CN101250546A - 脂肪酶基因以及工程菌和脂肪酶菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脂肪酶基因，其编码的脂肪酶，表达该酶的工程菌及工程菌的应用。本发明提供的脂肪酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明提供的基因工程菌可用于低温全细胞催化生产生物柴油，在10℃－25℃催化能力受温度影响很小，因此，稳定性好，降低了反应需要的热能，使得生物柴油的生产更加节能。此外，细胞处理过程简单，且细胞经过处理后可重复利用，大大降低了酶的生产成本，简化了生产工艺，提高了生产效率，同时，本发明开辟了利用脂肪酶基因转化大肠杆菌所得可溶表达的基因工程菌进行全细胞催化的先例，这为今后构建基因工程菌以及全细胞催化都提供了新思路，也为进一步获得更为优化的工程菌奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种脂肪酶基因以及工程菌。
背景技术
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，因其广泛的工业应用价值而倍受人们关注，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中。脂肪酶是生物体内一类重要的代谢酶，从催化特性看，它具有高度的化学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的另外一个特征是可以在异相系统(如油、水界面)或有机相中起作用，在水相中，脂肪酶通常催化水解反应的进行；而在有机相中，它却能催化多种合成反应：如酯化、酯交换、酯的醇解、酯的酸解等。脂肪酶的这些特性使其成为在手性化合物合成中重要的生物催化剂，多被用来催化一些酯类合成和转化反应，在食品增香、脱脂加工、污水处理及化工产品中有着广泛的应用。
随着世界范围内能源短缺和环境优化的需要，使得生物柴油备受关注。生物柴油，即动植物油脂与低碳醇进行酯交换反应所生成的脂肪酸低碳醇酯，具有持续的可再生性能：通过油菜等植物的光合作用将太阳能转化为生物能，再加工为生物柴油，取之不尽，用之不竭；具有优良的环保特性：生物柴油中不含硫和芳香族烷烃，使得二氧化硫、硫化物等废气的排放量显著降低；生物柴油中氧含量高，燃烧时一氧化碳的排放量显著减少。此外，它的可降解性明显高于矿物柴油：生物柴油可被现有的柴油机和柴油配送系统直接利用。因而生物柴油被认为是最有前途的柴油代替燃料。
在生产生物柴油众多方法中，由于酶法合成生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、后处理简单、无污染物排放，且原料油中的自由脂肪酸能完全转化成甲酯等优点，反应如图1所示，从而成为研究的热点。其中，酶法合成生物柴油大多采用脂肪酶催化的方法合成生物柴油。
但现有的脂肪酶催化的反应所使用的均为固定化酶，细胞展示酶或酵母细胞等，使得酶的生产成本很高，尚无利用廉价高效的可溶表达的大肠杆菌基因工程菌全细胞催化反应的报道。
此外，关于合成生物柴油反应的报道中，使用的脂肪酶菌株的最适催化温度多在35℃以上，反应需要加热，对能源的要求高，如能找到最适催化温度为常温的菌株，则能降低反应耗能，从而可以节约能源，因此，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种脂肪酶基因。
本发明还有一个目的在于，提供所述脂肪酶基因编码的脂肪酶。
本发明还有一个目的在于，提供一种转化有所述脂肪酶基因的基因工程菌株。
本发明的还有一个目的在于，提供所述基因工程菌的应用。
本发明提供的脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的基因工程菌株转化有所述脂肪酶基因，工程菌为大肠杆菌；具体地，通过将所述脂肪酶基因构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌而获得。
根据本发明的一个优选实施例，所述重组表达质粒的表达载体为pET28a。
本发明提供的所述基因工程菌可用于催化生产生物柴油。
本发明提供的所述基因工程菌可用于催化水解反应。
本发明提供的所述基因工程菌可用于催化合成反应。
本发明提供的所述基因工程菌可用于催化拆分反应。
