CN101250237A - 一种硫酸软骨素的无溶剂提取方法 - Google Patents

一种硫酸软骨素的无溶剂提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硫酸软骨素的无溶剂提取方法，该方法以软骨为原料，将其煮沸后粉碎并预研磨成粒径50～500μm的软骨粉末，再与固体碱试剂混合均匀，置于研磨器中充分研磨，研磨得到的粉末混合物用水充分溶解，过滤除去不溶物，滤液经过醇沉、取醇沉物干燥即得所述的硫酸软骨素。该方法从根本上克服了传统方法大量使用强碱(NaOH)和酶(胰酶)的问题，提取过程无需任何溶剂参与，而是通过球磨机中的研磨体所产生的高强度机械力引发，在无需溶剂参与的条件下实现，具有效率高、提取率高、产品纯度高和节能减排等优点。

Description

一种硫酸软骨素的无溶剂提取方法
(一)技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素的提取方法，尤其是一种无溶剂提取方法。
(二)背景技术
硫酸软骨素是一种从软骨中提取的纯天然高分子酸性粘多糖(糖胺聚糖)，其分子结构为β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖通过β1→3糖苷键形成的重复二糖单位所组成的多糖链，具有预防和治疗视力和听力下降以及降血脂、抗血栓、抗炎症、抗病毒甚至具有抗肿瘤和抑制肿瘤新生血管生成等多种生理活性作用。硫酸软骨素广泛应用于食品、保健品、化妆品和医药行业。随着生活水平的日益提高，硫酸软骨素的市场需求仍呈不断上升趋势。
硫酸软骨素传统的提取方法主要包括步骤：碱解、酶解、盐解、吸附、醇沉和干燥。
传统提取方法不但步骤繁琐，效率低，提取时间长，能耗高，提取率低，而且需要用到大量的强碱(如NaOH)和酶(如胰酶)，提取过程中还必须用NaOH溶液或稀HCl不断调节来维持胰酶发挥最大活性所需的pH值，在大规模工业化生产中操作复杂、能耗高、成本高、生产周期长，而且用传统方法来提取硫酸软骨素提取率低(平均约为7％)，纯度低(平均约为75％)。传统纯化步骤中常常用活性炭或白陶土吸附悬浮在水溶液中的杂蛋白，不但吸附效果差，而且吸附后过滤困难，容易堵塞滤孔，吸附杂蛋白的同时还吸附了一部分在溶液中呈明胶状的硫酸软骨素，使得提取率有所降低。
无溶剂提取方法是一种具有选择性的提取方法，无溶剂提取过程中发生的无溶剂化学反应具有不同于一般有机化学反应的反应特征和反应机理，如反应物浓度高、比表面积大、相互接触面积和碰撞机率大、立体选择性高，反应速率快，产物收率高，而且省去了预脱脂的步骤。无溶剂提取方法甚至能够用水直接提取传统提取工艺中无法直接水提的化合物，如酚酸类、黄酮类和生物碱类化合物等。
目前还未有用无溶剂提取方法提取硫酸软骨素的报道。
(三)发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、生产安全稳定可靠、提取率高、能耗低、成本低、周期短，产品纯度高且基本无污染的硫酸软骨素的无溶剂提取方法。
本发明的研究思路为：先利用球磨机中研磨体所产生的高强度机械力作用使软骨组织中硫酸软骨素连接在核心蛋白上的糖肽键发生断裂，释放硫酸软骨素并促使硫酸软骨素这种酸性粘多糖与固体碱试剂在无溶剂的条件下发生中和反应，生成硫酸软骨素水溶性盐，而软骨原料中的蛋白质组分在高强度机械力的作用下发生变性，水化膜被破坏，水溶性降低，所以用水即可充分溶解硫酸软骨素盐(e.g.CS-Na)，而变性后的水不溶性杂蛋白通过简单的过滤就可以除去。
本发明采用的技术方案如下：
一种硫酸软骨素的无溶剂提取方法，将富含硫酸软骨素的软骨原料煮沸后粉碎并预研磨成粒径50～500μm的软骨粉末，再与固体碱试剂混合均匀，置于研磨器中充分研磨，研磨得到的粉末混合物用水充分溶解，过滤除去不溶物，滤液经过醇沉、取醇沉物干燥即得所述的硫酸软骨素，所述的软骨粉末与固体碱试剂的质量比为10∶0.1～6.0；所述固体碱试剂为下列之一或几种的任意组合：钠的弱酸盐、钾的弱酸盐、氢氧化钙、羟基磷灰石、高岭石、碱性长石。
所述的硫酸软骨素的化学结构通式为由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖所组成的重复二糖单位以糖苷键首尾相连形成的多糖链，重复二糖单位上的N-乙酰氨基半乳糖的C4或C6位常带有硫酸酯基。在软骨原料中，硫酸软骨素化合物为酸型，如式(II)所示；本发明提取得到的硫酸软骨素化合物为钠型，如式(I)所示。以下结构如(I)-1～(I)-5，(II)-1～(II)-1所示的化合物为几种常见的硫酸软骨素化合物：
Figure S2008100608685D00031
Figure S2008100608685D00041
Figure S2008100608685D00051
以重复二糖单位上6位硫化的硫酸软骨素(即式(I)-1、式(II)-1所示化合物)为例，本发明所述反应可用以下方程式表示：
Figure S2008100608685D00052
本发明中，软骨粉末和固体碱试剂需要在研磨器中充分研磨，所述的研磨器可以是球磨机，也可以是冲压式研磨器，还可以是玛瑙研钵，优选球磨机。
进一步，所述的固体碱试剂优选为下列之一或任意几种任意比例的组合：磷酸氢二钠、硅酸钠、硼酸钠、醋酸钠、亚硝酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钙、羟基磷灰石、高岭石、碱性长石。所述的软骨粉末与固体碱试剂的质量比优选为10∶0.5～2.5。
