CN101233153A - 参与昆虫c-JUN氨基端激酶活性而调控害虫的生理条件的试剂 - Google Patents

参与昆虫c-JUN氨基端激酶活性而调控害虫的生理条件的试剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供调控害虫的生理条件的试剂，其中所述试剂具有调控昆虫c－Jun NH2－端激酶活性的能力；用于检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括在c－Jun NH2－端激酶与测试物质接触的反应系统中检测c－Jun NH2－端激酶活性的步骤，等等。

Description

参与昆虫c-JUN氨基端激酶活性而调控害虫的生理条件的试剂
技术领域
本发明涉及一种调节害虫的生理条件的试剂，所述试剂参与昆虫c-Jun NH2-端激酶活性，等等。
背景技术
关于昆虫c-Jun NH2-端激酶，例如，已经提出：
由bsk基因编码的黑腹果蝇(D.melanogaster)c-Jun NH2-端激酶早在胚胎时期就参与不同的生理过程，并且bsk在培养的细胞中调控免疫应答和体内的形态发生(例如，Sluss等，Genes Dev.(基因发育)10(21)：2745-58，1996)；
发育信号传导蛋白无翅(wg)和c-Jun NH2-端激酶信号传导级联共同合作促进背向闭合和腹侧图案模式(例如，McEven等，Development(发育)；127(16)：3607-17，2000)；
c-Jun NH2-端激酶信号传导级联对于正常的翅膀发育不是必需的，只是当信号水平不正常时，所述级联需要作为翅膀在正常位置发育的信息，这没有在c-Jun NH2-端激酶信号传导级联正常的发育中观察到，但是当所述信号级联变得异常时，所述激酶被激活，以提供保持适当的发育的系统(例如，Adachi-Yamada等，Nature(自然)，400(6740)；166-9，1999)，等等。
另外，在黑腹果蝇中，一种无效突变表型被描述为胚胎隐性致死性的，其与昆虫c-Jun NH2-端激酶的核心功能一致。已经分离的影响胚胎背部角质层和胚胎背部表皮的突变。
在黑腹果蝇发育过程中，c-Jun NH2-端激酶信号传导途径调节形态发生组织闭合运动，其包括细胞形状变化和肌动蛋白细胞-骨架的识别(例如，Noselli等，Curr Opin Genet Dev.(遗传发育学当代观点)，9(4)：466-72，1999)。此外，在黑腹果蝇中，已经描述c-Jun NH2-端激酶丢失功能的突变，其在胚胎阶段是致死性的。(例如，Sluss等，Genes Dev.(基因发育)10(21)：2745-58，1996)。
农业化学品的发现传统上是基于随机筛选过程，通常直接检测具体的化学品对整个生物体诸如昆虫、真菌和/或植物的作用，并且确定生物活性。一旦发现具有适当生物活性的化学化合物，需要更深刻的研究来专门确定这些化合物在分子水平上的作用模式或作用位点，以预测这些化合物的安全性和环境负担。
发明内容
本发明描述一种更基于靶点的筛选农业化学品的方法，其中针对已经鉴定为与化学妨碍目标位点的目的生物学和/或生理学相关的特异的靶点筛选控制昆虫或其它有害生物体的化合物。
具体地，本发明描述调控害虫的生理条件并且具有调控害虫c-JunNH2-端激酶活性的能力的试剂用于控制害虫。
即，本发明提供：
1.一种调控害虫的生理条件的试剂，其中所述试剂具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力；
2.按照第1项的试剂，其中所述c-Jun NH2-端激酶是棉蚜c-Jun NH2-端激酶；
3.按照第1项的试剂，其中所述试剂是杀虫剂；
4.按照第1项的试剂，其中所述调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力是抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力；
5.一种杀虫剂，其包括具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的物质或者所述物质的农业可用的盐作为活性成分；
6.按照第5项的杀虫剂，其中所述物质具有抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力；
7.按照第6项的杀虫剂，其中所述物质具有在不含细胞的系统中抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力，其中存在10μM或更多的所述物质时，所述c-Jun NH2-端激酶的活性低于不存在所述物质时的活性；
8.按照第6项的杀虫剂，其中所述物质具有在不含细胞的系统中抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力，具有100μM或更低的IC50；
9.检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括：
(1)第一步，检测选自下组A的c-Jun NH2-端激酶在所述c-Jun NH2-端激酶与测试物质接触的反应系统中的活性；和
(2)第二步，基于通过比较在第一步中测定的活性与对照活性而获得的差别评估所述测试物质的杀虫活性；
<组A>
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；
(b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1有83％或更高的序列相同性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；
(e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有65％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(f)包含由多聚核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(g)包含昆虫c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的蛋白；和
(h)包含棉蚜c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的蛋白；
10.筛选杀虫物质的方法，其包括选择具有通过按照第9项的方法评估的杀虫活性的物质；
11.一种杀虫剂，其包括通过按照第10项的方法选择的物质或其农业可用的盐作为活性成分；
12.控制害虫的方法，其包括将有效量的按照第5、6、7、8或11项的杀虫剂应用到害虫、害虫栖息地或要防治害虫的植物；
13.一种控制害虫的方法，其包括：
鉴定具有通过按照第9项的方法评估的杀虫活性的物质，并且
将害虫与所鉴定的杀虫物质接触；
14.一种昆虫c-Jun NH2-端激酶，其包含选自下组B的氨基酸序列：
<组B>
(a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；
(b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1有95％或更高的序列相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；
(e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有75％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(f)由多聚核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；和
(g)棉蚜c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列；
15.昆虫c-Jun NH2-端激酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用；
16.按照第14项的昆虫c-Jun NH2-端激酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用；
17.一种多聚核苷酸，其包含编码按照第14项的c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的核苷酸序列；
18.按照第17项的多聚核苷酸，其包括核苷酸序列SEQ ID NO：2；
19.一种多聚核苷酸，其包含与按照第17或18项的多聚核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
20.一种多聚核苷酸，其包含：
按照第17或18项的多聚核苷酸的部分核苷酸序列；或
与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；
21.按照第20项的多聚核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：3或4；
22.获得包含编码c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括：
通过聚合酶链式反应扩增需要的多聚核苷酸的步骤，聚合酶链式反应使用按照第20或21项的多聚核苷酸作为引物；
鉴定所扩增的需要的多聚核苷酸的步骤；和
回收所鉴定的多聚核苷酸的步骤；
23.获得包含编码c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括：
通过杂交检测需要的多聚核苷酸的步骤，杂交使用按照第19、20或21项的多聚核苷酸作为探针；
鉴定所检测的需要的多聚核苷酸的步骤；和
回收所鉴定的多聚核苷酸的步骤；
24.一种包含按照第17或18项的多聚核苷酸的核苷酸序列的环形多聚核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地与杆状病毒启动子连接；
25.按照第24项的环形多聚核苷酸，其中所述启动子是多角体蛋白基因启动子；
26.按照第24或25项的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起点；
27.按照第24、25或26项的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含杆状病毒穿梭载体和能够作为病毒在昆虫细胞中繁殖的核苷酸序列；
28.制备环形多聚核苷酸的方法，其包括将按照第17或18项的多聚核苷酸连接到载体中；
29.一种转化体，其中引入按照第17或18项的多聚核苷酸；
30.按照第29项的转化体，其中所述转化体是转化的昆虫细胞；
31.制备转化体的方法，其包括将按照第17或18项的多聚核苷酸引入到宿主细胞中；
32.一种重组杆状病毒，在其基因组中包含按照第17或18项的多聚核苷酸；
33.生产c-Jun NH2-端激酶的方法，其包括培养按照第29或30项的转化体并且回收所生产的c-Jun NH2-端激酶的步骤；
34.按照第14项的c-Jun NH2-端激酶或按照第17-21项中任一项的多聚核苷酸作为研究工具的应用；
35.按照第34项的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工具；和
36.一种系统，其包括：
输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的装置，其中所述能力是调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力；
