CN101298626A

CN101298626A - 一种高效粒子过滤器生物学检测方法及安全柜检测系统

Info

Publication number: CN101298626A
Application number: CN 200810116064
Authority: CN
Inventors: 李劲松; 温占波; 鹿建春; 赵建军; 毕建军
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2008-07-02
Publication date: 2008-11-05

Abstract

本发明涉及一种高效粒子过滤器生物学检测方法及安全柜检测系统，本发明方法是在一生物安全柜排风口处的高效粒子过滤器的前端设置一微生物气溶胶发生器和一空气微生物采样器，同时在高效粒子过滤器的后端设置1～4个空气微生物采样器，各所述采样器内设置有微生物培养皿；在向所述柜体敞开的前窗操作口送风的同时，人工发生模拟指示微生物，所述模拟指示微生物分别为自然空气中没有的，对人、动物、环境无生物危害的细菌和病毒；通过设置在所述高效粒子过滤器前、后空气微生物采样器内的培养皿，对所述模拟指示微生物进行采集；并进行培养后计数；通过计算高效粒子过滤器过滤前、后计数结果的比例关系，得到高效粒子过滤器对于微生物的过滤效率。

Description

一种高效粒子过滤器生物学检测方法及安全柜检测系统

技术领域

本发明涉及一种生物学检测方法及检测装置，特别是关于一种二级、三级生物安全柜的高效粒子过滤器生物学检测方法及安全柜检测系统。

背景技术

在病原微生物学和生物医学实验中，二级、三级生物安全柜是病原微生物实验室中一种常用且必须具备的生物安全防护设备，也是三级、四级生物安全实验室的一级防护屏障，它的排风过滤系统对病原微生物气溶胶的过滤净化效果，直接关系到对实验室外环境的保护。

目前，国内外对二级、三级生物安全柜中排风系统的高效粒子过滤器(HEPA)的检测，都是采用非生物气溶胶的方法，即采用粒子扫描、光密度测量等物理学方法进行检测评价。检测时，一般使用人工发生邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、聚α-烯烃(PAO)、聚乙二醇等的单分散气溶胶(0.3μm或0.5μm)，进行泄漏的检测。由于生物气溶胶粒子和非生物气溶胶粒子在组成成分、结构、物理特性等方面存在较大差异，特别是实验室产生的微生物气溶胶是多分散的、粒子粒径小、所带电荷也因微生物种类不同而不同。因此采用已有方法对负压感染动物饲养隔离装置的排风系统中高效粒子过滤器的检测评价结果，往往与高效粒子过滤器对微生物气溶胶的实际过滤效果不符。同时现有的检测方法仅对高效粒子过滤器进行逐行扫描检测，无法对整个高效粒子过滤器的结构泄漏、损伤泄漏、材料结构性泄漏作出系统性的检测。另外物理学检测方法还存在着现场操作的复杂性和仪器要求高的特点。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种应用于二级、三级生物安全柜排风系统中，操作安全可靠，检测效果真实准确，不会对环境产生二次污染的高效粒子过滤器生物学检测方法及安全柜检测系统。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种高效粒子过滤器生物学检测方法，其特征在于：(1)在一生物安全柜排风口处的高效粒子过滤器的过滤前端设置一微生物气溶胶发生器和一空气微生物采样器，同时在高效粒子过滤器的过滤后端设置1～4个空气微生物采样器，各所述采样器内设置有微生物培养皿；(2)在通过敞开的前窗操作口向安全柜内进风的同时，由空气微生物气溶胶发生器向安全柜内人工发生模拟指示微生物，所述模拟指示微生物分别为自然空气中没有的，对人、动物、环境无生物危害的细菌和病毒；(3)通过设置在高效粒子过滤器前、后的空气微生物采样器，分别在细菌和病毒两种模拟指示微生物的情况下进行空气采集；(4)取出所述各采集器中的培养皿，对所述模拟指示微生物进行生物学培养后计数；(5)通过计算高效粒子过滤器过滤前、后计数结果的比例关系，得到高效粒子过滤器对于微生物的过滤效率。

所述模拟指示微生物的细菌使用粘质沙雷氏菌，所述模拟指示微生物的病毒使用粘质沙雷氏菌的噬菌体SM701，所述人工发生模拟微生物气溶胶的粒子粒径范围为0.5～3μm之间，其中1μm的微生物气溶胶粒子数占75％以上。

