CN101226151B - 一种测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法 - Google Patents

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本发明公开了一种测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法，它利用纳米金对Cu(II)-葡萄糖-KBr生成的溴化亚铜微粒反应的催化作用，葡萄糖在一定浓度内与ΔI610nm存在良好的线性关系而建立起来的方法。本方法的优点是：与现有的方法相比，本方法将催化反应与共振散射光谱技术相结合，方法灵敏度高，检测限低，可达到μg/mL水平，选择性较好，操作方便，设备简单，只需要荧光分光光度计即可完成；并且所用试剂易得、成本低廉。

Description

一种测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法
技术领域：
本发明涉及葡萄糖的测定方法，具体地说是一种测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法。
背景技术：
葡萄糖是生命活动中不可缺少的物质，它在人体内能直接参与新陈代谢过程，在消化道中，葡萄糖比任何其他单糖都容易被吸收，而且被吸收后能直接为人体组织利用，具有补充体液、供给能量、补充血糖、强心利尿、促进解毒功能，对癌症也有一定治疗作用。此外，葡萄糖还用在印染制革、制镜工业和热水瓶胆镀银工艺中。目前，葡萄糖的检测方法主要有高效液相色谱法、酶催化法、斐林法等。前二种方法或仪器成本较高或使用较昂贵的酶试剂；虽然准确度较高，但要求在沸腾状态下滴定，操作不便且选择性不高。因此，建立一种简便快速、选择性较好、低成本的葡萄糖检测方法是非常有意义的。
近年来，金属纳米粒子的催化性能研究及应用是一个十分活跃的研究领域。贵金属金曾被认为是催化活性极低的元素，但近来发现小粒径的纳米金具有很好的催化性能。1939年James等人发现硝酸银在胶体金表面被对苯二酚还原，胶体金起到了催化作用；Dansher建立了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的金银染色法；1983年Holgate等人进一步把这个发现运用到组织学的研究中去，创立了免疫金银染色法。金催化金增强引起了人们浓厚的研究兴趣，它极大地提高了检测信号并避免了银增强带来的问题。此外，还可用作为标记物金纳米粒子催化金增强检测DNA和人免疫球蛋白G。近来，Mao等人将纳米金催化铜增强用于检测人免疫球蛋白G，结果同样满意。铜增强试剂易制备、易保存及稳定性好，有广泛的应用前景。共振散射光谱法具有简便、快速、灵敏等特点，已用于无机物、有机物、蛋白质、核酸等分析。迄今为止有关纳米金催化共振散射光谱法检测葡萄糖的方法尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的是要为克服现有技术的不足，而公开一种操作简便、快速、且灵敏度高、成本低的测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法。
本发明测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法包括以下步骤：
1、制备已知葡萄糖浓度的测试体系：
(1)在具塞比色管中，依次移取0.8-1.0mg.mL-1硫酸铜溶液，10-12mg.mL-1斐林试剂A(以氢氧化钠计)，1.912-3.0μg.mL-1金胶，一定量的浓度为1mg.mL-1葡萄糖，0.60-0.72mg.mL-1溴化钾溶液，定容至一定体积，于75℃水浴槽内反应8-10min；
(2)反应完成后将试管放入冷水中冷却至室温终止反应；
(3)用荧光分光光度计，设置电压450V，激发狭缝＝发射狭缝＝2.5nm，同步扫描激发和发射波长(λem-λex＝0nm)得到体系的RSS光谱。在610nm处测定体系的散射光强度；
2、依据步骤一的方法制备试剂空白体系：求得试剂空白体系的(I610nm)b；
3、计算ΔI610nm＝I610nm-(I610nm)b值；
4、以加入的葡萄糖浓度C为横坐标，ΔI为纵坐标，绘制工作曲线；
5、依照步骤一的方法制备检测体系：其中加入的是未知葡萄糖浓度的被测物，求被测物的ΔI；
6.根据工作曲线，即可求得被测样品中葡萄糖在一定线性范围内的浓度，其工作曲线为ΔI610nm＝7.830C-60.60，相关系数为0.9959，检出极限为8μg.mL-1。
步骤1所述的具塞试管为5mL的具塞试管，依次加入的硫酸铜溶液最佳浓度为0.828mg.mL-1，斐林试剂A(以氢氧化钠计)最佳浓度为11mg.mL-1，金胶最佳浓度为1.91μg.mL-1，1mg.mL-1葡萄糖用量为50μL～120μL，溴化钾溶液最佳浓度为0.72mg.mL-1，定容体积为2.5mL，水浴温度为75℃，最佳水浴反应时间为9min；
所述的冷却方式为流水冷却；
所述的共振散射测定波长为610nm；
所述的测定葡萄糖的线性范围为20～48μg.mL-1。
