CN101260436B - 一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法 - Google Patents
一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，包括下述步骤：(1)将正癸烷与N，N-二乙基苯胺混合；(2)将卵磷脂和胆固醇加入到步骤(1)制成的溶液中；(3)将ssDNA溶解于乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐咪唑溶液中；(4)将步骤(2)制成的溶液与步骤(3)制成的溶液混合，充分震荡5分钟后静止分层，上层溶液即一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液。本发明在双层类脂膜形成之前先将ssDNA探针引入成膜液中，ssDNA的探针与双层类脂膜的形成一步完成，不仅保证了双层类脂膜的稳定性，而且ssDNA探针每次的固定化量相同，保证了方法的重复性与稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种双层类脂膜成膜溶液的制备方法，特别是涉及一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法。
背景技术
双层类脂膜(BLM)是双分子层超薄度(厚度小于10nm)和两个有各向异性又相互联结的脂质界面。它具有与生物膜相似的厚度、电化学性质、渗透性和可激发性。在分子结构上具有亲水部分或极性头(polar head)和疏水部分或称非极性尾(nonpolar tail)。两亲化合物在水介质中的定向分布，导致膜脂装配成表面是亲水部分，内部是疏水部分的脂质双分子层。从生物相容性来看，BLM有很大优越性。在其它反应体系中的活性物质多被固定在刚性的类似固体体系中，在BLM中活性物质是被镶嵌于其中的，镶嵌意味着BLM中感兴趣的物质(即膜修饰物，如多肽、蛋白质、电子受体、供体、组织或整个细胞)是相对自由地顺应它的周围环境，同时BLM的存在极大地降低了界面的背景噪音。
目前报道的双层类脂膜主要有平板双层类脂膜(P-BLM)，金属支撑的双层类脂膜(s-BLM)，盐桥支撑的双层类脂膜(sb-BLM)及微滤膜支撑的双层类脂膜(filter-BLM)。其中平板双层类脂膜的通透性最好，存在状态也最接近真实的生物膜，但机械稳定性差，许多研究难以进行。金属支撑的双层类脂膜的稳定性虽然很好，但由于膜的一侧为金属材料，使得膜的通透性很差，不能用于膜通道等方面的研究。sb-BLM和filter-BLM稳定性和通透性介于两者之间，弥补了这方面的缺陷。将具有电子传递功能的化合物嵌入sb-BLM中，修饰后的sb-BLM可以作为电极使用，与其它电极组合，形成一个固体支撑的双层脂膜研究体系，该体系既能保持双层脂膜的自组装、超薄、易于形成等优点，又具有较好的稳定性，应用电化学手段，可以获取有关电子跨膜传递的重要信息。
基于BLMs表面核酸探针的固定化已有很多报道，目前国内外采用的方法均是BLM形成后，将ssDNA进行修饰，利用修饰物与膜之间的疏水作用或静电作用将ssDNA分子固定到BLMs上。Nikolelis等终端带有一个C16烷烃链的ssDNA(dT20)可嵌入s-BLM中作为核酸探针，由于C16烷烃链与成膜的磷脂分子的脂肪烃链之间的疏水作用和静电作用，dT20-C16与BLM有较高的结合常数，核酸探针的吸附使BLM与溶液界面的负表面电位增加，进而使膜表面的阳离子数量增加，跨膜电流增加。
本研究室也在文献报道的基础上进行了相关的研究，利用C12对设计的ssDNA进行修饰，研究结果表明：在BLMs表面固定C12修饰的ssDNA探针后，可使膜电流从十几PA增加到几百PA。虽然将ssDNA进行修饰在一定程度上能够提高固定化效果，但经过C12修饰的ssDNA价格较高，固定化效果也不十分理想，由于成膜与修饰分步进行，很难保证方法的重复性，这也限制了BLM在DNA检测领域的进一步应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，包括下述步骤：
(1)按体积比3∶1的比例将正癸烷与N，N-二乙基苯胺混合配成溶液；
(2)将卵磷脂和胆固醇加入到步骤(1)制成的溶液中，使卵磷脂的终浓度为0.016mg/L，使胆固醇的终浓度为0.004mg/L；
(3)将ssDNA溶解于0.1mol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐咪唑溶液中，使ssDNA的终浓度为1-5.0OD；
(4)按体积比为1∶1的比例将步骤(2)制成的溶液与步骤(3)制成的溶液混合，充分震荡5分钟后静止分层，上层溶液即一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液。
优选的是所述ssDNA的终浓度为2.5OD。
本发明的方法通过对成膜溶液的修饰，采用共价结合的方法，在双层类脂膜形成之前先将ssDNA探针引入成膜液中，ssDNA的探针与双层类脂膜的形成一步完成，不仅保证了双层类脂膜的稳定性，而且ssDNA探针每次的固定化量相同，保证了方法的重复性与稳定性。
附图说明
图1为本发明方法制备的一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液固定化效果时间-电流曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，包括下述步骤：
(1)按体积比3∶1的比例将正癸烷与N，N-二乙基苯胺混合配成溶液；
(2)将卵磷脂和胆固醇加入到步骤(1)制成的溶液中，使卵磷脂的终浓度为0.016mg/L，使胆固醇的终浓度为0.004mg/L；
