CN101263784B - 油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种方法，以解决现有技术中组培苗移栽成活率低、组培苗与种子植株花期相遇不良以及无相应制种方法等缺陷，大田的底肥选用复合肥和农家肥，父本和组培苗的行比设置为1∶3～4，组培苗移栽后的0～5天内播种父本种子，组培苗直接移栽至大田，组培苗不能接触底肥，移栽后马上浇定根水，用薄膜覆盖，保湿4～7天，移栽10～15天后，按照4～6公斤尿素/亩的量将尿素溶于清粪水施加，此后常规管理，制种即得，与现有技术相比，本发明提高了组培苗直接移栽的成活率，探讨了父母本之间花期相遇不良的问题，提供了一种有应用价值的组培快繁油菜雄性核不育植株制种的方法。
Description
技术领域
本发明涉及制种技术领域，特别是涉及一种利用油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种的方法。
背景技术
油菜在其田间选育的过程中，由于一些外界因素的影响，常常会产生一些突变体植株如单倍体、不育株、高蛋白、多柱头、无花瓣等，有些对育种具有重要意义。但采用常规育种方法，由于一些性状受多基因控制，在杂交、分离、选育过程中，比例小、易丢失，且耗时长。利用油菜营养体苔茎段进行离体快速繁殖，可在短期内获得大量与母体特殊性状一致的植株，这为保存优良遗传特性和快速繁殖优良品系提供了良好的实验手段。
利用不育系生产杂交种，通过杂种优势提高作物产量，是一个有效并被广泛利用的增产途径。在传统方法中，利用油菜核不育材料配制杂交种，苗期匀、定苗会损失不育株，初花期还需要拔除约一半的可育株，这不仅影响制种产量和制种纯度，而且费工费时。利用油菜苔茎段快速繁殖技术，可在较短时间内得到大量整齐一致、不育株率为100％的核不育株植株，在油菜杂交育种上具有实际的应用价值。
发明人对利用油菜苔茎段离体培养快速繁殖核不育材料技术进行了系统的研究，并发表了文章《基因型效应对甘蓝型油菜核不育系组织培养再生植株的影响》(《种子》，1997(5)：25-29)，《甘蓝型油菜雄性核不育系快速繁殖及其植株性状的初步研究》(《贵州农业科学》1996年第2期第23-26页)，《甘蓝型油菜核不育系组织培养快速繁殖》(《植物生理学通讯》，1995，31(2)：119～120)、《BA和PP333对油菜试管苗生长的影响》(《贵州农业科学》，1999，27(1)：10-13。)，《甘兰型油菜不同分枝薹段离体培养分化出苗能力比较》(《贵州农业科学》，1994(3)：11-14)，文章公开了一些组培快繁油菜核不育植株的方法：
材料：田间突变的甘蓝型油菜核不育植株
培养基：
分化培养基：B5培养基+6-BA 2mg/l+KT 1mg/l+GA30.5mg/l+谷氨酰胺2mg/l+水解乳蛋白500mg/l+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8；
增殖培养基：B5培养基+6-BA 6mg/l+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8；
生根培养基：B5培养基+多效唑1mg/l+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8。
培养条件：培养温度为20～25℃，每天光照时间10～12小时。
苔茎段再生组培苗的培育：在油菜初花期用70％酒精擦拭预切口进行表面消毒，用消毒刀片切下第3～7分枝即用创可贴封住切口。除去叶片将苔段于0.1％HgCl2中消毒10分钟，用无菌水冲洗6次后切片接种在分化培养基上进行分化培养，培养温度20～25℃，光照10～12小时。10天左右苔段接触培养基的切面膨大，分化出愈伤组织。20天左右有芽点突起，30天左右分化出2～3cm的不定芽。将不定芽切下，接种到增殖培养基中培养，30天后每个不定芽可增殖形成3～10棵以上不定芽苗。将不定芽苗接种到生根培养基中培养20天左右诱导生根。每棵不定芽苗上可长出3～8条长约3～8cm的根，形成完整的再生小植株，即组培苗。
