机离子的分析。
尿微量白蛋白(Malb)是糖尿病、高血压、心血管疾病血管损伤的一个指标，它的测定对糖尿病的早期诊断和改善预后具有划时代的意义。目前测定Malb的方法有芯片电泳法、毛细管电泳法、酶联免疫分析法、高效液相色谱法、时间分辨荧光免疫分析法、荧光免疫分析法等。在这些方法中，有的虽然操作简便，但灵敏度不高，有的灵敏度高，但操作复杂，耗时间长，有的使用有毒的物质，不仅污染环境，而且对人体有害。因此，研究检测人尿微量白蛋白的新方法具有重要的意义，但目前尚未见有免疫金催化-氧化亚铜增强的共振散射光谱法检测人尿微量白蛋白的方法的报道。
发明内容：
本发明的目的是要提供一种操作简便、快速的、灵敏度高的检测人尿微量白蛋白的共振散射光谱法。
本方法包括如下步骤：
(1)依次移取0.20mL pH 5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液，0.30mL 57.96μg/mL AuMalb，一定量的Malb溶液，于具塞刻度试管中，用二次蒸馏水将溶液稀释到2.0mL，在超声波反应器中反应20min，然后以转速16000rpm，离心金免疫复合物溶液30min，移取上层清液备用；
(2)依次移取25μL 69mg/mL CuSO4，100μL 250mg/mL NaOH(含346mg/mL酒石酸钾钠)溶液，12.0μL上层清液，220μL 1mg/mL葡萄糖溶液，于具塞刻度试管中，然后用二次蒸馏水定容至2.5mL，置于70℃恒温水浴6min；
(3)将溶液移到石英池中，置于荧光仪上同步扫描，得到体系的共振散射光谱；
(4)测定610nm波长处测共振散射光强度I610nm，以不加Malb为空白，并测其空白值(I610nm)b，计算ΔI＝I610nm-(I610nm)b；
(5)以加入的Malb溶液的浓度为横坐标，以ΔI为纵坐标，绘制工作曲线；
(6)依据步骤(1)(2)的方法制备检测体系，加入的Malb为未知浓度的检测样品，求得被测样品的ΔI，根据工作曲线，求得被测样品中的Malb的浓度。
在未加入Malb溶液之前，催化体系有微弱的同步散射信号(图1)，当加入Malb后，体系的同步散射增强。随着Malb浓度的增加，共振散射强度线性增强，Malb浓度在0.014-0.43ng/mL范围内与610nn波长的共振散射光强度增加值ΔI610nm存在良好的线性关系。其回归方程为ΔI＝280CMalb+10.87，相关系数为0.993，检出限为0.0072ng/mL。
本发明的原理
在pH 5.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液中，AuMalb发生非特异性聚集，经离心后，非特异性聚集的金标抗体被沉淀下来，上清液中的金标抗体较少。因AuMalb和Malb之间的免疫反应具有很高的特异性，在AuMalb中加入Malb后两者发生免疫反应，使原来非特异性聚集的金标抗体分散，生成的免疫复合物均于分布在溶液中，经过高速离心分离后，仍存在于上清液中。实验结果表明，AuMalb-pH 5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液经离心后，其上清液对Cu(II)-葡萄糖反应亦显示出微弱的催化效应，这是由于仍有微量的AuMalb不能离心分离。随着Malb量的增加，生成分散的胶体金免疫复合物越多，非特异性聚集的胶体金标抗体减少，离心后上层清中金标免疫复合物增多，催化作用增强(图2)，形成的Cu2O颗粒较多，导致共振散射强度增大。据此，可建立一个检测尿微量白蛋白免疫金催化氧化亚铜增强共振散射光谱分析方法。
本发明的优点：
(1)仪器简单，操作简便；
(2)菲林试剂稳定，适宜存放；
(3)胶体金制备简单，催化性能好，快速、灵敏度高。
附图说明
图1为本发明催化加强体系的共振散射光谱；
图中：a：0.69mg/mL CuSO4-1.0mg/mL NaOH-0.088mg/mL葡萄糖-0.042μg/mLAuMalb-0ng/mL Malb；b：a-0.029ng/mL Malb；c：a-0.058ngm/L Malb；d：a-0.12ng/mL Malb；e：a-0.23ng/mL Malb；f：a-0.29ng/mL Malb；
图2为本发明催化原理图。
具体实施方式
用本发明的方法检测10份健康人尿液中尿微量白蛋白的含量。
Cary ecupse荧光仪(美国瓦里安公司)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；TGL-高速冷冻离心机(上海安亭仪器有限公司)；SK8200LH超声波反应器(上海科导超声仪器有限公司)；H-600型透射电子显微镜(日本电子株式会社)。
240mg/L尿微量白蛋白(Malb)标准品，羊抗人尿微量白蛋白抗体(上海捷门生物技术合作公司)，HAuCl4(国药集团化学试剂公司)，样品尿液(桂林市第五人民医院)，0.20mol/LNa2HPO4，0.10mol/L柠檬酸溶液，0.10mol/L K2CO3，100mg/mL KCl，69.2mg/mLCuSO4，250mg/mL NaOH(含346mg/mL酒石酸钾钠)，1mg/mL葡萄糖溶液，所用试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。
1、纳米金采用柠檬酸钠还原法制备：取新制备的亚沸高纯水100mL，加入1.0mL 1％HAuCl4，在电炉上煮沸，2min后，在磁力搅拌加热下快速加入2.75mL 1％柠檬酸钠，溶液由无色变为蓝黑色最后是亮红色，表明金纳米颗粒已经形成，大约过程为2-3min，保持沸腾12min，撤去加热装置，自然冷却至室温。用二次蒸馏水定容至100mL，4℃下密封保存。
该胶体金浓度为57.96μg/mL(以Au计算)，其粒径约为10nm；
