CN101255416B - 从毛发提取生物物质的方法和用于该方法的毛发取样装置 - Google Patents

Abstract

本发明披露一种从毛发的毛根提取生物物质的方法，该方法包括下述步骤：使用需要以至少为预定基准值的拉力拔出的毛发。

Description

从毛发提取生物物质的方法和用于该方法的毛发取样装置

技术领域

本发明涉及从毛根提取生物物质(biosubstance)的方法。更具体而言，本发明涉及从以至少为预定基准值的拉力拔出的毛发的毛根提取生物物质例如RNA、DNA、蛋白质或元素的方法，以及用于所述方法的毛发取样装置。

背景技术

近来，由DNA微阵列(DNA microarray)进行的各种基因表达分析(geneexpression analyse)广泛用于解释各种疾病的分子机理以及研究疾病标记(disease marker)和药物靶标(drug target)。

对于DNA微阵列，首先从样品组织或样品细胞中提取RNA，然后使用RNA作为模板利用反转录酶合成cDNA。合成时，利用荧光物质例如Cy3或Cy5对cDNA进行标记，随后使标记cDNA与固定在微阵列上的探针DNA杂交。根据杂交cDNA发出的荧光信号，对表达基因进行分析。

过去，认为DNA微阵列需要大量RNA(数量级达几微克)来制备上述标记cDNA。因而，分析对象限于较大的组织片段和大量细胞，难以分析微小的组织片段和少量细胞例如活检样品(biopsy sample)。

然而，近年来，已开发出高灵敏度DNA微阵列，从而允许检测毫微克级的基因样品，从而还可对微量样品例如微小的组织片段和少量细胞进行基因表达分析。此外，在基因多态性分析、蛋白质组分析等中进行微量样品分析(micro-volume sample analyse)逐渐成为可能。

由于容易进行实际的临床采样，此外还能够积累样品及其分析数据并建立快速诊断方法，使得所述微量样品分析日益受到关注。

例如，在基因多态性分析中，目前为止，需要采集约10mL血样以采集血液中的白细胞，溶解白细胞以提取DNA，通过PCR扩增DNA，然后进行基因多态性分析。然而，目前，以全自动方式从微量样品(例如通过轻刺指尖得到的血滴或者通过刮取口黏膜采集到的极微小的黏膜片)提取DNA、扩增DNA、甚至判定DNA基因型的系统已投放市场。

随着对来自所述微量样品的生物物质例如RNA、DNA、蛋白质和元素的分析日益增多，除上述血滴和口黏膜之外，以毛发作为样品正日趋受到关注。毛发可非侵袭性地且简便地采集或取样，而不会对样品提供者(患者)造成强烈的肉体或精神痛苦或负担。因而，为了普及定制医疗，例如通过基因的单碱基多态性分析诊断药物过敏性，期望以毛发作为提取生物物质的合适来源。

作为诊断身体状况紊乱的方法，已开发出检测毛根中所含元素的方法(见特开2004-45133号公报，此后称为专利文献1)。

此外，特开2005-192409号公报(此后称为专利文献2)披露了恢复毛发例如毛发RNA的方法，所述方法如下：将毛发拔出后立即利用液氮将其冷冻至超低温，使冷冻毛发与RNA提取试剂接触，然后对所得毛发进行涡流搅拌处理(vortex agitation processing)以提取RNA。

发明内容

上述专利文献1中披露的诊断方法可通过检测毛根中所含的元素简便地诊断身体状况的紊乱。另一方面，专利文献2中披露的RNA提取方法可以高产率、高纯度简便地从毛发中提取RNA。

然而，还没有有关提取生物物质(例如RNA、DNA、蛋白质或元素)所用毛发的合适条件的研究。

已知毛发重复所谓的“毛发周期”(hair cycle)，所述周期由三个阶段组成，即生长期(anagen phase)、退化期(catagen phase)和休止期(telogen phase)。根据所用毛发所处的阶段，毛根状况差异巨大。从毛根提取的生物物质例如RNA、DNA、蛋白质或元素的数量和质量随毛根状况而发生变化。这些变化将成为难以保证利用这种生物物质的分析结果的重复性的因素。

另外，为避免生物物质在数量和质量方面的变化，采集毛发或对毛发进行取样时，可能不必要地拔出大量毛发，或者不得不再次对样品提供者(患者)进行毛发采集或取样。如此效率低且对样品提供者造成不便和负担。

因而，本发明的目的是提供从拔出毛发中数量和质量均稳定地提取生物物质例如RNA、DNA、蛋白质或元素的方法和用于该方法的毛发取样装置。

为实现上述目的，本发明提供从毛根提取生物物质例如RNA、DNA、蛋白质或元素的方法，该方法包括使用以至少为预定基准值的拉力拔出的毛发作为所述毛发。作为基准值，50g是优选的。本发明还提供用于拔出毛发的毛发取样装置，该装置包括夹持毛发的设备和测量拔出毛发时作用于毛发的拉力的设备。