组培苗的练苗和移栽：将组培苗在清水中洗去附着的培养基后，移栽到盛有蛭石+珍珠岩(1∶2)的纸杯中。用荷格兰营养液浇透，置入塑料薄膜棚架内保湿3～5天后，移到自然光下炼苗。10～30天后将苗移栽到大田中(大田的管理措施与种子苗相同)。
在这些文章中，发明人指出了现有油菜核不育系组培快繁技术还存在下述问题：育出的组培苗脆嫩、纤长易折、移栽成活率低等。而且目前也没有通过营养组织培养快速繁殖油菜核不育植株进行制种的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足：组培苗移栽成活率低、无相应制种方法等，提供一种油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种的方法，通过挑选相应的组培苗直接移栽大田、组培苗移栽后的0～5天内播种父本等方法来解决上述的技术问题。
本发明优选出的具体的技术方案如下：
油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种方法，包括组培苗的培育、移栽以及杂交制种步骤，以油菜雄性核不育系植株为材料，切取其初花期时的上部分枝苔段，消毒切段后置于分化培养基中进行分化培养，切取分化培养出的不定芽接种于增殖培养基中增殖，形成的不定芽苗接种于生根培养基中进行生根培养，即得组培苗再生植株移栽大田，播种父本，常规管理，杂交制种，其创新在于：所述大田的底肥选用农家肥和复合肥，父本和组培苗的行比设置为1∶3～4，组培苗移栽后的0～5天内播种父本，组培苗不能直接接触底肥，移栽后马上浇定根水，用塑料薄膜覆盖，保湿4～7天后逐步揭去薄膜，移栽后10～15天，按照4～6公斤尿素/亩的量将尿素溶于清粪水施加，此后常规管理，制种即得。
在组培苗生根培养时，最好在培养基中添加0.1～2mg/l的多效唑，多效唑具有壮苗的作用。
在生根培养基中添加多效唑的基础上，选择这样的组培苗直接移栽大田：带4～8片展开绿叶，有3～8条根并且根长1cm以上，茎长2～3cm，苗色深绿、矮壮。未添加多效唑培养的组培苗茎杆脆嫩、纤长瘦弱、抵抗力差，如果直接移栽大田，由于组培苗的培养环境是恒温恒湿的，与大田环境有很大的区别，组培苗会禁不住大田恶劣的自然条件而死亡，成活率极低，选择上述的组培苗移栽大田后，其成活率可达90％以上，并且节省了劳动力，提高了效率。
前述的大田底肥是由25公斤/亩复合肥和1000公斤/亩农家肥混合而成。这种组合的底肥可为组培苗提供充足的养分，使移栽后的组培苗更容易从异养型转变为自养型，生长健壮。
组培苗移栽后的管理过程中，在第一次施加尿素后的20～30天，最好再重复施肥一次。
为了研究组培快繁核不育植株进行制种的方法，发明人进行了大量的实验研究：
一、父、母本行比的研究
一般来说，现有制种技术中行比的优选大多采用种子来进行的，为了探讨种子父本和组培苗母本制种的最佳行比，发明人设置了如表1所示的父、母本制种行比。父、母本均是穴播，每行8穴，父本每穴定2株苗，母本每穴栽1株苗，3次重复，在收获时3个重复每行产量单独收获进行比较。结果表明靠近父本的第1-4行的产量较高，并且差异不大，而第5行的产量有所降低(表2)。因此父母本的行比设置为1∶3～4较为合适。
表1父、母本行比试验的田间设置图
| 父本 | 母本：1-9行 | 父本 | 母本：1-9行 | 父本 | 母本：1-9行 | 父本 |
表2父、母本行比试验行间产量比较结果(g)
| 行号 | 第一重复 | 第二重复 | 第三重复 | 总和 | 平均值 |
| 1 | 58.7 | 81.1 | 93.0 | 232.8 | 77.6 |
| 2 | 89.2 | 76.1 | 67.0 | 232.3 | 77.4 |
| 3 | 102.8 | 71.3 | 69.4 | 243.5 | 81.2 |
| 4 | 93.8 | 70.6 | 69.8 | 234.2 | 78.1 |
| 5 | 77.0 | 67.9 | 57.7 | 202.6 | 67.5 |
| 6 | 73.9 | 82.5 | 73.7 | 230.1 | 76.7 |
