CN101294207A - 冠心病检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测动脉粥样硬化和/或冠心病易感性的方法，它包括检测个体的连接附着分子(F11R)、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患动脉粥样硬化和/或冠心病的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。

Description

冠心病检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及连接附着分子(junctional adhesion molecule，F11R)的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其与动脉粥样硬化和/或冠心病的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。

背景技术

动脉粥样硬化是一种常见的进行性动脉疾病，病变主要累及中等大小的肌层动脉，动脉内膜脂质沉积，平滑肌细胞增生，形成局限性斑块，可使动脉壁变硬，严重时斑块破裂导致血栓、栓塞、出血，受累管腔部分或完全闭塞，临床表现为动脉粥样硬化血管并发症的发生，老年患者中最常见和最严重的血管并发症是动脉粥样硬化和/或冠心病(不稳定性心绞痛和心肌梗塞)和脑卒中。

动脉粥样硬化病变的发生和发展主要经历了四个循序渐进的病理过程：

1.脂质浸润前期内膜改变：内皮损伤

2.脂质条纹：泡沫细胞、T淋巴细胞聚集，平滑肌细胞增生。

3.纤维斑块：平滑肌纤维化，形成纤维帽。

4.复合病变：斑块钙化、破裂、溃疡，中膜病变。

动脉粥样硬化的病因及发病机制十分复杂，是动脉壁的细胞、细胞外基质、血液成分(特别是单核细胞、血小板和LDL)、局部血流动力学、环境及遗传因素之间一系列复杂作用的结果，因而病因并非是单一因素的。

动脉粥样硬化作为多基因疾病，发病原因不仅涉及到多个作用不同的基因，而且还涉及到基因-基因、基因-环境的相互作用。现在关于动脉粥样硬化发病机理的学说有很多，如渗入脂质学说、血管内膜损伤学说、炎症反应学说、氧化-抗氧化学说及血栓形成学说。所有这些学说都涉及到不同的生物通路，但是现在还没有一种学说能够在遗传学和分子生物学上得到完整的解释。

多年来，基于对动脉粥样硬化致病危险因素的长期研究，科学家们针对这些危险因素开展了大量的工作。目前为止，已经发现了血管紧张素I转化酶(ACE)和MTHFR的某些插入、缺失和突变可能使动脉粥样硬化和/或冠心病致病的潜在危险因素。前者使血压调节中发挥重要功能的酶类之一，后者是一种与半胱氨酸代谢有关的酶。

另外，德国科学家最近证实，AT1受体的表达水平与血管受损过程紧密联系：ACE抑制剂会减少AT1受体的激活，从而改善血管功能不良、有效的抑制动脉粥样硬化的发生和发展。

但长期以来，国内外研究较多地集中于脂质代谢通路中相关基因的突变及表达，如：副氧酶、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶等。在对内源性一氧化氮合成酶(eNOS)的研究中，现在已有一些研究工作表明eNOS与动脉粥样硬化的紧密关联。另有美国科学家提出了炎症机制在动脉粥样硬化的形成中的作用，并在小鼠试验中得到了一定的证实。

近年来，单核苷酸多态性(SNP)和单倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的广泛运用，为在分子水平上研究动脉粥样硬化的发生和发展的机制开辟了全新的思路。同时，高通量、低成本的SNP检测手段的不断出现也为SNP大规模快速分型提供了可能。

日本科学家利用大规模的病例-对照研究对9万多个相关基因SNPs进行了关联分析，发现了一个50KB的单倍型区域与心肌梗死密切相关，其中包括LTA(lymphotoxin-α)，NFKBIL1和BAT1等的多个SNP位点。

在另一研究中，虽然P-选择素(P-selectin)中S290N和N562D各自与心肌梗塞都没有独立相关性，但它们构成的单倍型却与心肌梗塞显著相关。

此外，SNP的存在与否以及等位基因频率存在人种及地域的差异，这就提示多基因疾病遗传异质性的存在，即同一疾病或性状在不同的人群中可能是不同的遗传因素造成的。在对凝血因子V基因的研究中，中国人群中未能发现国外报道的与白人女性心肌梗塞发病具有相关性的VLeiden突变，却发现了一个新的SNP-G/A1628(Arg485Lys)突变与APCR及动脉粥样硬化和/或冠心病相关，凝血因子V基因可能是中国人群动脉粥样硬化的一个易感基因。

另外，不同人群中SNP及其单倍型的类型和频率存在的这种差异可能与不同人群对药物及环境因素的反应性不同密切相关。

在过去的50多年来，大规模的流行病学调查和遗传研究已经对冠状动脉粥样硬化这一复杂疾病做了一系列的研究，发现了一些易感基因与动脉粥样硬化相关，例如ABCA1、CYBA、ApoE、LDLR等。更多的与动脉粥样硬化相关继续在发现和验证中。

