CN101287476A - 机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供可以有效降低机体内的活性氧类和/或自由基浓度、通过降低该活性氧类和/或自由基浓度来发挥抑制老化的进行、预防老年病或生活方式病、增进健康、抑制氧化应激等预定效果的机体内有害的活性氧类和/或自由基清除剂。本发明的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂包含至少含氢分子的液体或气体。该介质中可以含有氧分子。而且该介质可以包含水或水溶液，也可以是气体。该活性氧类和/或自由基清除剂可以用于治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍。

Description

机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂

技术领域

本发明涉及降低机体内的有害活性氧类和/或自由基浓度的活性氧类和/或自由基清除剂，特别是涉及可以有效降低机体内的活性氧类和/或自由基浓度、发挥抑制老化的进行、预防老年病或生活方式病、增进健康、抑制氧化应激等效果的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

背景技术

目前逐渐广泛认识到：通常被称作活性氧类或自由基的反应性分子的存在是导致包括老化、癌症、动脉粥样硬化、心肌梗塞、疾病发作、病毒感染、肺部异常、肠疾病和神经变性疾病在内的多种人类健康方面异常的至少一种原因，其与老化和健康的恶化有关。上述分子是生理反应的普通副产物，其由氧的代谢例如细胞呼吸或免疫系统功能(杀伤外来异物)和代谢所不可缺少的非常多的酶反应而产生。

特别是亚细胞器线粒体，其在电子传递体系中传递电子，但是经常发生电子泄漏，将2％～0.2％的用于呼吸的氧分子还原成活性氧类。而且，在一般环境中也会普遍产生这样的活性氧类。例如，活性氧类的周围产生源包括：烟、电离性放射线、大气污染、化学药品(致癌物质、多种石油化学制品、生物致死剂、色素、溶剂、细菌分裂抑制剂、其他)、有毒重金属和氧化或酸败脂肪。最一般的活性氧类有：超氧化物自由基、羟自由基、一重态氧、过氧化氢，广义而言包括：一氧化氮、过氧化亚硝酸盐和烷氧基自由基或脂质过氧化自由基等脂质自由基。超氧化物、羟自由基、一氧化氮、以及脂质过氧化自由基或烷氧基自由基等脂质自由基等是自由基分子类。

自由基分子具有氧化毒性，该毒性造成生命有机体中的核酸、蛋白质、脂质等所有生物分子结构的损伤。分子损伤诱发遗传密码的改变、酶反应的异常、脂质膜的变性等细胞异常，损害细胞。这样，自由基分子氧化能力强，由该氧化能力引起的障碍通常称作氧化应激。通过这种氧化应激的蓄积，有时会在个体水平导致神经学障碍、内分泌不稳定、过敏增加、血管内皮损伤、关节损伤和炎症。

氧化应激由细胞中过剩的活性氧类或自由基所具有的强氧化性能而引起。大部分超氧化物阴离子自由基(O₂ ^-·)是在线粒体中由从三羧酸循环到电子传递体系的过程中的电子泄漏而产生。另外，O₂ ^-·还由NADPH氧化酶或黄嘌呤氧化酶等氧化酶产生。O₂ ^-·被超氧化物歧化酶转化成过氧化氢，过氧化氢进一步被谷胱甘肽过氧化酶或过氧化氢酶转化成水，从而将其解毒。过剩的O₂ ^-·还原过渡金属铁或铜，所得还原产物和过氧化氢通过进行芬顿反应而生成羟自由基(·OH)。·OH是最强效的活性氧类，无差别地与核酸、脂质和蛋白进行反应。解毒该·OH的机理还未知，因此除去·OH成为最重要的抗氧化过程。

在称作抗氧剂的各种领域的分子中均可发现针对自由基分子的有毒影响的防护。机体内的自由基分子及其相关副产物有时被抗氧剂中和而转化成有害性较小的产物。这样的抗氧剂可以是酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等)、必需营养素(β-胡萝卜素、维生素C和E、硒等)、非常多的内生物质(谷胱甘肽等)或食品化合物(生物类黄酮等)。因此，人在机体内保持着一些针对自由基分子的天然抑制物。

但是，尽管机体内存在自由基抑制剂，但个体因自由基分子而受到许多障碍。因此，人们清楚包括营养补充在内的用于防止自由基分子引起的氧化的作用可延缓人体衰老，对增进健康、预防疾病很有益。

然而，氢分子的氧化还原电位为-0.42V，氧分子的氧化还原电位为+0.82V。因此，氢分子具有还原氧分子的内在能力。但是，氧化还原电位是可以氧化或还原的指标，仅表示平衡状态下氧化还原反应的最终状态而已，机体内实际上是否进行氧化还原反应是另一回事。通常为了反应迅速进行都需要催化剂等，或者必需在高温下进行反应。在具有复杂结构的细胞内进行氧化还原反应往往需要各自特有的酶，无法预测氢在机体内实际上是否发挥还原能力。

例如，根据氧化还原电位，氢和氧应该发生反应生成水，但是溶解在水中的氢分子和氧分子并没有发生反应生成水。同样，氢分子是否可以如上所述还原活性氧类或自由基，这只能在实际中通过实验来验证。从氧化还原电位来判断，氢分子在平衡状态应该可以还原超氧化物、一氧化氮、过氧化氢。另一方面，人们逐渐了解到超氧化物、过氧化氢、一氧化氮对机体也发挥必不可少的作用。包括对入侵细菌的杀伤作用、免疫功能、防癌机制、血管新生、血管扩张、精子形成、神经传递等。因此，如果氢分子在机体内通过还原而迅速去除这些自由基或活性氧类，则此时氢分子应该是有害的。

一直以来，氧化还原电位低的水是通过电解(参照下述专利文献1～3)或加压下使氢溶解(参照下述专利文献4)而制得。其中，利用电解法制备氧化还原电位低的水性饮料时，只是因OH^-离子而显示碱性，未必含有饱和浓度以上的氢气。当为碱性时，由OH^-离子产生还原能力，因此表面上显示还原性，但是当恢复至中性时氧化还原电位变高。即，只是表面上显示还原性。另外，若大量饮用碱性溶液，则健康方面出现问题。特别是肾脏负担加重，对具有肾功能障碍的人有害。另一方面，对于胃酸过多的人而言，适量饮用碱性溶液可产生少许效果，但该效果是由碱性溶液中和胃酸而产生的效果，并不是由氢气或还原能力产生的效果。

另外，还已知通过向水性饮料中混入金属镁来得到还原性水的方法，但是该情况下，由于生成氢气的同时还生成镁离子和OH^-离子，因此呈碱性。镁离子用于便秘药等中，因此只要适量就可期待维持人体健康的效果，但是已经如上所述，大量摄取碱性的水性饮料，身体会阻碍保持中性的功能，因此危险。仅溶解有氢气的饮料并不显碱性，因此认为安全性高。

专利文献1：日本特开2001-145880号公报

专利文献2：日本特开2001-137852号公报

专利文献3：日本特开2002-254078号公报

专利文献4：日本特开2004-230370号公报

发明内容

如上所述，已知自由基分子的氧化能力强，给机体造成氧化应激，一直以来提倡多元酚类、维生素类等对防止氧化应激有效。用于防止该氧化应激的、最普遍认可并可摄取的维生素C和维生素E，各自的安全性高且廉价。但是，由于维生素C为水溶性而维生素E为脂溶性，两者均无法容易地到达细胞内部。因此，需要开发可以广泛渗透到细胞内外的抗氧化物质。

另一方面，人们逐渐了解到：自由基不只是有害，还对机体发挥必不可少的作用。例如对入侵细菌的杀伤作用、免疫功能、防癌机制、血管新生、血管扩张、精子形成、神经传递等。上述作用是由超氧化物、过氧化氢、一氧化氮产生的。因此，如果可以发现能够选择性地仅除去羟自由基、过氧化亚硝酸盐、脂质过氧化自由基等反应性高、细胞障碍性高的自由基类等的物质，就可以安全地用于防御氧化应激，希望如此。

如上所述，一直以来作为用于去除自由基或活性氧类的药剂，以抗氧化维生素为代表的抗氧化物质用于增进健康，但是这些药剂未必能够容易地到达细胞内部。另外，人们清楚即使引用上述专利文献1～4所公开的还原性水，该水也不能维持还原性不变而广泛渗透到细胞内外，而且机体的结构和成分复杂，并不是均匀体系，因此无法容易地预测其作用效果。

本申请的发明人等考察了：将气态氢分子摄入到体内并迅速分布到细胞中，能够期待在自由基产生时去除自由基，并反复进行各种实验，结果确认：氢分子在细胞内可以减轻自由基的伤害，氢分子实际上摄入到包括人在内的动物体内，氢在动物体内实际上减轻了氧化应激，从而完成了本发明。

即，本发明的目的在于提供可以有效降低机体内的自由基浓度、通过降低该自由基浓度来发挥抑制老化的进行、预防老年病或生活方式病、增进健康、抑制氧化应激等预定效果的自由基清除剂和用于吸入该自由基清除剂的装置。

尽管具有细胞毒性，但低浓度的O₂ ^-·或过氧化氢发挥控制多个信号传递级联的信号分子的作用，控制细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化等的生理过程等，在生理学上具有重要的功能。高浓度的过氧化氢被髓过氧化物酶转化成次氯酸而显示抗菌作用。而且自由基一氧化氮是神经传递物质，在血管扩张中发挥重要作用。相对于此，象·OH等具有单向细胞毒性的自由基可以被氢分子中和，该氢分子不会抑制如上所述的活性氧类所具有的基本生理活性。本发明人发现：氢分子可以缓和由·OH诱导的细胞毒性而不影响其他活性氧类，具有可以作为抗氧化物质应用于医疗的潜力，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，该清除剂包含至少含氢分子的液体。

