CN101319238A

CN101319238A - 芹菜素硬脂酸酯在谷氨酸发酵中的应用

Info

Publication number: CN101319238A
Application number: CNA2008100294940A
Authority: CN
Inventors: 郑成; 卫云路; 孙保兴; 宁正祥
Original assignee: Guangzhou University
Current assignee: Guangzhou University
Priority date: 2008-07-16
Filing date: 2008-07-16
Publication date: 2008-12-10
Anticipated expiration: 2028-07-16
Also published as: CN101319238B

Abstract

本发明提供了芹菜素硬脂酸酯的新用途，即在谷氨酸发酵中的应用。在利用谷氨酸棒状杆菌发酵中后期添加少量芹菜素硬脂酸酯可以使谷氨酸产量提高，对菌种存活及生长几乎没有影响，其效果比添加tween－60好，且用量少。本发明还提供一种提高谷氨酸发酵产率的方法，该方法是以糖质作碳源通过谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸的，其特征是在发酵的第10～40小时往发酵液中加入发酵液总体积的0.05～0.2‰的芹菜素硬脂酸酯。

Description

芹菜素硬脂酸酯在谷氨酸发酵中的应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及促进谷氨酸发酵的方法。

背景技术

谷氨酸是通过微生物发酵法获得的，但是谷氨酸是微生物细胞内的代谢产物，其分泌产物需要通过细胞膜渗透到细胞外，同时谷氨酸载细胞内的积累对菌体代谢有负反馈作用，大大影响了微生物发酵法的产酸率。在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地渗透到细胞外面，就会加快生成谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素之一是细胞膜中的磷脂含量。

选育生物素缺陷型菌种是解决上述问题的常用且有效的手段。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成，而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一，因此磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。但是当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸，即目前最常用的亚适量生物素工艺。

随着表面活性剂产业的发展，研究者们发现表面活性剂也具有改变细胞膜通透性的作用，将表面活性剂作为发酵促进剂的研究越来越多，Duperray F等人公开了利用表面活性剂作为发酵促进剂提高氨基酸发酵产率的方法：使用工业生产菌种谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)进行药瓶发酵试验。培养基配方如下(每升含量)：40g葡萄糖，44ml大豆水解液(利用KOH调pH中性)，1.3gMgSO₄·7H₂O，1.3g(NH₄)₂SO₄，2.1gH₃PO₄，500μg生物素，200μgV_B1，用氢氧化钠调整pH7.4。种子培养条件为30℃，摇床转速为260rpm，培养OD₆₅₀值为1.0以上，接种进行正式发酵，发酵条件为30℃，摇床转速为260rpm，在发酵中期加入十二烷基乙酸铵(DA)或十二烷基三甲基铵(DTA)，当培养OD₆₅₀值为2.0以上为止，残糖含量到0.5％以下中止发酵。其中当DA添加量为400uM时谷氨酸产量为480nmol/mg，当DTA添加量为1000um时谷氨酸产量为560nmol/mg，研究表明加入DTA虽然产酸量较高，对于菌种的产酸寿命有所缩短，影响发酵后期的产酸率。(Duperray F，Jezequel D，Ghazi A，et al.Excretion of glutamate from Corynebacterium glutamicum triggered by amine surfactants[J].Biochim Biophys Acta 1992，1103：250-258)。

由于表面活性剂对微生物具有不同程度的毒杀作用，且不同种类的表面活性剂对不同的微生物发酵的促进作用也是不同的，因此表面活性剂用做发酵促进剂必须满足以下两个条件：(1)具有提高细胞膜通透性的作用，(2)对发酵生产菌生长危害小。可见并非所用的表面活性剂都适合做微生物发酵促进剂。目前常用作谷氨酸发酵促进剂的表面活性剂是吐温-60。

芹菜素硬脂酸酯是表面活性剂中的一种，它是一种非离子表面活性剂，具有较好乳化性，起泡性，柔软性，目前在应用方面报道及其少见，主要应用于油脂工业中，作为一种抗氧化剂使用，取得了良好的效果，但未见其用于谷氨酸发酵的报道。

发明内容

本发明的目的是提供芹菜素硬脂酸酯的新用途。

本发明实现上述目的的技术方案是：芹菜素硬脂酸酯在谷氨酸发酵中的应用。

本发明还提供一种提高谷氨酸发酵产率的方法，该方法是以用糖质作碳源通过谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸为基础的，其特征在于包括以下步骤：其特征是在发酵第10～40小时往发酵液中加入发酵液总体积的0.05～0.2‰的芹菜素硬脂酸酯。

