CN101255404A - 一种产麻黄碱的细菌及其生产的麻黄碱 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)CGMCC.No 2323及其代谢产物。该发明提供的菌株及在菌学上来说与其同等的菌株及其变异菌株，可有效地稳定用于生产麻黄碱。通过对麻黄内生菌筛选得到发酵法生产麻黄碱的原始菌株，旨在探索出一条利用生物技术、直接微生物转化法生产天然麻黄碱的新途径，1－麻黄碱产量0.67μg/mL和d－伪麻黄碱产量为3.32μg/mL，具有生产麻黄碱的优良特性方面具有重要的意义。

Description

一种产麻黄碱的细菌及其生产的麻黄碱
发明领域
本发明涉及微生物资源领域。具体的说，本发明涉及一种产生麻黄碱的细菌菌株及其代谢产物领域。
背景技术
麻黄碱也称麻黄素，其化学名称是1-苯基-2-甲氨基丙醇，共有4种旋光异构体。其中主要的是l-麻黄碱和d-伪麻黄碱。l-麻黄碱属于拟肾上腺激动药，主要用于治疗支气管哮喘、各种咳嗽、过敏反应、低血压等症，还具有松弛平滑肌，收缩血管，加速心率，升高血压及中枢神经兴奋作用。d-伪麻黄碱为拟交感神经药，具有上呼吸道粘膜血管收缩作用、升压作用、并具有显著的利尿作用。还具有抗炎作用。
在医药上，国内临床麻黄碱和伪麻黄碱的治疗感冒的复方药物有：白加黑、联邦伤风素、银得菲、泰诺感冒片、布洛伪麻胶囊等。治疗由感冒引起的鼻塞，鼻粘膜充血，咳嗽等症状。如复方盐酸伪麻黄碱片，复方盐酸伪麻黄碱口服溶液等。治疗咳嗽的中成药有：定喘宁胶囊、小儿止咳糖浆等；治疗鼻炎的药物有氯雷他定硫酸伪麻黄碱缓释片；羟苄羟麻黄碱在临床用于治疗月经不调以及先兆性流产和早产。在欧美国家，含有麻黄素的药物达300余种，其中含有盐酸伪麻黄碱的抗感冒药物就达200多种。另外国外有将麻黄碱做为食品添加剂，兴奋中枢并抑制肠蠕动以控制体重的，主要用于节食、减肥。
对麻黄碱的生产，国内主要采用植物提取法，直接从麻黄草中提取麻黄碱。这种传统工艺工序繁琐，劳动强度大；生产成本高，直接依赖麻黄草资源，产量小且不稳定。此外，麻黄碱的生产也有直接化学合成的报道(孙同庆，石鸿昌.dl-麻黄碱和dl-伪麻黄碱的合成〔J〕。中国医药工业杂志2000.31(12)：534)。但是产生的是l-麻黄碱和d-伪麻黄碱的外消旋体，需要进一步拆分，成本较高。利用生物转化法生产麻黄碱有许多优势，国内外报道一种半生物转化生产麻黄碱(石贵阳、董世建.d-伪麻黄碱转化菌株的筛选〔J〕.药物生物技术.2003，10(6)：377～38)(董世建、石贵阳.微生物转化法生产d-伪麻黄碱.无锡轻工大学学报.2004年3月：5～7)的方法是：先用丙酮酸脱羧酶将苯甲醛转化为苯基乙酰基甲醇(R-PAC)，再进一步合成麻黄碱。而利用微生物直接生物转化法生产麻黄碱国内外还未见公开报道。
发明内容
针对我国有关直接微生物转化法生产天然麻黄碱的研究工作刚刚开展，尚未有相关研究公开报导。本发明作者通过对麻黄内生菌筛选得到发酵法生产麻黄碱的原始菌株，旨在探索出一条利用生物技术、直接微生物转化法生产天然麻黄碱的新途径。
本发明提供的一株生产天然麻黄碱的菌株，通过在新疆巴音郭楞蒙古自治州地区和硕县万香庄园的人工种植中麻黄(Ephedra intermedia Schrenketc.A.Mey)的采集样本分离、筛选和培养，获得一批具有生产天然麻黄碱的菌株，从中筛选出一株编号为D16B2的菌株，具有稳定生产天然麻黄碱效果，经微生物学分类与鉴定，属于鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)。
本发明提供了一种产生麻黄碱的微生物菌种及其代谢产物麻黄碱。
本发明具体提供的一种产麻黄碱的菌株，命名为D16B2，能够产生稳定的麻黄碱。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2008年01月07日，保藏号是CGMCC.No 2323。经微生物学鉴定为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)。该菌株细胞呈杆状、革兰氏阴性、无芽孢，菌落表面湿润、透明、光滑、粘稠、易挑起、质地均匀、菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致，菌落较小、较厚、边缘较整齐。氧化酶阴性、严格好氧、在20～30℃生长，可在所有普通综合培养基上均能生长。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of SystematicBacterio-logy》)和《常用细菌系统鉴定手册》对D16B2菌株进行形态学测定，生理生化检测确定D16B2菌株为不动菌属中的成员，定为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)。经16SrDNA同源分析、系统发育分析结果都表明D16B2菌株属鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)。