[2][1]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的液体包含水溶液。

[3][2]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中含有的氢分子为过饱和状态。

[4][2]或[3]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，该清除剂还包含氧分子。

[5]机体内的活性氧类和/或自由基清除剂，该清除剂包含至少含氢分子的气体。

[6][5]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气和氧气的混合气体。

[7][5]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气、氧气和惰性气体的混合气体。

[8][5]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气和空气的混合气体。

[9][5]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气和麻醉气体的混合气体。

[10][5]～[9]中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中含有1～4％(v/v)浓度的氢气。

[11][5]～[9]中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中含有1.0～4.5％(v/v)浓度的氢气。

[12][1]～[11]中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中活性氧和/或自由基为选自羟自由基、过氧化亚硝酸盐、烷氧基自由基和脂质过氧化自由基的活性氧和/或自由基。

[13][12]的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中活性氧和/或自由基为羟自由基。

[14]药物组合物，该药物组合物含有[1]～[13]中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

[15]活性氧类和/或自由基引起的障碍的治疗或预防剂，该治疗或预防剂含有[1]～[13]中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

[16][15]的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍选自氧化应激、氧化应激引起的细胞死亡和氧化应激引起的线粒体功能障碍。

[17][15]的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍选自：脑梗塞、心肌梗塞、动脉硬化、缺血再灌流损伤、器官移植引起的紊乱、早产儿的网膜变性、急性肺病、人工透析引起的紊乱、炎症和脂质代谢紊乱。

[18][15]的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍为剧烈运动后的肌病或运动后吸入高浓度氧气产生的氧伤害。

[19][15]的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和ALS等神经变性疾病。

[20][15]的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍为癌症。

[21]饮料，该饮料适于减轻或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍，所述饮料含有：[1]～[4]中任一项的包含至少含氢分子的液体的活性氧类和/或自由基清除剂。

[22]饮料，该饮料上附有用于去除或降低机体内的活性氧类和/或自由基的标示，所述饮料含有：[1]～[4]中任一项的包含至少含氢分子的液体的活性氧类和/或自由基清除剂。

[23]饮料，该饮料上附有用于减轻或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的标示，所述饮料含有：[1]～[4]中任一项的包含至少含氢分子的液体的活性氧类和/或自由基清除剂，。

[24][21]～[23]中任一项的饮料，其中饮料为健康食品、功能性食品、营养辅助食品、食品营养强化剂或特定健康食品。

[25]容器，该容器装有[5]～[10]中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

[26][25]的容器，该容器为氢气瓶。

[27]用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其具备：装有[5]～[10]中任一项的包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器、气体吸入用装置以及向吸入用装置中供应上述容器中的气体的供给配管。

[28][27]的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，该设备还具备装有至少一种选自氧气、惰性气体和空气的气体的容器，其中将包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂和至少一种选自氧气、惰性气体和空气的气体分别或混合后供给气体吸入用装置。

[29][27]或[28]的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，该设备还具备装有麻醉气体的容器，其中将包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂和麻醉气体分别或混合后供给气体吸入用装置。

[30][27]～[29]中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中在装有包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器中装有1～4％的氢气。

[31][27]～[30]中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中装有包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器为氢气瓶。

[32][27]～[31]中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中气体吸入用装置为气体吸入用面罩。

[33][27]～[31]中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中气体吸入用装置为密闭室，通过向该密闭室中供应包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂来向密闭室内的受试者供应上述活性氧类和/或自由基清除剂。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2005-2385725号和2006-157827号的说明书和/或附图中记载的内容。

附图简述

图1表示在含氢培养基中经抗霉素A处理的PC12细胞的相差显微镜图像。

图2是抗霉素A处理后的含氢培养基和未填充氢的培养基中PC12细胞存活数的比较图。

图3是甲萘醌处理后的含氢培养基和未填充氢的培养基中PC12细胞存活数的比较图。

图4是表示抗霉素A或甲萘醌处理后的含氢培养基和未填充氢的培养基中PC12细胞存活数随时间变化的图。

图5是抗霉素A或甲萘醌处理后的含氢培养基和添加维生素E而未填充氢的培养基中PC12细胞存活数的比较图。

图6是在抗霉素A处理后置换成含氢培养基时PC12细胞存活数的比较图。

图7是表示溶氢浓度的变化给抗霉素A处理后的PC12细胞存活数带来的影响的图。

图8是含氢培养基中抗霉素A处理的PC12细胞的线粒体图像。

图9是表示在氧化应激亢进模型动物中氢水的4-HNE蓄积抑制效果的图。

图10是表示给予氢水的氧化应激亢进模型动物的血中4-HNE蓄积量随时间变化的图。

图11是表示由氢气吸入产生的缺血·再灌流损伤减轻效果的肝脏苏木精·伊红染色图像。

图12是表示饮用氢水的4人呼气中氢浓度的时间变化的图。

图13是表示在室温、中性下利用溶氢分子除去羟自由基的图。

图14是表示PC12细胞中利用氢分子除去羟自由基的图，表示在共焦激光显微镜下观察HPF荧光的结果的图。

图15是表示PC12细胞中利用氢分子除去羟自由基的图，表示定量HPF荧光强度的结果的图。

图16是表示鸟嘌呤的氧化被氢分子抑制的PC12细胞的图。

图17是表示PC12细胞中鸟嘌呤氧化被氢分子抑制的图。

图18是表示HNE产生被氢分子抑制的PC12细胞的图。

图19是表示利用氢分子抑制PC12细胞中HNE产生的图。

图20是表示利用氢分子防御体外缺血的神经细胞保护效果图，表示再灌流10分钟后将细胞用HPF进行染色的结果的图。

图21是表示利用氢分子防御体外缺血的神经细胞保护效果图，表示使用NIH Image软件计测100个细胞的HPF荧光强度的结果的图。

图22是表示由氢分子产生的存活神经细胞数的增加效果的图。

图23是通过细胞数表示由氢分子产生的存活神经细胞的存活率增加的图。

图24是通过活性表示由氢分子产生的存活神经细胞的存活率增加的图。

图25表示通过吸入氢气抑制氧化应激而产生的缺血再灌流损伤的保护效果的图，表示用TTC进行染色的结果的图。

图26表示通过吸入氢气抑制氧化应激而产生的缺血再灌流损伤的保护效果的图，表示脑梗塞体积的图。

图27表示各种氢气吸入时间下的缺血再灌流损伤保护效果的图。

图28表示通过吸入氢气抑制氧化应激而产生的缺血再灌流损伤的保护效果的图，表示对一周后将脑冠状切断所得切片进行苏木精·伊红染色的结果的图。

图29表示通过吸入氢气抑制氧化应激而产生的缺血再灌流损伤的保护效果的图，表示以通过苏木精·伊红染色所得的浅粉色可见区作为梗塞区算出一周后的梗塞体积的结果的图。

图30表示氢处置和未处置大鼠的体温或体重的变化的图。

图31表示在氢气存在和不存在下缺血再灌流损伤后的脑的抗8-OH-G抗体的免疫染色结果的图。

图32表示在氢气存在和不存在下缺血再灌流损伤后的脑的抗HNE抗体的免疫染色结果的图。

图33表示在氢气存在和不存在下缺血再灌流损伤后的脑的抗GFAP抗体的免疫染色结果的图。

图34表示对氢气存在和不存在下的缺血再灌流损伤后的脑进行线粒体特异性抗Iba-I抗体染色的结果的图。

图35表示对氢气存在和不存在下的缺血再灌流损伤后的脑进行线粒体特异性抗Iba-I抗体染色时呈阳性的细胞数的图。

图36是表示本发明的装置的图。

图37表示通过SOD(+/-)小鼠彼此交配而出生的小鼠的基因型的图。

图38表示氢水对通过SOD(+/-)小鼠彼此交配而出生的小鼠的基因型产生的效果的图。

图39表示评价氢水的防癌效果的实验方法的图。

图40表示给予氢水的小鼠和未给予氢水的小鼠的肝脏的GST-P阳性细胞巢数(图40a)和阳性巢面积(图40b)的图。

实施发明的最佳方式

氢可以通过还原机体内的活性氧类和/或自由基而将它们除去。

活性氧类是指氧化能力比氧强、氧化其他物质的能力高的分子，包括一重态氧、过氧化氢、臭氧、超氧化物自由基、羟自由基、过氧化亚硝酸盐等。除作为活性氧类的超氧化物自由基、羟自由基等以外，自由基还包括一氧化氮、烷氧基自由基(脂质自由基。L·)、脂质过氧化自由基(烷基过氧化自由基，LOO·)等。在本发明中，自由基有时是指还包括活性氧类在内的广义的自由基分子。

上述自由基中，羟自由基、过氧化亚硝酸盐、烷氧基自由基和脂质过氧化自由基具有细胞毒性，给机体带来有害的作用，是引起各种障碍的原因之一的有害活性氧类或自由基。在本发明中，氢通过还原而专门在短时间内将这些有害的活性氧类和/或自由基除去。另一方面，除上述有害活性氧类和/或自由基以外的活性氧类和/或自由基在机体内参与信号传递等，具有有用的功能，称作有益活性氧类和/或自由基。即使是氢也不能容易地除去有益活性氧类和/或自由基。本发明的包含至少含氢分子的液体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂专门只清除对机体有害的有害活性氧类和/或自由基。其中，氧化应激是指通过活性氧类和/或自由基的氧化能力而造成的机体障碍。

氢分子也能够透过细胞膜，因此其进入细胞内除去细胞内的活性氧类和/或自由基。氢分子还可以进入核内和线粒体内，可以保护基因不受活性氧类和/或自由基的侵害，可以抑制癌症。氢还能通过血-脑屏障，因此还可以保护脑不受氧化应激的侵害。