本发明所述的方法中芹菜素硬脂酸酯的较佳用量为为0.2‰；加入的最佳时间为发酵的第12小时。

本发明人发现在利用谷氨酸棒状杆菌发酵中后期添加少量芹菜素硬脂酸酯不仅可以使谷氨酸产量提高，其效果比添加tween-60好，且用量少，还可以缩短发酵时间，对菌种存活及生长几乎没有影响。

为了更好地理解本发明，下面将通过实验说明本发明所具有的技术效果。

1材料与方法

1.1主要材料及仪器

1.1.1菌株

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)T-613，广州市微生物研究所保存菌种。

1.1.2试剂及仪器

十二烷基硫酸钠(SDS)、吐温60(Tween-60)、芹菜素硬脂酸酯(PGS)均为市售分析纯化学试剂；两性甜菜碱001型表面活性剂(AB001)、两性甜菜碱024型表面活性剂(AB024)、两性甜菜碱449型表面活性剂(AB449)由广州慧源绿色生物化工有限公司提供(编号为企业产品代号)。

可见分光光度计(Spectrumlab 22PC)上海棱光技术有限公司；生化培养箱(DGG-9070B型)上海森信实验仪器有限公司；新型恒温振荡器(ZHWY-21020C)上海智城分析仪器制造有限公司；超净化工作台(ZHJY-1214B)上海智城分析仪器制造有限公司。

1.1.3培养基及培养条件

斜面培养基(％)：蛋白胨1.0，牛肉膏1.0，氯化钠0.5，琼脂2.0，pH值7.0；32℃恒温培养12～16小时，保存于4℃冰箱待用。

种子培养基(％)：葡萄糖3.0，玉米浆1.0，尿素0.5(分消)，磷酸氢二钾0.1，七水硫酸镁0.04，七水硫酸亚铁2ppm，一水硫酸锰2ppm，pH值7.0；

菌种培养方法：从斜面接一环菌至种子培养基，250mL摇瓶装液20mL，摇床转速96r/min，温度33℃，培养时间12～14h。

发酵培养基(％)：葡萄糖13.0，玉米浆0.6，初尿0.6(分消)，三水磷酸氢二钠0.7，七水硫酸镁0.06，氯化钾0.05，七水硫酸亚铁2ppm，一水硫酸锰2ppm，pH值7.0，总尿3.2(分消)；

发酵方法：按5％接种量将种子培养液接入发酵培养基，250mL装液量20mL，发酵前期0-16h摇床转速96r/min，温度33.5℃、发酵中期16-40h转速115r/min，温度36℃、发酵后期40-48h摇床转速105r/min，温度38℃，培养时间48h。需要添加表面活性剂的实验，添加方法按各实验介绍进行。

表面活性剂溶液的配制：将SDS、Tween-60、AB001、AB024、AB449均配制为10.0％的溶液待用；将PGS配置为0.5％的溶液待用。

1.2分析手段

1.2.1谷氨酸含量检测：茚三酮比色法。

1.2.2菌种生长量检测：将发酵液稀释10倍使用分光光度计在650nm处测定吸光度OD₆₅₀值。

1.2.3残糖量检测：采用费林试剂法。

1.2.4pH值检测：使用精密pH试纸3.0～5.4与6.4～8.0。

2结果与分析

2.1菌种基本特性的分析

冻干菌种经活化培养后，筛选产酸率高且产酸比较稳定的菌株，接保藏斜面保藏于4℃冰箱中，以供后续实验使用。为了更好确定加入表面活性剂的时间和剂量，研究了本菌种的基本发酵特性如图1和图2所示。由图1可知，随着发酵时间的推移，由于菌种对尿素的利用和谷氨酸的产生，使发酵体系的pH下降，当pH值下降到7.00以下时，及时向体系中补充一定量的尿素，一方面为菌种生长与产酸提供所必需的氮源，另一方面尿素被菌种利用时所产生的NH₄ ⁺可以调节发酵体系的pH值回升，并且从图中可以看出此过程较为平缓，不会有pH值的突变，有利于提高菌种对加入尿素后新体系的适应性。从残糖量曲线可以看出，发酵初期糖耗量较低，进入生长对数期后，残糖量陡然下降，当进入产酸末期后，菌种的耗糖量进一步下降。

从图2可知，本菌种的适应期一般为2～3h，由于种子培养基、发酵培养基成分基本相同，因此适应期比较短；对数生长期在第3～16h；稳定期为第16～40h；产酸期为16～48h。在没有添加表面活性剂的情况下，菌种产酸率基本稳定在3.0％左右。