所述微生物气溶胶发生器为气喷、回流式发生器，其额定工作流量下每分钟气溶胶化粘质沙雷氏菌液≥0.2ml，释放的粘质沙雷氏菌气溶胶中粒径2μm以下的活粒子比例≥80％，微生物气溶胶的释放速度为30±3m/min。

所述高效粒子过滤器前端的空气微生物采样器采用安装了琼脂平皿的Anderson六级空气微生物采样器，且在所述生物安全柜处于正常、稳定运行状态下，采集空气本底样本，采样时间为10min，采样器流量为28.3L/min。

所述高效粒子过滤器后端的采样器为安装了琼脂平皿的三台Anderson二级空气微生物采样器，各所述二级空气微生物采样器设置在距离所述高效粒子过滤器后端40～60cm处的排风口中轴线处、中轴线左侧和中轴线右侧，且在发生模拟指示微生物气溶胶10min后，开始检测采样，采样时间为10min，采样器流量为28.3L/min，重复检测3次。

一种实现上述方法的安全柜检测系统，其特征在于：它包括一柜体，所述柜体的顶部排风口处设置一连接排风管的高效粒子过滤器，所述高效粒子过滤器的前端设置一微生物气溶胶发生器和一空气微生物采样器；所述柜体外面设置1～4个空气微生物采样器，且各采样器的进气端分别通过一采样管通入所述高效粒子过滤器后端上方的排风管内；各所述采样器内设置有微生物培养皿，且各所述采样器的出口分别通过一管路连接抽气泵，所述柜体上设置有敞开的前窗操作口，空气从所述前窗操作口进入，经过所述高效粒子过滤器过滤后从所述排风管排出。

所述高效粒子过滤器前端的采样器为Anderson六级空气微生物采样器。

所述高效粒子过滤器后端的采样器为三台Anderson二级空气微生物采样器，所述采样器设置在距离所述高效粒子过滤器排风口40～60cm处的排风口中轴线处、中轴线左侧和中轴线右侧。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明方法直接针对二级、三级生物安全柜排风系统的高效粒子过滤器，提出了一种采用微生物气溶胶对高效粒子过滤器的过滤净化效果进行生物学检测的新方法。2、本发明的采用的微生物气溶胶选定使用的模拟指示微生物，是空气中没有的细菌和病毒(包括噬菌体)，而且该细菌和病毒对人群、动物、环境等都没有危害，因此，检测过程安全可靠，检测结果真实准确，特异性非常高。3、本发明选择粘质沙雷氏菌替代致病细菌，选择粘质沙雷氏菌的噬菌体替代致病病毒，同时通过设置在采集器中的琼脂培养基收集高效粒子过滤器前后的气溶胶粒子，并通过对落菌培养后进行粘质沙雷氏菌菌落和噬菌体空斑计数，进而通过计算得到高效粒子过滤器的实际过滤效果，实现了本发明生物学检测方法，弥补了现有物理学检测方法的缺陷。4、本发明方法系统性强，不仅可以检测高效粒子过滤器是否有泄漏，还可以检测高效粒子过滤器与负压感染动物饲养隔离装置之间安装的框架是否达到气密性密封。5、实现本发明方法的本发明装置，不但实用简便，结果真实准确，而且安全可靠。本发明装置可以广泛用于各种二级、三级生物安全柜条件下的高效粒子过滤器生物学检测过程中。

附图说明

图1是实现本发明方法的安全柜检测系统示意图

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行详细的描述。

如图1所示，本发明中的二级、三级生物安全柜检测系统包括一柜体1，在柜体1的顶部排风口处设置一连接排风管2的高效粒子过滤器3，在高效粒子过滤器3的前端设置一微生物气溶胶发生器4和一空气微生物采样器5，在柜体1外面设置1～4个空气微生物采样器6，将各采样器6的进气端分别通过一采样管7连接到高效粒子过滤器3后端上方的排风管内，在采样器4、5的出口分别通过一管路连接一抽气泵。柜体1的前面设置有敞开的前窗操作口8，空气从操作窗8进入，经过高效粒子过滤器3过滤后从排风管2排出。在两个采样器5、6的出口端分别通过一管路连接一抽气泵(图中未示出)，也可以两个管路并联连接一抽气泵。在微生物气溶胶发生器4的进气端与普通技术相同，通过管路依次连接一流量计、压力计、滤油装置和一空气压缩机。在二级生物安全柜中，微生物气溶胶发生器喷射轴在柜体1中心并与前窗操作口8上沿平齐，喷嘴前端位于前窗操作口8外100mm，喷雾方向平行于工作台面，正对前窗操作口。在三级生物安全柜体内，微生物气溶胶发生器4喷嘴前端位于柜体内高度下三分之一的水平处，喷口朝向排风管。