基于需要的标准查询并且回传(retrieve)数据信息的装置；和
显示并且输出查询和回传的结果的装置。
实行本发明的方式
本发明将在下文中详细地阐释。
在本发明中，“害虫”是指通过直接伤害人和动物或者通过损害农作物而给人的生活带来伤害或不适的小动物。它的实例包括节肢动物诸如昆虫、螨类、蜱类和线虫类(Nematoda)，并且其典型的实例如下：
半翅目(Hemiptera)：
飞虱科(Delphacidae)如灰飞虱(Laodelphax striatellus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)和白背稻飞虱(Sogatella furcifera)，角顶叶蝉科(Deltocephalidae)如黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和Empoasca onukii，蚜科(Aphididae)如棉蚜(Aphis gossypii)和桃蚜(Myzus persicae)，蝽科(Pentatomidae)，粉虱科(Aleyrodidae)如温室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)和Bemisia argentifolli，蚧科(Coccidae)，网蝽科(Tingidae)，木虱科(Psyllidae)，等；
鳞翅目(Lepidoptera)：
螟蛾科(Pyralidae)如二化螟(Chilo suppressalis)、稻纵卷叶野螟(Cnaphalocrocis medinalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nuhilalis)和Parapediasiateterrella，夜蛾科(Noctuidae)如斜蚊贪夜蛾(Spodoptera litura)、贪夜蛾(Spodoptera exigua)、粘虫(Pseudaletia separata)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉夜蛾属(Trichoplusia spp.)、实夜蛾属(Heliothis spp.)、Helicoverpa和山卷蛾(Earias spp.)，粉蝶科(Pieridae)如菜粉蝶日本亚种(Pieris rapae crucivora)，卷蛾科(Tortricidae)如棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana fasciata)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)和苹果皮小卷蛾(Cydia pomonella)，蛀果蛾科(Carposinidae)如桃蛀果蛾(Carposina niponensis)，Bucculatricidae如桃潜夜蛾(Lyonetiaclerkella)，细蛾科(Gracillariidae)如金纹小潜细蛾(Phyllonorycterringoniella)，夜潜蛾科(Phyllocnistidae)如柑橘夜潜蛾(Phyllocnistiscitrella)，巢蛾科(Yponomeutidae)如小菜蛾(Plutella xylostella)，麦蛾科(Gelechiidae)如红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)，灯蛾科(Arctiidae)，谷蛾科(Tineidae)，等；
双翅目(Diptera)：
库蚊属(Culex)如淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、三带喙库蚊(Culestritaeniorhynchus)和致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)，伊蚊属(Aedes)如埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)，按蚊属(Anopheles)如中华按蚊(Anophelinae sinensis)，摇蚊科(Chironomidae)，蝇科(Muscidae)如家蝇(Musca domestica)和厩腐蝇(Muscina stabulans)，丽蝇科(Calliphoridae)，麻蝇科(Sarcophagidae)，夏厕蝇(Fanniacanicularis)，花蝇科(Anthomyiidae)如灰地种蝇(Delia platura)和葱地种蝇(Delia antigua)，实蝇科(Trypetidae)，果蝇科(Drosophilidae)，毛蠓科(Psychodidae)，蚋科(Simuliidae)，虻科(Tabanidae)，螫蝇科(Stomoxyidae)，潜蝇科(Agromyzidae)，等；
翘翅目(Coleoptera)：
谷物食虫(Diabrotica)如西方谷物食虫(Diabrotica virgifera)和南方谷物食虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)，金龟科(Scarabaeidae)如古铜异丽金龟(Anomala cuprea)和多色异丽金龟(Anomala rufocuprea)，象虫科(Curculionidae)如玉米象(Sitophilus zeamais)、稻水象(Lissorphoptrus oryzophilus)和绿豆象(Calosobruchys chinensis)，拟步甲科(Tenebrionidae)如黄粉甲(Tenebrio molitor)和赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)，叶甲科(Chrysomelidae)如水稻负泥虫(Oulema oryzae)、黄守瓜(Aulacophora femoralis)、黄曲条菜跳甲(Phyllotreta striolata)和马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)，窃蠹科(Anobiidae)，瓢虫(Epilachna spp.)如二十八斑瓢虫(Epilachna vigintioctopunctata)，粉蠹科(Lyctidae)，长蠹科(Bostrychidae)，天牛科(Cerambycidae)，毒隐翅虫(Paederus fuiscipes)，等；
缨翅目(Thysanoptera)：
蓟马科(Thripidae)，如包括palmi蓟马(Thrips palmi)的蓟马(Thripsspp.)，包括西方花蓟马(Flankliniella occidentalis)的花蓟马(Frankliniellaspp.)，包括Sciltothrips dorsalis的Sciltothrips，管蓟马科(Phlaeothripidae)，等；
膜翅目(Hymenoptera)：
叶蜂科(Tenthredinidae)，蚁科(Formicidae)，胡蜂科(Vespidae)，等；
网翅目(Dictyoptera)：
蜚蠊科(Blattidae)，Blattellidae，等；
直翅目(Orthoptera)：
剑角蝗科(Acrididae)，蝼蛄科(Gryllotalpidae)，等；
蚤目(Siphonaptera)：
人蚤(Pulex irritans)，等；
虱目(Anoplura)：
体虱(Pediculus humanus capitis)，等；
等翅目(Isoptera)：
白蚁科(Termitidae)，等；
蜱螨目(Acarina)：
叶螨科(Tetranychidae)如二斑叶螨(Tetranychus urticae)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)和小爪螨(Oligonychus spp.)，瘿螨科(Eriophyidae)如橘刺皮瘿螨(Aculops pelekassi)和斯氏针刺瘿螨(Aculus schlechtendali)，跗线螨科(Tarsonemidae)如侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)，细须螨科(Tenuipalpidae)，杜克螨科(Tuckerellidae)，硬蜱科(Ixodidae)如长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)、台湾革蜱(Dermacentor taiwanicus)、卵形硬蜱(Ixodes ovatus)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)和微小牛蜱(Boophilus microplus)，粉螨科(Acaridae)如腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)，皮刺螨科(Dermanyssidae)，肉食螨科(Cheyletidae)如粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)和屋尘螨(Dermatophagoides ptrenyssnus)，诸如普通肉食螨(Cheyletus eruditus)、马六甲肉食螨(Cheyletus malaccensis)和Cheyletusmoorei、皮刺螨(Dermanyssus spp.)，等；
线虫类(Nematodes)：
咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)，伪短体线虫(Pratylenchusfallax)，大豆异皮线虫(Heterodera glycines)，马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)，北方根结线虫(Meloidogyne hapla)，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，等。
在本发明中，“调控害虫的生理条件”是指将生命体内诸如各种现象或其机制的条件改变成不同于通常条件的条件，所述现象是害虫生存应该维持的，例如，功能如呼吸、消化、分泌、体液循环、新陈代谢、神经传递等。实例包括通过停止呼吸以致不提供害虫内部新陈代谢必需的氧气而改变条件，和通过停止害虫的神经传递功能以致终止害虫的各种活动而改变条件。
在本发明中，“调控害虫的生理条件的试剂”是当对害虫应用时可以调控害虫的生理条件的试剂。
在本发明中，“昆虫c-Jun NH2-端激酶”是指在昆虫中存在的c-JunNH2-端激酶，是在各种生物体中存在的c-Jun NH2-端激酶之一。在本文中，昆虫是在动物界(Animalia)，节肢动物门(Arthropod)，昆虫纲(Insecta)下分类的动物，并且它的实例包括下列各目的节肢动物：Protura，弹尾目(Collembola)，双尾目(Diplura)，缨尾目(Thysanura)，蜉蝣目(Ephemeroptera)，蜻蜓目(Odonata)，织翼夜蛾目(Plecoptera)，蛩蠊目(Grylloblattodea)，直翅目(Orthoptera)，Phasmatodea，革翅目(Dermaptera)，螳螂目(Mantodea)，Blattaria，等翅目(Isoptera)，纺足目(Embioptera)，啮虫目(Psocoptera)，食毛目(Mallophaga)，虱目(Anoplura)，缨翅目(Thysanoptera)，半翅目(Hemiptera)，脉翅目(Neuroptera)，长翅目(Mecoptera)，毛翅目(Trichoptera)，鳞翅目(Lepidoptera)，鞘翅目(Coleoptera)，双翅目(Diptera)，膜翅目(Hymenoptera)，蚤目(Siphonaptera)，捻翅目(Strepsiptera)，等。