至少含氢分子的液体的特征在于包含水溶液。作为形成该水溶液的介质，可以使用纯水、离子交换水、蒸馏水、生理盐水等。还可以将使用纯水、离子交换水或蒸馏水作为上述介质而得到的机体内的有害自由基清除剂添加到一般的水性饮料、例如矿泉水、果汁、咖啡、茶等中饮用。其中，饮料包括饮料用的健康食品、特定保健用食品、营养功能食品、营养辅助食品、食品营养强化剂等。其中，特定保健用食品是指饮食生活中为了特定的保健目的而摄取的、标示出通过该摄取可以期待该保健目的的食品。这些饮料可以附有用于去除或降低机体内的活性氧类和/或自由基的标示或用于减轻或预防自由基引起的障碍的标示。并且，可以附有具体定义由活性氧类和/或自由基引起的障碍、用于减轻或预防这些障碍的标示，还可以附有对抗老化或抗氧化有用的标示。而且，出于同样目的可以将含有氢的液体用于化妆水中。

氢分子即使处于过饱和状态也可以在水或水溶液中溶解一定时间。这种氢分子为过饱和状态的水或水溶液可以通过在加压下将氢气溶解于水或水溶液中之后除去压力来制造。例如，将水溶液在0.4MPa以上的氢气压下放置数小时、优选1～3小时即可。水溶液形式的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂还可以饮用，还可以以共存有氧的生理盐水的形式用于静注。该情况下，可以使用导管进行给药或静注给药。注入后摄取到机体内的氢几乎不被机体吸收，通过血液分布至全身而发挥效果，之后与呼气一同被排出。

在1氢气压、室温条件下，平均1L水中能够溶解约17.5mL氢(约1.6ppm、约0.8mM)。本发明的水溶液形式的活性氧类和/或自由基清除剂，在平均1L水溶液中含有10mL以上、优选15mL以上、特别优选17.5mL以上的氢分子。本发明的水溶液形式的活性氧类和/或自由基清除剂含有1ppm以上、优选1.5ppm以上的氢分子。本发明的水溶液形式的活性氧类和/或自由基清除剂含有0.1mM以上、优选0.4mM以上、进一步优选0.6mM、特别优选0.8mM以上的氢。

本发明的水溶液形式的活性氧类和/或自由基清除剂还可以含有氧分子。氢分子和氧分子在水溶液中共存，氢分子和氧分子即使是混合状态，也不会直接发生反应，两者都能稳定共存。但是，当气体中含有大量氧分子时，为了确保安全性，优选使氢含量不足全部气体的4.7％(v/v)。在不存在安全性问题的使用环境下，氢含量优选为尽可能高的浓度。含有氧的活性氧类和/或自由基清除剂也可以饮用或以生理盐水的形式静注使用，但在注射给药的情况下，与不含氧分子的情形相比，不会造成机体内局部氧不足的状态，因此很少对机体组织造成损伤。

本发明的饮料优选保存在用铝等不能透过氢的原材料制成的容器中。这样的容器例如有铝袋。另外，温度越低溶解的氢越多，因此优选在低温下保存。

本发明的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂可以是气态。这种情况下，氢浓度为1～4.7％，优选1～4.5％，进一步优选1～4％(v/v)，进一步优选1.5～2.5％(v/v)，进一步优选为约2％。为了确保安全性，希望氢气含量不足约4.7％(v/v)，但在密闭条件下，如果是不产生静电的安全条件下也可以进一步提高氢气含量。本发明的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂可以进一步含有氧气和/或其他惰性气体。含有氧气时，包含氢气和氧气的混合气体。氧气用于呼吸。惰性气体可以使用氮气、氦气、氩气等，但希望是廉价的氮气。该惰性气体的含量可由本领域技术人员在不过多的范围内任意设定，但考虑到用于呼吸的氧气浓度，优选80％(v/v)以下。本发明的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂还可以是氢气和空气的混合气体。这样的混合气体可以通过向空气中适当混合氢气而简单地进行制造。本发明的含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂还可以含有麻醉用气体。该情况下，机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂包含氢气和麻醉气体的混合气体。麻醉气体的例子有笑气等。

本发明的气态的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂例如可以装入高压气瓶等耐压性容器中。本发明还包含装有气态的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器。

本发明的气态的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂可以让受试者吸入。可以使用吸入装置进行吸入，但只要从装有上述机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器通过配管经由吸入装置进行吸入即可。对吸入装置没有限定，例如有吸入面罩，该面罩优选可以同时覆盖受试者的口和鼻。并且，吸入装置可以具有密闭的小密室，该小室的大小足以容纳受试者，当受试者进入该小室时，通过向小室内供应本发明的气态的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，可以让受试者吸入。这种小室的一个例子为封闭床。受试者可以躺在床上吸入本发明的气态的至少含氢分子的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

本发明还包含药物组合物等组合物，该组合物含有：包含至少含氢分子的液体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂作为有效成分。该情况下，活性氧类和/或自由基清除剂可以是液态，也可以是气态。上述组合物可以用于预防或治疗由活性氧类和/或自由基引起的障碍。

其中，由活性氧类和/或自由基引起的障碍是指：活性氧类和/或自由基为原因之一的障碍、疾病、功能异常等。具体有氧化应激、氧化应激引起的细胞死亡和氧化应激引起的线粒体功能障碍。还有脑梗塞、心肌梗塞、手术时等引起的缺血再灌流损伤、器官移植引起的紊乱、早产儿的网膜变性、急性肺病、人工透析引起的紊乱和炎症。还有剧烈运动后的肌病和运动后吸入高浓度氧气产生的氧伤害。还有阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和ALS等神经变性疾病。并且，通过防止核的DNA氧化还可以用于预防或治疗癌症。并且，活性氧类和/或自由基参与老化的进行，本发明的活性氧类和/或自由基清除剂通过治疗或预防伴随老化而产生的各种障碍，能够发挥抗老化(抗衰老、抗加龄)作用。即，本发明的活性氧类和/或自由基清除剂还可以用作对抗老化有用的组合物。上述障碍中，脑梗塞和心肌梗塞是因血液在缺氧状态下流动，产生活性氧类和/或自由而引发障碍。另外，手术时引起的缺血再灌流损伤是因手术时血流停止而手术结束时血液流动，产生活性氧类和/或自由基而引发障碍。在器官移植中，移植的器官处于缺氧状态，而移植后血液流动，产生活性氧类和/或自由基而引发障碍。早产儿的网膜变性是由于早产儿接受高浓度氧治疗，容易产生活性氧类，因此网膜受到损伤。在急性肺病中，因高浓度氧治疗而产生活性氧类和/或自由基，从而引发障碍。而且，剧烈运动直后，由于停止运动从缺氧状态供氧，从而产生活性氧类和/或自由基而引发障碍。

在本发明中，预防或治疗包括：对实际具有障碍的受试者给予活性氧类和/或自由基清除剂治愈该障碍；向存在产生障碍的危险的受试者给予活性氧类和/或自由基清除剂降低该障碍产生的危险、减轻该障碍的程度、抑制该障碍等。

对给予或摄取上述组合物的时期没有限定，现实中可以在发生障碍时给予或摄取。还可以在机体内即将产生活性氧类和/或自由基之前或产生之后不久给予或摄取。例如优选剧烈运动后、剧烈运动后摄取氧时、遭受精神应激、肉体应激后等。并且，烟草的烟中含有大量超氧化物自由基，其在机体内转化成羟自由基，据说该羟自由基给基因带来损伤是肺癌的原因之一。因此，还可以用于预防吸烟者的肺癌。

就给药而言，当为液态活性氧类和/或自由基清除剂时，可以通过口服、静脉注射进行给药。当为癌症等局部疾病时，可以直接针对癌症部位给药，例如为内脏癌症时，可以通过注射向腹腔内给药。当为气态活性氧类和/或自由基清除剂时，可以通过吸入进行给药。

本发明还包含用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，该设备具备：装有包含至少含氢分子的气体的机体内有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器、气体吸入用装置以及向吸入用装置中供应上述容器中的气体的供给配管。容器例如有氢气瓶。如上所述，气体吸入装置的例子有吸入面罩、密闭小室。该设备还可以具备装有至少一种选自氧气、惰性气体、空气和麻醉气体的气体的容器，此时可以将包含至少含氢分子的气体的机体内有害活性氧类和/或自由基清除剂和至少一种选自氧气、惰性气体和空气的气体分别或混合后供给气体吸入用装置。图36表示本发明设备的概略图。该图具备：气体吸入用装置1；装有包含含氢分子的气体的机体内有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器2；装有至少一种选自氧气、惰性气体、空气和麻醉气体的气体的容器3；以及配管4，通过配管向气体吸入用装置中供应气体，供给受试者。

以下，使用实施例来详细说明本发明的具体例子，但以下实施例并非用于限制本发明，对于不脱离专利申请范围所示的技术思想而进行各种变更，本发明均可适用。

在以下实施例中，只要没有特别说明，则氢和氧的测定、培养细胞的氢处理和培养细胞的染色按以下方法进行。详细条件如各实施例中所示。

氢和氧的测定

溶液中的氢和氧的浓度分别利用氢电极(ABLE Inc.)和氧电极(Strathkelvin Instruments Ltd)进行测定。氢气浓度利用气相色谱法(TERAMECS公司、京都)进行测定。荧光强度的测定中使用了RF-5300PC(岛津制作所制)。在溶液条件的实验中，通过在0.4MPa氢气压下放置2小时使氢溶解。在利用氢去除羟自由基的测定实验中，向溶有氢的水中加入磷酸缓冲液(10mM，pH7.4)、氢氧化亚铁(0.1mM)、HPF(0.4μM，第一化药)，用氢电极测定了浓度。接着，在芬顿反应开始时加入过氧化氢(5μM)，在23℃下缓慢搅拌。