本发明的产麻黄碱的微生物菌种D16B2。其微生物学特性有细胞杆状、革兰氏阴性和氧化酶阴性，再通过法国梅里埃公司生产的VITEK32自动鉴定仪测定，其微生物学特性如表1所示。其结果与可能是鲁氏/琼氏不动杆菌(presumptive Acinetibacter lwoffii/junii)相似性达99％。
表1菌株D16B2的生理生化特征
Table 1 Physiological and biochemical characters of the D16B2 strain
经过该菌株的Chelex-100提取DNA、用原核生物16SrRNA特征引物进行PCR的扩增和测序，得到16SrRNA基因测序。测序结果共计1446bp。此序列已在GeneBank中的登录，其登录号为EU386165。通过与已被LPSN(List ofProkaryotic names with Standing in Nomenclature)收录鲁氏不动菌(Acinetobacter lwoffii)模式菌株DSM 2403的16SrRNA比对相似性达99％，确定该菌株为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)。
上述微生物菌种为原始菌株，通过自然变异或人工诱导变异的菌株也可用作本发明麻黄碱的产生菌种。
作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变，如紫外线辐射处理、钴60辐照处理、离子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等化学诱变剂处理，用麻黄碱产生菌分离筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌株。
另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌种中获取产麻黄碱关键酶基因，以原核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等、真核微生物，如酵母等，作为基因受体菌，构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的产麻黄碱菌种。
通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。
本发明获得鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)CGMCC.No2323，且具有生产麻黄碱的优良特性，菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，25℃，200rpm于摇床培养7天，l-麻黄碱产量0.67μg/mL和d-伪麻黄碱产量为3.32μg/mL。
附图说明
图1是D16B2菌种鉴定的归属进化树图。
图2是D16B2菌株的BTB筛选培养基培养结果。
图3是D16B2菌株的发酵液的薄层层析图谱。
图4中a是D16B2菌株的发酵液的HPLC图谱；b是l-麻黄碱和d-伪麻黄碱标准样品的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1：从麻黄样品分离产麻黄碱的微生物
通过从新疆巴音郭楞蒙古自治州地区和硕县万香庄园的人工种植中麻黄(Ephedra intermedia Schrenk etc.A.Mey)的茎和根采集样本。将茎和根在无菌条件下，用75％酒精消毒，无菌水冲洗，吸干多余水分，将茎和根分别切成0.5cm左右的小段(组织块法)或用无菌研钵磨成浆状(研磨法)，分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基(NA)、高氏一号培养基、马丁氏培养基和水琼脂培养基上，在30℃恒温培养4～7天，相继长出不同类型的微生物，对不同形态、不同颜色的菌落进行初步分类，并在相应的培养基纯化获得一批麻黄内生菌的微生物菌株，然后用BTB(溴麝香草酚蓝，Bromothymol Blue)筛选培养基和发酵实验，利用薄层层析法定性检测发酵液麻黄碱和高效液相色谱定性定量检测发酵液中麻黄碱的含量。从中筛选出一株编号为D16B2的菌株。D16B2具有生产麻黄碱的优良特性，l-麻黄碱产量0.67μg/mL和d-伪麻黄碱产量为3.32μg/mL。经微生物学鉴定和分子生物学16SrRNA比对，D16B2菌为不动菌属中的成员，定为鲁氏不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)。