较好的，本发明中在将软骨原料煮沸后，可先将煮沸后的软骨先用刀刃型粉碎机粉碎成1～5mm的颗粒，然后置于球磨机中预研磨成粒径50～500μm的软骨粉末。
本发明将软骨粉末与固体碱试剂混合均匀后需将混合物充分研磨，推荐在球磨机中研磨30～180min。球磨得到的粉末混合物加水溶解时，加入的水量推荐为粉末混合物质量的5～10倍。
本发明在醇沉中，一般控制最终醇浓度在65％～75％。所述的醇可以是乙醇、异丙醇等，优选乙醇。推荐所述的醇沉按照如下进行：取滤液，边搅拌边加入滤液体积2～5倍量的95％乙醇，静置4～8h，过滤得到滤渣即为醇沉物。
醇沉得到的醇沉物干燥可采用真空干燥或常压烘干。
具体的，所述的提取方法推荐按照如下步骤进行：将富含硫酸软骨素的软骨原料煮沸后粉碎成1～5mm的颗粒，再预研磨成粒径50～500μm的软骨粉末，然后室温下与固体碱试剂按质量比10∶0.1～6.0混合均匀并置于球磨机中球磨30～180min，球磨得到的粉末混合物用质量为粉末混合物质量的5～10倍的水充分溶解，过滤除去不溶物，边搅拌边加入滤液体积2～5倍量的95％乙醇，静置4～8h，过滤得到滤渣即为醇沉物，醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥4～8h即得所述的硫酸软骨素。
本发明采用无溶剂提取方法提取硫酸软骨素，与现有技术相比，其有益效果体现在：
(1)无溶剂提取过程中无需任何溶剂参与，而且不需要用到强碱(NaOH)和酶(胰酶)，提取过程中用到的球磨机能耗低，不需要传统工艺中用来加热反应设备的蒸汽，可大幅度降低能耗成本，而且无溶剂提取的提取率高，产品纯度高。无溶剂提取过程不产生任何污染环境的废液，是一种绿色的化学提取方法；
(2)无溶剂提取过程用到的球磨机操作简单，生产周期缩短；
(3)在球磨机中研磨体引发的高强度机械力作用下，原料的超细粉末具有特殊的物理、化学性质，如比表面积增大，相应的分散性、溶解性和反应活性增强，促使原料中的目标物质与精心挑选的固体试剂在无溶剂的条件下就能发生充分的化学反应，使得提取率大大提高。
(4)反应的选择性高，例如，加入的固体碱试剂与原料中的酚酸类物质在无溶剂的条件下发生中和反应，生成水溶性盐，用水充分溶解即可将原料中的酚酸类物质直接提取出来，而其他脂溶性化合物不溶于水，所以不需要原料预脱脂的步骤；
(5)后处理简单：无溶剂提取得到的粗产物只需经过简单的后续纯化就可以得到纯度较高的目标产物。
总体上，该方法从根本上克服了传统方法大量使用强碱(NaOH)和酶(胰酶)的问题，提取过程无需任何溶剂参与，而是通过球磨机中的研磨体所产生的高强度机械力引发，在无需溶剂参与的条件下实现，具有效率高、提取率高、产品纯度高和节能减排等优点。
(四)附图说明
图1是钠型硫酸软骨素(CS-Na)标准品的红外光谱图；
图2是本发明实施例1得到的硫酸软骨素产品的红外光谱图。
(五)具体实施方式：
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成3mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为200μm的粉末。
室温下，取粒径为200μm的软骨粉末10.0g，加醋酸钠5.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨60min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于8倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积3倍量的95％乙醇，静置5h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥6h即得硫酸软骨素0.83g。将得到的硫酸软骨素成品与Sigma公司标准品CS-Na用红外光谱(IR)进行比较，检测结果分别如图2、图1所示。并用CPC滴定法和HPLC进行定量检测，产品质量与Sigma公司标准品进行比较。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)8.3％，纯度92.3％。
实施例2
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成5mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为500μm的粉末。
室温下，取粒径为500μm的软骨粉末10.0g，加碳酸钠3.0，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨30min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于10倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积2倍量的95％乙醇，静置6h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥5h即得硫酸软骨素0.80g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)8.0％，纯度91.5％。
实施例3
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成1mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为100μm的粉末。
