CN101245314A - 一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器 - Google Patents

一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，反应器包括储液瓶，脉动源，阻力调节器，顺应性调节器和血管组织动态培养腔，由工控机控制；反应器克服了组织工程领域常用的动脉血管组织工程反应器无法模拟动脉血管血液流动的顺应性、流动惯性和流动阻力等阻抗特性，以及无法提供近似于动脉内血液脉动流环境的缺点，该反应器具有以下功能：a.反应器用于组织工程动脉血管的培养；b.反应器用于模拟不同动脉段动脉血管在生理状态下脉动流的脉动频率、脉搏波波形、二次波、幅度和时相；模拟动脉血管在高血压等病理状态下高管内压力、高剪切应力的血流动力学环境；模拟动脉血管在低剪切应力时的血流动力学状况。

Description

一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器
技术领域
本发明涉及细胞培养、组织工程领域，更具体地涉及一种血管组织工程反应器。
背景技术
在组织工程领域，组织工程生物反应器是研究不同环境因素(物理、生化因素)对特定细胞、组织的三维功能化培养的影响的重要技术手段，也是改进功能化组织质量、降低生产成本(包括自动化、在线监控等)，使组织工程从实验室进入到标准的工业化规模化生产和临床应用过程中的一个关键环节。因此，有针对性地研发先进的组织工程用生物反应器对于组织工程的发展具有重大意义(Martin，et al.，2004；Portner，R.，et al.，2005)。
迄今为止，自体移植、同种异体血管、异种血管、以及人工合成血管都不能够成为理想的动脉血管替代物(特别是6mm口径以下的血管)，近年来组织工程化动脉血管构建和功能研究为这一领域带来了希望。在生理状态下，动脉血管所处的力学环境是，管内血液呈周期性脉动流状态，血压和血液流动速度(与管壁剪切应力直接相关)呈周期性脉搏波形态，压力和流速在一个心动周期内有较大的脉动，而对于分布在不同部位的动脉血管段这些特征还有所不同。近来的研究表明，在培养过程中应力对组织工程化血管的力学特性有显著的影响，脉动流灌注下培养组织工程化动脉血管平滑肌细胞和内皮细胞，与定常流流状态下的培养有显著的不同，因此建立可提供脉动流培养环境的血管组织工程反应器成为近来血管组织工程领域的一个重要趋势(Jeong，S.I.，et al.，2005；McFetridge，P.S.，et al.，2004；Kitagawa，T.et al.，2006；Thompson，C.A.etal.，2002；Hsiai T K.et al.，2002)。
现有的血管组织工程反应器存在较大的缺陷，Hsiai(2002)所研制的实际上是脉动流FlowChamber实验装置而不是组织工程反应器；Thompson研制的是脉动流式心瓣组织工程反应器；Jeong(2005)，McFetridge(2004)，Kitagawa(2006)的反应器是针对血管的。上述反应器基本上采用蠕动泵或蠕动泵加步进电机的方式作为脉动源，并且由于没有做流体回路的脉搏波仿真优化设计，没有仔细考虑流动阻抗、顺应性、阻力、流动惯性的模拟，导致现有的反应器无法提供近似于动脉内血液脉动流状态的近生理流动环境。
本发明针对动脉血管组织生长的体内力学环境，在总结和研究体外环境下力学因素对血管平滑肌、血管内皮细胞和外膜成纤维细胞的三维培养和功能化影响的基础上，采用新的动脉血管组织工程反应器设计原理：在流动回路上模拟动脉血液流动的顺应性和流动阻力，采用圆筒状永磁式直线直流电机，产生近生理脉动流；模拟不同动脉段的脉动频率、压力和流量波形，模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流动力学状况。
发明内容
本发明的目的是提供一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，利用该反应器可以进行多种直径和长度的组织工程动脉血管培养，也可以进行血管细胞、血管组织生物学的研究，其特点在于采用新的动脉血管组织工程反应器设计原理：在流动回路上模拟动脉血液流动的顺应性和流动阻力，产生近生理脉动流；模拟不同动脉段的脉动频率、压力和流量波形，模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流动力学状况。
本发明公开了一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，该反应器具有以下特征：
一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，能够在流动回路上模拟动脉血液流动的顺应性、流动惯性和流动阻力等阻抗特性，产生近生理脉动流；能够用于组织工程动脉血管的培养；该反应器主要由储液瓶，脉动源，阻力调节器，顺应性调节器和血管组织动态培养腔构成，由工控机控制：
a.培养基从储液瓶出发，经过脉动源，阻力调节器1，顺应性调节器1调节后进入血管组织动态培养腔，流出血管组织动态培养腔后经阻力调节器2，顺应性调节器2回到储液瓶，构成了一个血管内循环；该流路构成可以使流经血管组织动态培养腔的培养基具有近生理脉动流的特性；
b.储液瓶经由无菌空气交换器与瓶外空气相通；储液瓶与pH计相连接，可以在线检测瓶中液体的pH值；储液瓶有换液装置，便于更换培养基；
c.培养基经过脉动源成为脉动流状态；脉动源由两端安装有单向止逆阀的脉动腔、直线直流电机构成；脉动腔为充满液体的体积固定的密闭腔，密闭腔的下方通过密闭活塞与直线直流电机相连，密闭腔通过其中央的弹性软管与上下游的反应器管路相连，在软管的上下游出口处各有一个单向止逆阀，保证从脉动源流出的培养基为脉动单向流；
d.血管组织动态培养腔为两端有接头的密闭腔，密闭腔两端的接头连接上下游反应器管路和血管组织培养物；
通过调节直线直流电机、顺应性调节器和阻力调节器，在一定范围内调整脉搏波波形、压力和流量范围、及搏动频率，对培养的血管模拟不同动脉段的脉动频率、压力和流量波形，模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流动力学状况。
近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器用于组织工程动脉血管的培养，动脉血管管材包括经过脱细胞处理的动物血管，由胶原、蚕丝纤维、羊毛纤维等天然材料构成的管材和由PLGA、PLA、PLG、海藻酸钠、聚四氟乙烯等高聚物构成的管材，血管直径在2-10mm之间，血管长度在10-30cm之间，血管管材上的细胞包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和外膜成纤维细胞。