本发明提供的所述基因工程菌可用于催化酰化反应。
本发明提供的所述基因工程菌可用于催化环氧化反应。
通过比对，本发明的脂肪酶基因与现有报道的其它脂肪酶基因的同源度最高为75％，因此是一种脂肪酶基因。
通过比对，本发明的脂肪酶的氨基酸序列与现有报道的其它脂肪酶的同源度最高为80％，因此，本发明的基因所编码的脂肪酶同样是一种脂肪酶。
根据本发明的一个优选实施例，使用本发明的脂肪酶催化生产生物柴油，在10℃-25℃催化转化得到的生物柴油，其转化率达90-100％，高于作为对照的35℃-40℃的40％-60％的转化率，也高于现有大多数工业使用的脂肪酶在低温下的转化率。
本发明提供的基因工程菌可用于全细胞催化生产生物柴油，其最适催化温度为15℃，且在10℃-25℃催化能力受温度影响很小，因此，稳定性好，降低了反应需要的热能，使得生物柴油的生产更加节能。此外，细胞处理过程简单，且细胞经过处理后可重复利用，大大降低了酶的生产成本，简化了生产工艺，提高了生产效率，同时，本发明开辟了利用脂肪酶基因转化大肠杆菌所得可溶表达的基因工程菌进行全细胞催化的先例，这为今后构建基因工程菌以及全细胞催化都提供了新思路，也为进一步获得更为优化的工程菌奠定了基础。
附图说明
图1为脂肪酶催化生产生物柴油的转酯反应示意图。
图2为基因工程菌BL21/lipK107的发酵表达产物经纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为表达后的全细胞蛋白电泳图；泳道2为表达后没有纯化的破壁上清液；泳道3为表达后没有纯化的破壁沉淀；泳道4为经过His-Tag柱纯化后的LIPK107蛋白。
图3为扩增基因保守序列时的核酸电泳图。
图4为扩增基因保守序列上、下游时的核酸电泳图。
图5为扩增全长基因的核酸电泳图。
图6为高效气相色谱测定生物柴油转化率的图谱。从左到右四个明显的峰依次为棕榈酸甲酯；内标；油酸亚油酸甲酯；棕榈酸甲酯。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
在本发明的实施例中使用的大肠杆菌BL21和载体pET28、pET32均购自Novagen公司。
实施例1、新脂肪酶基因的获得
发明人自行筛选到了一株产碱性脂肪酶的野生菌株，为变形杆菌属。本实施例通过PCR方法从该野生菌株克隆脂肪酶基因。
1.1、脂肪酶基因保守序列的获得
设计并合成用于扩增脂肪酶基因保守序列(即SEQ ID NO：1的214-581位点对应的序列)的PCR引物Bsxl-1和Bsxl-2，其序列分别如下：
Bsxl-1：5’-AAAGTAAATTTAATCGGTCATAGC-3’；
Bsxl-2：5’-TGAATAGTAATGAACACCATTTAC-3’。
以所筛选的野生菌株总DNA为模板，以引物Bsxl-1和Bsxl-2为引物对，进行PCR扩增，具体条件如下：
反应体系：Tag酶1μl，缓冲液5μl，模板1μl，dNTP 4μl，上下游引物各1μl，纯水33μl。
反应过程：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 10min。
将获得的PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图3所示，根据图3结果，回收约400bp的片段，并将其测序，测序结果显示，获得的PCR产物符合预期，为lipK107基因的保守序列。
1.2、全长脂肪酶基因lipK107的获得：
根据保守序列，设计并合成用于扩增全长lipK107基因的PCR引物up-1、up-2和down-1、down-2，其中，up-1、up-2用于扩增保守序列的上游片段，down-1、down-2用于扩增保守序列的下游片段，其序列分别如下所示：
up-1：5’-ATACCCACAGGCATTACCTAAAACC-3’；
up-2：5’-GTGAAGGTGATGAAATCGTAAATGG-3’；
down-1：5’-AGTTACCGAAGCAACACTATCAGGA-3’；
down-2：5’-TTAGCCGCAACGTAACGACAAGCTA-3’。
按Takara等公司提供的gene-walking试剂盒所述的方法，分别用平头酶EcoR V，Pvu II，Sma I，Dra I，Sca I，Hpa I等酶切野生菌株总DNA，连接试剂盒提供的接头，再用up-1、up-2和down-1、down-2及试剂盒提供的接头引物进行巢氏PCR，具体如下：