培养细胞的氢处理

将DMEM培养基在0.4MPa氢气压下放置2小时使氢溶解。另外通过通入氧气来准备氧饱和培养基，与溶氢培养基混合，使25℃下的溶氧浓度为8.5mg/L。另外，用氢电极测定了氢浓度。为了由O₂ ^-·产生·OH，向细胞中添加抗霉素A。将PC12细胞装入密闭容器中并在37℃下培养，上述密闭容器中装有适当调整了溶氢和溶氧浓度的包含氢和氧的气体。

培养细胞的染色

检测·OH时，向细胞培养基中加入HPF(0.4μM)，使用共焦激光显微镜(Olympus公司制FV300)，在激发波长488nm、吸收波长510nm下观察其荧光图像。线粒体的染色使用Mito Tracker Green(1μM，Molecular Probes)和Mito Tracker Red(100nM，Molecular Probes)。抗HNE和抗8-OH-G抗体从日研Seil购买。抗TUJ-1和抗GFAP抗体分别从Babco和Immunon购买。

实施例1

已知氢分子具有还原能力，但无法预测其是否可以象上述那样在短时间内还原参与生物学上重要的氧化还原的分子类和自由基分子类。因此，在实施例1中使用氢水测定了其对各分子类的作用。

氢水的制备

首先，将1升水注入到容量为5升的耐压瓶(UNICONTROLS公司制)中，之后填充氢气使压力为0.4MPa。2小时后边减压边从瓶中回收添加有氢的水。氢含量使用溶氢测定器(ABLE公司制)进行分析。利用该方法得到含有约0.8mM的过饱和氢的水(氢水)。

氢水的活性氧类去除作用的测定

接着，针对一氧化氮NO，通过向用0.01M磷酸调整至pH7.4的氢水中加入0.1mM或1mM的NO供体即1-羟基-2-氧代-3-(N-甲基-3-氨基丙基)-3-甲基-1-三氮烯(NOC7，同仁化学研究所公司制)，在室温下反应30分钟，接着加入1μM的5-(和-6)-氯甲基-2’，7’-二氯二氢荧光黄二乙酸酯(DCFDH，Molecular Probe公司制，美国)，使用荧光分析装置(TECAN公司制，奥地利)在485nm的激发波长下测定，来测定NO残留量。

针对过氧化亚硝酸盐(Peroxynitrite ONOO^-)，向用0.01M磷酸调整至pH7.4的氢水中加入过氧化亚硝酸盐溶液(同仁化学研究所公司制)，使最终浓度为62.3mM，在室温下反应10分钟，接着使用分光光度计(BECKMAN公司制)测定300nm的吸光度。

针对过氧化氢H₂O₂，向氢水中加入过氧化氢水(和光纯药公司制)使最终浓度为100μM～1μM，在室温下反应30分钟，接着加入等量的含有20μM DCFDA的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2)，反应10分钟后使用荧光分析装置在485nm的激发波长下测定，来测定H₂O₂残留量。

针对羟自由基(·OH)，向氢水中加入最终浓度为100μM的过氯酸亚铁(Aldrich公司制)、1mM的过氧化氢和1pM的2-[6-(4’-羟基)苯氧基-3H-呫吨-3-酮-9-基]苯甲酸(HPF，同仁化学研究所公司制)，反应10分钟后，使用荧光分析装置在485nm的激发波长下测定。HPF对过氧化氢的反应性低，对羟自由基显示高反应性而发出荧光。由此测定羟自由基的残留量。

向氢水中加入0.1mM的产生作为脂质自由基指标的脂质过氧化自由基(烷基过氧化自由基)(LOO·)的2，2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(和光纯药公司制)，室温下反应1小时，接着加入等量的含有20μMDCFDA的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2)，反应10分钟后，使用荧光分析装置在485nm的激发波长下测定，从而来测定LOO·残留量。

针对超氧化物(O₂ ^-·)，按照制造商的手册向氢水中混合TREVIGEN公司的超氧化物歧化酶分析试剂盒中所含的25x反应液、黄嘌呤溶液和NBT溶液，之后加入黄嘌呤氧化酶溶液使产生O₂ ^-·，使用分光光度计在550nm下经时性测定NBT-双甲的蓄积。

将细胞色素c(Sigma公司制)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FDA)(Sigma公司制)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)(Sigma公司制)溶解在氢水中，使浓度分别为10μM、1mM、1mM，室温下反应30分钟后，使用分光光度计分别测定415nm、400nm、340nm的吸光度。结果如表1所示。应说明的是，表1中的去除量表示以在未填充氢的水中进行反应时的各分子类残留量为100％、从中扣除在氢水中进行反应时的各分子类残留量而得到的值。

由表1所示的测定结果可以得出以下结论。即，可以确认氢水将反应性最高、毒性最高的羟自由基、过氧化亚硝酸盐自由基和脂质过氧化自由基还原而除去。而没有确认到已知在体内用于信号传递等的NO、超氧化物、过氧化氢等的去除。同样，氢水也没有对通过氧化还原反应而在机体内的能量代谢中发挥中心作用的细胞色素c、FDA、NAD⁺产生任何影响。

表1

活性氧类	去除量(％)
		NO	＜1
ONOO-	97
		H2O2	＜1
·OH	69
		ROO·	37.6
O2 -·	＜1

呼吸链相关的分子类	去除量(％)
		细胞色素c	＜1
FAD	＜1
		NAD+	＜1

*去除量表示以在未填充氢的水中进行反应时的各分子类残留量为100％、从中扣除在氢水中进行反应时的各分子类残留量而得到的值

实施例2

抗霉素A是线粒体的呼吸链复合体III的抑制剂，促进细胞中活性氧类的产生，其结果是诱导由氧化应激引起的细胞死亡。因此，在实施例2中，测定在抗霉素A存在下氢的氧化应激防御效果。

含氢培养基的制备

细胞培养液中要求含有氧、大致呈中性且不含高浓度的金属离子。为了制备氧分子和氢分子共存的培养液，按照亨利定律，可以预测分别对其加压、溶解。使上述氢加压装置的空间中充满氧后，将氢气加压至5气压。由于氧气分压可以维持1气压，因此可以确保培养所必需的氧浓度。使1升细胞培养用培养基-Dulbecco′s Modified EagleMedium(达尔伯克改良伊格尔培养基)(DMEM，Invitrogen公司制)中含有最终浓度为100单位/mL的青霉素G(Invitrogen公司制)和100μg/mL的链霉素(Invitrogen公司制)，将其注入到容量为5升的耐压瓶中，之后填充氢气使压力为0.4MPa。2小时后边减压边从瓶中回收添加有氢的DMEM。

或者，当不需要高浓度的氢时，通过适量加入氧饱和DMEM来制备与添加氢之前的DMEM具有相同程度溶氧的含氢培养基。溶氧使用Mitocell MT200(CT和C公司制)，测定培养液的DMEM的溶氧浓度并保持恒定。氢含量用上述溶氢测定器进行分析。制备含氢DMEM时的溶氧和溶氢浓度的测定结果的一个例子如表2所示。向该培养基中添加马血清(PAA公司制，奥地利)使最终浓度为1％，将溶氢浓度为0.6～0.8mM、溶氧浓度为8.6～9.3mg/L的含氢培养基用于以后的实验。

表2

DMEM	溶氧(mg/L)	溶氢(mM)
			氢填充前	8.86	0
氢填充后(1)	5.73	0.7
			氧饱和(2)	32.0	0
含氢培养基＊	8.89	0.6

*向(1)中添加约1/10量的(2)

来源于大鼠肾上腺的嗜铬细胞瘤PC12株的培养

将来源于大鼠肾上腺的嗜铬细胞瘤PC12株悬浮在含有10％胎牛血清(EQUITECH-BIO公司制，美国)和5％马血清的DMEM中，接种在胶原包被的细胞培养皿中，使细胞密度为1×10⁴/cm²。将细胞置于5％CO₂、37℃的培养箱中进行培养。为了确认含氢培养基的效果，培养一夜后吸出培养基，用含有1％马血清的DMEM洗涤细胞一次，用于以后的实验。

用含氢培养基进行细胞培养时，使用开放体系的培养皿，但为了防止氢自培养液中释放，进行以下处理。即，向容量为3升的塑料容器中加入2升适当浓度的氢水，将台放在水面上，将正在含氢培养基中培养的培养皿静置在该台上，密封状态下在37℃下培养。以后，当使用氢水时，沿用该方法。将正在未填充氢的培养基中培养的培养皿静置在添加有未处理的水以代替制备好的氢水的塑料容器的台上，在37℃下培养。

氢对抗霉素A诱导的细胞死亡的抑制效果的研究

为了测定氢的氧化应激防御效果，用胶原包被的24孔细胞培养皿(IWAKI公司制)培养PC12细胞，每孔中加入2mL的添加或未添加抗霉素A(Sigma公司制)的含氢培养基，24小时后在相差显微镜下计数具有锥型细胞形态的活细胞。此时使用未填充氢的含1％马血清的DMEM(以下称作未填充氢的培养基)作为比较对照。24小时后的相差显微镜图像如图1所示。

此时，在用向未填充氢的培养基中添加10μg/mL的抗霉素A的培养基培养的细胞中观察到多个圆而小的死细胞，锥型活细胞减少。相对于此，向含氢培养基中添加10μg/mL的抗霉素A时死细胞减少，与不含氢的培养基相比活细胞的比例显著增加。改变抗霉素A的浓度，计数含氢培养基和未填充氢的培养基中的活细胞数，结果如图2所示。棒图表示至少4个孔的平均值，误差线表示标准偏差。抗霉素A的浓度为10μg/mL和30μg/mL时，含氢培养基的存活细胞数均显著增加，显示了添加氢而产生的细胞死亡抑制效果。