| 7 | 78.4 | 94.2 | 79.0 | 251.6 | 83.9 |
| 8 | 76.1 | 84.3 | 76.8 | 237.2 | 79.1 |
| 9 | 86.1 | 72.0 | 76.4 | 234.5 | 78.2 |
二、组培苗移栽的研究
1、组培苗不能接触底肥
起初，发明人将组培苗移栽至大田，其成活率极低，拔起组培苗观察，发现苗的根部腐烂。经过分析，得知其原因是工人在栽种将组培苗接触了大田底肥。大田底肥是复合肥和农家肥混合施用，复合肥的浓度较高，而农家肥有时没有经过发酵或发酵不彻底，在这种情况下，接触底肥的组培苗就会被烧死，所以，移栽时组培苗不能接触底肥。
2、直接移栽的组培苗的选择
一般来说，健壮的组培苗成活率高。但怎样的指标表明该组培苗是健壮的？例如苗势情况？具体绿叶数？根长等？而且，组培苗在试管中的生长环境是恒温恒湿的，直接移栽大田很难适应，一般组培苗需要先移栽在营养钵中练苗23周，然后再移栽到大田；为了减少组培苗练苗过程中所耗费的时间和所需的人力、物力和财力，同时克服现有技术中组培苗移栽成活率低的问题，发明人通过研究发现，由于组培苗一般是在室内栽培，光线往往不足，生长一般比较细长，而移栽时茎段过长(＞4～10cm)，纤细，在移栽过程中易折断，成活率低；如果移栽苗的根太短(＜1cm)，栽培后难以固定植株，也不利于水分和营养的吸收；一定的绿叶数可以使组培苗移栽后迅速进行光和作用，供给生长所需要的养分；因此在生根培养基中加入具有壮苗作用的多效唑，植株生长矮壮，选择带4～8片展开绿叶、有3～8条根并且根长1cm以上、茎长2～3cm、苗色深绿、矮壮的组培苗直接移栽大田，组培苗的成活率可达90％以上。
3、组培苗移栽后的管理
一般的作物栽培多是利用种子繁衍苗，即使是油菜苗床的移栽苗，由于有胚乳和苗床所施的肥料提供养份，一般苗都较大，也较健壮。对于组培苗的移栽，一般都是经过炼苗后才移栽大田。
直接移栽大田的组培苗很小，即使是健壮组培苗也是相对而言，与种子苗相比，它仅为同期栽培的种子苗的1/5或1/10大小，并且移栽以后，它没有胚乳提供养分，所以发明人对组培苗移栽后的管理进行了研究，优选出了如下的管理措施：
移栽后马上浇定根水，用薄膜覆盖，保湿4～7天以后逐渐揭去薄膜，移栽后10～15天后，按照4～6公斤尿素/亩的量将尿素溶于清粪水施加，20～30后天重复施肥一次，此后常规管理。
三、花期不遇问题
为了探讨种子父本和组培苗母本制种花期不相遇的问题，发明人在2007年进行了研究，设置了7个组培苗移栽期，分别为9月30日，10月5日，10月10日，10月15日，10月20日，10月25日，10月30日。父本播种时间为10月10日，每个移栽期之间间隔5天，收获时考察单株产量。结果表明，在本发明所选用的组培苗苗势指标的条件下，父、母本在同一天播种和移栽或父本播种后的第5天后移栽母本的处理的单株产量最高(分别为15.84g和13.58g，表3)，表明这两个处理的父、母本花期相遇较好。由此说明在组培苗移栽后的当天或此后的5天内播种父本种子，制种产量较高。
表3组培苗母本不同移栽期与种子苗父本杂交制种的单株产量结果(g)
| 组培苗移栽期 | 第一重复 | 第二重复 | 总和 | 平均值 |
| 9月30日 | 4.34 | 5.92 | 10.26 | 5.13 |
| 10月5日 | 3.51 | 13.95 | 17.46 | 8.73 |
| 10月10日 | 19.45 | 12.22 | 31.67 | 15.84 |
| 10月15日 | 16.15 | 11.01 | 27.16 | 13.58 |
| 10月20日 | 6.65 | 11.67 | 18.32 | 9.16 |
| 10月25日 | 8.91 | 10.90 | 19.81 | 9.91 |
| 10月30日 | 6.01 | 7.84 | 13.85 | 6.93 |