所述毛发取样装置还可包括规定毛发相对于体表的拔出方向的设备或能够放大观察拔出毛发的毛根形状的设备。

所述毛发取样装置还可包括采集拔出毛发的毛根图像信息的设备和根据采集设备采集到的毛根图像信息判定拔出毛发的毛根形状的设备。

所述毛发取样装置还可包括存储预先采集的基准毛根图像信息的存储设备，其中判定设备根据由采集设备采集到的毛根图像信息和基准毛根图像信息之间的比较来判定毛根形状。

在上述毛发取样装置中，判定设备可通过检测毛根外形轮廓上的拐点并统计拐点数进行比较。

在本发明中，术语“毛发”是指覆盖人类或非人类动物皮肤(体表)的所有毛发。以人类为例，术语“毛发”包括头部毛发、面部毛发、臂部和腿部毛发等。另一方面，如本申请所用，术语“毛根”是指每根毛发埋在体表下侧的端部。拔出毛发的毛根可附带形成内毛根鞘(inner root sheath)、外毛根鞘(outer root sheath)、毛乳头(papilla)等的细胞群(island)。

采用本发明的生物物质提取方法可同时以稳定的数量和质量从毛发中提取生物物质例如RNA、DNA、蛋白质或元素。本发明的毛发取样装置适用于所述提取方法。

附图说明

图1显示皮肤截面的示意图以说明毛发周期；

图2为从随机拔出的毛发提取的RNA量的示意图；

图3A、3B和3C为显示本发明第一实施方案的毛发取样装置不同工作阶段的截面图；

图4为显示本发明第二实施方案的毛发取样装置的前视图；

图5A为显示本发明第三实施方案的毛发取样装置中的夹具(chuckassembly)的放大前视图，图5B为图3A～3C所示毛发取样装置中的夹具的放大前视图，图5C为毛发生长方向与体表之间角度的示意图；

图6A显示利用图3A、3B和3C所示毛发取样装置拔出的毛发的毛根放大图，图6B显示利用图5A所示毛发取样装置拔出的毛发的毛根放大图；

图7为本发明第四实施方案的毛发取样装置的前视图；

图8为本发明第五实施方案的毛发取样装置的概念图；

图9为显示图8所示毛发取样装置中的判定区的判定程序流程图；

图10A显示由图8所示毛发取样装置中的采集区在图9所示步骤S 1中获得的毛根图像，图10B显示由图10A所示毛根图像勾画出的毛根外形轮廓及其拐点；

图11显示由图8所示毛发取样装置中的采集区在图9所示步骤S1中获得的另一毛根图像。图11B显示由图11A所示毛根图像勾画出的毛根外形轮廓及其拐点；

图12A～12F为试剂盒用于从拔出毛发提取生物物质的不同阶段的示意图；

图13为拔出毛发所需的拉力和RNA提取量之间的关系图；

图14A～14C分别图示从拔出时所用拉力不同的多组毛发中提取的RNA的电泳谱图；

图15显示分别使用从图13A组中的毛发和对照组中的毛发提取的RNA得到的GAPDH基因的基因表达分析结果；

图16A显示在不改变毛发生长方向与体表之间角度的情况下所拔出的毛发的毛根放大图，图16B显示没有以特定角度拔出的毛发的毛根放大图，图16C为从毛根提取的RNA溶液的浓度列表；

图17A(D1～D4)显示外形轮廓各自具有三个或以上拐点的毛根的图像，图17B(E1～E4)显示外形轮廓各自具有两个或以下拐点的毛根的图像；和

图18A和18B(D1～E4)分别图示从图17所示的D组和E组毛根中得到的RNA的电泳谱图。

具体实施方式

如上所述，根据毛发所处的毛发周期(生长期、退化期和休止期之一)，从毛根提取的生物物质例如RNA、DNA、蛋白质或元素的数量和质量明显不同。

参考图1，现将对毛发结构和毛发周期进行说明。

图1显示皮肤截面的示意图。毛发由露出皮肤的毛干、处于真皮中的毛根以及毛乳头细胞(图1中标记a)和毛母质细胞(hair matrix cell)(图1中标记b)组成，所述毛乳头细胞和毛母质细胞均作为毛根的形成源。

毛发周期分为三个阶段，包括生长期(I)、退化期(II)和休止期(III)。在生长期(I)中，由毛乳头细胞a向毛母质细胞b提供营养，使毛母质细胞b旺盛地分裂。分裂的毛母质细胞b转变为毛细胞并角质化，相继形成的毛细胞推动分裂的毛母质细胞b形成毛发。

