CN101297796A - 一种注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用灰树花菌丝体提取分离出的如附图I所示结构的β－葡聚糖制成的注射用冻干粉及制备方法，属医药制剂技术领域。从图中可知，该多糖的单糖组成均为葡萄糖，主链的葡萄糖残基以β－1，6－糖苷键连接，支链的葡萄糖残基以β－1，3－糖苷键连接，支链长度为2个葡萄糖残基，分支度约二分之一。该β－葡聚糖的分子量范围为50,000～250,000道尔顿，分子量分布宽度小于3.0。该葡聚糖为具有一定分子量范围的单一组分，该组分分子无论分子量大小，均具有相同的重复单元结构。试验证明本发明所提供的注射用冻干粉具有免疫调节、抗辐射、抑制肿瘤的特点。
Description
技术领域：
本发明涉及一种利用灰树花菌丝体提取分离出的β-葡聚糖制成的注射用冻干粉及制备方法，属医药制剂技术领域，具有免疫调节、抗辐射和抑制肿瘤等特点。
背景技术：
灰树花(Grifola frondosa)是担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌属中的大型真菌，又名贝叶多孔菌(Polyporus frondosus)、栗子蘑、千佛菌、重菇等，日本称之为舞茸(maitake)，为名贵药食两用真菌。主要分布在亚热带至温带森林中，外观灰白色，其子实体中富含氨基酸、多糖以及微量元素等在内的多种营养成份。1984年Ohno等在“Antitumor activityand structural characterization of Glucans extracted from cultured fruitbodies of Grifola rondosa.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1984，32(3)：1142-1151”中首次报道了灰树花多糖具有抗肿瘤活性以来，各国对灰树花多糖的化学结构及保健功能的研究已逐步展开，其对人体生理功能良好的调节作用也逐渐被人们认识。传统的生产方法为固体栽培，利用液体发酵方法可以大规模获得灰树花菌丝体。研究表明，灰树花菌丝体中含有多种不同结构的多糖，如α构型的多糖和β构型的多糖。其中β-葡聚糖具有广泛的药理活性，其免疫调节活性、抑制肿瘤活性和抗辐射活性尤其突出。此外还具有抗人免疫缺陷病毒(HIV)以及各种肝炎病毒，降低血糖，改善睡眠和调节血脂代谢等活性。
目前，以灰树花及灰树花多糖为原料的保健品已风靡日本和美国，已上市的产品主要有日本的MAITEX系列产品、美国的GRIFRON、MAITAKE系列产品及我国的保力生胶囊、栗蘑胶囊等。
以上产品所用主要原料多是从固体栽培的子实体中提取的粗多糖，该类产品存在生物降解严重，生物利用度低，口服效果差的缺点。而利用灰树花菌丝体可生产高纯度β-葡聚糖，利用纯化的灰树花β-葡聚糖生产注射用β-葡聚糖冻干粉针制剂尚未见报导。
灰树花多糖的提取多通过水提取获得水溶多糖，但存在得率低，α构型的多糖和β构型的多糖不易分离的缺点，本发明则先用乙醇和水作为溶剂去除菌丝体中的小分子物质和杂多糖，再利用碱提取出制剂所需的β-葡聚糖。
发明内容：
本发明的目的是提供一种注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉以及制备方法。灰树花β-葡聚糖冻干粉能够有效保持β-葡聚糖的特有结构和药理活性，体内吸收快，并能克服现有技术所制备产品存在生物降解严重，生物利用度低，口服效果差的缺点。本发明涉及一种注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉制剂，其主要原料为灰树花β-葡聚糖。
用作制剂原料的灰树花β-葡聚糖的重复单元结构式如附图I所示。从图中可知，该多糖的单糖组成均为葡萄糖，主链的葡萄糖残基以β-1，6-糖苷键连接，支链的葡萄糖残基以β-1，3-糖苷键连接，支链长度为2个葡萄糖残基，分支度约二分之一。该β-葡聚糖的分子量范围为50,000～250,000道尔顿，分子量分布宽度小于3.0。该葡聚糖为具有一定分子量范围的单一组分，该组分分子无论分子量大小，均具有相同的重复单元结构。
本发明涉及一种注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉制剂的制备方法，其特征是以灰树花β-葡聚糖为主要原料，加入赋形剂，经浓配、稀配、过滤、除菌、分装，在-40℃～30℃的范围内，连续冷冻干燥28～38小时，轧盖、封装制成。
本发明的制剂产品有效成分结构独特，制剂剂型新颖，具有免疫调节、抗辐射和抑制肿瘤活性。该制剂产品制备工艺简单，容易操作，所用的原料来源丰富。制剂有效成分的结构和药理活性保持良好，生物利用度高。
具体实施方式：
取灰树花发酵菌丝体100g，加入80％的乙醇300ml，室温搅拌2h，4000r/min离心。取沉淀加入去离子水300ml，加热至微沸，搅拌提取2h，6000r/min离心，重复提取2次。取沉淀加入4％的NaOH200ml，室温搅拌提取1h，6000r/min离心，沉淀中再加入4％的NaOH200ml，60℃提取3h，6000r/min离心。热碱重复提取2次，合并上清液。
取上述热碱提取的上清液，缓慢加入冰乙酸至ph值为7，此时有大量沉淀产生，6000r/min离心。取上清液，用截流分子量为10000Dalton的超滤膜浓缩并脱盐。浓缩至100ml时，在浓缩液中加入4倍体积95％的乙醇，此时有大量多糖析出。6000r/min离心，收集滤饼。