实施例3

氢对甲萘醌诱导的细胞死亡的抑制效果的研究

甲萘醌是线粒体的呼吸链复合体I的抑制剂，促进细胞中活性氧类的产生，其结果是诱导由氧化应激引起的细胞死亡。因此与实施例2所示的抗霉素A引起的细胞死亡实验同样，为了测定氢的氧化应激防御效果，用胶原包被的24孔细胞培养皿培养PC12细胞，每孔加入2mL添加或未添加不同浓度的甲萘醌(Sigma公司制)的含氢培养基，24小时后在相差显微镜下计数具有锥型细胞形态的活细胞。此时使用未填充氢的培养基作为比较对照。结果如图3所示。棒图表示至少4个孔的平均值，误差线表示标准偏差。添加10μM的甲萘醌时，含氢培养基的存活细胞数显著增加，显示添加氢而产生的细胞死亡抑制效果。

实施例4

氢对抗霉素A和甲萘醌诱导的细胞死亡的抑制效果的经时性测定

按照与实施例2和3相同的方法，经时性测定在抗霉素A和甲萘醌诱导细胞死亡时氢的氧化应激防御效果，研究氢的防御效果的持续性。用胶原包被的24孔细胞培养皿(IWAKI公司制)培养PC12细胞，每孔加入2mL添加或未添加10μM甲萘醌或30μg/mL抗霉素A的含氢培养基，0、1、2、3天后在相差显微镜下计数具有锥型细胞形态的活细胞。其结果如图4所示。各点表示至少4个孔的平均值。2天以后也可以确认添加氢而产生的细胞死亡抑制效果，表明添加氢而产生的细胞死亡抑制效果在第24小时以后还在持续。

实施例5

氢与维生素E的细胞死亡抑制效果的比较测定

在实施例5中，将众所周知的具有抗氧化效果且广泛使用的维生素E和氢进行比较。按照与实施例2和3相同的方法，利用抗霉素A和甲萘醌诱导细胞死亡，比较含氢培养基和含α-生育酚(维生素E)而不含氢的培养基中的存活细胞数。首先，用胶原包被的24孔细胞培养皿(IWAKI公司制)培养PC12细胞，每孔加入2mL添加或未添加3μM甲萘醌或10μg/mL抗霉素A的含氢培养基或含有100μM α-生育酚(Sigma公司制)的未填充氢的培养基，24小时后在相差显微镜下计数具有锥型细胞形态的活细胞。使用未填充氢的培养基作为比较对照。结果如图5所示。

棒图表示至少4个孔的平均值，误差线表示标准偏差。与不含氢的培养基相比含氢培养基中的存活细胞数显著增加，而在含有α-生育酚的不含氢培养基中，虽然抗霉素A诱导的细胞死亡的抑制效果较氢弱但仍可确认，但相对于甲萘醌没有确认到显著的效果。以上结果显示：与维生素E相比，在细胞水平氢是更优异的抗氧化应激物质。

实施例6

后添加含氢培养基而产生的抗霉素A诱导细胞死亡的抑制效果的测定

为了表明含氢培养基产生的抗霉素A诱导细胞死亡的抑制效果来源于氢抑制了抗霉素A引起的氧化应激、而不是来源于氢使抗霉素A变性，用含有抗霉素A而未填充氢的培养基处理细胞，一定时间后更换为含氢培养基，调查是否抑制了细胞死亡。与实施例5所示的由抗霉素A诱导的细胞死亡实验同样，用胶原包被的24孔细胞培养皿培养PC12细胞，每孔加入2mL添加有30μg/mL抗霉素A的未填充氢的培养基，之后在1、3和6小时的时刻更换成各2mL的含氢培养基或未填充氢的培养基。从添加抗霉素A时算起，24小时后在相差显微镜下计数具有锥型细胞形态的活细胞。结果如图6所示。

棒图表示至少4个孔的平均值，误差线表示标准偏差。与不含氢的培养基相比，在1和3小时后更换成含氢培养基的情况下存活细胞数显著增加。即使在添加抗霉素A之后给予氢也可以抑制细胞死亡，因此显示氢抑制了因添加抗霉素A而二次产生的氧化应激。另外，6小时后没有确认到效果，推测这是因为此时已经发生了不可逆的细胞死亡，因此与是否添加氢无关，细胞按一定比例死亡。

实施例7

溶氢浓度对细胞死亡抑制效果的影响的测定

研究细胞中防御氧化应激所必需的氢浓度。与实施例2所示的由抗霉素A诱导的细胞死亡实验同样，用胶原包被的24孔细胞培养皿培养PC12细胞，每孔加入2mL添加有30μg/mL抗霉素A的浓度不同的含氢培养基，24小时后在相差显微镜下计数具有锥型细胞形态的活细胞。结果如图7所示。由于细胞死亡的抑制依赖于氢浓度，因此确认抑制效果是由氢产生的。而且，即使氢浓度相当于饱和氢浓度的约1/16即50μM的低浓度，也可以显著抑制细胞死亡。

实施例8

氢对由氧化应激引起的线粒体功能障碍的抑制效果的测定

若氧化应激被抗霉素A等促进，则发生线粒体的功能障碍。因此，与实施例2所示的由抗霉素A诱导的细胞死亡实验同样，用胶原包被的35mm玻璃底培养皿培养PC12细胞，向其中加入含有10μg/mL抗霉素A的含氢培养基。使用未填充氢的培养基作为比较对照。50分钟后添加线粒体特异性色素Mito Tracker Green(最终浓度为1μM，MolecularProbe公司制，美国)和线粒体膜电位感受性色素Mito Tracker Red(最终浓度为10nM，Molecular Probe公司制，美国)，再培养10分钟。用共焦激光显微镜(Olympus公司制)观察其在488nm和543nm的激发波长下发出的荧光图像。结果如图8所示。

在图8所示的实验中，在0.6mM氢的存在或不存在下添加10μg/mL的抗霉素A，30分钟后添加1μM的Mito Tracker Green(MTGreen)和100nM的Mito Tracker Red(MTRed)，再培养10分钟。接着，用共焦激光显微镜观察细胞的荧光。定标线条为50μm。不存在氢时MTRed染色强度的减少显示线粒体膜电位的降低，在重合的图像中，与氢存在时相比绿色进一步变深。因此认为氢分子通过了线粒体膜。

在未填充氢的培养基中，抗霉素A处理的细胞其线粒体形态变得圆而零碎，而抗霉素A未处理的细胞其线粒体形态为网状结构。另外，Mito Tracker Red的荧光强度也下降。这表明线粒体的功能降低，但在含氢培养基中进行了抗霉素A处理的细胞的形态和Mito TrackerRed的荧光强度均接近于抗霉素A未处理的细胞，可知线粒体功能降低得到抑制。即，氢分子保护了线粒体。

实施例9

氢水对氧化应激亢进模型动物产生的效果的测定

导入了醛脱氢酶2的钝化基因(inactive gene)的转基因小鼠显示出促进氧化应激和老化相关疾病(C2小鼠；日本特开WO2005/020681，A1)。让该C2小鼠(5周龄，雌，每组4只)自由摄取氢水。在开放体系中氢自氢水中游离消失，为了使氢长时间保持溶解于水的状态，在摄水口放两个轴承滚球，水不会漏出而同时又不与空气接触。小鼠可以拨动轴承滚球从摄水口饮水。按照该方法，与开放体系相比小鼠的饮水量没有减少。按照该方法24小时后仍残留一半以上的氢。向容量为100mL的玻璃给水瓶中填充按照实施例1的方法制备的氢水直至瓶满，24小时更换一次氢水。对照的水使用从氢水中脱去了氢的水，除氢溶解以外使用完全相同的水。

让C2小鼠自由摄取氢水或对照水，测定血液和大腿肌肉中由过氧化脂质产生的有害醛和作为机体内氧化应激蓄积指标的4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)的浓度变化。4周后从眼底取全血。另外，大腿肌肉立即用液氮冷冻，在-80℃下保存。冻结的脏器用锤破碎后，向100mg脏器中添加1mL冰冷的缓冲液(100mM氯化钠、10mM Tris盐酸，pH 7.2)。接着，用POLYTRON(KINEMATICA AG公司制，瑞士)细切，加入1/4量的10％SDS，之后在冰上超声处理1分钟，然后在4℃下以3000rpm的转速离心，回收其上清液，用缓冲液稀释使提取蛋白量为10mg/mL，制备肌肉提取液。使用60μL全血和200μL肌肉提取液，按照制造商的手册所记载的方法，使用BIOXYTECH HAE-586分析试剂盒(OXIS公司制，美国)测定4-HNE浓度。结果如图9所示。血液和大腿肌肉中氢水摄取组的4-HNE量均显著减少。该结果表明：与饮料同时摄取的氢可以抑制血液内和组织内的机体内氧化应激。

实施例10

不同溶氢浓度的水的氧化应激抑制效果的经时性测定

按照实施例9让C2小鼠(4周龄，雄，每组4～5只)自由摄取溶氢浓度不同的水，1、2和3周后从眼底取60μL血液，按照实施例9所示的方法测定4-HNE量。给予的水的氢含量为：高浓度(H：1.6～1.2mM)、中浓度(M：0.7～0.9mM)、低浓度(L：0.3～0.5mM)和对照(C：0mM)。每一只的饮料在各组之间没有确认到差别。结果如图10所示。在摄取高浓度和中浓度氢水的组中，第2周时确认4-HNE量减少。但是低浓度组未见减少，由此表明：饱和浓度以上的氢水有效抑制了氧化应激。另外显示：两周左右的连续饮用对抑制氧化应激有效。