当毛发周期随后进入退化期(II)时，毛母质细胞b停止分裂。当毛发周期进一步发展进入休止期(III)时，毛乳头细胞a停止向毛母质细胞b提供营养，毛母质细胞b程序性死亡，最终毛发脱落。经过一定时间的休止期(III)之后，毛发周期再次进入生长期(I)。

如上所述，在毛发周期的生长期(I)，毛根处的细胞分裂最为旺盛且毛根处存在的细胞量最大。因而，从毛根提取生物物质时，希望从处于生长期(I)的毛发进行提取，从而可同时以充分的数量和质量提取生物物质。

如果从处于退化期(II)或休止期(III)的毛发的毛根提取生物物质，在该阶段毛根细胞处于停止分裂的状态，例如对于RNA而言，在该阶段毛根细胞处于转录活性极低的状态，从而可能无法提取足量的RNA。

图2示例将毛发随机拔出时从各毛发的毛根提取的RNA量。在图2中，横坐标表示各毛发的样品编号，纵坐标表示由各样品制得的RNA溶液的浓度(ng/根)。随后将在本申请中对本发明的RNA提取方法进行详细说明。

分别由样品编号为1～12的毛发制得的RNA溶液的浓度由数ng/根至40ng/根明显变化。因而应当认识到，可能无法从随机拔出的毛发中提取稳定量的RNA。

本发明人进行了广泛的研究以消除这种变化。从而发现，通过选择以至少为预定基准值的拉力拔出的毛发的毛根，然后进行生物物质的提取，可同时以稳定的数量和质量获得生物物质。

如上所述，在退化期(II)或休止期(III)，毛母质细胞b停止分裂并程序性死亡，从而毛发处于极易脱落的状态。相反，在生长期(I)，毛母质细胞b旺盛地分裂，使得毛根处于充满细胞的状态，从而毛发难以脱落。因而，与处于退化期(II)或休止期(III)的毛发相比，处于生长期(I)的毛发需要较大的拉力将其拔出。换言之，认为以至少为预定基准值的拉力拔出的毛发为处于生长期(I)的毛发，从而认为选择这种毛发可同时以稳定的数量和质量获得生物物质。

该方法可用于覆盖人类或非人类动物皮肤的所有毛发，特别是，适用于人类毛发。通过将取样位置的毛发整体剃下之后选择新生毛发，可更可靠地获得处于生长期(I)的毛发。

可根据动物物种或应用本发明的毛发部位，适当地设定预定基准值，所述预定基准值可使处于生长期(I)的毛发区别于处于退化期(II)或休止期(III)的毛发。发现，当本发明的方法应用于人类毛发时，通过将基准值设为50g，可同时优化所提取的生物物质的数量和质量。

应当注意的是，将上述基准值设定为过大值通常可导致毛发的毛干劈裂或对毛根造成损伤，从而可使毛乳头细胞(见图1中的标记a)保留在皮肤侧，从而造成可能无法很好地从毛根提取生物物质的潜在问题。

本发明还提供毛发取样装置，该装置用于选择性采集以大小为预定基准值的拉力拔出的毛发。

此后将参考附图对本发明的毛发取样装置的特定优选实施方案进行说明。应当注意的是，此后将要说明的实施方案以实施例的方式示例本发明的特定代表性实施方案，不应以所述实施方案狭义地解释本发明的范围。

图3A～3C为本发明第一实施方案的毛发取样装置处于不同工作阶段的截面图。

在图3A中，示为标记A的毛发取样装置装配有外筒1、所述外筒内可沿箭头P所指方向移动的内筒2和作为用于夹持毛发的部分的夹具3。毛发取样装置A将以标记H表示的毛发夹持在夹具3处，并将所述毛发从体表T拔出。为在下述生物物质提取过程中便于以简单的方式进行作业，可优选将夹具3设计为使用强磁体等以可拆卸的方式与内筒2相连。在该图中，将外筒1、内筒2和夹具3示例为金属制部件。然而，所述材料并不限于金属，作为替换性方案，它们可由树脂制造。应当注意的是，对本发明中各部件的材料没有特殊限定，除非另作具体说明。

当通过夹具3夹持毛发H时，希望夹持毛发H距体表10mm以内的部位。由此可避免毛发H的毛干劈裂或者避免损伤毛根。

毛发取样装置A还装配有外筒弹簧5，其作为用于测量拔出毛发H时作用于夹具3的拉力的部分。外筒弹簧5连接内筒2与位于外筒1相对端的弹力调整螺栓4，并产生以箭头Q₀表示的回复力。外筒1设置有内筒止动板11，从而，在初始状态，回复力Q₀使内筒止于内筒止动板11。应当注意的是，外筒弹簧5可采用能够产生回复力Q₀的各种弹性部件中的一种取代弹簧。这同样适用于本申请随后将要说明的内筒弹簧21。