c-Jun NH2-端激酶(EC 2.7.1.37)是一种蛋白激酶，并且是具有将ATP的磷酸基转移到c-Jun上的活性的MAP激酶家族的一员。
本领域的技术人员公知的一些检测可以用来监测c-Jun NH2-端激酶活性。这些检测使用天然的底物或合成的肽-底物。例如，c-Jun NH2-端激酶活性可以应用基于放射活性的检测进行监测，所述检测使用生物素化的c-Jun融合蛋白作为底物。另一个使用c-Jun融合蛋白监测c-Jun NH2-端激酶活性的实例是激酶-Glo发光激酶检测。第三个使用合成的肽底物监测c-Jun NH2-端激酶活性的实例是荧光偏振。ATF-2(活化转录因子2)是c-JunNH2-端激酶底物的一个实例(Fowler Ann等，(2002)，AnalyticalBiochemistry(分析生物化学)308(2002)223-231)。
尽管已经显示结合如7-mers一样小的肽，但是认为在肽中的9-12个残基与Ser/Thr蛋白激酶中的活性位点裂口接触。肽底物的特异性通常限制在磷酸化作用位点的残基+3到-3，尽管这一区域之外的残基偶尔可以贡献底物特异性。激酶的肽底物可以从已知的内源底物的序列和文献信息选择。应用所述方法，设计了多种不同的肽底物。例如，通过基于放射活性的方法，检测了关于来源于棉蚜的c-Jun NH2-端激酶底物的活性。从这些检测结果，例如，可以选择具有最高的磷酸基转移活性的底物。关于这样的底物，例如，存在由氨基酸序列SEQ ID NO：14组成的肽。
一种选择的肽底物可以用于上文所述的基于放射活性的方法，并且，例如，c-Jun NH2-端激酶活性可以应用使用IMAP技术的荧光偏振方法进行检测。IMAP技术基于磷酸对固定在纳米颗粒上的金属(MIII)配位复合物的高亲和性结合。这种IMAP结合试剂与在c-Jun NH2-端激酶反应中生成的荧光磷酸肽上的磷酸基复合。这一结合引起肽的分子运动速率的变化，并且导致对于在所述肽的末端附着的荧光标记所观察到的荧光偏振值的增加。
在上文提及的各种检测c-Jun NH2-端激酶活性的方法中，上文提及的荧光偏振方法理想地作为许多样品的c-Jun NH2-端激酶活性的自动并且有效的检测方法，所述荧光偏振方法应用IMAP技术，使用由氨基酸序列SEQ ID NO：14组成的肽作为底物。实例包括这样的方法，即，按照在所述系统上附加的手册中所述的方法，使用具有发展的结合系统的IMAP筛选快速试剂盒(IMAP screening Express Kit)(由分子装置(MolecularDevice)制备)，并且使用包含在氨基端加上生物素的氨基酸序列SEQ IDNO：13的肽作为底物，和使用包含羧基端被荧光标记的氨基酸序列SEQID NO：14的肽作为底物。
另外，检测昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的方法可以通过与上述方法相似的方法进行。
在不同的昆虫物种中已经鉴定了一些c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列，例如，在黑腹果蝇中(登记号AAB51187)，在刚比亚按蚊(Anophelesgambiae)中(登记号EAA05905)，在白纹伊蚊(Aedes albopictus)中(登记号AA031950)，在意大利蜜蜂(Apis mellifera)中(登记号XP_392806)，等等，这些可以在公共数据库中找到。此外，已经在不同的昆虫物种中鉴定了一些c-Jun NH2-端激酶基因的核苷酸序列，例如，在黑腹果蝇中(登记号NM_164900)，在刚比亚按蚊(Anopheles gambiae)中(登记号XM_310236)，在白纹伊蚊(Aedes albopictus)中(登记号AF515780)，在意大利蜜蜂(Apis mellifera)中(登记号XM_392806)等等，这些可以在公共数据库中找到。
另外，按照下文所述的方法，可以从棉蚜鉴定c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列和c-Jun NH2-端激酶基因的核苷酸序列。所鉴定的棉蚜c-JunNH2-端激酶的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中显示，并且棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的核苷酸序列在SEQ ID NO：2中显示。
在除昆虫之外的动物中已经鉴定了一些c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列，例如，在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中(登记号NP_741434)，在智人(Homo sapiens)中(登记号NP_002744，NP_620448，NP_620446)，等等，这些可以在公共数据库中找到。此外，在除昆虫之外的动物中已经鉴定了一些c-Jun NH2-端激酶基因的核苷酸序列，例如，在秀丽隐杆线虫中(登记号NM_171371)，在智人(Homo sapiens)中(登记号NM_002753，NM_138982，NM_138980)，等等，这些可以在公共数据库中找到。
表1显示棉蚜c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)与在其它动物中发现的c-Jun NH2-端激酶及其基因的序列的序列相同性。
表1
  序列来源 相对于SEQ IDNO：1的氨基酸序列的相同性(％)   相对于SEQ IDNO：2的核苷酸序列的相同性(％)
黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)   84.0   71.3
意大利蜜蜂(Apis mellifera)   88.4   69.6
白纹伊蚊(Aedes albopictus)   92.1   69.4
刚比亚按蚊(Anopheles gambiae)   88.5   67.9
秀丽隐杆线虫(Ceanorhabditiselegans)   71.8   60.6
智人(Homo sapiens)JNK1   82.4   61.8
智人JNK2   80.0   62.9
智人JNK3   62.2   58.8
调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力是指增加或者减少昆虫c-JunNH2-端激酶活性的能力，即，意指激活c-Jun NH2-端激酶的能力，或者抑制c-Jun NH2-端激酶活性的能力。并且，可以向检测c-Jun NH2-端激酶活性的反应系统中加入测试物质，以研究所述测试物质对c-Jun NH2-端激酶活性的影响。
已知SP600125(Bennett BL等，Proc Natl Acad Sci USA.(美国国家科学院学报)2001年11月20；98(24)：13681-6.)等为具有抑制c-Jun NH2-端激酶活性的能力的物质。
反应中测试物质的IC50值意指不含测试物质的反应的活性的50％被抑制的测试物质的浓度。测试物质的IC50值可以通过这样确定：将不同浓度的测试物质添加到c-Jun NH2-端激酶活性检测反应系统中，检测在添加的测试物质的每一浓度(剂量)的c-Jun NH2-端激酶活性(反应)，产生剂量-反应曲线，并且计算c-Jun NH2-端激酶活性被抑制50％时的所加入的测试物质的浓度。更具体地，剂量-反应曲线可以应用四参数逻辑模型或S形剂量-反应模型生成：
f(x)＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))
f ( x ) = A + B - A 1 + ( C / x ) D
以计算IC50值。特别地，IC50值可以应用商购计算软件XLfit(由IDBS制作)进行计算。
具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的试剂是一种含有具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的物质作为活性成分的试剂。
在本发明中，“调控害虫的生理条件的试剂，其中所述试剂具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力”是一种具有通过前文提及的检测方法指明的调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的试剂，并且意指可以调控害虫的生理条件的试剂。所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中昆虫c-Jun NH2-端激酶是棉蚜c-Jun NH2-端激酶。另外，所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中调控害虫的生理条件的试剂是杀虫剂。另外，所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力是抑制使用SEQ ID NO：14的肽作为底物的反应的能力。
在本发明中，“杀虫剂”是指具有控制害虫的能力的试剂。除本发明中公开的方法之外，用于检测控制害虫的能力的方法的实例还包括，检测关于害虫的杀虫活性的方法。具体地，例如，可以按照下述方法检测杀虫活性。
按照昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版(Elsevier Science Publisers)1985)第35-36页所述的方法，除了制备具有下述组成(表2)的无菌人工饲料之外，并且将测试试剂在DMSO中的溶液以0.5体积％加入到人工饲料中，并且混合，饲养棉蚜，在6天后研究存活的棉蚜的数目，并且按照下述方程获得控制值。
表2
Figure A20068002825600191
控制值(％)＝{1-(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}×100
在所述方程中的字母代表下述意义：
Cb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目
Cai：在未处理部分中在观察时存活的虫子数目
Tb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目
Tai：在处理部分中在观察时存活的虫子数目
可以这样说，表现出显著高的控制值的测试试剂具有杀虫活性。更具体地，可以确定具有30％或更大的控制值的测试试剂具有实质杀虫活性，并且可以确定具有小于30％的控制值的测试试剂没有实质杀虫活性。
本发明的杀虫剂包含具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的化学物质或其农业可用的盐作为活性成分。
在本发明中，农业可用的盐是指这样形式的盐，即，控制试剂的制备及所述制剂的应用不是变得不可能，并且可以是以任何形式的盐。具体地，所述盐的实例包括与无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、和磷酸，有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、和乙磺酸，或酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸的酸式加成盐；与无机碱的盐，无机碱如钠、钾、镁和铝，与有机碱如甲胺、乙胺和乙醇胺，或碱性氨基酸如赖氨酸和鸟氨酸的盐；以及铵盐。