实施例11

吸入氢气产生的缺血·再灌流损伤减轻效果的测定

使用小动物全身麻醉器Soft Lander(株式会社Neuroscience)向小鼠(C57BL/6种，5周龄，雄)供应混合麻醉气体(氧：0.3L/分钟，笑气：0.7L/分钟，Sevofrane(丸石制药株式会社)：3％)，导入全身麻醉。导入麻醉后供给Sevofrane减少至1.5％的混合麻醉气体(氧：0.3L/分钟，笑气：0.7L/分钟，Sevofrane：1.5％)，长时间维持麻醉，使用以下所示的外科技术(参考文献：Yadav，S.S.等，Transplantation 65，1433-1436(1998))制作肝脏局部缺血·再灌流损伤模型动物，通过苏木精·伊红染色(H&E染色)评价缺血·再灌流损伤产生的肝缺血性组织变性和肝实质细胞的细胞死亡。

切开腹部中央，将通往肝脏左叶的门静脉、肝动脉、胆管这三管一起用微型夹钳(FD562，Aesculap，South San Francisco，CA，美国)闭塞(缺血开始)，用绢丝缝合腹部。90分钟后除去缝合的绢丝再次开腹，摘掉微型夹钳(再灌流开始)。再次用绢丝缝合腹部，麻醉下将肝脏左叶再灌流3小时。氢气供给组中，在指定期间按照指定的氢气流量与上述混合麻醉气体混合后供给，但为了保持总混合气体的流量恒定，仅通过氢气流速来减少笑气的流量。3小时后再灌流，之后摘出肝脏左叶(缺血肝)，切成短条状细片，浸在10％中性缓冲福尔马林溶液(和光纯药工业株式会社)中固定。

将固定的缺血肝片用乙醇进行脱水、用二甲苯除去脱水剂，再用自动包埋装置(SAKURA，Tissue-Tek VIP5)进行石蜡浸泡。包埋在石蜡中的缺血肝用滑行切片机切成3μm～5μm厚的薄片，将切片贴在载玻片上。用二甲苯处理，接着用乙醇处理，除去石蜡，用流水进行水洗。使用迈尔苏木精溶液(和光纯药工业株式会社)进行苏木精染色后，继续水洗，再用1％伊红Y溶液(和光纯药工业株式会社)进行伊红染色。用乙醇完全脱水后，用二甲苯浸透，封入带有封入剂Malinol(武藤化学药品株式会社)的盖玻片中，制作永久标本。

结果如图11和表3所示。

表3

氢气流氢气吸入时间量(L/分钟)	肝组织变性区(％)
		0	74
0.2从再灌流开始前5分钟到再灌流开始后5分钟(共10分钟)	10
		0.1从再灌流开始前5分钟到再灌流开始后5分钟(共10分钟)	20
0.04从再灌流开始前10分钟到整个再灌流期间(共280分钟)	26

在图11中，氢气未处理的肝组织有多个细胞中的细胞质发生变性(未被伊红染成红色，显白色)，并且核(用苏木精染成紫色)和脱落的细胞多。从再灌流开始前5分钟到再灌流开始后5分钟的10分钟期间吸入氢气(0.2L/分钟)的小鼠，其肝组织中核和细胞质的变性少，组织保持良好。表4的数据表示使用图像处理软件NIH Image，由切片整体的数码照片计测肝组织变性区(涂白区)的面积，以切片整体面积为100％时变性区所占的比例。通过吸入氢气，所有病例中肝组织变性均减轻。已经逐渐了解缺血·再灌流产生的损伤是自由基作用的效果，由此表明：通过吸入氢气，自由基被去除。可以类推：通过吸入氢气，通常不仅可以减轻缺血·再灌流损伤，还可以去除自由基。应说明的是，在4％氢的条件下氢不会点燃，可以安全使用。

实施例12

由摄取氢气产生的运动后的自由基去除效果的测定

已知剧烈运动和停止剧烈运动会产生自由基，给以肌肉为代表的各种组织带来损伤。通过摄取氢水和吸入氢气显示去除运动后的自由基的效果。让大鼠(Wister大鼠，8周龄，雄)以40m/分钟的速度跑20分钟，之后立即吸入含有10％氢气的空气30分钟。或者腹腔注射含有过饱和氢的生理盐水，并休息30分钟。30分钟后宰杀，取出骨骼肌，通过H&E染色来确认肌肉组织的损伤因摄取氢而减轻。并且，利用PCR法检测线粒体DNA的缺失变异，在摄取氢的大鼠中显示线粒体DNA的缺失减少。以上结果表明：摄取氢维持了剧烈运动后的肌肉组织。方法是根据Sakai，Y.，Iwamura，Y.，Hayashi，J.，Yamamoto，N.，Ohkoshi，N.，Nagata，H.，Acute exercise causes mitochondrial DNA deletion in ratskeletal muscle.，Muscle and Nerve 22：256-261，1999。

实施例13

通过饮用氢水、吸入氢气使氢分子进入机体内的证明

通过研究人呼气中的氢浓度来研究通过摄取溶解有氢的水或吸入氢气实际上氢分子是否进入体内。呼气中的氢浓度存在个体差异，因此以呼气氢浓度为10ppm以下的4个人为对象。用Breath GasAnalyzer(呼气中氢分析装置)TGA-2000(TERAMECS株式会社，京都)测定摄取氢水前的呼气中的氢浓度，之后每千克体重饮用摄取10mL氢水。之后，用不含氢的水漱口，完全除去氢水，经时测定呼气中的氢浓度。虽然存在个体差异，但摄取氢水后20分钟之内呼气中氢浓度上升30ppm以上，之后减少。1小时后，与摄取氢水前相比仍维持高值，由此表明氢进入体内并溶解于血液中，以呼气的方式从肺排出。以上表明：若摄取氢水，则20分钟左右氢进入机体内并溶解于血液中。结果如图12所示。

应说明的是，此处是通过饮用氢水使氢分子进入体内，当让受试者吸入氢气时，可以采用以下方法：将空气和氢气分别或事先混合供给盖住受试者口和鼻的气体吸入用面罩内而使其吸入；或者让受试者躺在密闭容器内的床上，将空气和氢气分别或者事先混合供给密闭容器内而使其吸入等。该情况下，只要氢气浓度为约4％体积以下，就不存在点燃或爆炸的危险性。

实施例14

研究在单纯的溶液状态下氢分子是否还原生理物质。室温下在用氢分子饱和的中性溶液中，氢分子没有还原NAD⁺、FAD、Fe³⁺、Cu²⁺和含有三价血红素铁的氧化型细胞色素c。即，氢分子在溶液中稳定，并没有扰乱氧化还原反应。在该条件下，氢分子没有还原过氧化氢、一氧化氮或O₂ ^-。该结果表明：氢分子没有中和这种在信号传递中起到主要作用的活性氧类。相对于此，如图13所示，在相同条件下即使不存在催化剂氢分子也使·OH减少。图13表示在室温、中性下由溶氢分子除去羟自由基。羟自由基用荧光分光光度计进行监测。图13a表示在各种氢分子浓度中HPF荧光强度的代表性经时变化。基线1和2表示在0.8mM的氢浓度下不含过氧化氢(1)和不含过氯酸亚铁(2)的HPF荧光强度变化。图13b表示由独立的4次实验求出的反应初期速度的平均值和标准偏差的结果。由芬顿反应产生的·OH用2-[6-(4’-羟基)苯氧基-3H-呫吨-3-酮-9-基]苯甲酸(HPF)的荧光进行监测。HPF可以特异性地检测·OH，而不能检测过氧化氢或O₂ ^-·。

实施例15

研究氢分子是否可以中和培养细胞中的·OH。自发的·OH的产生并没有达到显示细胞毒性的量而难以检测，因此利用两种不同方法诱导·OH。应说明的是，以HPF作为标记色素，使用共焦激光显微镜检测·OH。最初，准备分别用氢和氧饱和的培养基，用氢和氧电极边监测边混合，使各自的浓度适量。接着，将PC12细胞的培养基更换成该培养基，再将细胞装入充满气体的容器中，上述气体制备成氢和氧为适量浓度。在PC12细胞中通过添加线粒体呼吸链抑制剂抗霉素A而产生O₂ ^-·，经过芬顿反应使·OH增加。如图14和图15所示，若用氢分子对其进行处理则·OH减少。图14表示在0.6mM氢存在或不存在下添加抗霉素A，30分钟后用共焦激光显微镜观察HPF的荧光的结果。箭头和箭尾分别表示核中HPF的荧光为阳性和阴性的细胞。定标线条为50μm。图15表示在0.6mM氢存在或不存在下添加抗霉素A时对HPF荧光强度进行定量的结果。通过各自独立的实验用NIH Image软件对100个细胞进行计测。为了保持初期的氢浓度，用适量气体浓度的密闭容器培养细胞。非常有趣的是氢分子使核的·OH减少(在图14的右板中用箭尾表示)。

在0.6mM氢存在或不存在下添加抗霉素A，进一步培养24小时后用抗8-OH-G抗体和抗HNE抗体染色，用共焦激光显微镜观察。结果如图16～19所示。图16和图18的定标线条为100μm。抗8-OH-G抗体(图17)和抗HNE抗体(图19)的免疫染色强度用NIH Image软件进行定量。在结果如图14～19所示的实验中，抗霉素A(+)、氢(+)和维生素E(+)的浓度分别为10μg/ml、0.6mM和0.1mM。平均值和标准偏差由独立的4次实验求出。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。

在图16和17中，如氧化鸟嘌呤(8-OH-G)的减少所示，氢分子保护了核DNA不被氧化。另外，如图22所示，氢分子抑制了过氧化脂质的最终产物4-羟基-5-壬烯醛(HNE)的蓄积，这表明也抑制了脂质的过氧化。

实施例16

使用大鼠大脑皮质初代培养细胞，在较生理的条件下诱导氧化应激。已知从缺血状态到再灌流的急剧变化会引起由氧化应激产生的损伤。因此模仿缺血，将细胞在氮或氢环境下曝露于氧葡萄糖缺乏状态60分钟。