当由毛发取样装置A拉拔毛发H时，拉力F作用在夹具3和内筒2上。

当拉力F小于外筒弹簧5作用在内筒2上的回复力Q₀即F＜Q₀时，夹具3和内筒2保持上述初始状态(止于内筒止动板11的状态)。

换言之，当毛发H处于易于拔出的状态且拔出毛发所需的拉力F小于回复力Q₀(F＜Q₀)时，毛发H被拔出，而夹具3和内筒2保持上述初始状态(止于内筒止动板11的状态)。

另一方面，当毛发H处于难以拔出的状态且拉力F大于回复力Q₀即F＞Q₀时，夹具3和内筒2被拉力F牵引并沿箭头P所指的方向移动。此时夹具3和内筒2的移动造成外筒弹簧5拉伸，使得回复力从初值Q₀提升至Q₁(Q₁＞Q₀)(见图3B)。

应当注意的是，通过内筒弹簧21与内筒2内壁相连的止动器22设置在内筒2中。内筒弹簧21产生的回复力q使止动器22通过开在内筒2壁上的止动窗23紧压外筒1。另外，外筒1内壁上设置有可固定止动器22的凹处12。

如图3C所示当拉力F使夹具3和内筒2沿箭头P所指的方向移动时，在回复力q施加的压力下，止动器22与凹处12啮合，从而限制(锁定)内筒2和夹具3沿箭头P所指的方向移动。

现假设此时与施加在内筒2和夹具3上的拉力F对抗的外筒弹簧5回复力为Q_s，可认为基于回复力(Q₀，Q₁，Q_s)，外筒弹簧5表现出测量下限Q₀至上限Q_s范围内的拉力F的功能。

如图3C所示一旦将内筒2和夹具3锁定，夹具3克服回复力Q_s并产生拔出毛发H所需的拉力F。

换言之，当需要大于回复力Q_s的拉力F来拔出毛发H时，通过止动器22将夹具3和内筒2锁定，然后将毛发H拔出。另一方面，当以不大于回复力Q_s的拉力F拔出毛发H时，回复力Q₁使夹具3和内筒2返回初始状态(止于内筒止动板11的状态)而不被锁定。

如上所述，将通过止动器22锁定作为指标，毛发取样装置A可仅选择以等于或大于预定基准值(＝回复力Q_s)的拉力F拔出的毛发H。应当注意的是，通过弹力调整螺栓4可使回复力Q_s增大或减小并可根据将要拔出的毛发H的位置等使回复力Q_s适当地变化。

图4为本发明第二实施方案的毛发取样装置的前视图。

图4中以标记B表示的毛发取样装置在外筒1内装配有力敏传感器元件(force sensor unit)(未示出)，作为用于测量拔出毛发H时作用于夹具3的拉力的部分，并且在外筒1表面上还装配有显示器件13。当毛发取样装置3拉拔夹持在夹具3上的毛发H时，通过力敏传感器元件测量作用于夹具3的拉力F并在显示器件13上显示拉力F数值。

如上所述，可认为以预定基准值或以上的拉力拔出的毛发是处于生长期(I)的毛发(见图1)。选择这种毛发使得可以稳定的数量和质量获得生物物质。然而本发明人发现，如果以远大于预定基准值的过大拉力拔出毛发，则毛发在毛干处劈裂或者对毛根造成损伤而将毛母质细胞(见图1中的标记b)留在皮肤侧，使从毛根中提取生物物质变得劣化。因而，对于拉力基准值，除下限以外，还希望设定上限。

对此而言，毛发取样装置B显示拔出毛发H所需的拉力F数值，因而可确定拉力F是否落在下限和上限之间。当拔出毛发H所需的拉力F落在预定下限和上限之间时，在显示器13上还可显示“合格”作为评定结果以更加易于确认。从而，利用毛发取样装置B，可更容易地选择适于提取生物物质的毛发。

图5A为本发明第三实施方案的毛发取样装置中夹具3的放大前视图。为了比较，将毛发取样装置A中的夹具3的放大前视图示于图5B。另外，图5C为毛发H生长方向与体表T之间角度的示意图。

图5A中表示为标记C的毛发取样装置装配有臂24，作为用于规定毛发H拔出方向相对于体表T的角度的部分。在该图中，将臂24设置为与内筒2相连。然而臂24可设置为与外筒相连(未示出)或与其它部件相连，而不限于如图所示的设置，因而对于臂24的设置没有特殊限制。

为从毛根稳定地提取生物物质，除了选择处于生长期(见图1)的毛发之外，还需避免上述过大的拉力对毛根造成的任何损伤。本发明人还发现根据毛发的拔出方向，毛根可能受到损伤，并且还发现在不改变毛发相对于体表的生长方向的情况下拔出毛发对于避免这种损伤是有效的。