在本发明中，“包含具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的物质或其农业可用的盐作为活性成分的杀虫剂”意指可以通过包含具有在检测方法中鉴定的调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的物质或其农业可用的盐作为活性成分而控制害虫的试剂。所述物质的优选实例包括具有抑制c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力的化合物。所述物质的更优选的实例包括具有在不含细胞的系统中抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力的物质，其中在存在10μM或更多的所述物质下，c-Jun NH2-端激酶的活性低于在不存所述物质下的活性。另外，所述物质的其它优选的实例包括具有在不含细胞的系统中以100μM或更小的IC50值而抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力的物质。
在本发明中，“用于检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括第一步，在c-Jun NH2-端激酶与测试物质接触的反应系统中检测选自组A的c-JunNH2-端激酶的活性，和第二步，基于通过比较在第一步中测定的活性与对照的活性而获得的差别而评估测试物质的杀虫活性”是指特征在于在用于检测测试物质的杀虫能力的各种方法中包括第一步和第二步的方法。
在本文中，组A是指：
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；
(b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1有83％或更高的序列相同性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；
(e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有65％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(f)包含由多聚核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(g)包含昆虫c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的蛋白；和
(h)包含棉蚜c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的蛋白。
第一步是在通过将测试物质加入到前文提及的各种c-Jun NH2-端激酶活性检测系统中而使得c-Jun NH2-端激酶与测试物质接触的状态下检测c-Jun NH2-端激酶活性的步骤。另外，第二步是比较测试物质检测的活性与对照物质的活性并且基于差异评估杀虫能力的步骤。在本文中，对照意指，例如，在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中的情形中，其中只加入与用来溶解所述测试物质相同的溶剂的检测部分。
在具有第一步和第二步用于检测测试物质所拥有的杀虫能力的方法中所用的c-Jun NH2-端激酶是在组A中所示的蛋白。在组A的蛋白中，在由(a)代表的蛋白的氨基酸序列和由(b)，(c)，(e)，(f)，(g)和(h)代表的蛋白的氨基酸序列之间可以识别的差别是部分氨基酸的删除、取代、加成等。这些包括，例如，由于具有由(a)代表的氨基酸序列的蛋白在细胞中受到的加工引起的删除。另外，实例包括由下列各项所产生的氨基酸的删除、取代、添加等：由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过基因定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。
经受删除、取代、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现c-Jun NH2-端激酶的肽酶活性的范围内的数目。另外，氨基酸取代的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行取代。所述取代的具体实例包括在下列各组中的取代：(1)甘氨酸，丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)丝氨酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。
人工引入氨基酸的删除、添加或取代(下文，在一些情形中笼统叫作氨基酸的改变)的方法的实例包括将基因定点突变引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中，并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用amber突变的方法(缺口双链方法(gapped duplex method)，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变随机引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列反应条件下进行PCR的方法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常规浓度改变的反应条件下，或在促进聚合酶反应的Mg2+的浓度从常规浓度升高的反应条件下。PCR方法的实例包括，例如，在Method in Molecular Biology(分子生物学方法)，(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
在本文中，“序列相同性”是指两种核苷酸序列或两种氨基酸之间的相同性。“序列相同性”通过比较在待比较的序列的所有区域的最佳状态排列的两个序列而确定的。在此处，在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中，可以允许添加或删除(例如，缺口等)。可以通过使用如FASTA[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(美国科学院学报)4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，Nucleic Acid Research(核酸研究)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生序列比对的同源性分析而计算序列相同性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上可用。备选地，序列相同性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN Ver.5(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.Science(科学)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列相同性。
在(f)中所述的“严格条件”的实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在按照Sambrook J.Frisch E.F.Maniatis T.分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring HarborLaboratory press)所述的常规方法进行的杂交中，例如，杂交体在45℃在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬酸三钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤(MolecularBiology(分子生物学)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐浓度可以从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件进行选择。洗涤步骤的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件进行选择。备选地，盐浓度和温度都是可以变化的。
在(h)中描述的蛋白是指在昆虫c-Jun NH2-端激酶中存在于棉蚜中的c-Jun NH2-端激酶，并且包括含有(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。
另外，组A的蛋白包括含有在(g)中所述的昆虫c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的蛋白，并且更优选地包括这样的蛋白，即，其中当与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对时以致获得最大的序列相同性，在与氨基酸序列SEQID NO：1的(I)位置64，(II)位置66，(III)位置90，(IV)位置107，(V)位置112，(VI)位置195，(VII)位置288，(VIII)位置289，(IX)位置358，(X)位置359和(XI)位置368相对应的位置的氨基酸残基分别为(I)苏氨酸(在与64对应的位置)，(II)谷氨酰胺(在与66对应的位置)，(III)苯丙氨酸(在与90对应的位置)，(IV)丙氨酸(在与107对应的位置)，(V)精氨酸(在与112对应的位置)，(VI)苏氨酸(在与195对应的位置)，(VII)天冬氨酸(在与288对应的位置)，(VIII)精氨酸(在与289对应的位置)，(IX)丝氨酸(在与358对应的位置)，(X)缬氨酸(在与359对应的位置)和(XI)谷氨酰胺(在与368对应的位置)。在此处，“与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对以致获得最大的序列相同性”意指包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的多个待分析的氨基酸序列的序列相同性通过如上文所述的FASTA，BLAST，CLUSTAL W程序进行分析，并且对它们进行序列比对。通过所述方法比对多个序列，而不管氨基酸序列的插入或删除，可以确定每一氨基酸序列中的保守氨基酸残基的位置。认为保守氨基酸残基存在于目的蛋白的三维空间结构中的相同位置，并且推测关于目的蛋白的特异功能具有相似的作用。例如，当将包括在本发明中公开的c-Jun NH2-端激酶序列的昆虫c-Jun NH2-端激酶与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对以致获得氨基酸序列的最大的序列相同性时，显示在与氨基酸序列SEQ ID NO：1的(I)位置64，(II)位置66，(III)位置90，(IV)位置107，(V)位置112，(VI)位置195，(VII)位置288，(VIII)位置289，(IX)位置358，(X)位置359和(XI)位置368相对应的位置的氨基酸残基分别为(I)苏氨酸(在与64对应的位置)，(II)谷氨酰胺(在与66对应的位置)，(III)苯丙氨酸(在与90对应的位置)，(IV)丙氨酸(在与107对应的位置)，(V)精氨酸(在与112对应的位置)，(VI)苏氨酸(在与195对应的位置)，(VII)天冬氨酸(在与288对应的位置)，(VIII)精氨酸(在与289对应的位置)，(IX)丝氨酸(在与358对应的位置)，(X)缬氨酸(在与359对应的位置)和(XI)谷氨酰胺(在与368对应的位置)。