大鼠大脑皮质初代培养神经细胞利用16天的胎儿来制备。除去脑膜后，将大脑皮质剪断，用蛋白酶混合液(SUMILON)消化。用吸液管进行机械解离后，将细胞分散在神经细胞培养培养基(SUMILON)中，按5×10⁴个细胞/cm²接种在聚-L-赖氨酸包被的培养皿中。培养基每3天用含有B-27(Gibco)的Neurobasal培养基(Gibco)进行交换，将培养11天的细胞用于实验。在形成氧葡萄糖缺乏状态的1天前将培养基交换成含有B-27 minus AO(Gibco)的Neurobasal培养基(Gibco)。神经细胞的质量控制通过用神经细胞特异性抗TUJ-1抗体和星形细胞特异性抗GFAP抗体染色来确认。90％以上的细胞为神经细胞。

为了开始氧葡萄糖缺乏状态，用通入95％氮/5％二氧化碳或95％氢/5％二氧化碳的不含葡萄糖的DMEM培养基交换细胞培养基。将其在95％氮/5％二氧化碳或95％氢/5％二氧化碳环境中、30℃下放置1小时。为了结束氧葡萄糖缺乏状态，与交换前的培养基再次交换，进一步在95％空气/5％二氧化碳环境中、37℃下继续培养。

结束氧葡萄糖缺乏状态10分钟后，根据HPF荧光来测定·OH量时，如图20和21所示，发现当不存在氢时·OH显著增加，当氢存在时·OH没有显著增加。图20表示再灌流10分钟后将细胞用HPF染色(左为荧光图像，右为荧光图像和诺马斯分辨干涉图像的重叠)的结果。对照则是将细胞用含有葡萄糖和氧的DMEM培养基处理，以代替曝露于氧葡萄糖缺乏状态。定标线条为100μm。图21表示使用NIH Image软件对100个细胞计测HPF荧光强度的结果。平均值和标准偏差由独立的4次实验求出。**P＜0.01。

氧葡萄糖缺乏1天后，进一步通过神经细胞特异性抗TUJ-1抗体染色来检测存活神经细胞时，如图22所示，氢分子使存活神经细胞数增加。另外，如图23和24所示，其存活率也增加。图23表示氧葡萄糖缺乏状态开始1天后在相差显微镜下对一定视野计数存活神经细胞数的结果。图24表示按照改良的MTT法测定细胞存活率的结果。图23和24所示的平均值和标准偏差由独立的4次实验求出。^#P＜0.0001、*P＜0.05。上述结果显示：氢分子抑制了氧化应激造成的细胞死亡。

实施例17

为了研究能否将抗氧化物质的氢分子用于医疗，使用大鼠缺血模型进行研究。

大脑缺血时因多种机制而产生活性氧类，缺血再灌流后检测出·OH。将大鼠的大脑动脉轻度闭塞造成90分钟局部性缺血，接着再灌流30分钟。只要没有特别指定，则在此期间继续吸入氢。即将再灌流前血中给予FK506(1mg/kg体重)一次，即将再灌流前和刚刚再灌流后血中给予依达拉奉(3mg/kg体重)两次。麻醉后通常将大鼠在空气中、20℃下维持。只要没有特别指示，则120分钟都吸入氢分子。让大鼠吸入笑气(用于麻醉)、氧和氢按66～70％、30％、0～4％(体积/体积)的比例混合的气体。轻度大脑动脉闭塞1天后，将脑切片，用在线粒体的呼吸过程中能够作为基质的2，3，5-三苯基四唑鎓盐(TTC)染色。一周后将动物麻醉，之后迅速取出脑，用10％福尔马林固定。包埋于石蜡中的脑切成6μm厚的切片，用苏木精·伊红染色。另外，抗体染色时使用VECSTAIN ABC试剂盒。抗Iba I抗体从和光纯药买入。分析切片时使用图像分析软件(Mac Scope ver.2.55，Mitsuya商事)。应说明的是，所有动物实验都按照日本医科大学动物委员会的准则进行。

梗塞体积通过测定脑的白可见区进行推算。结果如图25和26所示。图25表示轻度大脑动脉闭塞1天后将脑冠状切成6块并用TTC染色的结果。为了比较，进一步测试两种化合物。一种是依达拉奉，在日本被推荐用于脑梗塞的处置。另一种是FK506，在美国用其治疗脑梗塞的临床试验正在进行中。氢分子较任一种化合物都更有效地减轻氧化障碍。图26表示脑梗塞体积，脑梗塞体积由各切片的梗塞体积×厚度的总计算出。图26中的E和F表示在最适条件下给予依达拉奉(6mg/kg体重)和FK506(1mg/kg体重)时的梗塞体积。梗塞体积的平均值和标准偏差由各组6只动物的值求出。与氢气浓度0％相比，*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。与氢气浓度2％相比，^##P＜0.01、^###P＜0.001。

如图25和26所示，可清楚确认：梗塞体积依赖于氢浓度而减少，2％的氢浓度最有效(图26)。

图27表示只在缺血时吸入氢而再灌流时不吸入氢的情况下的结果。将大鼠的大脑动脉轻度闭塞，造成90分钟局部性缺血，接着再灌流30分钟。在A、B、C所示的3种不同期间吸入2％氢气。图27a表示其模式图。图27b表示上述3种不同期间吸入氢气时的梗塞体积。轻度大脑动脉闭塞1天后将脑冠状切成6块，用TTC染色，脑梗塞体积由各切片的梗塞体积×厚度的总计算出。与氢气浓度0％相比，*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.0001。与A相比，^##P＜0.05、^###P＜0.0001。如图27所示，只在缺血时吸入氢而再灌流时不吸入氢的情况下，梗塞体积没有减少。其结果显示：为了显示氢分子的保护效果，再灌流时氢分子必须存在。

另外，如图28和29所示，轻度大脑动脉闭塞1周后，氢处置组和未处置组的梗塞体积更加显著不同。图28表示轻度大脑动脉闭塞1周后将脑冠状切断所得切片进行苏木精·伊红染色的结果，图28的照片为其中3块不同切片的染色图像。图29表示以苏木精·伊红染色得到的浅粉色可见区作为梗塞区，与上述同样算出梗塞体积的结果。梗塞体积的平均值和标准偏差由各组6只动物的值求出。与氢气浓度0％相比，*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。与氢气浓度2％相比，^##P＜0.01、^###P＜0.001。

如图30所示，氢处置大鼠与未处置大鼠相比体重和体温均有改善。图30a和图30b分别以2％氢气吸入(实线)、未吸入(虚线)表示体温和体重的变化。平均值和标准偏差由各组6只动物的值求出。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。如上述结果所示，氢分子不仅改善初期脑障碍，还抑制障碍发展。

使用闭塞1周后的脑，用表示核酸氧化的抗8-OH-G抗体、表示脂质过氧化的抗HNE抗体和抗GFAP抗体将脑切片染色，研究由氢分子的保护效果产生的分子水平的变化，结果如图31～33所示。图31表示使用抗8-OH-G抗体时的结果，图32表示使用抗HNE抗体时的结果，图33表示使用星形细胞特异性抗GFAP抗体时的结果。轻度大脑动脉闭塞3天和7天后将脑固定，包埋在石蜡中。将6μm厚的冠状切片用抗8-OH-G抗体、抗HNE抗体和抗GFAP抗体染色。图31～33的左侧照片表示大脑侧头部的同一闭塞周边区。定标线条为100μm。图31～33的右侧的图表示由各组6只动物的值求出一定视野下(0.25mm²)的各抗体阳性细胞数的平均值和标准偏差的结果。*P＜0.05、**P＜0.01。氢处置大鼠的任一种氧化标记的染色均显著减少。

图34表示将脑的同一区用线粒体特异性抗Iba-I抗体染色的结果。染色实验中，轻度大脑动脉闭塞3天和7天后将脑固定，包埋在石蜡中。冠状切片用各自的抗体染色。照片表示大脑侧头部的闭塞中心区。图34的定标线条为200μm，图34的插入照片的定标线条为100μm。图35表示由各组6只动物的值求出一定视野下的Iba-I阳性细胞数的平均值和标准偏差。*P＜0.05。如图34和35所示，将脑的同一区用小神经胶质细胞特异性抗Iba-I抗体染色时，抗Iba-I抗体的染色因氢处置而显著减少。小神经胶质细胞的累积是脑障碍的指标，该结果强烈表明：氢分子显著抑制了氧化应激，而且还显著抑制了脑障碍。

实施例18氢水的效果

SOD基因敲除小鼠的SOD-/SOD-纯合小鼠出生率的增加

线粒体中存在的MnSOD(锰超氧化物歧化酶)将线粒体内产生的超氧化物自由基(O₂ ^-·)转化成过氧化氢的酶，基因存在于核内。若MnSOD缺失则O₂ ^-·蓄积，与NO反应的频率升高，有害的ONOO^-(过氧化亚硝酸盐)增加，产活细胞毒性。或者O₂ ^-·还原过渡金属，使Cu²⁺和Fe²⁺增加，加速了芬顿反应，生成有害的羟自由基(·OH)。因此，缺失MnSOD的动物因死产导致出生频率减少，或者即使出生也会在一周内死亡。使杂合具有MnSOD缺失基因的小鼠(SOD2(+/-))彼此交配，生出MnSOD正常的小鼠(SOD2(+/+))、杂合具有MnSOD的小鼠(SOD2(+/-))、MnSOD完全缺失的小鼠(SOD(-/-))，按照孟德尔定律应该以1∶2∶1的比例出生。实际上MnSOD缺失小鼠因上述有害的活性氧、自由基而死产，出生率减少(图37)。

将16只MnSOD雌性杂交小鼠分成2组，一组饮用8天氢水，进行交配。之后继续饮用氢水直至分娩。妊娠小鼠分别为5只和6只，生出42只和45只。从该出生的鼠仔尾部提取DNA，按照常规方法决定基因型。