本发明中的微生物气溶胶发生器4用人工发生模拟指示微生物替代非生物粒子。其中模拟指示微生物包括两种，一种是细菌，用自然空气中没有的，对人、动物、环境无生物危害的细菌，另一种是病毒，用自然空气中没有的，对人、动物、环境无生物危害的病毒。本发明的细菌使用粘质沙雷氏菌，也可以使用其它非致病细菌；本发明的病毒使用粘质沙雷氏菌的噬菌体，也可以使用其它非致病的病毒、噬菌体。本发明在对高效粒子过滤器3进行生物学检测的过程中，是通过微生物气溶胶发生器4分别人工发生含有细菌的模拟指示微生物气溶胶和含有病毒的模拟指示微生物气溶胶，并分别通过设置在柜体1内、外的采样器5、6进行收集，再对收集的细菌或病毒进行生物学培养和计数，然后通过计算高效粒子过滤器3过滤前、后计数结果的比例关系，得到高效粒子过滤器3对应微生物的真实过滤效率。

下面通过具体实施例，对本发明作进一步的说明。

本发明在进行生物学检测过程中使用的材料：

1、模拟指示微生物：

本实施例的细菌采用粘质沙雷氏菌(Serratia Marcescens)，粘质沙雷氏菌菌落为玫瑰红色，微凸，光滑湿润，边缘整齐。

本发明的病毒采用粘质沙雷氏菌噬菌体SM701悬液。

人工发生模拟微生物气溶胶的粒子粒径范围为0.5～3μm之间，其中1μm的微生物气溶胶粒子数占75％；

2、试剂

(1)磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)

取无水磷酸氢二钠2.83克，磷酸二氢钾1.36克，加入蒸馏水至1000ml，调节pH至7.2～7.4，在121℃高压蒸汽下灭菌20min备用。

(2)普通琼脂培养基

成分：蛋白胨10克牛肉膏粉3克 NaCl5克琼脂粉15克

加入1000ml蒸馏水或去离子水混合加热熔解，调节pH至7.2～7.4，在121℃高压蒸汽下灭菌20min备用。

(3)普通肉汤培养基

成分：牛肉膏3克蛋白胨10克氯化钠5克

加水至1000ml，调节pH至7.2～7.4，在121℃高压蒸汽下灭菌20min备用。

(4)LB培养基(Luria-Bertani培养基)

成分：胰蛋白胨10克酵母提取物5克 NaCl10克

3、粘质沙雷氏菌悬液制备

(1)在无菌条件下将粘质沙雷氏菌(Serratia Marcescens)菌种划线接种到普通琼脂培养基平皿(90×15mm)上；

(2)在30±0.5℃下培养24±2h；

(3)在无菌条件下从特征性菌落(玫瑰红色，微凸，光滑湿润，边缘整齐)表面上挑取一接种环细菌转移到装有5ml肉汤液体培养基的试管中；

(4)在37±0.5℃下，摇床(160rpm)培养24±2h；

(5)在4℃下保存，保存期限为15天，使用前用平皿稀释计数法确定菌液浓度，按上述方法制备的菌液，其平均浓度应为1×10¹⁰～4×10¹⁰/ml；

(6)用PBS稀释液将细菌原液按适当比例稀释后即可应用。

4、粘质沙雷氏菌噬菌体SM701悬液的制备和培养

(1)宿主菌菌液的制备

将在普通琼脂培养基上生长的粘质沙雷氏菌接种于肉汤液体培养基，在37℃下，150rpm振荡培养8h，在4℃下保存备用。

(2)粘质沙雷氏菌噬菌体SM701的增殖

将粘质沙雷氏菌噬菌体液0.1ml和宿主菌液0.2ml加入5ml LB液体培养基中，室温放置1h，在37℃下50rpm振荡培养3.5h后，离心机10000rpm离心10min，将上清液用0.22μm滤膜过滤，所得扩增液效价检查应为10⁹～10¹⁰pfu/ml，在4℃下保存。如效价不足，可重复增殖。