以酶切后的总DNA为模板，分别以up-1、接头引物和down-1、接头引物为引物对进行上下游PCR扩增，具体条件如下：
反应体系：Tag酶1μl，缓冲液5μl，模板1μl，dNTP 4μl，上下游引物各1μl，纯水33μl。
反应过程：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。
将PCR产物稀释50倍，以其作为模板，分别以up-2、接头引物和down-2、接头引物为引物对，进行上下游PCR扩增，具体条件如下：
反应体系：Tag酶1μl，缓冲液5μl，模板1μl，dNTP 4μl，上下游引物各1μl，纯水33μl。
反应过程：95℃ 5min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。
将上述获得的PCR产物，进行琼脂糖电泳检测，结果如图4所示，根据图4结果，回收大于500bp的片段，并将其测序，再将回收片段与保守序列拼接后在GenBank上和已报道的脂肪酶序列比对，得到全长脂肪酶基因，命名为lipK107。
根据测序和比对结果，得到的全长脂肪酶基因lipK107序列如SEQ ID NO：1所示，同时，根据比对结果，扩增到的脂肪酶为新脂肪酶，与已报道脂肪酶的核苷酸同源度最高(即GenBank上的变形杆菌属的脂肪酶基因序列)为75％。
虽然，以上提供了从野生菌株通过PCR方法获得全长脂肪酶基因lipK107的方法，但是，本领域的技术人员根据本发明所公开的基因序列，采用其它方法，如合成法，同样可以获得全长脂肪酶基因lipK107，这是显而易见的。
实施例2、工程菌构建
2.1、基因lipK107的克隆
根据lipK107全长基因序列，设计并合成扩增引物qe-1和qe-2，其序列如下所示：
qe-1：5’-aaagaattcatgtcaacgaaatatcctat-3’；
qe-2：5’-aaagcggccgcctttaaagttgcttactcgcta-3’。
其中，在引物qe-1上引入EcoR I酶切位点(如qe-1的下划线所示)，在引物qe-2上引入Not I酶切位点(如qe-2的下划线所示)。
以所筛选的野生菌株总DNA为模板，以引物qe-1和qe-2为引物对，进行PCR扩增，具体条件如下：
反应体系：Tag酶1μl，缓冲液5μl，模板1μl，dNTP 4μl，上下游引物各1μl，纯水33μl。
反应过程：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 90s，30个循环；72℃ 10min。
将PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图5所示，根据图5结果，回收大小约900bp的片段。
2.2、重组表达载体的构建和转化
将实施例2.1中回收的片段经EcoRI、Not I酶切，然后与同样经EcoR I、Not I酶切的pET28载体连接，筛选，得到重组质粒pET-lipK107，将其测序，测序结果显示，克隆入的脂肪酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。
按常规方法将质粒转化大肠杆菌BL21，获得生产脂肪酶的基因工程菌BL21/lipK107。
实施例3、工程菌表达及表达产物鉴定
3.1、工程菌表达
将实施例2中获得的BL21/lipK107接种入LB培养基，于37℃培养至对数生长期后，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，继续培养8小时。离心收集菌体，超声破菌，离心收集上清，用His-Tag亲和柱纯化得到了纯化的脂肪酶，SDS-PAGE电泳，结果如图2所示，根据图2结果，LipK107蛋白主要为可溶表达，且蛋白表达量较高，在约33kDa处看到清晰条带，与预期的脂肪酶大小吻合。
3.2、表达产物鉴定
用实施例3.1中获得的纯化的脂肪酶LipK107催化水解反应，以鉴定表达产物，具体步骤如下：