动脉粥样硬化和/或冠心病作为一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找其相关基因进而阐明动脉粥样硬化和/或冠心病发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。

虽然已有许多关于各种基因多态性与动脉粥样硬化和/或冠心病的研究，但没有证实F11R基因与动脉粥样硬化和/或冠心病相关性的报道，更没有证实F11R基因的SNP与动脉粥样硬化和/或冠心病相关性的报道。

综上所述，为了尽早诊断动脉粥样硬化和/或冠心病，本领域迫切需要寻找动脉粥样硬化和/或冠心病易感基因，并开发检测动脉粥样硬化和/或冠心病的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的就是提供一种辅助诊断(尤其是早期诊断)动脉粥样硬化和/或冠心病的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗动脉粥样硬化和/或冠心病的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的动脉粥样硬化和/或冠心病易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的F11R基因、转录本和/或蛋白，并与正常的F11R基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患动脉粥样硬化和/或冠心病的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，所述的方法中检测的是F11R的基因或转录本，并与正常F11R核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

61位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在连接附着分子(F11R)的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)用F11R基因特异性引物扩增样品的F11R基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

61位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-2000bp，且含有SEQ IDNO：1中第61位。

在本发明的第三方面，提供了一种检测动脉粥样硬化和/或冠心病的试剂盒，它包括特异性扩增F11R基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-2000bp，且含有SEQ ID NO：1中第61位的扩增产物。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第61位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第61位的突变限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

61位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了F11R的基因组序列与动脉粥样硬化和/或冠心病密切相关，其中关联研究结果显示，在F11R的SEQ ID NO：1中第61位的SNP(61位T→C)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，因此可作为辅助性检测动脉粥样硬化和/或冠心病(或其易感性)的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。

F11R基因

连接附着分子(junctional adhesion molecule，F11R)的序列是已知，其详细序列和一些相关信息可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP。为了方便起见，在SEQ ID NO：1给出F11R中与本发明SNP相关的核苷酸序列。

F11R也称为jam，即连接附着分子(junctional adhesion molecule)。F11R基因(又称JAM基因)，是上皮细胞紧密连接的重要调控因子。可溶性的F11R基因蛋白，可以抑止单核细胞向炎症区域，以及动脉周样硬化区域的堆积。动物模型实验显示，在对一些阿朴脂蛋白缺陷的(apolipoprotein E-deficient(apoE-/-))小鼠喂食导致动脉周样硬化的饮食时，在动脉周样硬化的区域会出现F11R基因的高表达(Ostermann G et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2005；25(4)：729-35)。F11R基因在动脉周样硬化的形成中，具有功能上的作用。

本发明人对F11R基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与动脉粥样硬化和/或冠心病易感性并不相关，然而关联研究表明SEQID NO：1中61位T→C却是与动脉粥样硬化和/或冠心病易感性关联性非常高的SNP。

具体而言，本发明揭示了F11R基因第2号内含子的单核苷酸多态性(SNP)以及该多态性与冠状动脉粥样硬化的相关性。本发明的SNP是SEQ ID NO：1所示序列的第61位的C/T多态，它位于人F11R基因的第2号内含子，等位基因型C在冠状动脉粥样硬化病人群中的频率，要高于在正常对照人群中的频率。

基于本发明的新发现，F11R蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：用于辅助性诊断动脉粥样硬化和/或冠心病，或用于筛选促进F11R蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。

另一方面，本发明还包括对人F11R DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人F11R基因产物或片段。较佳地，指那些能与人F11R基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人F11R蛋白的分子，也包括那些并不影响人F11R蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人F11R基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人F11R蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人F11R蛋白功能的抗体以及不影响人F11R蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人F11R基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人F11R基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人F11R蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人F11R蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗F11R抗体是不识别正常F11R但识别突变F11R的抗体，或者识别正常F11R但不识别突变F11R的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的动脉粥样硬化和/或冠心病易感性检测。

利用本发明F11R蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与F11R蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明还涉及定量和定位检测人F11R蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在F11R蛋白的方法是利用F11R蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与F11R蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在F11R蛋白。

F11R蛋白的多聚核苷酸可用于F11R蛋白相关疾病的辅助诊断。在诊断方面，F11R蛋白的多聚核苷酸可用于检测F11R蛋白的表达与否或在疾病状态下F11R蛋白的异常表达。如F11R DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断F11R蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用F11R蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测F11R蛋白的转录产物。

检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。F11R蛋白突变的形式包括与正常野生型F11R DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用F11R基因特异性引物扩增样品的F11R基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：61位T→C，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

应理解，在本发明首次揭示了F11R基因的SNP与动脉粥样硬化和/或冠心病的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在61位T→C。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：2和3的序列。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-2000bp，较佳地为150-1500bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO：1中第61位。