储液瓶材质为玻璃、不锈钢、塑料、聚碳酸酯等；储液瓶的容量在0.2L-2L之间；储液瓶经由无菌空气交换器与瓶外空气相通；储液瓶与pH计相连接，可以在线检测瓶中液体的pH值；储液瓶有换液装置，便于换液。
脉动源由脉动腔，直线直流电机和直线电机功率驱动器构成；脉动腔为充满液体的体积固定的密闭腔，密闭腔的下方通过密闭活塞与直线直流电机相连，密闭腔通过其中央的弹性软管与上下游的反应器管路相连，在软管的上下游出口处各有一个单向止逆阀，保证从脉动源流出的培养基为脉动单向流。
脉动源由脉动腔和直线直流电机构成；直线直流电机为圆筒状永磁式直线直流电机，圆筒状永磁式直线直流电机的往复运动对脉动腔产生的挤压模拟心脏射血入主动脉的过程，在一定范围内可以调节脉动流的脉动频率、流量和压力，其中脉动频率控制在0-200次/分钟，流量范围控制在0-1000ml/分钟，压力控制在0-250mmHg。
血管组织动态培养腔为密闭腔，用于培养血管组织；密闭腔两端有接头连接反应器管路和血管组织培养物，培养基在血管组织培养物内脉动流动，为培养的细胞提供营养物质并提供近生理状态的压力和剪切应力；血管组织动态培养腔材质为玻璃、不锈钢、塑料、聚碳酸酯，容量在0-200ml之间，长度在5-50cm之间；密闭腔两端连接血管组织培养物的接头直径在2-15mm之间，接头间距在5-50cm之间，材质为不锈钢、塑料、聚碳酸酯。整个血管组织动态培养腔可拆卸、可高温消毒。
反应器用于组织工程动脉血管的培养，包括由经过脱细胞处理的动物血管；由胶原、蚕丝纤维、羊毛纤维等天然材料和由PLGA、PLA、PLG、海藻酸钠、聚四氟乙烯等高聚物构成的组织工程动脉血管的培养。。
反应器用于模拟近似于生理脉动流的整体波形、二次波、幅度和时相，模拟类似于高血压的高管内压力，高剪切应力等血流动力学环境。阻力调节器可以调节血管组织动态培养腔的培养液灌注压力和培养液灌注压力波形、波幅；顺应性调节器可以调节组织动态培养腔的流动惯性；阻力调节器和顺应性调节器共同调节获得近似于生理脉动流的整体波形、二次波、幅度和时相，获得类似于高血压的高管内压力，高剪切应力等血流动力学环境；模拟动脉血管在低剪切应力时的血流动力学状况。
近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器整个循环管路通过放入动物细胞培养箱维持37℃，5-15％CO2，95％相对湿度的培养条件。
近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器整个循环管路的体积控制在100-200ml之间。
整个反应器系统安装、拆卸方便；整个反应器、包括循环通道管路和接头可拆卸、可消毒，消毒条件为：130℃，3个大气压，时间1小时。
本发明提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，与现有反应器相比有如下有益效果：
1.本发明所提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器克服了常用的动脉血管组织工程反应器无法模拟动脉血管血液流动的顺应性、流动惯性和流动阻力等阻抗特性，无法提供近似于动脉内血液脉动流环境的缺点，能够在流动回路上模拟动脉血液流动的顺应性、流动惯性和流动阻力等阻抗特性，能够在流动回路上模拟近生理脉动流的压力和流量脉搏波，产生近生理脉动流；
2.采用本发明所提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，能够在一定范围内调整脉搏波波形、压力和流量范围、及脉动频率，模拟不同动脉段的脉动频率、压力和流量波形，模拟高血压，高剪切应力，低剪切应力等血流动力学状况；
3.本发明所提供的近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器功能先进，方便易用。既可用于培养动脉血管组织，也可用作研究血管细胞、组织生物学的仪器。具有较大的推广应用前景和较大的潜在社会经济效益。
附图说明
图1.显示了人体动脉血管内血液呈周期性脉动流状态，血压和血液流动速度呈周期性脉搏波形态；压力和流速在一个心动周期内有较大的脉动，分布在不同部位的动脉血管段这些特征也各不相同；
图2.显示了近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器的结构原理；
图3a.显示了实验测得的流经血管组织动态培养腔的压力和流量波形；左边的图为实验测得的流经血管组织动态培养腔的压力波形，右边的图为实验测得的流经血管组织动态培养腔的流量波形；
图3b.显示了常用的脉动流环境动脉血管组织工程反应器的结构，以及利用该反应器获得的压力波形(Thompson.C.A.，Tissue Engineering，8(6)，2002)；
图4.显示了实验测得的流经血管组织动态培养腔的压力波形；
具体实施方式
下文提供了实施例进一步说明本发明，但本发明不仅限于以下实施例。
实施例1.
1.按照图2连接反应器部件，包括储液瓶、脉动源、阻力调节器1、顺应性调节器1、血管组织动态培养腔、阻力调节器2和顺应性调节器2；
2.消毒反应器，消毒条件为：130℃，3个大气压，时间1小时；
3.在血管组织动态培养腔安装组织工程血管；
4.连接反应器与监测控制装置；
5.按照培养要求配制培养基，将无菌培养基注入储液瓶；
6.选定工控机中预设的圆筒状永磁式直线直流电机驱动曲线，设定脉动频率为70次/分钟，电机增益1-5％之间，设定初始位置；启动圆筒状永磁式直线直流电机，开始灌注培养；
7.调节阻力调节器和顺应性调节器，控制流经血管组织动态培养腔的压力、流量波形：其中进口压力在80-150mmHg之间，出口压力在60-120mmHg之间；流量在0-1.6ml/s；
实施例2.
1.按照图2连接反应器部件，包括储液瓶、脉动源、阻力调节器1、顺应性调节器1、血管组织动态培养腔、阻力调节器2和顺应性调节器2；
2.消毒反应器，消毒条件为：130℃，3个大气压，时间1小时；
3.在血管组织动态培养腔安装组织工程血管；
4.连接反应器与监测控制装置；
5.按照培养要求配制培养基，将无菌培养基注入储液瓶；
6.选定工控机中预设的圆筒状永磁式直线直流电机驱动曲线，设定脉动频率为70次/分钟，电机增益1-5％之间，设定初始位置；启动圆筒状永磁式直线直流电机，开始灌注培养；
7.调节阻力调节器和顺应性调节器，控制流经血管组织动态培养腔的压力、流量波形：其中进口压力在110-140mmHg之间，出口压力在85-110mmHg之间。

