CN101245100B - 具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白与编码基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有细胞免疫保护功能的鼠疫菌蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供在鼠疫菌感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生细胞免疫保护功能的蛋白与编码基因及其在制备鼠疫疫苗中的应用。实验证明，本发明的蛋白在鼠疫菌的感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生免疫保护作用。可以本发明的蛋白或基因作为活性成分制备鼠疫疫苗，同时将本发明的蛋白或基因相互或与现有的具有免疫保护作用的F1、LcrV抗原或基因联合免疫或制备重组融合多价亚单位疫苗或DNA疫苗将能增强现有鼠疫疫苗的免疫保护效果和免疫保护范围。本发明为寻找鼠疫菌具有细胞免疫保护功能的蛋白提供了一种新手段，将在鼠疫的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白及相应编码基因与其应用，特别是涉及在鼠疫菌感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生免疫保护功能的蛋白与相应编码基因以及它们在制备鼠疫疫苗中的应用。
背景技术
鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌引起的一种A类传染病，在历史上曾引起三次世界性的大流行。2000年世界卫生组织将鼠疫列为重新抬头的传染病，多重耐药鼠疫菌株的产生以及鼠疫菌可以用做生物武器和生物恐怖的可能给鼠疫菌的预防、治疗带来了困难。有效的疫苗接种能够阻断鼠疫的传播，达到最终消灭鼠疫的目的。但是，迄今为止，还没有一种能够在大范围内使用而且切实有效的鼠疫疫苗。目前已研究的鼠疫疫苗包括灭活全菌苗、减毒活疫苗、重组蛋白亚单位疫苗与核酸DNA疫苗等。灭活及减毒活疫苗在20世纪亚洲鼠疫流行地区中的应用十分广泛，免疫原性与反应性的变异以及短期的保护力意味着通过在整个疫区接种这类疫苗来防御鼠疫并不可行。鼠疫亚单位疫苗和DNA疫苗的研究主要集中在鼠疫耶尔森氏菌已知的两个主要保护性抗原F1(荚膜抗原)抗原(Andrews GP，Heath DG，Anderson GW，Jr.，Welkos SL，FriedlanderAM：Fraction 1 capsular antigen(F1)purification from Yersinia pestis CO92and from an Escherichia coli recombinant strain and efficacy against lethalplague challenge.Infect Immun 1996，64(6)：2180-2187)和LcrV(V抗原)(AndersonGW，Jr.，Leary SE，Williamson ED，Titball RW，Welkos SL，Worsham PL，Friedlander AM：Recombinant V antigen protects mice against pneumonic andbubonic plague caused by F1-capsule-positive and-negative strains of Yersiniapestis.Infect Immun 1996，64(11)：4580-4585)上。F1抗原由鼠疫耶尔森氏菌pMT质粒上的F1操纵子编码，以多聚体的形式在细胞表面形成荚膜，起到抗吞噬细胞吞噬的功能。F1抗体通过阻断F1蛋白的抗吞噬作用从而起到免疫保护作用(Du Y，Rosqvist R，Forsberg A：Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis ininhibition of phagocytosis.Infect Immun 2002，70(3)：1453-1460)。V抗原是一种多功能蛋白，与鼠疫耶尔森氏菌的抗吞噬能力有关，具有免疫保护和免疫抑制作用(Pettersson J，Holmstrom A，Hill J，Leary S，Frithz-Lindsten E，yonEuler-Matell A，Carlsson E，Titball R，Forsberg A，Wolf-Watz H：The V-antigenof Yersinia is surface exposed before target cell contact and involved invirulence protein translocation.Mol Microbiol 1999，32(5)：961-976)。基于鼠疫菌已知的具有免疫保护性的蛋白亚单位F1与LcrV抗原基础上的疫苗对腺型鼠疫具有理想的保护效果，由USAMRIID研制的F1、V融合亚单位疫苗已经在鼠和部分非人类灵长动物体内被证明对鼠疫有效；在英国，重组F1、V蛋白联合亚单位疫苗已经完成在人类的一期安全性试验，正在进行二期试验(Williamson，E.D.，Flick-Smith，H.C.，Lebutt，C.et al.Human immune response to a plague vaccine comprisingrecombinant F1 and V antigens.Infect Immun 2005，73(6)：3598-3608)。但是这类疫苗对肺型鼠疫的免疫保护效果还有待进一步提高(M.L.Pitt，Animal Modelsand Correlates of Protection for Plague Vaccines Workshop，Gaithersburg，MD，13 to 14 October 2004，http://www.fda.gov/cber/minutes/workshop-min.htm)，而且，F1-鼠疫菌株同样能在人类引起感染，LcrV抗原存在血清学变异。
除体液免疫外，细胞免疫是鼠疫免疫的一个重要的组成部分。同时能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫的疫苗将能更有效地预防鼠疫。目前，关于鼠疫感染后细胞免疫的研究还很少，最近的研究发现，鼠疫菌在感染过程中产生的T细胞免疫不仅仅只针对F1和LcrV蛋白，其它蛋白在鼠疫菌的细胞免疫保护过程中可能起到作用(Philipovskiy AV，Smiley ST，Vaccination with live Yersinia pestis primesCD4 and CD8 T cells that synergistically protect against lethal pulmonary Y.pestis infection.Infect Immun 2007，75(2)：878-885)。