(3)噬菌体培养计数：

双层平皿法：下层用含1.5％琼脂的LB培养基7～9ml铺皿，放入采样器5、6中进行噬菌体采样后取出，在无菌条件下，在50℃的上层半固体培养基4～6ml中加入含有0.3ml 10⁹pfu/ml的粘质沙雷氏菌，然后放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板，待凝固后，在30～36℃下培养12～24h，计数噬菌斑。

采用本发明装置进行生物学检测方法，包括以下步骤：

1、本底检测

保持柜体1处于正常、稳定运行状态，用安装了琼脂平皿的Anderson六级空气微生物采样器5，在柜体1内采集空气本底样本，采样时间10min，采样器5流量为28.3L/min。

2、对微生物气溶胶发生器4的选择应满足下列条件：

(1)气喷、回流式发生器；

(2)额定工作流量下每分钟气溶胶化粘质沙雷氏菌液≥0.2ml；

(3)释放的粘质沙雷氏菌气溶胶中粒径2μm以下的活粒子比例≥80％；

(4)微生物气溶胶的释放速度为30±3m/min。

3、对微生物气溶胶发生器4校准采用以下方法：

(1)测量微生物气溶胶发生器的喷雾口的面积(m²)，计算以0.5m/s的速度喷出气溶胶时，气溶胶发生器的气流量(m³/s)；

(2)向微生物气溶胶发生器4中加入一定体积的粘质沙雷氏悬液菌，悬液菌落浓度用平板稀释法计算；

(3)打开微生物气溶胶发生器4和采样器5，控制气流量，使气溶胶喷出速度为0.5m/s，对微生物的损伤率小于15％。微生物气溶胶发生器4工作后分流回流液，准确测量体积后用平板稀释法计算其菌落浓度，采样20min。采样后准确测量并记录剩余菌液体积；

(4)结果计算

气溶胶发生量＝(菌液原体积-喷雾20min后菌液体积-回流液体积)/20；

气溶胶喷出速度＝气流流量(m³/s)/喷雾口面积(m²)；

气溶胶中粒径2μm以下活粒子比例＝Andersen式采样器5、6级平皿菌落数/各级平皿菌落数之和

粘质沙雷氏菌(PBS稀释液)的回收率＝回流液菌落浓度/菌液原浓度。

本实施例检测时，将粘质沙雷氏菌悬液用PBS稀释液稀释至(1～8)×10⁷/ml，冰浴放置，连接到本发明装置中微生物气溶胶发生器4的进液口上，发生模拟的微生物气溶胶的粒子粒径范围在0.5～3μm之间，其中1μm的微生物气溶胶粒子数占75％。

4、排风管模拟样本的采集检测

在距离柜体1排风管2上方40～60cm处的排风管2中轴线处、中轴线左侧和中轴线右侧，分别设置一采样管7，每根采样管7分别连接一台Anderson二级空气微生物采样器6，三台采样器6的出气端可以并联连接一抽气泵。

在保持柜体1处于正常、稳定运行状态下，在柜体1内发生模拟指示微生物气溶胶10min后，开始检测采样。采样时间为10min，采样器6流量为28.3L/min，每种(包括细菌和病毒)检测重复3次。

5、检测样品培养分析

将本底采集样本、模拟检测采集样本置于温箱中30±0.5℃培养24±2h后，进行粘质沙雷氏菌菌落和噬菌体空斑计数。

6、本发明检测结果的计算：

(1)菌落浓度以CFU/m³表示，本底中指示菌浓度应为0CFU/m³。

(2)柜体1内平均模拟指示菌气溶胶浓度应大于10⁴CFU/m³，排风管2处高效粒子过滤器3对指示菌气溶胶的过滤率应根据高效粒子过滤器3过滤前指示菌气溶胶浓度和高效粒子过滤器3过滤后指示菌气溶胶浓度进行计算，是否合格应根据国家相关标准进行判定。