饮用对照水的情况下生出的45只鼠仔中，MnSOD(+/+)∶MnSOD(+/-)∶MnSOD-/-)的比例为14∶29∶2。而饮用氢水的母鼠生出的鼠仔为42只，其比例为14∶20∶8，MnSOD(-/-)小鼠多8倍，具有统计学意义(图38)。

以上结果显示：氢水减轻了O₂ ^-·引起的氧化应激。

实施例19饮用氢水和腹腔内给予氢水产生的防癌效果

作为用于预测致癌性的检测方法，近年开发了各种中期致癌性试验法。使用鼠类进行的两阶段致癌模型是指首先作为起始处置，给予不足以致癌的少量已知致癌物质，之后给予受检物质，检测是否具有促进作用的试验方法，检测致癌性时特别关注促进作用，来评价受检物质的致癌性。

中期肝致癌性试验法(伊东法)是指在促进期的初期切除部分肝脏，在再生增殖期促进肝细胞的细胞分裂，从而在短期内诱发变异细胞巢的方法，迄今为止累积了最多的数据(Ito N，Tamano S，Shirai T.，Cancer Sci.2003 Jan；94(1)：3-8.综述)。以大鼠肝脏为靶向，迄今为止检测出了313种化学物质，在作为肝致癌性物质(包括促进剂(promoter))的化学物质中，据报道有60/65(92％)为阳性结果，本试验方法在检测以肝为靶向的致癌物质方面可靠性高、有效。并且，按照本试验方法以各种给药量检测肝致癌物质所得的结果中，GST-P阳性细胞巢的发生的定量值与长期致癌性试验得到的肝细胞癌的发生频率相关，有人还报道了用量相关性(Ogiso，T等，Toxicol.Pathol.，13，257-265，1985)。

本实施例中采用的检测方法为：将已报道具有肝致癌性的一种杂环胺MeIQx和受检物质在中期肝致癌性试验法的促进阶段同时给药。该检测方法是为了检测受检物质对肝致癌的抑制作用而开发的，迄今为止广濑等人(Hirose，M.et al.，Carcinogenesis，16，3049-3055，1995)使用该模型发现了几种肝致癌抑制物质。

本实施例中使用含氢生理盐水(H₂生理盐水)和含氢水(H₂水)作为受检物质。在本实施例中，使用上述模型，腹腔内给予受检物质即含氢生理盐水，再饮水给予含氢水，来检测对肝致癌的抑制作用。

为了研究将含氢生理盐水和含氢水联合给药是否对肝致癌具有抑制效果，采用以胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GST-P)阳性细胞巢为指标的中期肝致癌性试验法进行定量研究。

为了对肝致癌进行起始处置，对于6周龄的F334系雄大鼠，以二乙基亚硝胺(DEN)为引发剂，按200mg/kg的用量腹腔内给药一次，两周后开始将受检物质即含氢生理盐水以10ml/kg的给药量、1日2次或7次/周的频率腹腔内给药6周，再饮水给予含氢水。对照组腹腔内给予生理盐水和饮水给予自来水。另外，还设有DEN未处置的对照组和受检物质给药组。DEN处置组、未处置组各自进一步分为：以肝致癌物质即2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-f]喹喔啉(MeIQx)作为促进剂并以饲料中0.02％浓度和受检物质联用给药6周的组。实验开始3周后(受检物质给药开始1周后)，将所有动物切除部分肝脏，实验开始8周后(受检物质给药期间结束后)宰杀、剖检，之后对肝脏中的GST-P阳性细胞巢进行定量分析。实验方法如图39所示。

给药期间没有发现因给予受检物质而引起的一般状况的变化、死亡动物和体重变化。在所有受检物质给药组中摄水量在给药期间的某一时期显示高值倾向，由此认为这是受检物质给药的影响。

在肝脏重量和肉眼病理学检查中没有发现受试物质给药的影响，血液生化学检查中也没有发现暗示受检物质给药产生的毒性的变动。推测这次使用的受检物质抑制了过氧化脂质的生成，因此还测定了血清过氧化脂质，但在这次实验中没有发现被抑制。

肝脏GST-P阳性细胞巢的数目(图40a)和面积(图40b)的计测结果如图40所示。含氢生理盐水(腹腔内给药)和含氢水(饮水给药)的联合给药轻度抑制了DEN处置组的GST-P阳性细胞巢的发生，其抑制率以个数计为28.0％，以面积计为25.2％。除DEN外还给予MeIQx的组中，含氢生理盐水和含氢水也轻度抑制了GST-P阳性细胞巢的发生，其抑制率以个数计为21.0％，以面积计为20.9％。

如上所述，含氢生理盐水和含氢水对抑制致癌有效。

产业实用性

本发明具备上述构成。如上述实施例详细说明的那样，根据本发明可以去除机体内的有害活性氧类和/或自由基，因此可以抑制由该活性氧类和/或自由基的存在而引起的各种不良影响。从而发挥可以抑制人体老化的进行、增进健康和预防疾病的优异效果。后述实施例的结果显示：氢分子作为有效的抗氧化物质有许多优点。即，氢分子以不影响代谢过程中的氧化还原反应或细胞信号中的活性氧类的适当强度有效中和·OH。相对于已知的多种抗氧化物质无法容易地到达靶向器官或组织，氢分子则容易通过机体膜而扩散至细胞质中，从而具有可以有效分布的特性。炎症或缺血再灌流产生的氧化应激还因其他各种状况而产生。其中例如有：运动过度、心肌梗塞、出血导致的手术中断、器官移植等。象氢分子那样有效、但不造成其他损伤的抗氧化物质从其便利性方面考虑可以用于多数的医疗领域。氢气吸入已经被用于保护潜水员以防减压而导致潜水病，其安全性得到广泛确认。另外，本发明中用于治疗的氢浓度不存在点燃或爆炸的危险性。而且，吸入的氢气溶解于液体，并容易地透过血管而被转运。这样，最广为人知的分子之一-氢，其作为副作用小、安全而有效的抗氧化物质可以广泛用于医疗领域。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均以直接参考的方式而纳入本说明书中。

Claims (33)

1.机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，该清除剂包含至少含氢分子的液体。

2.权利要求1的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的液体包含水溶液。

3.权利要求2的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中含有的氢分子为过饱和状态。

4.权利要求2或3的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，该清除剂还包含氧分子。

5.机体内的活性氧类和/或自由基清除剂，该清除剂包含至少含氢分子的气体。

6.权利要求5的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气和氧气的混合气体。

7.权利要求5的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气、氧气和惰性气体的混合气体。

8.权利要求5的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气和空气的混合气体。

9.权利要求5的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中至少含氢分子的气体包含氢气和麻醉气体的混合气体。

10.权利要求5～9中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中含有1～4％(v/v)浓度的氢气。

11.权利要求5～9中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中含有1.0～4.5％(v/v)浓度的氢气。

12.权利要求1～11中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中活性氧类和/或自由基为选自羟自由基、过氧化亚硝酸盐、烷氧基自由基和脂质过氧化自由基的活性氧类和/或自由基。

13.权利要求12的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂，其中活性氧类和/或自由基为羟自由基。

14.药物组合物，该药物组合物含有权利要求1～13中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

15.活性氧类和/或自由基引起的障碍的治疗或预防剂，该治疗或预防剂含有权利要求1～13中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

16.权利要求15的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍选自氧化应激、氧化应激引起的细胞死亡和氧化应激引起的线粒体功能障碍。

17.权利要求15的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍选自：脑梗塞、心肌梗塞、动脉硬化、缺血再灌流损伤、人工透析引起的紊乱、器官移植引起的紊乱、早产儿的网膜变性、急性肺病、炎症和脂质代谢紊乱。

18.权利要求15的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍为剧烈运动后的肌病或运动后吸入高浓度氧气产生的氧伤害。

19.权利要求15的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍选自：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和ALS等神经变性疾病。

20.权利要求15的治疗或预防剂，其中活性氧类和/或自由基引起的障碍为癌症。

21.饮料，该饮料适于减轻或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍，所述饮料含有：权利要求1～4中任一项的包含至少含氢分子的液体的活性氧类和/或自由基清除剂。

22.饮料，该饮料上附有用于清除或降低机体内的活性氧类和/或自由基的标示，所述饮料含有：权利要求1～4中任一项的包含至少含氢分子的液体的活性氧类和/或自由基清除剂。

23.饮料，该饮料上附有用于减轻或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的标示，所述饮料含有：权利要求1～4中任一项的包含至少含氢分子的液体的活性氧类和/或自由基清除剂。

24.权利要求21～23中任一项的饮料，该饮料为健康食品、功能性食品、营养辅助食品、食品营养强化剂或特定健康食品。

25.容器，该容器装有权利要求5～10中任一项的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂。

26.权利要求25的容器，该容器为氢气钢瓶。

27.用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其具备：装有权利要求5～10中任一项的包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器、气体吸入用装置以及向吸入用装置中供应上述容器中的气体的供给配管。

28.权利要求27的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，该设备还具备装有至少一种选自氧气、惰性气体和空气的气体的容器，其中将包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂和至少一种选自氧气、惰性气体和空气的气体分别或混合后供给气体吸入用装置。

29.权利要求27或28的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，该设备还具备装有麻醉气体的容器，其中将包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂和麻醉气体分别或混合后供给气体吸入用装置。

30.权利要求27～29中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中在装有包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器中含有1～4％的氢气。

31.权利要求27～30中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中装有包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂的容器为气瓶。

32.权利要求27～31中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中气体吸入用装置为气体吸入用面罩。

33.权利要求27～31中任一项的用于向需要治疗或预防由活性氧类和/或自由基引起的障碍的受试者供应活性氧类和/或自由基清除剂的设备，其中气体吸入用装置为密闭室，通过向该密闭室中供应包含至少含氢分子的气体的机体内的有害活性氧类和/或自由基清除剂来向密闭室内的受试者供应上述活性氧类和/或自由基清除剂。

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