室温下，取粒径为100μm的软骨粉末10.0g，加碳酸氢钠6.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨120min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于5倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积5倍量的95％乙醇，静置5h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥6h即得硫酸软骨素0.78g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)7.8％，纯度90.5％。
实施例4
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成5mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为500μm的粉末。
室温下，取粒径为500μm的软骨粉末10.0g，加氢氧化钙10.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨180min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于5倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积4倍量的95％乙醇，静置8h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥4h即得硫酸软骨素0.75g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)7.5％，纯度90.2％。
实施例5
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成2mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为200μm的粉末。
室温下，取粒径为200μm的软骨粉末10.0g，加硅酸钠8.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨100min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于6倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积3倍量的95％乙醇，静置6h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥5h即得硫酸软骨素0.76g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)7.6％，纯度91.2％。
实施例6
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成1mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为100μm的粉末。
室温下，取粒径为100μm的软骨粉末10.0g，加磷酸氢二钠5.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨60min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于5倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积2倍量的95％乙醇，静置4h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥6h即得硫酸软骨素0.72g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)7.2％，纯度92.0％。
实施例7
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成2mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为200μm的粉末。
室温下，取粒径为200μm的软骨粉末10.0g，加碱式碳酸钙60.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨180min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于6倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积3倍量的95％乙醇，静置5h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥4h即得硫酸软骨素0.85g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)8.5％，纯度91.3％。
实施例8
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成3mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为300μm的粉末。