2.2不同表面活性剂的初步遴选

本实验选择了6种表面活性剂分别为SDS、Tween-60、AB001、AB024、AB449、PGS。由于6种表面活性剂的性质各异，对微生物的毒性也不同，因此在添加的剂量与加入时间上亦存在差异。一般来说阳离子表面表面活性剂对生物的毒性较大，非离子表面活性剂毒性小，对生物的生长影响较弱，阴离子表面活性剂的毒性和杀菌力介于两者之间。将6种表面活性剂分别在发酵开始后4h和16h加入不同剂量，发酵48h后测量体系的产酸率，从而比较它们对于发酵产酸率的影响，结果如表1所示。

表1表面活性剂对谷氨酸棒状杆菌产谷氨酸率(％)的影响

由表1可见，除了SDS、AB001外，其他五种表面活性剂在特定的加入剂量和加入时间对该菌种产酸率有一定程度的提高，这可能是因为SDS所带负电抑制谷氨酸的分泌；AB001效果不佳的原因在于其杀菌能力较强，菌种对其较为敏感。AB449和PGS的效果最好，可将产酸率分别提高19.73％和18.37％。

2.3芹菜素硬脂酸酯最佳添加量的确定

在发酵培养基中分别加入不同质量分数PGS，加入时间为16h，最终测定各个样品的产酸率和OD₆₅₀值。实验结果如表2和图3所示。从图3可知，当加入PGS的浓度在0.05‰～0.20‰之间，谷氨酸发酵的产酸率均较空白实验有一定程度的提高，其中当加入浓度达到0.20‰时，谷氨酸的产量达到最大值3.64％，比对照实验产率提高了16.67％；同时从最终OD₆₅₀曲线可以得出，加入PGS后，对菌种生长有一定的抑制作用，特别当添加量超过0.30‰时，对菌种生长有了较为严重的负面影响，即发挥了表面活性剂的杀菌效力。

表2

PGS(％)	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.35	0.4
PGS(％)	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.35	0.4	Final OD₆₅₀	1.284	1.287	1.29	1.328	1.387	1.294	1.286	1.305	1.045
RG(％)	3.12	3.15	3.20	3.41	3.64	3.05	3.15	3.19	2.95	Final OD₆₅₀	1.284	1.287	1.29	1.328	1.387	1.294	1.286	1.305	1.045

2.4不同时间加入芹菜素硬脂酸酯对产酸率的影响

结果如表3和图4所示，将0.2‰PGS在发酵菌种的生长对数期加入或者是在产酸期后期，即20小时以后加入对发酵产酸率有一定程度的抑制作用，特别是在发酵前期0h～10h加入，产酸率明显降低，同时菌种的OD₆₅₀值也异常低下，分析原因主要是由于菌种对PGS为敏感，特别是在菌种快速繁殖生长阶段，细胞膜结构还比较松散，不利于菌种的生长，另外初期菌种数量有限，PGS的杀菌作用体现比较明显。当将其在对数期末期或者产酸初期即12h～16h加入，产酸率有了一定程度提高，在12h加入达到了产酸率的最大值3.79％，较空白实验的产酸率提高了19.5％。

表3

Time(h)	0	4	8	12	16	20	24	28	32
Time(h)	0	4	8	12	16	20	24	28	32	Final OD650	1.203	0.886	0.865	1.305	1.336	1.289	1.309	1.267	1.209
RG(％)	3.17	2.71	2.83	3.79	3.48	3.32	3.15	2.95	2.84	Final OD650	1.203	0.886	0.865	1.305	1.336	1.289	1.309	1.267	1.209

2.5芹菜素硬脂酸酯加入对发酵周期的影响

结果如表4和图5所示，在加入0.2‰PGS后，谷氨酸的发酵达到产酸最大值的时间较空白实验提前了4h，即发酵周期从原来的44h缩短为40h和36h。

表4

3结论

通过对芹菜素硬脂酸酯(PGS)的加入时间和加入剂量的单因素实验分析可知，在产酸初期加入0.20‰的PGS，可以将谷氨酸发酵产酸率提高16.67％，且将发酵时间缩短4h，可见PGS作为谷氨酸发酵促进剂的有显著效果的。

本实验选用菌种产酸率较目前生产菌种的产酸率相差较大，是因为实验选用发酵法生产谷氨酸的原始菌种，此菌种是从土壤中直接分离纯化而得，并未进行定向诱变育种。但是现有的高产菌株都是在原始菌株的基础上改造的，细胞结构和代谢循环基本一致，产酸机理也相差无几，因此可以认为在选用原始菌种的发酵体系中，根据与目前谷氨酸发酵工艺常用的表面活性剂tween-60的对比实验数据——产酸率所提高的相对比率可以较好反映本发明的技术效果。