Claims

1、一种高效粒子过滤器生物学检测方法，其特征在于：

(1)在一生物安全柜排风口处的高效粒子过滤器的过滤前端设置一微生物气溶胶发生器和一空气微生物采样器，同时在高效粒子过滤器的过滤后端设置1～4个空气微生物采样器，各所述采样器内设置有微生物培养皿；

(2)在通过敞开的前窗操作口向安全柜内进风的同时，由空气微生物气溶胶发生器向安全柜内人工发生模拟指示微生物，所述模拟指示微生物分别为自然空气中没有的，对人、动物、环境无生物危害的细菌和病毒；

(3)通过设置在高效粒子过滤器前、后的空气微生物采样器，分别在细菌和病毒两种模拟指示微生物的情况下进行空气采集；

(4)取出所述各采集器中的培养皿，对所述模拟指示微生物进行生物学培养后计数；

(5)通过计算高效粒子过滤器过滤前、后计数结果的比例关系，得到高效粒子过滤器对于微生物的过滤效率。

2、如权利要求1所述的一种高效粒子过滤器生物学检测方法，其特征在于：所述模拟指示微生物的细菌使用粘质沙雷氏菌，所述模拟指示微生物的病毒使用粘质沙雷氏菌的噬菌体SM701，所述人工发生模拟微生物气溶胶的粒子粒径范围为0.5～3μm之间，其中1μm的微生物气溶胶粒子数占75％以上。

3、如权利要求2所述的一种高效粒子过滤器生物学检测方法，其特征在于：所述微生物气溶胶发生器为气喷、回流式发生器，其额定工作流量下每分钟气溶胶化粘质沙雷氏菌液≥0.2ml，释放的粘质沙雷氏菌气溶胶中粒径2μm以下的活粒子比例≥80％，微生物气溶胶的释放速度为30±3m/min。

4、如权利要求1或2或3所述的一种高效粒子过滤器生物学检测方法，其特征在于：所述高效粒子过滤器前端的空气微生物采样器采用安装了琼脂平皿的Anderson六级空气微生物采样器，且在所述生物安全柜处于正常、稳定运行状态下，采集空气本底样本，采样时间为10min，采样器流量为28.3L/min。

5、如权利要求1或2或3所述的一种高效粒子过滤器生物学检测方法，其特征在于：所述高效粒子过滤器后端的采样器为安装了琼脂平皿的三台Anderson二级空气微生物采样器，各所述二级空气微生物采样器设置在距离所述高效粒子过滤器后端40～60cm处的排风口中轴线处、中轴线左侧和中轴线右侧，且在发生模拟指示微生物气溶胶10min后，开始检测采样，采样时间为10min，采样器流量为28.3L/min，重复检测3次。

6、如权利要求4所述的一种高效粒子过滤器生物学检测方法，其特征在于：所述高效粒子过滤器后端的采样器为安装了琼脂平皿的三台Anderson二级空气微生物采样器，各所述二级空气微生物采样器设置在距离所述高效粒子过滤器后端40～60cm处的排风口中轴线处、中轴线左侧和中轴线右侧，且在发生模拟指示微生物气溶胶10min后，开始检测采样，采样时间为10min，采样器流量为28.3L/min，重复检测3次。

7、一种实现如权利要求1～6所述高效粒子过滤器生物学检测方法的安全柜检测系统，其特征在于：它包括一柜体，所述柜体的顶部排风口处设置一连接排风管的高效粒子过滤器，所述高效粒子过滤器的前端设置一微生物气溶胶发生器和一空气微生物采样器；所述柜体外面设置1～4个空气微生物采样器，且各采样器的进气端分别通过一采样管通入所述高效粒子过滤器后端上方的排风管内；各所述采样器内设置有微生物培养皿，且各所述采样器的出口分别通过一管路连接抽气泵，所述柜体上设置有敞开的前窗操作口，空气从所述前窗操作口进入，经过所述高效粒子过滤器过滤后从所述排风管排出。

8、如权利要求7所述的一种安全柜检测系统，其特征在于：所述高效粒子过滤器前端的采样器为Anderson六级空气微生物采样器。

9、如权利要求7或8所述的一种安全柜检测系统，其特征在于：所述高效粒子过滤器后端的采样器为三台Anderson二级空气微生物采样器，所述采样器设置在距离所述高效粒子过滤器排风口40～60cm处的排风口中轴线处、中轴线左侧和中轴线右侧。