实施例2：初筛产麻黄碱的菌株
将实施例1中所得的菌株接种在BTB筛选培养基(葡萄糖3％、酵母膏粉0.5％、MgSO4 0.07％、NaCl 0.05％、K2HPO4 0.01％、(NH4)2SO4 0.3％、溴麝香草酚蓝0.01％、琼脂2.0％、pH7.0)上，25℃恒温4～7天，在绿色背景下菌落周围形成蓝色指示圈的为阳性菌落，是筛选目标。经初步鉴定为细菌。参见附图2。
实施例3：复筛产麻黄碱的菌株
将实施例2中所得的菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基(50ml三角瓶装量15ml)中，25℃，200rpm于摇床培养7天，将所得培养液在离心10min。取上清液0.8ml置于1.5mlEP管，加入0.2mlM HCl，使溶液成酸性，备用。麻黄碱和伪麻黄碱标准溶液为0.1％，同样取标准溶液0.8ml置于1.5mlEP管，加入0.2mlM HCl，备用。进行薄层层析。展开剂选用氯仿∶甲醇∶氨水(20∶5∶0.5)，显色剂为0.2％茚三酮的乙醇溶液。将显色剂直接加入展开剂中。层析完毕，在105℃下烘烤5min后观察。挑选与标准品相同迁移率得斑点所对应得菌株，得到有五菌株分别产麻黄碱类似物。参见附图3
实施例4：新菌株产麻黄碱的结构鉴定
将实施例3所得五株菌株在上述培养条件7天。将所得培养液在5000×g离心10min。取上清液0.8ml置于1.5ml EP管，加入0.2mlM HCl，使溶液成酸性，备用。将所得溶液和麻黄碱和伪麻黄碱标准溶液利用高效液相色谱进行检测和比对，以确认其所产物为麻黄碱。结果经确认D16B2的产物为麻黄碱，其中，l-麻黄碱产量0.67μg/mL和d-伪麻黄碱产量为3.32μg/mL。
参见附图4a和参见附图4b
实施例5：产麻黄碱的新菌株的纯化鉴定
本发明的产麻黄碱的微生物菌种D16B2。其微生物学特性有细胞杆状、革兰氏阴性和氧化酶阴性，再通过法国梅里埃公司生产的VITEK 32自动鉴定仪测定，获得其D16B2菌株生理生化特性。其结果与可能是鲁氏/琼氏不动杆菌(presumptive Acinetibacter lwoffii/junii)相似性达99％。经过该菌株Chelex-100提取DNA、用原核生物16SrRNA特征引物进行PCR的扩增和测序，得到16SrRNA基因测序。通过与已被LPSN(List of Prokaryotic names withStanding in Nomenclature)收录鲁氏不动菌(Acinetobacter lwoffii)模式菌株DSM 2403的16SrRNA比对相似性达99％，初步确定该菌株为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)。综合同源性比对结果和鲁氏不动杆菌在细菌发育系统中位置，从Genebank中选择了21个菌株的16SrRNA基因序列(各菌株名及其在Genebank中的登录号)，应用Clustalx1.8和MEGA3.1软件进行多重比较后构建系统发育树。上述各菌株经系统发育学分析得系统发育树状图参见附图1。结果表明，D16B2菌株与各类鲁氏不动杆菌的遗传距离比与其它不动杆菌的均小，且D16B2和鲁氏不动杆菌在一个分支中。由此进一步证明，D16B2菌株为鲁氏不动杆菌。

Claims (3)

1、一种鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)CGMCC.No.2323。
2、一种利用权利要求1所述的鲁氏不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)CGMCC.No.2323发酵获得的麻黄碱。
3、一种利用权利要求1所述的鲁氏不动杆菌(Acinetobacterlwoffii)CGMCC.No.2323通过自然变异或人工诱导变异的菌株通过发酵获得的麻黄碱。
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