发明内容
本发明的目的是提供在鼠疫菌感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生免疫保护功能的蛋白。
本发明所提供的具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，是下述氨基酸残基序列之一(氨基酸残基序列来源于鼠疫耶尔森氏菌CO92株)：
1)序列表中的SEQ ID NO：1(YPO0606)；
2)序列表中的SEQ ID NO：2(YPO0612)；
3)序列表中的SEQ ID NO：3(YPO1914)；
4)序列表中的SEQ ID NO：4(YPO3119)；
5)序列表中的SEQ ID NO：5(YPO3047)；
6)序列表中的SEQ ID NO：6(YPO0420)；
7)序列表中的SEQ ID NO：7(YPCD1.05c)；
8)序列表中的SEQ ID NO：8(YPO1377)；
9)序列表中的SEQ ID NO：9(YPO3720)；
10)将序列表中SEQ ID NO：1-9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且仍具有免疫保护功能的蛋白。
序列表中的SEQ ID NO：1由480个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：2由381个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：3由234个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：4由421个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：5由423个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：6由328个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：7由129个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：8由177个氨基酸残基组成；序列表中的SEQ ID NO：9由421个氨基酸残基组成。
编码上述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID NO：10的DNA序列(YPO0606)；
2)序列表中SEQ ID NO：11的DNA序列(YPO0612)；
3)序列表中SEQ ID NO：12的DNA序列(YPO1914)
4)序列表中SEQ ID NO：13的DNA序列(YPO3119)；
5)序列表中SEQ ID NO：14的DNA序列(YPO3047)；
6)序列表中SEQ ID NO：15的DNA序列(YPO0420)；
7)序列表中SEQ ID NO：16的DNA序列(YPCD1.05c)；
8)序列表中SEQ ID NO：17的DNA序列(YPO1377)；
9)序列表中SEQ ID NO：18的DNA序列(YPO3720)；
10)与序列表中SEQ ID NO：10-18限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有免疫保护功能的核苷酸序列；
11)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：10-18限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO：10由1440个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第1440位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：11由1143个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第1143位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：12由702个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第702位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：13由1263个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第1263位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID NO：14由1269个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第1269位碱基，编码具有序列表中SEQID NO：5的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO：15由984个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第984位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO：16由387个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第387位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO：17由531个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第531位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO：18由1263个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1-第1263位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及各种宿主均属于本发明的保护范围。
扩增本发明基因中任一片段的引物对也是本发明要保护的。
本发明还提供了一种表达上述具有细胞免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的方法。
本发明所提供的表达上述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的方法，是将上述含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的相应基因的重组表达载体导入宿主细胞内，诱导表达从而获得具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白。