将对硝基苯酚酯配成浓度为25mmol/L的异丙醇浓溶液，作为浓底物液，取25μl浓底物液，溶于75μl异丙醇与二甲基亚砜(DMSO)混合液(V异丙醇∶VDMSO＝2∶1)，将此100μl底物混合液与900μl 100mM Tris-HCl(pH 8.0)、100μl 80mM CaCl2水溶液以及500μl稀释1000倍的酶溶液混合，在37℃下反应5分钟后，加入1ml 0.01％SDS(wt/v)终止反应，并于405nm比色检测。
在上述反应过程中有明显的黄色产物生成，表明BL21/lipK107表达的脂肪酶可以催化对硝基苯酚酯生成对硝基苯酚。
实施例4、BL21/lipK107培养及蛋白纯化
4.1、培养基配制
分别配制种子培养基和诱导培养基，配方如下：
种子培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，卡那霉素0.05，pH7.0。
诱导培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，卡那霉素0.05，IPTG 0.19，pH7.0。
经检测，培养基中的微量元素浓度：ZnCl2 34.2g/L，FeCl3·6H2O 2.7g/L，MnCl2·4H2O10g/L，CuCl2·2H2O 0.85g/L，CoCl2·2H2O 23.8g/L，H3BO3 0.31g/L，Na2MoO4 0.25g/L。
4.2、菌种培养与菌体收集
将BL21/lipK107菌加入到种子培养基中，于250rpm，37℃下，培养12小时，获得种子液。
将BL21/lipK107菌的种子液接种到诱导培养基中，于200rpm，30℃下培养，并在2小时和3小时后，分两次添加IPTG至终浓度为0.8mmol/L，继续培养8小时。
然后将培养液于8000×g、4℃离心，收集沉淀，将获得的大肠杆菌细胞于无菌双蒸水中洗涤1-2次，再重悬于50mM pH8.0 Tris/HCl缓冲液中，并加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至0.3％(w/v)，然后于150rpm，25℃摇床培养75分钟后，于6000×g、4℃离心，收集细胞沉淀，获得菌体。
4.3、蛋白纯化
将实施例4.2获得的菌体超声破碎，然后10000×g、4℃离心10分钟，将收集上清，获得粗酶液；
然后将粗酶液用镍柱纯化，脱盐，获得纯酶。
实施例5、BL21/lipK107的应用
5.1、催化水解反应
在摇瓶中加入2.5ml乳化的橄榄油，加入pH为7的磷酸缓冲液2.0ml，分别加入一定量实施例4得到的全细胞、粗酶或纯酶，37℃水浴反应10分钟后加入乙醇7.5ml终止反应。加入酚酞试剂作为指示剂，用0.05M的NaOH滴定至终点，然后取样分析检测，结果均显示水解反应体系中有脂肪酸生成，说明脂肪酶lipK107可以催化水解反应。
5.2、催化合成反应
将实施例4中制备的大肠杆菌细胞、粗酶和纯酶分别置于冷冻干燥机干燥成粉末。
在100mL具塞三角瓶中将0.10mol/L乙酸、0.125mol/L乙醇和7.5mL正庚烷组成非水相酯化反应体系。
加入一定量酶粉，于37℃条件下，在恒温摇床中以150转/分钟的速度旋转振荡48小时，然后取样分析检测，结果显示合成反应体系中有乙酸乙酯，说明脂肪酶lipK107可以催化合成反应。
5.3、催化拆分反应
在摇瓶中加入0.5mmol α-苯基乙醇，10ml甲苯，1mmol乙酸乙烯酯，分别加入一定量实施例4得到的全细胞、粗酶或纯酶，在恒温摇床中以37℃，200转/分钟的速度旋转振荡96小时，检测产物，结果显示脂肪酶lipK107可以催化手性拆分反应。
5.4、催化酰化反应
在摇瓶中加入2.5mmol糖单元的葡甘聚糖，7.5mmol脂肪酸乙烯酯，10ml叔丁醇，分别加入一定量实施例4得到的全细胞、粗酶或纯酶，在恒温摇床中以40℃，200转/分钟的速度旋转振荡48小时，检测产物，结果显示脂肪酶lipK107可以催化酰化反应。
5.5、催化环氧化反应
将5mmol丙烯醇与一定量羧酸溶于10ml有机溶剂中，分别加入一定量实施例4得到的全细胞、粗酶或纯酶，搅拌10min使其混合均匀。在恒温搅拌下每隔15min向反应液中滴加30μl浓度为30％的过氧化氢，直至全部加人720μl。恒温持续搅拌16h，检测产物，结果显示脂肪酶lipK107可以催化环氧化反应。
5.6、催化生产生物柴油