具有杀虫能力的物质可以通过使用检测对上文提及的害虫的杀虫能力或控制作用而测定杀虫能力的方法进行筛选。
备选地，具有杀虫能力的物质还可以通过使用c-Jun NH2-端激酶测定杀虫能力的方法进行筛选。具体地，当应用使用c-Jun NH2-端激酶测定杀虫能力的方法鉴定测试物质的杀虫能力是特定的值或更大，或者特定的值或更小时，可以通过选择所述物质而筛选具有杀虫能力的物质。
由于通过所述筛选方法选择的物质具有杀虫能力，所以它可以用作包含所述物质或农业可用的盐作为活性成分的杀虫剂。
害虫的控制通常可以通过将有效量的杀虫剂应用到被保护的农作物、害虫或害虫的栖息地而进行。
当将杀虫剂用于农业和林业时，其使用量通常关于每1000m2的杀虫剂的量为0.1到1000g。当将杀虫剂配制成乳液、水可分散的粉剂、易流动的制剂、微胶囊制剂等时，所述试剂通过用水将活性成分稀释至1到10,000ppm的浓度，并且用其喷雾而应用，并且当杀虫剂配制成粒剂、粉剂等时，所述试剂通常如其那样进行应用。
杀虫剂可以通过叶子-处理如农作物等需要防止害虫的植物而使用，并且还可以通过在移植农作物的苗之前处理苗床，或者处理在种植时的种植洞或株基而使用。此外，为了控制害虫在耕地的土壤中栖息的目的，可以通过处理所述土壤而应用所述试剂。备选地，所述试剂可以通过将已经加工成薄片或细线的树脂制剂环绕在农作物上，将所述制剂在农作物附近延伸和/或散布在株基的土壤表面而使用。
当将杀虫剂用作害虫控制剂用于防止时疫时，乳液、水可分散的粉剂、流动物等通常通过用水稀释以致活性成分的浓度为0.01到10,000ppm而应用，并且油剂、气溶胶、薰剂、毒饵等按照原样进行应用。
杀虫剂的一种用途的实例包括控制家畜如牛、绵羊、山羊和鸡或小动物如狗、猫、大鼠和小鼠的外部寄生虫，在这种情形中，所述试剂可以通过兽医已知的方法施用给动物。作为一种具体的施用方法，当意欲全身控制时，例如，所述试剂通过片剂、混合在饲料中的、栓剂、注射剂(肌内、皮下、静脉内、腹膜内等)等而施用，当意欲非全身控制时，所述试剂通过喷雾油性试剂或水性液体试剂、在治疗时进行倾倒或打点、用洗发精制剂清洗动物或给动物附上已经加工成项圈或耳签的树脂制剂的方法而应用。当施用给动物体时杀虫剂的量通常在0.1到1,000mg范围，其表示为每1kg动物化合物A和化合物B的总量。
它们的使用量和使用浓度都不同，这取决于这样的情形诸如制剂种类、使用时间、使用位置、使用方法、害虫种类、损害程度等，可以增加或减少，而不管前文提及的范围，并且可以适当地选择。
前文提及的杀虫剂可以用于上文所述的控制害虫的方法中。
另外，在另一方面，害虫还可以通过使用前文提及的测定测试物质拥有的杀虫能力的方法鉴定具有杀虫能力的物质(所述鉴定方法具有第一步和第二步，使用选自组A的c-Jun NH2-端激酶)，并且将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触而进行控制。在此处，作为将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触的方法，可以应用前文提及的制备方法、应用方法等。
组B中所示的氨基酸序列是昆虫c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列，其包含下述(a)到(g)任一种氨基酸序列。
(a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；
(b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1有95％或更高的序列相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；
(e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有75％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(f)由多聚核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；和
(g)棉蚜c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列。
在组B的氨基酸序列中，在由(a)代表的氨基酸序列和由(b)，(c)，(e)，(f)和(g)代表的氨基酸序列之间可以识别的差别是部分氨基酸的删除、取代、添加等。这些包括，例如，由于具有由(a)代表的氨基酸序列的蛋白在细胞中受到的加工引起的删除。另外，实例包括由下列各项所产生的氨基酸的删除、取代、添加等：由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过基因定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。
经受删除、取代、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现c-Jun NH2-端激酶的肽酶活性的范围内的数目。另外，氨基酸取代的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行取代。所述取代的具体实例包括在下列各组中的取代：(1)甘氨酸，丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)丝氨酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。
人工引入氨基酸的删除、添加或取代(下文，在一些情形中笼统叫作氨基酸的改变)的方法的实例包括将基因定点突变引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中，并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用amber突变的方法(缺口双链方法，Nucleic Acids Res.(核酸研究)，12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变随机引入到编码由(a)代表的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列反应条件下进行PCR的方法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常规浓度改变的反应条件下，或在促进聚合酶反应的Mg2+的浓度从常规浓度升高的反应条件下。PCR方法的实例包括，例如，在Method in Molecular Biology(分子生物学方法)，(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。
在本文中，“序列相同性”是指两种核苷酸或两种氨基酸之间的相同性。“序列相同性”通过比较在待比较的序列的所有区域的最佳状态排列的两个序列而确定的。在此处，在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中，可以允许添加或删除(例如，缺口等)。可以通过使用如FASTA[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(美国科学院学报)4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，Nucleic Acid Research(核酸研究)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生比对的同源性分析而计算序列相同性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上可用。备选地，序列相同性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN Ver.5(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.Science(科学)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列相同性。
在(f)中所述的“严格条件”的实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在按照Sambrook J.Frisch E.F.Maniatis T.分子克隆第二版，冷泉港实验出版社(Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratorypress)所述的常规方法进行的杂交中，例如，杂交体在45℃在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬酸三钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤(Molecular Biology(分子生物学)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐浓度可以从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件进行选择。洗涤步骤的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件进行选择。备选地，盐浓度和温度都是可以变化的。
具有在(g)中所述的氨基酸序列的蛋白是指在昆虫c-Jun NH2-端激酶中存在于棉蚜中的c-Jun NH2-端激酶，并且包括包含(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。
例如，具有在组B中所示的氨基酸序列的蛋白可以按照下文所述的方法使用编码在组B中所示的氨基酸序列的多聚核苷酸进行制备。
昆虫c-Jun NH2-端激酶可以用作提供评估杀虫活性的指示的试剂。具体地，例如，昆虫c-Jun NH2-端激酶可以通过用作c-Jun NH2-端激酶用于使用c-Jun NH2-端激酶测定杀虫能力的方法中而提供评估杀虫活性的指示的试剂。另外，更具体的方法可以按照前文所述的检测c-Jun NH2-端激酶活性的方法而进行。
另外，当昆虫c-Jun NH2-端激酶用作提供评估杀虫活性的指示的试剂时，更优选地，需要昆虫c-Jun NH2-端激酶是具有在组B中所示的氨基酸序列的c-Jun NH2-端激酶。
具有编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸(以下，在一些情形中叫作多聚核苷酸组B)具有可以在生物体的细胞中或体外翻译系统中产生具有组B中所示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。多聚核苷酸组B可以是从天然克隆的DNA、向从天然克隆的DNA中引入核苷酸的删除、取代或添加的DNA，例如，通过基因定点诱变或随机诱变，或人工合成的DNA。具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。