所述宿主可为任一可表达外源基因的原核或真核细胞，如大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为E.coli DH5α、E.coli BL21、E.coli Top10、E.coli JM109、E.coli BLR、E.coli BLR(DE3)等。
所述真核细胞可为哺乳动物细胞、酵母细胞或植物细胞等，包括COS-7、CHO、BHK-21、COS2.7、VeroE6、HeLa、HEK293和酵母细胞等。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(购自美国Invitrogen公司)。
用于构建含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组大肠杆菌表达载体的出发载体可为pET载体系列、pQE载体系列、pGEX载体系列、IMPACTTM系统与Gateway系统pDEST载体系列等，包括pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)、pET-30a、pQE-30、pMAL-2、pMXB10、pDEST17、pDEST15、pDEST14与pDEST24等。
以pDET17或pET32a为出发载体，构建的含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的大肠杆菌表达载体可为pDEST17-YPO0606、pDEST17-YPO0612、pDEST17-YPO1914、pDEST17-YPO3119、pDEST17-YPO3047、pDEST17-YPO0420、pET32a-YPCD1.05c、pDEST17-YPO1377和pDEST17-YPO3720。
用于构建含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组真核表达载体的出发载体可为pcDNA3.1(-)、pEGFP-N1、pcDNA(pcDNA3.1(+)等)、pCMV5、pSilence1.0-U6、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo、pTEF1、pPICZα、pAM82、pAAh5等。
上述重组表达载体和表达菌株或细胞系均可按照常规方法构建。
培养含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度可为0.01-5.0mM/L，优选为1.0mM/L；所述诱导温度可为15-42℃，优选为28℃；所述诱导时间可为2-8小时，优选为4小时。
本发明具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白可用于制备鼠疫亚单位疫苗，编码该蛋白的基因可用于制备鼠疫核酸疫苗。
需要的时候，以具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白制备的鼠疫亚单位疫苗或核酸疫苗中还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一种或多种细胞因子或微生物的成分(CpG，脂质A，霍乱毒素，脂蛋白，大肠杆菌不耐热肠毒素)作为免疫佐剂。
此外，本发明具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白可以相互或与F1和/或LcrV亚单位联合免疫或制备多价亚单位疫苗。
本发明的疫苗可以制成注射液、微球体、干粉针剂或气雾剂等多种剂型。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述核酸疫苗和亚单位疫苗的用量可采用药学领域中核酸疫苗和亚单位疫苗的常规剂量，并可根据实际情况调整。
本发明提供了具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白及其编码基因。实验证明，本发明的蛋白在鼠疫菌的感染和免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应，并且能够产生免疫保护作用。可以本发明的蛋白或基因为活性成分制备鼠疫疫苗，同时将本发明的蛋白相互或与现有的具有免疫保护作用的F1、LcrV亚单位联合免疫或制备的多价亚单位疫苗将能增强现有鼠疫疫苗的免疫保护效果和免疫保护范围。本发明为寻找鼠疫菌具有免疫保护功能的蛋白提供了一种新手段，将在鼠疫的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图附图
图1为体外抗原再刺激鼠疫菌EV76株免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ的Elispot图
图2为101个鼠疫菌蛋白体外再刺激EV76株免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ的情况
图3为具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白原核表达产物的12％SDS-PAGE检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物合成及测序工作均由上海生物工程有限公司完成。
实施例1、具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的筛选
用下述方法筛选具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，具体过程包括以下步骤：
一、候选基因的挑选及在大肠杆菌中的克隆、表达
通过PSORTb、SignalP和ProtcompB软件对鼠疫菌CO92株(鼠疫耶尔森氏菌第一株测序株)染色体上的4016个基因编码蛋白的细胞定位进行分析，结果有1006个基因编码的蛋白为膜相关、分泌性蛋白；对这些蛋白的跨膜区通过TopPred软件进行分析，由于含有多个跨膜区的蛋白难以进行体外表达，将所有跨膜结构区超过3个的蛋白去除。结果430个基因编码的蛋白的跨膜区少于4个；在这430个基因中，结合已有的对鼠疫菌的研究，挑选出190个已证明或推测的与鼠疫菌毒力相关的基因，加上38个鼠疫菌脂蛋白以及33个鼠疫菌质粒编码的毒力相关因子共261个基因进行体外克隆、表达。Array Designer软件设计相应引物，利用Gateway克隆表达技术(参见invitrogen公司产品手册)将基因克隆到表达载体pDEST17或利用酶切的方法将基因克隆到表达载体pET32a上。结果174个基因能够在大肠杆菌BL21(DE3)中表达相应大小的蛋白。将表达相应蛋白的基因克隆株接种在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，以1mM/L IPTG诱导重组融合蛋白表达，利用Ni-NTA层析柱纯化重组蛋白。纯化出的蛋白以0.01M PBS透析，最后用BCA蛋白检测试剂盒(PIERCE公司产品，具体方法参见产品说明书)检测蛋白浓度，用12％SDS-PAGE检测蛋白纯度。最终101个蛋白在纯度与浓度上满足下一步进行细胞免疫功能检测的需要。