将该滤饼重新溶于300ml去离子水，6000r/min离心后，取上清液上10000Dalton的超滤膜浓缩，再用4倍体积95％的乙醇析出多糖。此过程重复2次。
对最后析出的多糖溶于50ml去离子水，离心后，将上清液冷冻干燥，即为灰树花β-葡聚糖原料。
用上述方法提取时，该β-葡聚糖的得率为1.1％。对上述原料进行结构分析证明，其结构如附图1所示，为带有β-1.3-分支的β-1.6-葡聚糖。用硫酸苯酚法测定其多糖含量为95.2％，用HPLC法测定，其含量为96.5％。
取灰树花β-葡聚糖原料2g，加入1000ml注射用水，充分溶涨3小时，再加入甘露醇200g，加热搅拌使充分溶解，加注射用水至2000ml，搅拌均匀，按药液体积的0.1％加入针用活性炭，搅拌吸附30分钟，过滤脱炭。检验合格后，用0.22μm的滤膜精滤除菌，按2ml/支的量分装到1000支5ml的西林瓶中。在-40℃的温度下冷冻4小时，在-40℃～-5℃的温度范围内冷冻干燥15小时，在-5℃～30℃的温度范围内冷冻干燥15小时。完成冻干后，轧盖，检验包装。该制剂产品含有效成分灰树花β-葡聚糖2mg/支。
本实施例中，β-葡聚糖溶涨所用的时间可以是0.5～4小时，甘露醇用量可以是100～200g，针用活性炭用量可以是药液体积的0.1％～1％，注射用水总量为400～2000ml，冷冻干燥的时间为28～38小时。
用本发明的制剂按现有方法进行了免疫调节、抗辐射和抑制肿瘤活性试验，结果如表1、表2和表3所示。
从表1、表2和表3的试验实验结果可以看出，本发明的制剂产品能明显提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，具有细胞免疫和体液免疫的功能，可提高辐射后肌体的白细胞数、存活时间和存活率，对实体瘤S180的抑瘤率可达65％，具有明显的提高免疫、抗辐射和抑制肿瘤活性。
表1注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉的免疫调节作用
| 组别 | 剂量(mg/Kg) | 胸腺指数(mg/g) | 脾指数(mg/g) | P值 |
| 模型组 | 0 | 7.63±1.99 | 1.99±1.08 | - |
| 阳性对照组 | 4 | 6.66±1.12 | 1.82±0.76 | |
| 低剂量组 | 1 | 8.73±2.03 | 2.88±1.03 | ＜0.05 |
| 高剂量组 | 4 | 8.28±3.23 | 2.70±0.88 | ＜0.05 |
表2注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉的抗辐射作用
a：p＜0.01，b：p＜0.05
表3注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉对实体瘤S180的抑制作用
| 组别 | 剂量(mg/Kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(％) | P值 |
| 模型组 | 0 | 1.12±0.46 | - | |
| 阳性对照组 | 4 | 0.83±0.62 | 25.82 | |
| 低剂量组 | 1 | 0.66±0.63 | 41.12 | ＜0.05 |
| 高剂量组 | 4 | 0.39±0.23 | 65.11 | ＜0.01 |
附图是灰树花β-葡聚糖的基本结构单元图。
Claims (4)
1、一种注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉，其特征是以灰树花β-葡聚糖为主要成分制成。
2、根据权利要求1所述的灰树花β-葡聚糖的重复单元结构式如附图I所示。从图中可知，该多糖的单糖组成均为葡萄糖，主链的葡萄糖残基以β-1，6-糖苷键连接，支链的葡萄糖残基以β-1，3-糖苷键连接，支链长度为2个葡萄糖残基，分支度约二分之一。该β-葡聚糖的分子量范围为50,000～250,000道尔顿，分子量分布宽度小于3.0。该葡聚糖为具有一定分子量范围的单一组分，该组分分子无论分子量大小，均具有相同的重复单元结构。
3、一种注射用灰树花β-葡聚糖冻干粉的制备方法，其特征是以灰树花β-葡聚糖为主要原料，加入赋形剂，经浓配、稀配、过滤、除菌、分装、冷冻干燥、轧盖、封装制成。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征是β-葡聚糖溶涨所用的时间为0.5～4小时，针用活性炭用量为药液体积的0.1％～1％，冷冻干燥的温度为-40℃～30℃，冷冻干燥时间为28～38小时。
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| CN104906055A (zh) * | 2015-06-29 | 2015-09-16 | 湖南科伦制药有限公司 | 一种三磷酸胞苷二钠冻干粉针剂的制备方法 |
| CN114796093A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-07-29 | 正大制药（青岛）有限公司 | 一种注射用海藻倍他葡萄糖用生产工艺 |
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