<第一种获得方法>
例如，将在下文中显示获得包含多聚核苷酸组B中所包含的核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸的方法。作为一个步骤，从棉蚜获得总RNA，合成cDNA文库，并且进行PCR扩增，由此可以获得目的多聚核苷酸。
将在盆栽黄瓜的叶片上培养的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和卵用小刷子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨10分钟，同时保持在冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公司)中。在260nm检测制备的总RNA的吸收，以按照常规方法计算浓度。
应用通过上述方法获得的棉蚜总RNA作为模板，并且按照附在试剂上的手册使用随机引物(由Invitrogen制备)和superscript III(由Invitrogen制备)进行RT-PCR，以合成cDNA文库。
应用通过上述方法获得的棉蚜cDNA文库作为模板，并且按照附在试剂上的手册使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸引物和包含核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸引物以及Pfu Turbo(由Stratagene制备)进行PCR。PCR的条件如下：在94℃温育10分钟；然后是30个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃30秒和72℃2分钟；并且接着在72℃温育7分钟。
如上文所述，可以获得包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸。
<第二种获得方法>
备选地，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸还可以通过制备具有由下列方法引入的突变的多聚核苷酸而获得：应用为上文提及的基因定点诱变的amber突变的方法、通过使用引入突变等的引物使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸作为模板的PCR方法。
<第三种获得方法>
备选地，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸还可以通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸作为探针的杂交方法而获得。更具体地，第三种获得方法可以按照在前文提及的由冷泉港实验出版社出版的Sambrook J.Frisch E.F.Maniatis T.分子克隆第二版中所述的常规杂交而进行。
<第四种获得方法>
备选地，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸还可以通过基于已知的昆虫c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列制备引物并且进行PCR而获得。为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离c-JunNH2-端激酶的同系物，应用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein Analysis Server)的网址http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html公共可用)，并且基于前文提及的来源于棉蚜的c-Jun NH2-端激酶基因序列和先前已知的Ancylostomacaninum(NCBI登记号AAF00539)，Xenopus laevis(BAB91438，BAB85483)，智人(NP_620448，NP_002744)，Mus musculus(BAC31240)，Rattusnorvegicus(S43969)，Gallus gallus(BAA19188)，果蝇(AAF52883，AAC47325)，刚比亚按蚊(EAA05905)和白纹伊蚊(AAO31950)的核苷酸序列，设计简并引物。
在选择的昆虫物种中的c-Jun NH2-端激酶基因同系物的部分序列通过一系列PCR扩增，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制备)按照附在所述试剂上的生产商的方法而进行。PCR条件为在94℃10分钟；然后是40个PCR循环，一个循环为94℃30秒，45℃1分钟和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
然后，设计对所得到的c-Jun NH2-端激酶基因的昆虫同系物的部分序列特异的引物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3’和5’RACE PCRs这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合成试剂盒(由Clontech制备)按照附在所述试剂盒上的生产商的用法指导而进行。
在3’RACE和5’RACE反应中，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的通用引物混合物(UPM)与对目的序列特异的正向引物或反向引物组合使用。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。关于引物，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物与特异的正向引物或特异的反向引物组合使用，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
上述测序结果显示5’-端序列和3’-端序列，其每一端分别编码昆虫c-Jun NH2-端激酶的N-端区域和C-端区域。
因此，在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸可以通过基于已知的昆虫c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列制备引物通过PCR而获得。
具有与多聚核苷酸组B的多聚核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用来应用杂交方法获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸。
本发明中的获得方法包括通过杂交检测需要的多聚核苷酸的步骤，鉴定所检测的需要的多聚核苷酸的步骤，和回收所鉴定的需要的多聚核苷酸的步骤。每一步骤将在下文中具体阐释。
通过杂交检测需要的多聚核苷酸的步骤和鉴定所检测的需要的核苷酸的步骤可以这样进行，即，通过使用具有与多聚核苷酸组B的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸作为探针，按照例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd edition(分子克隆：实验室手册第二版)”(1989)，冷泉港实验室出版社，“Current Protocols In Molecular Biology(当代分子生物学方法)”(1987)，John Wiley和Sons有限公司ISBN0-471-50338-X等中所述的方法进行。
具体地，例如，将具有与SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA通过已知的方法用放射性同位素或荧光标记进行标记，其使用随机引发的DNA标记试剂盒(Random Primed DNA Labelling Kit，由Boehringer制备)、随机引物DNA标记试剂盒Ver.2(由TAKARA SHUZO有限公司制备)、ECL直接核酸标记和检测系统(ECL Direct Nucleic AcidLabelling and Ditection System，由(Amersham生物科学制备)，或Megaprime DNA-标记系统(由Amersham生物科学制备)进行标记，并且这可以用作探针。
用于杂交的条件的实例包括严格条件，并且具体地，实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠)、5×Denhart’s杂交溶液(0.1％(w/v)菲克400，0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)、0.5％(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIGEASY Hby solution，Boehringer Mamnnheim)中进行温育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDFS下进行温育两次持续15分钟，并且此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和0.5％SDS下进行温育持续30分钟。更具体地，例如，可以通过应用具有与多聚核苷酸组B的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸作为模板，使用Megaprime DNA-标记系统(由AmershamPharmacia生物技术制备)并且使用在试剂盒中指定的反应溶液，而制备用32P标记的探针。使用这一探针按照常规方法进行菌落杂交，在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠)、5×Denhart’s杂交溶液(0.1％(w/v)菲克400，0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)、0.5％(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution，BoehringerMamnnheim)中进行温育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDS下进行温育两次持续15分钟，并且此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和0.5％SDS下进行温育持续30分钟，由此可以检测(包含)杂交的多聚核苷酸(的菌落)。因此，可以通过杂交检测需要的多聚核苷酸，并且可以鉴定所检测的需要的多聚核苷酸。
对于回收所鉴定的需要的多聚核苷酸，可以通过前文提及的方法，例如，按照如在“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的碱方法的方法，从含有所检测并且鉴定的多聚核苷酸的菌落回收质粒DNA。所回收的需要的多聚核苷酸(质粒DNA)的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam，A.M和W.Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，560，1977等中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，5463，1977等中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由Amersham生物科学制备)、染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(AppliedBiosystems)制备)等。