Claims (7)

1、一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于反应器包括储液瓶，脉动源，阻力调节器，顺应性调节器和血管组织动态培养腔，反应器由工控机控制：
a.培养基从储液瓶出发，经过脉动源，阻力调节器1，顺应性调节器1调节后进入血管组织动态培养腔，流出血管组织动态培养腔后经阻力调节器2，顺应性调节器2回到储液瓶；
b.储液瓶经由无菌空气交换器与瓶外空气相通；储液瓶与pH计相连接；储液瓶有换液装置；
c.脉动源由两端安装有单向止逆阀的脉动腔、直线直流电机构成；脉动腔为充满液体的体积固定的密闭腔，密闭腔的下方通过密闭活塞与直线直流电机相连，密闭腔通过其中央的弹性软管与上下游的反应器管路相连，在软管的上下游出口处各有一个单向止逆阀；
d.血管组织动态培养腔为两端有接头的密闭腔，密闭腔两端的接头连接上下游反应器管路和血管组织培养物。
2、如权利要求1所述的一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于：所述的储液瓶材质为玻璃、不锈钢、塑料、聚碳酸酯；储液瓶的容量在0.2L-2L之间。
3、如权利要求1所述的一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于：直线直流电机提供的脉动频率为0-200次/分钟，流量范围为0-1000ml/分钟，压力为0-250mmHg。
4、如权利要求1所述的一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于：血管组织动态培养腔材质为玻璃、不锈钢、塑料、聚碳酸酯，容量在0-200ml之间，长度在5-50cm之间；密闭腔两端连接血管组织培养物的接头直径在2-15mm之间，接头间距在5-50cm之间，材质为不锈钢、塑料、聚碳酸酯。
5、如权利要求1所述的一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器，其特征在于：所述的反应器整个循环管路的体积为100-200ml。
6、如权利要求1所述的一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器的应用，其特征在于反应器用于组织工程动脉血管的培养，包括由经过脱细胞处理的动物血管；由胶原、蚕丝纤维、羊毛纤维等天然材料和由PLGA、PLA、PLG、海藻酸钠、聚四氟乙烯等高聚物构成的组织工程动脉血管的培养。
7、如权利要求1所述的一种近生理脉动流环境动脉血管组织工程反应器的应用，用于模拟动脉血管在生理状态下脉动流的脉动频率、整体波形、二次波、幅度和时相，模拟动脉血管在病理状态下高管内压力、高剪切应力的血流动力学环境；模拟动脉血管在低剪切应力时的血流动力学状况。
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