在摇瓶中加入4.45ml异辛烷，426mg橄榄油，65mg菌体，80ml无水甲醇(分三次间隔4小时加入)，于10-25℃，180rpm，反应12小时，收获反应液，离心分离细胞，获得的上清即为生物转化得到的生物柴油，以高效气相色谱测定，结果如图6所示，同时，以35℃和40℃作为对照，具体反应条件和结果如表1所示，根据图6和表1的结果，生物转化得到的生物柴油的转化率达90-100％。
表1、催化生产生物柴油的反应条件和结果
| 反应 | 反应温度(℃) | 转化率(％) |
| 1 | 10 | 93.1 |
| 2 | 15 | 99.8 |
| 3 | 25 | 92.2 |
| 4 | 35 | 60.8 |
| 5 | 40 | 40.6 |
离心分离后的细胞经Tris-HCl洗涤后，可作为催化剂重复利用，重复利用3次后，催化能力仍有初次的70％以上。
现有的生物柴油生产，多数由纯酶或固定化酶催化，酶的生产成本很高，处理复杂，且催化温度多为35℃以上，反应需要大量热能。而本发明提供的基因工程菌可以直接进行全细胞催化，不需要酶的纯化或固定化过程，因而大大节约了酶的生产成本，节省了酶的处理过程，且最适催化温度低，反应过程中不需要加热，有利于节约能源。
综上所述，本发明提供的基因工程菌不仅可用于催化水解反应、合成反应、拆分反应、酰化反应和环氧化反应，还可用于全细胞催化生产生物柴油，其最适催化温度为15℃，且在10℃-25℃催化能力受温度影响很小，因此，稳定性好，并降低了反应需要的热能，使得生物柴油的生产更加节能。此外，细胞处理过程简单，且细胞经过处理后可重复利用，大大降低了酶的生产成本，简化了生产工艺，提高了生产效率，同时，本发明开辟了利用脂肪酶基因转化大肠杆菌所得可溶表达的基因工程菌进行全细胞催化的先例，这为今后构建基因工程菌以及全细胞催化都提供了新思路，也为进一步获得更为优化的工程菌奠定了基础。
序列表
Claims (20)
1、一种脂肪酶基因，其特征在于，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2、如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3、如权利要求1或2所述的基因编码的脂肪酶。
4、一种基因工程菌株，其特征在于，所述菌株含有表达如权利要求3所述的脂肪酶的质粒。
5、如权利要求4所述的工程菌株，其特征在于，所述质粒含有如权利要求1或2所述的基因和合适的表达载体片段。
6、如权利要求5所述的工程菌株，其特征在于，所述表达载体为pET28载体。
7、如权利要求4-6中任一项所述的工程菌株，其特征在于，所述菌株通过将如权利要求1或2所述的脂肪酶基因构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌而获得。
8、如权利要求7所述的工程菌株，其特征在于，所述重组表达质粒为pET-lipK107。
9、如权利要求4-8中任一项所述的基因工程菌用于催化生产生物柴油的应用。
10、如权利要求9所述的应用，其特征在于，用于催化生产生物柴油的为脂肪酶工程菌株全细胞。
11、如权利要求4-8中任一项所述的基因工程菌用于催化水解反应的应用。
12、如权利要求11所述的应用，其特征在于，用于催化水解反应的为脂肪酶工程菌株全细胞、脂肪酶粗酶或脂肪酶纯酶。
13、如权利要求4-8中任一项所述的基因工程菌用于催化合成反应的应用。
14、如权利要求13所述的应用，其特征在于，用于催化合成反应的为脂肪酶工程菌株全细胞、脂肪酶粗酶或脂肪酶纯酶。
15、如权利要求4-8中任一项所述的基因工程菌用于催化拆分反应的应用。
16、如权利要求15所述的应用，其特征在于，用于催化拆分反应的为脂肪酶工程菌株全细胞、脂肪酶粗酶或脂肪酶纯酶。
17、如权利要求4-8中任一项所述的基因工程菌用于催化酰化反应的应用。
18、如权利要求17所述的应用，其特征在于，用于催化酰化反应的为脂肪酶工程菌株全细胞、脂肪酶粗酶或脂肪酶纯酶。
19、如权利要求4-8中任一项所述的基因工程菌用于催化环氧化反应的应用。
20、如权利要求19所述的应用，其特征在于，用于催化环氧化反应的为脂肪酶工程菌株全细胞、脂肪酶粗酶或脂肪酶纯酶。
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| CN101250546B (zh) | 2012-06-13 |
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