具有多聚核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多聚核苷酸或具有与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用来使用PCR获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。本发明中的获得方法包括通过PCR扩增需要的多聚核苷酸的步骤，鉴定所扩增的需要的多聚核苷酸的步骤，和回收所鉴定的需要的多聚核苷酸的步骤。每一步骤将在下文中具体阐释。
在通过PCR扩增需要的多聚核苷酸的步骤中，具体地，基于约20bp-约40bp的核苷酸序列，例如，选自由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列和与SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列有互补性的序列的核苷酸序列，从多聚核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列或与所述部分核苷酸序列有互补性的核苷酸序列设计并且合成的DNA，可以用作引物对。引物对的实例包括一套包含SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列的多聚核苷酸和包含SEQ ID NO：4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。例如，通过将商购的PCR试剂盒指定的反应溶液添加到通过前文提及的方法制备的cDNA文库中而制备PCR反应溶液。反应条件可以变化，这取决于要用的引物对，并且例如，可以应用下列条件：这样的条件，即在所述条件下，在94℃温育10分钟后，重复大约40个循环，1个循环为94℃15秒，60℃15秒，和72℃3分钟，并且继续在72℃进行温育3分钟；这样的条件，即在所述条件下，在94℃进行温育2分钟，然后在约8℃进行温育3分钟，并且然后重复大约40个循环，1个循环为94℃30秒，55℃30秒，和72℃4分钟；或者这样的条件，即在所述条件下，进行5-10个循环，1个循环为94℃5秒，然后72℃4分钟，并且继续进行约20-40个循环，1个循环为在94℃温育5秒，然后在70℃4分钟。在PCR中，例如，可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene制备)，Amplitaq Gold(由应用生物系统制备)，Takara Heraculase(商标名)(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，包含在便利cDNA PCR试剂盒(Advantage cDNA PCR Kit)中的DNA聚合酶(由Clonetech制备)，TaKaRa Ex Taq(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，PLATINUMTM PCR超级混合物(由东方生命技术(Lifetech Oriental)制备)。
通过PCR扩增的需要的多聚核苷酸的鉴定可以通过琼脂糖凝胶电泳按照“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的方法检测分子量而进行。另外，关于所扩增的需要的多聚核苷酸，使用商购的DNA测序反应试剂盒，例如，染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统制备)按照附在试剂盒上的手册进行测序反应，并且使用DNA测序仪3100(由应用生物系统制备)分析核苷酸，由此，可以读取扩增片段的核苷酸序列。
回收所鉴定的需要的多聚核苷酸的方法的实例包括按照“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的方法从琼脂糖凝胶纯化并且回收通过琼脂糖凝胶电泳鉴定的前文提及的多聚核苷酸的方法。另外，这样回收的多聚核苷酸或通过PCR扩增的需要的多聚核苷酸可以按照“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的常规方法、和“当代分子生物学方法”(1987)，John Wiley和Sons有限公司ISBN0-471-50338-X中所述的常规方法克隆到载体中。要用的载体实例包括pUCA119(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，pTVA118N(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，pBluescriptII(由Toyobo有限公司制备)，pCR2.1-TOPO(由Invitrogen制备)等。另外，克隆的多聚核苷酸的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbertmethod)(例如，在Maxam，A.M和W.Gilbert，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，560，1977中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，74，5463，1977中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由Amersham生物科学制备)、染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(Applied Biosystems)制备)等。
另外，具有多聚核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多聚核苷酸或具有与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸可以用来获得多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸，其不但使用PCR方法还使用前文提及的杂交方法。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸。
制备具有在组B中所示的氨基酸序列的蛋白的方法的实例包括培养其中引入选自多聚核苷酸组B的多聚核苷酸的转化体并且回收所生产的蛋白的方法。另外，为了制备本文所用的转化体，其为这样的工作，诸如制备包含这样的多聚核苷酸的环形多聚核苷酸，即，在所述多聚核苷酸中，选自多聚核苷酸组B的多聚核苷酸可操作性地与来源于杆状病毒的启动子连接。所述方法将在下文详细阐述。
另外，通过使用具有编码所用的c-Jun NH2-端激酶的核苷酸序列的多聚核苷酸的类似的方法可以制备并且获得在组A中所示的c-Jun NH2-端激酶，所述c-Jun NH2-端激酶用于使用c-Jun NH2-端激酶来测定杀虫能力的方法中。
杆状病毒是属于一组多变的感染许多不同物种的昆虫作为它们的天然宿主的大双链DNA病毒中的病毒。杆状病毒基因组在感染的宿主细胞的细胞核中复制并且转录，在所述宿主细胞的细胞核中大的环形杆状病毒DNA(80-200kb)包装成杆状核壳体。用于外源基因表达的分离体的实例为苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclearpolyhedrosis virus(AcMNPV))和家蚕蛾(Bombyx mori(silkworm，蚕))核型多角体病毒(BmNPV)。
杆状病毒来源的启动子意指包含在杆状病毒基因组中的基因的启动子。在它们当中，用于表达外源基因的杆状病毒启动子的实例包括多角体蛋白基因的启动子，和p10基因的启动子(Harris和Polayes(1997).Focus(焦点)19，6-8)。
多角体蛋白(多角体)基因的启动子是编码多角体蛋白的基因的启动子，所述多角体蛋白是当杆状病毒感染昆虫细胞时所产生的细胞核内内含体的主要成分。多角体蛋白不是复制病毒必需的蛋白，并且通过用目的蛋白的基因取代它的基因，可以表达数量达到细胞蛋白50％的目的蛋白。
在本发明中，“可操作性地连接”意指将包含目的基因的多聚核苷酸连接到包含启动子序列的多聚核苷酸的下游，以便目的基因可以在所用的转录系统中进行转录。具体地，例如，当使用后来描述的多角体蛋白基因的启动子时，包含目的基因的多聚核苷酸可以连接到多角体蛋白基因启动子的下游。另外，例如，当使用除多角体蛋白基因启动子之外的启动子时，还可以将包含目的基因的多聚核苷酸连接到包含除多角体蛋白基因启动子以外的启动子序列的多聚核苷酸的下游。更具体地，例如，当使用利用多角体蛋白基因启动子的质粒pFastbacHT(由Invitrogen制备)载体时，可以通过将目的基因连接到位于多角体蛋白基因启动子下游的限制酶位点如BamHI，EcoRI，SalI，SpeI，NotI，XbaI，PstI，XhoI，SphI，KpnI和HindIII而可操作性地连接多聚核苷酸。
在本发明中，“环形多聚核苷酸”是通过将多聚核苷酸链的末端结合而制成环形的多聚核苷酸，并且实例包括除了质粒DNA、杆状病毒穿梭载体DNA等以外的许多细菌的染色体DNAs。
质粒DNA是相对低分子量的环形多聚核苷酸，并且实例包括pET(由Takara Mirus生物有限公司制备)和pBluescriptII(由Stratagene制备)，其用于在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达。其它实例包括pFastBac1，pFastBac HTA，pFastBac HT B，pFastBac HT C，pFastBac Dual，pBlueBacII(由Invitrogen制备)，pAcSG2(由Pharmingen制备)等，其包含杆状病毒表达盒。
杆状病毒穿梭载体是由BAC(细菌人工染色体)组成的高分子量DNA，所述BAC包含完整的杆状病毒基因组，例如在DH10BacTM大肠杆菌细胞(invitrogen)中存在的bMON14272(136kb)。杆状病毒穿梭载体DNA在大肠杆菌细胞中作为大质粒增殖，并且可以包含用于在杆状病毒启动子控制下表达外源基因的表达盒。
在其中将包含编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸可操作性地连接到杆状病毒来源的启动子上的环形多聚核苷酸特异地为，例如，包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA的环形多聚核苷酸，并且例如，可以按照下述方法制备并且获得。