即毛发取样装置C可在不改变毛发H相对于体表的生长方向的情况下拔出毛发H。

更具体而言，现假设在图5C中毛发H沿与体表T成α角的方向生长。如果通过未装配臂24的毛发取样装置A拔出毛发H，则体表T的一部分随毛发H一起拔起，使得毛发H相对于体表T的角度α由α变为β。

另一方面，在毛发取样装置C的情况下，臂24将体表T压住，使得可在保持与体表T的初始角度α而没有将体表T拉起的情况下将毛发H拔出。

此外，希望将臂24构造为支撑部分241和体表接触部分242经由铰链销243相互连接，根据毛发H和体表T的位置，适当地调节支撑部分241和体表接触部分242之间的角度γ。这种构造还有利于在保持与体表T的初始角度α的情况下将毛发H拔出。

图6A显示利用图3A、3B和3C所示毛发取样装置A拔出的毛发的毛根放大图像，图6B显示利用图5A所示毛发取样装置C拔出的毛发的毛根放大图像。图6B中的毛根端部(毛球(hair bulb))大于图6A中的毛根端部。因而，可推断图6B中的毛根毛球包含大量细胞(毛母质细胞(见图1中的标记b))。将在实施例中对从所述毛根提取生物物质的结果进行说明。

图7为本发明第四实施方案的毛发取样装置的前视图。

在图7中，以标记D表示的毛发取样装置装配有放大器6，作为用于放大观察拔出毛发的毛根形状的部分。利用毛发取样装置D，将毛发H拔出后，可通过设置在放大器6中的透镜61放大并观察夹持在夹具3上的毛发H的毛根h。从而，通过目视观测可确定拔出毛发的毛根h形状，如图6所示。

虽然在毛发取样装置D中设置了放大器6作为能够放大观察毛发H的毛根h形状的部分，但可设置显微镜等代替放大器6。通过利用显微镜等采集毛根图像信息、利用计算机程序自动判定毛根形状以及向实验员通报结果，可更简便地选择能够良好的提取生物物质的毛发。

图8为本发明第五实施方案的毛发取样装置的概念图。

在图8中，以标记E表示的毛发取样装置装配有采集毛根h的毛根图像信息的采集区81、存储预先采集的基准毛根图像信息的存储区82和根据所采集的毛根图像信息判定毛根h形状的判定区83。

由采集区81采集的毛根图像信息输出到判定区83。作为采集区81，可采用常用的图像采集设备例如CCD照相机。

由采集区81预先采集毛根图像信息之后进行生物物质的提取，将可获得良好提取结果的毛根的毛根图像信息(基准毛根图像信息)存储在存储区82中。将所存储的基准毛根图像信息输出到判定区83。

判定区83通过比较由采集区81输入的毛根图像信息和由存储区82输入的基准毛根图像信息判定毛根h的形状，并将判定结果输出到显示器件13(见图4)。虽然可将存储区82和判定区83构造成如图所示的分立单元，但可通过使用通用计算机构造成一体式单元。

可使用通用图像分析程序或其改进程序，通过判定区83在毛根h的毛根图像信息和基准毛根图像信息之间进行比较。例如可通过根据毛根图像信息检测毛根h外形轮廓上的拐点并统计拐点数进行比较，或者可通过计算毛根h的亮度进行比较。

此后将参考图9～图11B对通过检测毛根h外形轮廓上的拐点并统计拐点数判定毛根h形状的方法进行说明。

图9为图8所示判定区83的判定步骤流程图。

在步骤1(在图中表示为“S1”，此后将沿用该表示方式)，判定区83首先从采集区81获取毛根h的毛根图像信息。然后，在步骤S2中，根据毛根h的毛根图像信息，勾画出毛根h的外形轮廓，随后在步骤S3中，描出轮廓上的拐点，并在步骤S4中统计拐点数。

如本申请所用，术语“拐点”是指给定函数的凹凸发生变化的分界，换言之，是指给定函数的一阶微分函数的倾斜正负倒转的点。因而，在本发明中，术语“拐点”是指毛根h外形轮廓的凹凸发生变化的分界，即毛根h外形轮廓的切线的倾斜正负相反的点。

图10A～11B示例步骤S2和S3中勾画出的毛根外形轮廓及其拐点的具体实例。图10A和11A示出由采集区81采集的毛根图像，图10B和11B示出根据毛根图像勾画出的毛根外形轮廓和拐点。以标记r表示的拐点数在图10B中为5，在图11B中为1。

随后，判定区83采用与判定毛根h形状的方式相同的方式，对步骤S5中计算出的拐点数和由基准毛根图像信息计算出的拐点数基准值进行比较，并将判定结果输出到显示器件13(步骤S6)。