2、免疫共振散射光谱探针的制备：取80mL胶体金溶液，在磁力搅拌下加入1.6mL0.1mol/L的K2CO3调节pH值约为6.5，将1.6mLanti-Malb溶液缓慢逐滴加入胶体金溶液中，大约8min加完，继续搅拌10min，再加入1.42mL3％的PEG-20000作为稳定剂(其终浓度为约为0.05％)，再继续搅拌15min后，4℃密封保存。以金计算，其浓度为57.96μg/mL金标记anti-Malb(AuMalb)；
3、取健康人尿液10份，以3000r/min，离心10min，取上清液备用。依次移取0.20mL pH 5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液，0.30mL 57.96μg/mL AuMalb，一定量的尿液上清液，于具塞刻度试管中，用二次蒸馏水将溶液稀释到2.0mL，在超声波反应器中反应20min，然后以转速16000rpm，离心金免疫复合物溶液30min，移取上层清液备用；
4、依次移取25μL 69mg/mL CuSO4，100μL 250mg/mLNaOH(含346mg/mL酒石酸钾钠)溶液，12.0μL上层清液，220μL 1mg/mL葡萄糖溶液，于具塞刻度试管中，然后用二次蒸馏水定容至2.5mL，置于70℃恒温水浴6min。将溶液移到石英池中，置于荧光仪上同步扫描，得到体系的共振散射光谱，测定610nm波长处测共振散射光强度1610nm；
5、不加尿液上清液作空白，测其共振散射光强度(I610nm)b，计算ΔI＝I610nm-(I610nm)b；
6、计算尿液中尿微量白蛋白的含量。
按以上实验方法测定健康人尿样中微量白蛋白的含量，然后在每个已知尿白蛋白含量的尿样中加入0.12ng/mL的Malb，测定并计算其回收率，实验结果如表1。本方法测定的结果与健康人尿中Malb的含量基本一致，小于15mg/L，回收率在92.1-115.7％之间。
表1样品分析结果
Table 1 Results for Malb in urine samples
Claims (3)
1、检测人尿微量白蛋白的共振散射光谱法，其特征是：测定方法包括如下步骤：
(1)依次移取0.20mL pH 5.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液，0.30mL 57.96μg/mLAuMalb，一定量的已知浓度的Malb溶液，于具塞刻度试管中，用二次蒸馏水将溶液定容到2.0mL，在超声波反应器中反应20min，然后以转速16000rpm，离心金免疫复合物溶液30min，移取上层清液备用；
(2)依次移取25μL 69mg/mL CuSO4，100μL 250mg/mL NaOH(含346mg/mL酒石酸钾钠)溶液，12.0μL上层清液，220μL 1mg/mL葡萄糖溶液，于具塞刻度试管中，然后用二次蒸馏水定容至2.5mL，置于恒温水浴；
(3)将溶液移到石英池中，置于荧光仪上同步扫描，得到体系的共振散射光谱；
(4)测定610nm波长处测共振散射光强度I610nm，以不加Malb为空白，并测其空白值(I610nm)b，计算ΔI＝I610nm-(I610nm)b；
(5)以加入的Malb溶液的浓度为横坐标，以ΔI为纵坐标，绘制工作曲线；
(6)依据步骤(1)(2)的方法制备检测体系，加入的Malb为未知浓度的检测样品，求得被测样品的ΔI，根据工作曲线，求得被测样品中的Malb的浓度。
2、如权利要求1所述的测定方法，其特征是：Malb浓度在0.014-0.43ng/mL范围内与610nm波长的共振散射光强度增加值ΔI610nm存在良好的线性关系，其回归方程为ΔI＝280CMalb+10.87，相关系数为0.993，检出限为0.0072ng/mL。
3、如权利要求1所述的测定方法，其特征是：该体系反应温度70℃下，反应6min。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN103439307A (zh) * | 2013-09-30 | 2013-12-11 | 桂林理工大学 | 一种利用靛蓝染料快速检测食品中蛋白质的方法 |
| CN104849243A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-08-19 | 广西师范学院 | 一种以碳点为探针运用共振光散射法检测血红蛋白的方法 |
| CN105137087A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-12-09 | 华中农业大学 | 利用兔抗鸡IgY-纳米金免疫散射探针作检测鸡IgY-标准曲线方法及检测方法 |
| CN115825263A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-21 | 南京科技职业学院 | 一种血清中氧化型白蛋白的检测方法及其试剂盒 |
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2008
- 2008-07-03 CN CNA2008100736683A patent/CN101320044A/zh active Pending
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| CN115825263A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-21 | 南京科技职业学院 | 一种血清中氧化型白蛋白的检测方法及其试剂盒 |
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