室温下，取粒径为300μm的软骨粉末10.0g，加羟基磷灰石50.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨90min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于10倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积5倍量的95％乙醇，静置7h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥8h即得硫酸软骨素0.80g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)8.0％，纯度90.8％。
实施例9
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成4mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为400μm的粉末。
室温下，取粒径为400μm的软骨粉末10.0g，加高岭石40.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨120min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于8倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积3倍量的95％乙醇，静置6h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥5h即得硫酸软骨素0.90g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)9.0％，纯度91.6％。
实施例10
将煮沸后的软骨原料用刀刃型粉碎机粉碎成3mm颗粒，再用球磨机将软骨颗粒研磨成粒径为300μm的粉末。
室温下，取粒径为200μm的软骨粉末10.0g，加碱性长石30.0g，混合均匀后置于球磨机中在无溶剂的条件下研磨60min。
将球磨后得到的混合物粉末溶于8倍量的水中，搅拌促进溶解，过滤除去水不溶物，取滤液，边搅拌加入滤液体积2倍量的95％乙醇，静置5h、过滤得到的醇沉物置于60℃真空干燥箱中干燥6h即得硫酸软骨素0.75g。将得到的硫酸软骨素成品作定性定量检测，检测方法同实施例1。计算得硫酸软骨素提取率(相对于原料)7.5％，纯度90.8％。

Claims (9)

1. 一种硫酸软骨素的提取方法，其特征在于所述的提取方法为：将富含硫酸软骨素的软骨原料煮沸后粉碎并预研磨成粒径50～500μm的软骨粉末，再与固体碱试剂混合均匀，置于研磨器中充分研磨，研磨得到的粉末混合物用水充分溶解，过滤除去不溶物，滤液经过醇沉、取醇沉物干燥即得所述的硫酸软骨素，所述的软骨粉末与固体碱试剂的质量比为10∶0.1～6.0；所述固体碱试剂为下列之一或几种的任意组合：钠的弱酸盐、钾的弱酸盐、氢氧化钙、羟基磷灰石、高岭石、碱性长石。
2. 如权利要求1所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于所述的固体碱试剂为下列之一或任意几种任意比例的组合：磷酸氢二钠、硅酸钠、硼酸钠、醋酸钠、亚硝酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钙、羟基磷灰石、高岭石、碱性长石。
3. 如权利要求2所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于所述的软骨粉末与固体碱试剂的质量比为10∶0.5～2.5。
4. 如权利要求1所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于先将煮沸后的软骨粉碎成1～5mm的颗粒，然后再预研磨成粒径50～500μm的软骨粉末。
5. 如权利要求1所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于将软骨粉末与固体碱试剂混合均匀后在球磨机中研磨30～180min。
6. 如权利要求1～5之一所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于所述的醇沉为：取滤液，边搅拌边加入滤液体积2～5倍量的95％乙醇，静置4～8h，过滤得到滤渣即为醇沉物。
7. 如权利要求6所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于所述的醇沉物干燥采用真空干燥或常压烘干。
8. 如权利要求1所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于研磨得到的粉末混合物加水溶解时，加入的水量为粉末混合物质量的5～10倍。
9. 如权利要求1所述的硫酸软骨素的提取方法，其特征在于所述的方法按照如下步骤进行：将富含硫酸软骨素的软骨原料煮沸后粉碎成1～5mm的颗粒，再预研磨成粒径50～500μm的软骨粉末，然后室温下与固体碱试剂按质量比10∶0.5～2.5混合均匀并置于球磨机中球磨30～180min，球磨得到的粉末混合物用质量为粉末混合物质量的5～10倍的水充分溶解，过滤除去水不溶物，滤液中加入2～5倍量95％乙醇，静置4～8h，醇沉得到的沉淀置于60℃真空干燥箱中干燥4～8h即得所述的硫酸软骨素。
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