与现有技术相比，本发明进一步具体了油菜核不育植株组培快繁的方法，提高了组培苗移栽的成活率，解决了父、母本之间花期相遇不良的问题，并且，本发明对利用组织培养技术快速繁殖油菜雄性核不育植株制种的方法进行研究，优选出了移栽大田时父、母本的适宜行比，提高了制种产量、质量和节约了成本，还对移栽大田时的底肥以及后继管理进行了研究，提高了组培苗的成活率，是一种具有应用价值的制种方法。
具体实施方式
本发明的优选实施方式：
材料：油菜核不育系植株
培养基：分化培养基：B5培养基+6-BA 2mg/l+KT 1mg/l+GA30.5mg/l+谷氨酰胺2mg/l+水解乳蛋白500mg/l+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH调为5.8；
增殖培养基：B5培养基+6-BA 10mg/l+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8；
生根培养基：B5培养基+PP3331mg/l+蔗糖3％+琼脂0.8％，添加3mg/l的多效唑，pH5.8。
培养条件：培养温度为20～25℃，每天光照时间10～12小时。
苔茎段再生组培苗的培育：在油菜初花期用70％酒精擦拭预切口进行表面消毒，用消毒刀片切下第3～7分枝即用创可贴封住切口。除去叶片将苔段于0.1％HgCl2中消毒10分钟，用无菌水冲洗6次后切片接种在分化培养基上进行分化培养，培养温度20～25℃，光照10～12小时。10天左右苔段接触培养基的切面膨大，分化出愈伤组织。20天左右有芽点突起，30天左右分化出2～3cm的不定芽。将不定芽切下，接种到增殖培养基中培养，30天后每个不定芽可增殖形成3～10棵以上不定芽苗。将不定芽苗接种到生根培养基中培养20天左右诱导生根。每棵不定芽苗上可长出3～8条长约3～8cm的根，形成完整的再生小植株，即组培苗。
组培苗的移栽：选择土质较厚、肥沃、疏松的土壤进行组培苗的移栽，将复合肥和农家肥按照25Kg/亩和1000Kg/亩的比例混合后埋入大田作为底肥，父本和组培苗(即母本)的行比设置为1∶3～4，在组培苗移栽的当天按照此行比播种父本种子，这样的处理可以使父、母本的花期相遇较好、使母本充分授粉、提高制种产量，选择这样的组培苗直接移栽大田：带4～8片展开绿叶，有3～8条根并且根长1cm以上，茎长2～3cm，苗色深绿、矮壮，注意组培苗不能接触底肥，移栽后马上浇定根水，用薄膜覆盖，保湿4～7天，10～15天后，按照4～6公斤尿素/亩的量将尿素溶于清粪水施加，20天重复施肥一次，此后常规管理。
杂交制种：用常规方法制得油菜杂交一代种子。
Claims (3)
1.一种油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种方法，包括组培苗的培育、移栽以及杂交制种步骤，以油菜雄性核不育系植株苔茎段为材料，切取其初花期时的上部分枝苔茎段，消毒切段后置于分化培养基中进行分化培养，切取分化培养出的不定芽接种于增殖培养基中增殖，将增殖的不定芽苗接种于生根培养基中进行生根培养，即得组培苗再生植株，移栽大田，播种父本，常规管理，杂交制种，即得，其特征在于：所述的组培苗在生根培养阶段的培养基中添加0.1～2mg/l的多效唑，选择这样的组培苗直接移栽大田：带4～8片展开绿叶，有3～8条根并且根长1cm以上，茎长2～3cm，苗色深绿、矮壮，所述大田的底肥选用农家肥和复合肥，父本和组培苗的行比设置为1∶3～4，组培苗移栽后的0～5天内播种父本，组培苗不能直接接触底肥，移栽后马上浇定根水，用塑料薄膜覆盖，保湿4～7天后逐步揭去薄膜，移栽后10～15天，按照4～6公斤尿素/亩的量将尿素溶于清粪水施加，此后常规管理，制种即得。
2.按照权利要求1所述油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种方法，其特征在于：所述的大田底肥是由25公斤/亩复合肥和1000公斤/亩农家肥混合而成。
3.按照权利要求1所述油菜苔茎段组培快繁雄性核不育系制种方法，其特征在于：在第一次施加尿素后的20～30天重复施肥一次。
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