本发明方法的原理是金纳米微粒催化斐林试剂-葡萄糖-溴化钾的反应，存在以下两个机理：①酒石酸钾钠铜络合物阴离子被纳米金晶种吸附至表面，使胶粒带负电，当加入葡萄糖溶液后，它迅速被葡萄糖还原成溴化亚铜纳米微粒，得到溴化亚铜-金复合纳米，如图1(A)所示；②生成的溴化亚铜纳米微粒作为晶种催化斐林试剂-葡萄糖反应，生成粒径更大溴化亚铜纳米微粒，如图1(B)所示。
本方法加入适量浓度的溴化钾，使产物较稳定，这是因为适量浓度的溴化钾可以生成较稳定的溴化亚铜，抑制了亚铜离子的歧化反应，使产物不易被氧化。随着葡萄糖的不断加入，生成的复合钠米微粒增多，从而导致共振散射强度增大。葡萄糖在一定浓度范围内与ΔI610nm存在良好的线性关系，据此建立一个测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法。
本发明的优点是：与现有的方法相比，本方法将催化反应与共振散射光谱技术相结合，方法灵敏度高，检测限低，可达到μg/mL水平，选择性较好，操作方便，设备简单，只需要荧光分光光度计即可完成，并且所用试剂易得，成本低廉。
附图说明：
图1为本发明催化反应原理图
图2为本发明实施例纳米金催化体系的共振散射光谱图，其中，a：11mg.mL-1斐林试剂-0.828mg.mL-1硫酸铜-1.91μg.mL-1胶体金-0.72mg.mL-1溴化钾；b：a-18μg.mL-1葡萄糖；c：a-22μg.mL-1葡萄糖；d：a-30μg.mL-1葡萄糖；e：a-36μg.mL-1葡萄糖；f：a-44μg.mL-1葡萄糖；
图3为本发明实施例的工作曲线；
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的阐述：
下面的实施例是应用纳米金对Cu(II)-葡萄糖-KBr生成溴化亚铜微粒反应的催化作用，建立的检测葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法。
实施例
检测1#样品(紫光古汉集团衡阳制药有限公司)；
2#样品(六技工矿集团大华药业有限公司)；
3#样品(郑州羚锐制药有限公司)；
3种不同的葡萄糖注射液样品的葡萄糖浓度，操作步骤如下：
1、制备已知葡萄糖浓度的测试体系：
(1)在5mL具塞比色管中，依次移取30μL69mg.mL-1硫酸铜溶液，110μL 0.25g.mL-1斐林试剂A(以氢氧化钠计)，100μL 47.8μg.mL-1金胶，50μL～120μL的1mg.mL-1葡萄糖，30μL60mg.mL-1溴化钾溶液，定容至2.5mL，于75℃水浴槽内反应9min；
(2)反应后将试管放入冷水中冷却至室温终止反应；
(3)用Cary Eclipse荧光分光光度计(美国Varian公司)，设置电压450V，激发狭缝＝发射狭缝＝2.5nm，同步扫描激发和发射波长(λem-λex＝0nm)得到体系的RSS光谱。在610nm处测定体系的散射光强度I610nm；
2、用步骤一的方法，制备反应空白体系：求得试剂空白(I610nm)b；
3、计算ΔI610nm＝I610nm-(I610nm)b值；
4、根据测定结果，以加入的葡萄糖浓度Cglucose为横坐标，ΔI610nm为纵坐标，绘制工作曲线，随着葡萄糖浓度C(20～48μg.mL-1)的增大，I610nm值增加。其工作曲线为ΔI610nm＝7.830C-60.60(图3)，相关系数为0.9959，检出限为8μg.mL-1；
5、依据步骤一的方法，分别取1#样品、2#样品、3#样品3种不同的葡萄糖注射液样品制备检测体系：分别求得1#、2#、3#样品的ΔI；
6、根据工作曲线，即可求得葡萄糖注射液样品中葡萄糖的浓度。
图2a表明，空白体系的同步散射很弱，图2b、c、d、e、f表明，当加入葡萄糖反应后，体系在542nm、610nm、723nm出现3个较明显的同步散射峰，其中610nm的同步散射峰最强。已知该仪器在465nm处有最强发射，因此542nm、610nm、723nm的同步散射峰均为纳米微粒共振散射效应产生的共振散射峰。随着葡萄糖浓度的增加，610nm处共振散射强度线性增大。本发明选取波长为610nm进行测定。
本发明实施例中3种不同的葡萄糖注射液样品的分析结果见表1；
结果证明：本法测定的结果和厂家所标浓度和误差很小。
  样品   单次测得值(mg.mL-1)   平均值(mg.mL-1)   相对标准偏差(n＝5，％)   厂家标示浓度(mg·mL-1)
  1#2#3#   51.5051.6650.8650.8651.34100.8101.7100.498.9103.3494.3507.0513.4510.2511.8   51.24±0.368101.0±1.627507.3±7.664   0.721.611.51   50100500
表1
本发明实施例中共存物质对检测40μg.mL-1葡萄糖的影响见表2，结果表明，本方法选择性较好。
  共存物质   允许量(μg.mL-1)   相对误差(％)   共存物质   允许量(μg.mL-1)   相对误差error(％)
  HSABSA维生素CL-赖氨酸L-酪氨酸肌酸Ni2+，Cl-   601609610012030600   +0.3+3.4+9.1-1.2+0.3-5.2-4.5   蔗糖乙醇乙二醇Fe2+，Cl-Zn2+，SO4 2-Mg2+，SO4 2-   407927519.224080   +8.3-7.6+8.0-2.0-0.4+8.2
表2