由于本发明的SNP与动脉粥样硬化和/或冠心病具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期辅助性诊断动脉粥样硬化和/或冠心病，而且可以未雨绸缪地使一些携带者在未发病前就采取合理的预防措施(如在饮食上采取相应控制)，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。当然，最终宜用常规检测方法进行确诊。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.1研究对象

在经冠状动脉造影确诊为动脉粥样硬化的病人中，挑选病变支数在2条或2条以上，且病变狭窄程度在50％以上的病人作为病例。另取经冠状动脉造影确诊为没有动脉粥样硬化的正常人作为对照，尽量选取年龄、性别和籍贯与病例组相匹配。

在知情同意的基础上随机收集了191个病人和186个正常对照个体的外周血样本。

1.2实验方法和结果

1.2.1DNA提取

用常规酚氯仿法从人的外周血样本中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。

1.2.2PCR及测序引物的设计

根据GenBank中F11R的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。

表1引物序列表

引物名称	序列(5′-3′)	SEQ ID NO：
			有义引物	gccgcctggg gatctagaga gcacc	2
反义引物	aacttcacag ctgcagacag ggtca	3

1.2.3F11R基因的PCR扩增

以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得F11R的扩增产物。

1.2.4SNP的发现和检测

PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。

结果，发现存在数个SNP，其中包括以下SNP：SEQ ID NO：1中61位T→C。

1.2.5SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在动脉粥样硬化和/或冠心病病人和正常对照组中进行分型和关联分析。

对基因分型结果进行描述性统计分析，列联表进行卡方检验。观察基因型在病人和对照之间是否具有差异。

分析结果显示，在总共191个病人和186个正常对照中，F11R的61位的SNP(记为RS2297221)在病人组和对照组之间存在显著差异：F11R基因的第2号内含子的该单核苷酸多态性等位基因型G的频率在病人群中为83.0％，在对照中为76.6％，两者具有显著性差异(p＝0.029)。

上述结果证实了SEQID NO：1中61位的SNP与动脉粥样硬化和/或冠心病的发生存在着相关性。

实施例2

动脉粥样硬化和/或冠心病易感性检测试剂盒

如实施例1所述，SEQ ID NO：1中61位T→C的突变与动脉粥样硬化和/或冠心病疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计F11R基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

随机挑选100个人构成的测试组，其中包括未知是否患动脉粥样硬化的对象、已知患动脉粥样硬化和/或冠心病病人和经检测无动脉粥样硬化的正常人。

抽取测试组中待检测对象的外周血3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将动脉粥样硬化和/或冠心病检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出61位T→C。

检测结果：

对于F11R存在61位T→C的对象，进一步通过常规方法检测以确认是否患有动脉粥样硬化情况。检测结果表明，含61位T→C的检测对象的动脉粥样硬化和/或冠心病易感性比例明显高于不含C正常人群(高出至少约50％)。

因此，这表明通过检测F11R的61位T→C，可进行动脉粥样硬化的辅助性检测和/或早期诊断。

实施例3

动脉粥样硬化和/或冠心病易感性辅助性检测

重复实施例2的检测，不同点在于随机选取了80个人(检测前不知道是否有动脉粥样硬化症状)进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

抽取待检测对象的外周血3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将动脉粥样硬化和/或冠心病检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

结果同样证实了，含61位T→C的检测对象的动脉粥样硬化比例明显高于该位点不为C的检测对象。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>冠心病检测方法和试剂盒

<130>072059

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>121

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gccgcctggg gatctagaga gcacccagcc cagcctgcag tttggggctg ttccccatct   60

tgtgtatttg ctgctgcttc ttccttcggc tcattttgac cctgtctgca gctgtgaagt  120

t                                                                  121

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

gccgcctggg gatctagaga gcacc    25

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

aacttcacag ctgcagacag ggtca    25

Claims (10)

1.一种体外检测样品是否存在连接附着分子(F11R)的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用F11R基因特异性引物扩增样品的F11R基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

61位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQID NO：2和3的序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO：1中第61位。

4.一种检测动脉粥样硬化和/或冠心病的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增F11R基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-2000bp且含有SEQ ID NO：1中第61位的扩增产物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第61位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第61位的突变限制性内切酶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是以下的单核苷酸多态性：

61位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

8.一种对个体的动脉粥样硬化和/或冠心病易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测该个体的F11R基因、转录本和/或蛋白，并与正常的F11R基因、转录本和/或蛋白相比较，

其中，存在差异就表明该个体患动脉粥样硬化和/或冠心病的可能性高于正常人群。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，检测的是F11R的基因或转录本，并与正常F11R核苷酸序列比较差异。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

61位T→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。