(3)将ssDNA溶解于0.1mol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐咪唑溶液中，使ssDNA的终浓度为5.0OD；
(4)按体积比为1∶1的比例将步骤(2)制成的溶液与步骤(3)制成的溶液按混合，充分震荡5分钟后静止分层，上层溶液即一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液。
实施例2
一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，包括下述步骤：
(1)按体积比3∶1的比例将正癸烷与N，N-二乙基苯胺混合配成溶液；
(2)将卵磷脂和胆固醇加入到步骤(1)制成的溶液中，使卵磷脂的终浓度为0.016mg/L，使胆固醇的终浓度为0.004mg/L；
(3)将ssDNA溶解于0.1mol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐咪唑溶液中，使ssDNA的终浓度为1.0OD；
(4)按体积比为1∶1的比例将步骤(2)制成的溶液与步骤(3)制成的溶液按混合，充分震荡5分钟后静止分层，上层溶液即一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液。
实施例3
一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，包括下述步骤：
(1)按体积比3∶1的比例将正癸烷与N，N-二乙基苯胺混合配成溶液；
(2)将卵磷脂和胆固醇加入到步骤(1)制成的溶液中，使卵磷脂的终浓度为0.016mg/L，使胆固醇的终浓度为0.004mg/L；
(3)将ssDNA溶解于0.1mol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐咪唑溶液中，使ssDNA的终浓度为4.0OD；
(4)按体积比为1∶1的比例将步骤(2)制成的溶液与步骤(3)制成的溶液按混合，充分震荡5分钟后静止分层，上层溶液即一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液。
实施例4
一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，包括下述步骤：
(1)按体积比3∶1的比例将正癸烷与N，N-二乙基苯胺混合配成溶液；
(2)将卵磷脂和胆固醇加入到步骤(1)制成的溶液中，使卵磷脂的终浓度为0.016mg/L，使胆固醇的终浓度为0.004mg/L；
(3)将ssDNA溶解于0.1mol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐咪唑溶液中，使ssDNA的终浓度为2.5OD；
(4)按体积比为1∶1的比例将步骤(2)制成的溶液与步骤(3)制成的溶液按混合，充分震荡5分钟后静止分层，上层溶液即一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液。
实施例5
1琼脂支撑(Sb)-BLMs的制备过程
第一步：将8～10cm长、直径为0.3mm的银丝和6cm长、直径为0.8mm的聚四氟乙烯管分别用洗涤剂，水和去离子水洗净，干燥，并将银丝的一部分绕成螺旋状，其直径和长度分别略小于0.8mm和4cm；
第二步：将银丝的螺旋状部分插入聚四氟乙烯管中；
第三步：将琼脂溶液煮沸融化，然后，用注射器将热的琼脂溶液灌入包括有银丝的聚四氟乙烯管中，冷却，浸泡在0.1mol/L KCl溶液中，得到sb电极备用；
第四步：将sb电极的琼脂端切出一个新鲜表面，立即将其放入实施例1制备的连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液中5分钟，然后移入电解液中，将该电极的金属丝一端和参比电极与测试仪器连接，测定膜电流和膜电位-电流关系，大约10分钟，双层类脂膜形成后，即可用于反应体系的测定。
观察ssDNA探针的固定化效果，如图1所示，图1中采样间隔：0.1S，a为实施例4制得成膜溶液的电流-时间曲线；b为乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)咪唑溶液与含有N，N-二乙基苯胺(NNA)的溶液充分反应后制得成膜溶液的电流-时间曲线。
从图1可以看出，在相同条件下，引入了ssDNA之后的成膜溶液其膜电流大大增加，这与文献报道相一致，由于ssDNA在BLM上的镶嵌，使膜电阻降低，膜电流增加。
Claims (2)
1.一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，其特征是包括下述步骤：
(1)按体积比3∶1的比例将正癸烷与N，N-二乙基苯胺混合配成溶液；
(2)将卵磷脂和胆固醇加入到步骤(1)制成的溶液中，使卵磷脂的终浓度为0.016mg/L，使胆固醇的终浓度为0.004mg/L；
(3)将ssDNA溶解于0.1mol/L的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐咪唑溶液中，使ssDNA的终浓度为1-5.0OD；
(4)按体积比为1∶1的比例将步骤(2)制成的溶液与步骤(3)制成的溶液混合，充分震荡5分钟后静止分层，上层溶液即一种连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液。
2.根据权利要求1所述的连接有ssDNA探针的双层类脂膜成膜溶液的制备方法，其特征是所述ssDNA的终浓度为2.5OD。
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