Claims (3)

1.一种测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法，其特征是：测定方法包括如下步骤：
(1)制备已知葡萄糖浓度的测试体系：
①在5.0mL具塞比色管中，依次移取30μL 69mg.mL-1硫酸铜溶液，110μL氢氧化钠浓度为0.25g.mL-1的斐林试剂A液，100μL 47.8μg.mL-1金胶，50～120μL浓度为1mg.mL-1葡萄糖，30μL浓度为60mg.mL-1溴化钾溶液，定容至2.5mL体积，于75℃水浴槽内反应9min；
②反应后将试管放入冷水中冷却至室温终止反应；
③用荧光分光光度计设置电压450V，激发狭缝＝发射狭缝＝2.5nm，同步扫描激发和发射波长得到体系的共振散射光谱，在610nm处测定体系的散射光强度I610nm；
(2)用步骤(1)的方法，制备反应空白体系：求得试剂空白(I610nm)b；
(3)计算ΔI610nm＝I610nm-(I610nm)b值；
(4)根据测定结果，以加入的葡萄糖浓度Cglucose为横坐标，ΔI610nm为纵坐标，绘制工作曲线；
(5)依据步骤(1)的方法，制备检测体系：求得被测样品的ΔI；
(6)根据工作曲线，即可求得被测样品中葡萄糖的浓度。
2.如权利要求1所述的一种测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法，其特征是：步骤(1)所述的冷却方式为流水冷却。
3.如权利要求1所述的一种测定葡萄糖的纳米金催化共振散射光谱法，其特征是：步骤(6)所述的测定葡萄糖的线性范围为20-48ug.mL-1。
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