可根据所需生物物质的数量和质量，按照需要设定拐点的基准数。如随后在实施例中所描述的，本发明人发现，当毛根的拐点数多且毛根的外形轮廓限定复杂形状时，可提取良好的生物物质。当毛根h的拐点数多于拐点基准数时，判定区83输出如下判定结果：“该毛发适合用于提取生物物质”，并在显示器件13上作出相应的显示。相反，当毛根h的拐点数少于拐点基准数时，判定区83输出如下判定结果：“该毛发不适合用于提取生物物质”，并在显示器件13上作出相应的显示。

作为替换性方案，可通过计算毛根图像中的毛根h亮度在判定区83对毛根h的形状进行判断。

如本申请所用，术语“亮度”是指毛根图像中的明度差，具体而言是指最明亮拍摄区域和最暗拍摄区域的明度之比(明区/暗区)，这意味着明/暗比越大亮度越大。或者，还可将明/暗比定义为毛根图像中的高密度/低密度比(低密度区/高密度区)，可认为与最暗拍摄区的密度和最明亮拍摄区的密度之间密度差的大小含义相同。

如随后将在实施例中描述的，本发明人发现亮度高时可良好地提取生物物质。基于这种发现，可通过在判定区83中根据毛根图像信息计算亮度并对该亮度和由基准毛根图像信息计算出的基准亮度进行比较，判定毛根h的形状。

如上所述，通过自动判定毛根形状并显示判定结果，毛发取样装置E可更加正确地选择适合用于提取生物物质的毛发。

接着，将根据图12A～图12F对从拔出毛发提出生物物质的具体方法进行说明。

作为方便且可靠地从拔出毛发提取生物物质的试剂盒，本发明人设计出图12A～图12F所示的提取试剂盒。作为从毛发提取生物物质的相关问题，由于毛发在采集或取样之后处理困难，所以存在对毛根的损伤和提取作业过程中的污染造成的生物物质质量劣化。对于这些问题，即使通过上述方法采集到合适的毛发，分析结果有时仍不稳定。因而，本发明提供提取试剂盒，实验员可容易地使用该试剂盒并且该试剂盒能够可靠地收纳所采集或取样到的毛发的毛根。

此后将对如何使用所述提取试剂盒进行具体说明。将夹在取样装置A～D之一的夹具3上的毛发H与夹具3一起从内筒(未示出)上整体取下(见图12A)。如上所述，可优选使用强磁体等将夹具3设计为可从内筒2上拆卸下来，以便于提取过程中进行作业。显然还可在不拆卸夹具3的情况下进行作业。

然后，通过将毛发H推向塞71中部的方式，将夹持在夹具3上的毛发H插进塞71中形成的狭缝72(见图12B)。通过所述操作，能够可靠地提供用于提取作业的拔出毛发H。应当注意的是，在图12B中，(B₁)表示从狭缝72侧观察时的塞71的侧视图，(B₂)表示塞71的顶视图。

图12C所示的主体73装配有盖74并且内部充满提取溶剂75。当塞71和在先前的步骤中夹在狭缝71中的毛发H一起逐渐塞入主体73时，关闭狭缝72，使帽71更牢固地夹持毛发H并同时将提取溶剂75密封。此时，毛发H的毛根h浸在提取溶剂75中(见图12D)。

图12E所示，然后关闭塞71上的盖74，从而将盖71和提取溶剂75完全密封在主体73内，接着，将主体73倒转，使盖74变为底面(见图12F)。

主体73底壁设置有移液管尖端t的自由端可穿入的移液管插入部分76。因而，对提取试剂盒进行构造，使得可使用移液管搅拌和吸出提取溶剂75并可注入另一种试剂。

因此，可在主体73内实现从毛发h提取生物物质。例如，将可吸附核酸的树脂、二氧化硅球等引入提取溶剂75可使从提取溶剂75中的毛根h中溶出的核酸吸附在树脂、二氧化硅球等上。然后通过移液，具体而言通过吸出提取溶剂并注入洗涤液或再溶解溶剂，进行核酸的提取。

以下将对本发明的生物物质提取方法的效果进行研究。在生物物质例如RNA、DNA、蛋白质和元素等中，RNA尤其易于分解，使得难以对其进行处理。因而，提供大量优质RNA是影响实验重复性的重要因素。在实施例中，具体取RNA作为目标生物物质进行研究。

实施例

实施例1

有关拉力的研究

在该实施例中，对人类毛发进行研究，以确定拔出毛发所需的拉力与RNA提取数量和质量之间的关系。

从头后部两耳之间的区域，具体而言从头后部耳间中央(正中)的区域拔取毛发。按照提供的规程(见RNeasy micro.pdf，11-16页)，通过RNA提取试剂盒(“RNEASY MICRO KIT”(商品名)，Qiagen制造)，由拔出毛发的毛根制备总RNA(此后简称为“RNA”)溶液。使用“AGILENT RNA 600 NANOKIT”(商品名，Agilent Technologies制造)，通过“BIOANALYZER 2100”(商品名，Agilent Technologies制造)测定RNA的浓度。遵照制造商提供的规程(见RNA6000 nano.pdf)。