附图说明

图1是菌种发酵过程pH值、残糖量变化曲线图，其中

表示残糖量，表示pH值。

图2是菌种发酵过程OD₆₅₀值、产酸率变化曲线图，其中

表示发酵液OD650值，

表示产酸率。

图3是不同浓度芹菜素硬脂酸酯对谷氨酸发酵的影响曲线图，其中其中

表示发酵液最终OD650值，

表示产酸率。

图4是不同时间加入芹菜素硬脂酸酯对谷氨酸发酵的影响曲线图，其中其中

表示发酵液最终OD650值，

表示产酸率。

图5对是芹菜素硬脂酸酯谷氨酸发酵周期的影响曲线图，其中

表示加入芹菜素硬脂酸酯的发酵曲线，

表示不加入芹菜素硬脂酸酯的发酵曲线。

具体实施方式

例1

菌种：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)T-613，广州市微生物研究所保存菌种。

发酵工艺由菌种培养和发酵两个步骤组成：

(1)菌种培养：从斜面接一环菌至种子培养基，250mL摇瓶装液20mL，摇床转速96r/min，温度33℃，培养时间12～14h，0D₆₅₀值大于0.5培养终止。

(2)发酵：按5％接种量将种子培养液接入发酵培养基，250mL装液量20mL，发酵前期0-16h摇床转速96r/min，温度33.5℃、发酵中期16-40h转速115r/min，温度36℃、发酵后期40-48h摇床转速105r/min，温度38℃，在12h时添加0.05‰芹菜素硬脂酸酯，培养时间48h；

其中，

所述的种子培养基(％)组成为：葡萄糖3.0，玉米浆1.0，尿素0.5(分消)，磷酸氢二钾0.1，七水硫酸镁0.04，七水硫酸亚铁2ppm，一水硫酸锰2ppm，pH值7.0；

发所述的酵培养基(％)组成为：葡萄糖13.0，玉米浆0.6，初尿0.6(分消)，三水磷酸氢二钠0.7，七水硫酸镁0.06，氯化钾0.05，七水硫酸亚铁2ppm，一水硫酸锰2ppm，pH值7.0，总尿3.2(分消)。

结果：经过测量得知谷氨酸发酵产酸量为3.15％，较空白试验产酸率提高了0.961％，OD₆₅₀值达到1.287。

例2

发酵工艺由菌种培养和发酵两个步骤组成：

(1)菌种培养：从斜面接一环菌至种子培养基，250mL摇瓶装液20mL，摇床转速96r/min，温度33℃，培养时间12～14h，OD₆₅₀值大于0.5培养终止。

(2)发酵：按5％接种量将种子培养液接入发酵培养基，250mL装液量20mL，发酵前期0-16h摇床转速96r/min，温度33.5℃、发酵中期16-40h转速115r/min，温度36℃、发酵后期40-48h摇床转速105r/min，温度38℃，在16h时添加0.2‰芹菜素硬脂酸酯，培养时间48h；

其中，

结果：经过测量得知谷氨酸发酵产酸量为3.48％，较空白试验产酸率提高了11.53％，OD₆₅₀值达到1.336。

例3

发酵工艺由菌种培养和发酵两个步骤组成：

(2)发酵：按5％接种量将种子培养液接入发酵培养基，250mL装液量20mL，发酵前期0-16h摇床转速96r/min，温度33.5℃、发酵中期16-40h转速115r/min，温度36℃、发酵后期40-48h摇床转速105r/min，温度38℃，在14h时添加0.1‰芹菜素硬脂酸酯，培养时间48h；

其中，

结果：经过测量得知谷氨酸发酵产酸量为3.56％，较空白试验产酸率提高了14.10％，OD₆₅₀值达到1.352。

例4

发酵工艺由菌种培养和发酵两个步骤组成：

(2)发酵：按5％接种量将种子培养液接入发酵培养基，250mL装液量20mL，发酵前期0-16h摇床转速96r/min，温度33.5℃、发酵中期16-40h转速115r/min，温度36℃、发酵后期40-48h摇床转速105r/min，温度38℃，在12h时添加0.2‰芹菜素硬脂酸酯，培养时间48h；

其中，

结果：经过测量得知谷氨酸发酵产酸量为3.64％，较空白试验产酸率提高了16.67％，OD₆₅₀值达到1.387。

Claims

1、芹菜素硬脂酸酯在谷氨酸发酵中的应用。

2、一种提高谷氨酸发酵产率的方法，该方法是以糖质作碳源通过谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸的，其特征是在发酵第10～40小时往发酵液中加入发酵液总体积的0.05～0.2‰的芹菜素硬脂酸酯。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于芹菜素硬脂酸酯的用量为0.2‰。

4、如权利要求2或3所述的方法，其特征在于加入芹菜素硬脂酸酯的时间是发酵的第12小时。