二、鼠疫菌EV76株免疫BALB/c小鼠模型的构建
将26℃培养的鼠疫耶尔森氏菌活疫苗EV76株通过肌肉途径免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠(5×106CFU/只，动物由军事医学科学院实验动物中心提供)，PBS组为对照组。28天后鼠尾取血，ELISA检测血清抗F1抗体的滴度，结果EV76免疫小鼠抗F1抗体的滴度为1∶6400-1∶12800，说明鼠疫耶尔森氏菌活疫苗EV76株免疫小鼠后能够刺激小鼠产生针对鼠疫菌的免疫反应。免疫后第35天眼球取血处死小鼠，无菌取小鼠脾。
三、Elispot试验筛选在鼠疫菌免疫过程中能够刺激T细胞免疫反应的蛋白
分别将3只EV76免疫小鼠或对照小鼠的脾合并，200目的铜网分离小鼠脾细胞。利用Elispot技术(BD公司产品，具体方法参见产品说明书)检测步骤一获得的101个重组表达的鼠疫菌蛋白(10μg/mL)体外刺激EV76株免疫小鼠脾细胞中能够分泌IFN-γ的细胞数，从而筛选能够刺激T淋巴细胞反应的蛋白。结果如图1、图2和表1所示，以分泌IFN-γ的细胞数大于100/106脾细胞为标准，34个蛋白能够明显的刺激鼠疫耶尔森氏菌EV76株免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ。
表1在鼠疫耶尔森氏菌EV76活疫苗株免疫小鼠体内能够刺激T细胞反应的蛋白
四、具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的筛选
在上述34个蛋白中，关于YPCD1.26c、YPCD1.28、YPCD1.31c、YPCD1.55c、YPO1303、和YPO3015免疫保护性的研究已有文献报道(Benner GE，Andrews GP，Byrne WR，et.al，Immune response to Yersinia outer proteins and other Yersinia pestis antigensafter experimental plague infection in mice.Infect Immun 1999，67(4)：1922-1928；Leary SE，Griffin KF，Galyov EE，et.al，Yersinia outerproteins(YOPS)E，K and N are antigenic but non-protective compared to Vantigen，in a murine model of bubonic plague.Microb Pathog 1999，26(3)：159-169；Tanabe M，Atkins HS，Harland DN，et.al，The ABC transporterprotein OppA provides protection against experimental Yersinia pestisinfection.Infect Immun 2006，74(6)：3687-3691；Matson JS，Durick KA，BradleyDS，et.al，Immunization of mice with YscF provides protection from Yersiniapestis infections.BMC Microbiol 2005，5(1)：38)；而YPO2092、YPO2109和YPO2120的编码基因位于鼠疫菌91001株(与进行鼠疫菌攻击试验所用菌株122株同属于布氏田鼠型鼠疫菌，Song，Y.，Z.Tong，J.Wang，et.al，Complete genome sequence ofYersinia pestis strain 91001，an isolate avirulent to humans.DNA Res，2004，11：179-97)中缺失的33Kb大片段上，无法进行免疫保护试验。因此对表1中其余的25个鼠疫菌候选疫苗靶标的免疫保护进行研究。以CpG1826(5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′)为免疫佐剂，在第0、21、35天以15μg蛋白+10μg CpG佐剂100μl免疫BALB/c小鼠(10只/组)，同时以单独免疫10μg CpG或PBS的小鼠为阴性对照，以15μg LcrV+10μg CpG佐剂为阳性对照。
在初次免疫后60天以鼠疫菌122株(与已测序菌株91001株分离于同一鼠疫疫源地。属于布氏田鼠型，此类鼠疫菌对小鼠具有强毒性，但对人类无致病力。与对人具有致病性的鼠疫菌CO92株和KIM株相比，其染色体上缺失一33kb的染色体片段。此菌株由青海地方病研究所分离，对BALB/c小鼠的半数致死量LD50为6CFU)进行免疫保护性检测(攻菌量分别为20LD50和100LD50，攻菌试验在BSL-3中操作与观察)。结果YPO0606、YPO0612、YPO1914、YPO3119、YPO3047、YPO0420、YPCD1.05c、YPO1377和YPO3720能够明显保护小鼠抵御20LD50鼠疫菌的攻击(P＜0.01，差异具有显著性)，说明这些蛋白能够在鼠疫菌感染过程中起到部分保护作用。其中，YPO0606具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列，由480个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：10的核酸序列；YPO0612具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列，由381个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：11的核酸序列；YPO1914具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列，由234个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：12的核酸序列；YPO3119具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列，由421个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：13的核酸序列；YPO3047具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列，由423个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：14的核酸序列；YPO0420具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