结果如图13所示，其中横坐标表示拔出每根毛发所需的拉力(g)，纵坐标表示从毛发提取的RNA溶液的浓度(ng/根)。

对于所需拉力为50g或以上的毛发(图中A组)，提取出浓度为40ng/根或以上的高浓度RNA溶液。另一方面，对于所需拉力为35～40g(B组)的毛发和所需拉力小至5g的毛发(C组)，所得RNA溶液的浓度低至25ng/根或更低。应当注意的是，对于C组，使用手指梳理毛发时脱落的那些毛发，把这些毛发作为用5g拉力拔出的毛发。

由上可知，通过使用50g的拉力作为基准值并从以基准值或更大拉力拔出的毛发的毛根提取RNA，可稳定地制备高浓度RNA溶液。

接着，对从A组～C组毛发提取的RNA的质量进行研究。

如上所述，RNA极不稳定且易于分解。在分解的RNA中，信使RNA(mRNA)也被切断。当通过逆转录酶由mRNA合成cDNA时，出现的问题在于可能无法合成cDNA或者仅能够合成短片段cDNA。在这种情况下，难以实现利用cDNA的基因表达分析。

作为判定RNA质量的方法，过去采取对RNA进行电泳分离，然后确定核糖体RNA(18sRNA和26sRNA)的电泳条带。对于已发生分解的RNA，核糖体RNA的电泳条带减少或消失。另一方面对于未分解的优质RNA，可清晰地确认核糖体RNA的电泳条带。

使用“RNA 6000 NANOKIT”(商品名，Agilent Technologies制造)，分别电泳分离从A组～C组毛发提取的RNA溶液，并通过“BIOANALYZER2100”(商品名，Agilent Technologies制造)测量各自的核糖体RNA(18sRNA和26sRNA)电泳条带强度。遵照制造商提供的规程(见RNA6000 nano.pdf)。

结果如图14A～14C所示，在所述各图中，横坐标表示电泳时间(秒)，纵坐标表示条带强度(荧光单位(FU))。

图14A示出从图13中A组(需要以50g或以上的拉力拔出的毛发)提取的RNA的电泳谱图。在电泳时间约为35s处，检测到属于18sRNA的高强度(4FU或以上)条带(见图中^*)。类似地，在电泳时间约为40s处，观察到属于26sRNA的高强度条带(见图中^**)。

另一方面，对于从图13中B组(需要以35～40g的拉力拔出的毛发)提取的RNA，观察到分别属于18sRNA和26sRAN的条带峰，但它们的荧光强度明显低于A组条带的荧光强度，具体而言属于18sRNA的条带的荧光强度低至约2FU(见图14B，注意纵坐标方向的比例)。由此说明与A组相比B组中发生更多地RNA分解。

对于从图13中C组(需要以5g的拉力拔出的毛发)提取的RNA，未观察到属于18sRNA和26sRNA的条带，并且未能通过电泳检测到属于RNA本身的任何荧光(见图14C)。

由上可知，通过使用50g拉力作为基准值并从以基准值或更大拉力拔出的毛发的毛根中提取RNA，可稳定地制备高质量的RNA溶液。

接着，使用从图13中A组(需要以50g或以上的拉力拔出的毛发)提取的RNA，对基因表达分析结果的重复性进行研究。

使用从与A组相同的位置随机拔出的毛发作为对照组。通过上述方法从A组毛发和对照组毛发中提取RNA，通过本领域公知的方法利用逆转录酶合成cDNA，并测定GAPDH基因的表达量。公知GAPDH基因为所谓的“家务”基因，并在基因表达分析中用作基因表达量的指标。

结果如图15所示，其中横坐标表示A组和对照组毛发的样品编号，纵坐标表示各样品中的GAPHD基因相对表达量。

应当理解的是，与以实心菱形表示的对照组相比，图中以实心圆圈表示的A组GAPDH基因表达量的最大值和最小值之差较小且变化较小。因而，在A组各样品中以高的重复性，成功量化了GAPDH基因的表达量。

由上可知，显然使用50g的拉力作为基准值并从以基准值或更大的拉力拔出的毛发的发根中提取RNA，可实现高重复性的基因表达分析。

实施例2

有关拔出方向和毛根形状的研究

在该实施例中，对毛发拔出方向相对体表的角度与拔出毛根的形状和RNA提取数量、质量之间的关系进行研究。

图16A示出了使用规定毛发拔出方向与体表之间角度的部分，在不改变毛发生长方向与体表之间角度的情况下拔出的毛发的毛根放大图，图16B示出了以未规定角度拔出的毛发的毛根放大图，图16C为分别从所述毛发提取的RNA溶液的浓度列表。