列，由328个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：15的核酸序列；YPCD1.05c具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列，由129个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：16的核酸序列；YPO1377具有序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列，由177个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：17的核酸序列；YPO3720具有序列表中SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列，由421个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：18的核酸序列。
实施例2、具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的原核表达及表达产物的纯化
用下述原核表达的方法获得具有细胞免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，具体方法为：利用位点特异性重组，通过Gateway克隆技术，将具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白相应基因编码序列(YPO0606、YPO0612、YPO1914、YPO3119、YPO3047、YPO0420、YPO1377和YPO3720)克隆入表达载体pDEST17(invitrogen公司)，得到具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的原核表达载体(分别命名为pDEST17-YPO0606、pDEST17-YPO0612、pDEST17-YPO1914、pDEST17-YPO3119、pDEST17-YPO3047、pDEST17-YPO0420、pDEST17-YPO1377和pDEST17-YPO3720)，对于具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白YPCD1.05c编码序列采用限制性内切酶的方法克隆入表达载体pET32a，得到具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的YPCD1.05c原核表达载体(pET32a-YPCD1.05c)。将表达载体转染至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。挑取PCR鉴定阳性的单克隆，接种至5mL LB液体培养基中，37℃、150rpm培养12小时，然后按1∶100的比例接种于200mL LB液体培养基中，在37℃、150rpm下振荡培养，待O.D600＝0.8时，加入IPTG(终浓度为1mM/L)，28℃诱导4小时。离心收集菌体，重悬于7mL细菌裂解液(50mM/L NaH2PO4，300mM/L NaCl，10mM/L咪唑pH＝8)。超声波裂解仪裂解细胞，通过高速低温冷冻离心机10000rpm离心30分钟，将上清与沉淀分开，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达形式。以Ni合琼脂糖层析柱纯化相应蛋白，以包涵体形式表达的蛋白以包涵体复性液稀释(0.1M/L Tris.Cl，1mM/L EDTA，1M/L Urea，0.25mM/L GSSG，2mM/L GSH，0.4M/LL-Arg，pH＝8)复性。所有纯化出的蛋白均以0.01M PBS透析24h。用12％SDS-PAGE检测表达蛋白的纯化效果，检测结果如图3所示(M：蛋白低分子量marker；1：YPO0606；2：YPO0612；3：YPO1914；4：YPO3119；5：YPO3047；6：YPO0420；7：YPCD1.05c；8：YPO1377；9：YPO3720)，表明经表达获得了纯度较高的约52.7KD、45.6KD、28.1KD、50.7KD、50.3KD、38.7KD、32.1KD、22KD、49.3KD的具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白。
序列表
Claims (11)
1.具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白，其序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列。
2.编码权利要求1所述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。
6.含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
7.一种表达权利要求1所述具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的方法，是将含有权利要求2或3所述编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用于构建含有权利要求2或3所述编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的重组大肠杆菌表达载体的出发载体为pET-22b(+)、pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)、pET-30a、pQE-30、pMAL-2、pMXB10、pDEST17、pDEST15、pDEST14或pDEST24。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：以pDEST17或pET32a为出发载体，构建的含有编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因的大肠杆菌表达载体为pDEST17-YPO0606、pDEST17-YPO0612、pDEST17-YPO1914、pDEST17-YPO3119、pDEST17-YPO3047、pDEST17-YPO0420、pET32a-YPCD1.05c、pDEST17-YPO1377和pDEST17-YPO3720。
10.权利要求1所述的具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白在制备鼠疫亚单位疫苗中的应用。
11.权利要求2所述编码具有免疫保护功能的鼠疫菌蛋白的基因在制备鼠疫核酸疫苗中的应用。
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