图16B中的毛根端部(毛球)大于图16A中的毛根端部。因而，可推断图16B所示的毛根中含有大量细胞(毛母质细胞(见图1标记b))。

对于从所述毛根提取的RNA量，如图16B所示从以规定角拔出的毛发中提取的RNA量为93.93ng/根，如图16A所示明显大于从以未规定角度拔出的毛发中提取的RNA量(40.14ng/根)。

由上可知，通过利用规定毛发拔出方向与体表之间角度的设备拔出毛发，提高了由毛根提取的RNA量。

图17A(D1～D4)示出了拔出毛发的毛根图像，其中每根毛发的外形轮廓上具有三个或以上拐点(D组)，图17B(E1～E4)示出了拔出毛发的毛根图像，其中每根毛发的外形轮廓具有两个或以下拐点(E组)。应当注意的是，拔出时E4所示的毛发在毛干处折断。

表1列出了从D组和E组毛发提取的RNA的数量和质量。以按照实施例1所述的工艺制备的相应RNA溶液的浓度(pg/μL)表征各RNA量。应当注意的是无法从E4所示的毛发提取RNA。

按照与实施例1相同的方式，由进行RNA电泳并测量电泳条带强度得到的核糖体RNA(26sRNA/18sRNA)的存在比例，表征各RNA质量。图18A和18B(D1～E4)示例各样品的电泳谱图。26sRNA/18sRNA越大，RNA的质量越好。应当注意的是，对于E组，所提取的RNA量过少而无法评价其质量。

表1

样品	RNA量(pg/μL)	RNA质量(26s/18s)
			D1	551	2.0
D2	368	1.5
			D3	513	1.7
D4	302	1.7
			E1	47	-
E2	55	-
			E3	9	-
E4	-	-

如表1所示，可判定与从每根具有两个或以下拐点的E组毛根提取的RNA相比，从每根具有三个或以上拐点的D组毛根提取的RNA的数量和质量均良好。由此说明可从外形轮廓上拐点数较多且形状较复杂的毛根中提取出较好的生物物质。

由图17A和17B(D1～E4)可知，D组毛根的亮度大于E组毛根的亮度(明/暗比或高/低密度比)。因而，说明可从亮度较高的毛根中提取出较好的生物物质。

本发明的活体提取方法可用于使用微量样品的各种分析例如基因表达分析、基因多态性分析和蛋白质组分析，并有助于解释病理、研究药物靶标等。另一方面，本发明的毛发取样装置便于临床采集毛发，因而有助于积累分析数据并基于所述分析数据建立诊断方法。

本领域技术人员应当理解的是，在所附权利要求或其等价物的范围内，可根据设计需求和其它因素进行各种改进、组合、亚组合和改变。

相关申请的交叉引用

本发明包含与于2007年3月1日提交于日本专利局的特愿JP2007-051449和于2007年9月20日提交于日本专利局的特愿JP2007-243237相关的主题，在此引入其全文作为参考。

Claims (9)

1.一种从毛发的毛根提取生物物质的方法，其包括下述步骤：

使用以至少为预定基准值的拉力拔出的毛发作为所述毛发；

采集所述拔出的毛发的毛根图像信息；

根据采集到的毛根图像信息判定所述拔出的毛发的毛根形状；

进行所述生物物质的提取，其中所述生物物质选自RNA(核糖核酸)、DNA(脱氧核糖核酸)、蛋白质或元素。

2.权利要求1的方法，其特征在于，其中所述基准值为50g。

3.一种用于拔出毛发的毛发取样装置，其特征在于，其包括：

夹持所述毛发的设备，和

测量拔出所述毛发时作用于该毛发的拉力的设备。

4.权利要求3的毛发取样装置，其特征在于，其还包括：

规定所述毛发相对于体表的拔出方向的设备。

5.权利要求3的毛发取样装置，其特征在于，其还包括：

能够放大观察所述拔出毛发的毛根形状的设备。

6.权利要求3的毛发取样装置，其特征在于，其还包括：

采集所述拔出毛发的毛根图像信息的采集设备，和

根据由所述采集设备采集到的毛根图像信息判定所述拔出毛发的毛根形状的判定设备。

7.权利要求6的毛发取样装置，其特征在于，其还包括：

存储预先采集的基准毛根图像信息的存储设备，

其中所述判定设备根据由所述采集设备采集到的毛根图像信息和所述基准毛根图像信息之间的比较判定所述毛根形状。

8.权利要求7的毛发取样装置，其特征在于，其中所述判定设备通过检测所述毛根外形轮廓上的拐点并统计所述拐点数进行所述比较。

9.一种用于拔出毛发的毛发取样装置，其包括：

用于夹持所述毛发的部分，和

用于测量拔出所述毛发时作用于所述毛发的拉力的部分。

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