将包含按照前文提及的方法克隆的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的质粒DNA用EcoRI消化，并且将得到的包含棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的约1.3kbp DNA片段与预先用EcoRI消化的质粒载体pFastBac HT B(由Invitrogen制备)连接。所获得的质粒是包含含有与杆状病毒多角体蛋白启动子可操作性连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA的环形多聚核苷酸的一个实例。另外，按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，这一质粒可以引入到大肠杆菌(Escherichia coli)DH10Bac中，并且包含多角体蛋白基因启动子和棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA可以通过在细胞中重组而插入到杆状病毒穿梭载体DNA中。例如，通过前文提及的方法，可以制备并且获得包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA的环形多聚核苷酸。
类似地，环形多聚核苷酸可以通过将编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸连接到载体上而制备。
在本发明中，“复制起点”是对于自身在宿主细胞中复制所必需的特异的DNA序列。复制起点的实例包括用于细菌质粒的colE1和f1。另外，同源重复(hrs)区域和非-hr区域存在于杆状病毒穿梭载体DNA中(Pijlman等.(2003)Journal of General Virology(普通病毒学杂志)84，2669-2678)。
所述环形多聚核苷酸的一个实例是杆状病毒穿梭载体。在此处，杆状病毒穿梭载体意指杆状病毒穿梭载体(bacmid)DNA。杆状病毒穿梭载体DNA可以增殖并且遗传加工到大肠杆菌中。当从大肠杆菌分离并且引入到昆虫宿主细胞中时，杆状病毒穿梭载体可以作为病毒增殖。例如，在bMON14272(invitrogen)情形中，可以在大肠杆菌中产生重组杆状病毒穿梭载体，其通过将包含来自pFastBacTM供体质粒的杆状病毒表达盒的mini-Tn7元件转座到杆状病毒穿梭载体上的mini-attTn7附着位点上而产生。
用作杆状病毒增殖的宿主并且用于通过重组杆状病毒的方式而表达外源蛋白的宿主的昆虫细胞包括来源于Spodoptera frugiperda或来源于Trichoplusia ni的细胞系。所述细胞系的实例为Sf2细胞，Sf9细胞，Tn-368或High Five细胞或Mimic Sf9细胞(Invitrogen)。
转化体是通过向细胞中引入外源多聚核苷酸而遗传改变的真核细胞或原核细胞。转化体的实例包括通过引入包含杆状病毒表达盒的质粒如质粒载体pFastBac(由Invitrogen制备)而转化的大肠杆菌细胞等。另外，将DNA引入宿主细胞的技术的实例包括转化、转染、原生质体融合、脂转染、电穿孔等。
其中引入编码组B所示的氨基酸序列的多聚核苷酸的转化体的实例包括转化的大肠杆菌，在其中引入包含与杆状病毒多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA。具体地，所述转化体可以按照下述方法进行制备。
转化体可以这样制备，即通过按照在“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社中所述的方法，将在EcoRI位点插入包含棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA的质粒载体pFastBac HT B(由Invitrogen制备)引入到大肠杆菌细胞中而制备。另外，转化体还可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由Invitrogen制备)上的手册所述的方法将相同的质粒载体引入到大肠杆菌DH10Bac中而制备。
备选地，转化体还可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由Invitrogen制备)上的手册所述的方法将其中插入包含多角体蛋白基因启动子和棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的片段的杆状病毒穿梭载体DNA转染到昆虫细胞中而获得。
重组杆状病毒是在其中通过遗传-加工技术而改变杆状病毒基因组序列的杆状病毒。
重组杆状病毒的具体的实例包括，包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA片段的重组杆状病毒。重组杆状病毒可以这样制备，例如，通过杆状病毒DNA和转移载体DNA在昆虫细胞中的同源重组(Kitts(1996)Cytotechnology(细胞技术学)20，111-123)而制备。备选地，重组杆状病毒还可以这样制备，例如，通过将按照前文提及的方法制备的包含含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA片段的重组杆状病毒穿梭载体DNA引入到昆虫细胞中而制备。具体地，重组杆状病毒可以通过按照附在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(由Invitrogen制备)上的手册所述的方法，将包含含有与前文提及的杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA片段的重组杆状病毒穿梭载体DNA转染到昆虫细胞中而制备。更具体地，按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，将所述重组杆状病毒穿梭载体DNA转染到Sf9细胞(ATCC：CRL-1711)中，以获得重组的杆状病毒。对于转染，使用cellfectin(由Invitrogen制备)，补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(Grace’s Insect Cell Culture Medium)(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，和青霉素/链霉素(由生命技术制备)。另外，对于转染，使用2μg杆状病毒穿梭载体DNA和7μl cellfectin。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在8天后复苏P1重组杆状病毒储液。例如，0.5ml的这一杆状病毒储液可以进一步增殖，其通过接种在1×106个细胞/ml的300ml Sf9细胞培养物上而进行。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在4天后收集扩增的杆状病毒储液。将Sf9细胞在Erlenmeyer烧瓶中在27℃和135rpm悬浮培养。用于这种培养的培养基的成分包括补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，青霉素/链霉素(由生命技术制备)，和终浓度0.1％的普卢兰尼克F-68(Pluronic F-68，由Sigma-aldrich制备)。
c-Jun NH2-端激酶可以通过培养由前文提及的方法制备的转化体并且回收所生产的来源于昆虫的c-Jun NH2-端激酶而制备。
例如，c-Jun NH2-端激酶蛋白可以通过重组杆状病毒/Sf9细胞表达系统生产。这一系统是一种最有力和通用的可用真核表达系统，并且可以用来表达来自许多不同来源包括真菌、植物、细菌和病毒的异源基因。
备选地，c-Jun NH2-端激酶蛋白可以通过重组大肠杆菌表达系统生产。这一系统是用于异源蛋白高水平生产的最常用的原核表达系统。大肠杆菌是已知的遗传和生理上表征最好的生物体，容易操作，许多工具可用，它能够非常快速地生长，它在廉价的复合物或很好确定的基本培养基上生长，并且它具有极高的合成异源蛋白的能力。
另外，将通过培养转化体而生产的昆虫来源的c-Jun NH2-端激酶通过诸如超声、弗氏压碎器和Dyno碾碎机的方法进行裂解，并且以包含在细胞粗提物中的形式回收，并且通过使用通常在酶纯化中所用的方法诸如离子交换柱层析、反相柱层析、凝胶过滤柱层析等而获得纯化的蛋白。备选地，当设计来源于昆虫的c-Jun NH2-端激酶以具有His-标记的形式生产时，可以通过特异性识别并且结合His-标记的亲和柱层析快速从细胞粗提物中获得纯化的蛋白。通过所述方法，可以制备来源于昆虫的c-Jun NH2-端激酶。
例如，来源于昆虫的c-Jun NH2-端激酶可以这样制备，即通过培养用含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA片段转化的昆虫细胞，并且用弗氏压碎器将细胞碾碎，然后用柱层析纯化而制备。
更具体地，例如，将4×108个Sf9细胞悬浮在30ml包含重组杆状病毒穿梭载体DNA的重组杆状病毒储液中，所述重组杆状病毒穿梭载体DNA含有包含与杆状病毒多角体蛋白启动子可操作性地连接的棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的DNA片段，将混悬液在125ml Erlenmeyer中在135rpm在27℃旋转培养1小时。然后，将每1/3的细胞混悬液置于3个25ml的Erlenmeyer烧瓶中，向每个烧瓶中加入培养基，以便培养溶液的体积达到100ml，加入1ml的10％普卢兰尼克溶液，并且将这继续培养。48小时后，通过以290×g离心5分钟而收集感染杆状病毒的Sf9细胞。将缓冲液A(50mMHepes-HaOH pH7.5，0.5m NaCl，10mM咪唑)加入到所收集的Sf9细胞中，以将它们悬浮，并且使用弗氏压碎器(由Thermo Spectronic制备)按照在附加的手册中所述的方法在1,500psi的压力下将细胞裂解。将这一弗氏-加压的溶液在4℃以13,000xg离心20分钟，并且将得到的上层清液通过0.45mm过滤器过滤。然后，将这注射到用缓冲液A(50mM Hepes-HaOH pH7.5，0.5m NaCl，10mM咪唑)平衡的串联连接的两个HiTrap/HisTrap亲和柱(柱体积5ml，由Amersham生物科学制备)上，并且用100ml缓冲液A洗涤柱。然后，用150ml通过混合93％的缓冲液A和7％的缓冲液B(50mMHepes-HaOH pH7.5，0.5m NaCl，500mM咪唑)而获得的缓冲液洗涤柱。最后，将60ml通过混合50％的缓冲液A和50％的缓冲液B而获得的缓冲液注射到柱上。分离每1ml的洗脱级分，并且保存，并且用SDS-PAGE分析等分物，以鉴定含有46Kda c-Jun NH2-端激酶的级分。
此外，为了提高c-Jun NH2-端激酶的活性，可以将c-Jun NH2-端激酶用MKK4/SKK1，活性分子(active，由Upstate制备)和MKK7β1，活性分子(active，由Upstate制备)温育。在这一情形中，在附在MKK4/SKK1，活性分子(active，由Upstate制备)和MKK7β1，活性分子(active，由Upstate制备)上的手册中所述的部分激酶检测方法可以进行改进，并且可以激活c-Jun NH2-端激酶。
需要的缓冲液和试剂包括：
(i)Hepes缓冲液，MgCl2，ATP；
(ii)重组的MKK4/SKK1，在大肠杆菌(Upstate)中活性表达，以53.5μM的终浓度保存在50mM Tris/HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.1mM EGTA，0.03％Brij 35，270mM蔗糖，1mM苄脒，0.2mMPMSF，0.1％2-巯基乙醇中；和
(iii)重组的MKK7β1，在大肠杆菌(Upstate)中活性表达，以14.6μM的终浓度保存在50mM Tris/HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.1mMEGTA，0.03％Brij 35，270mM蔗糖，1mM苄脒，0.2mM PMSF，0.1％2-巯基乙醇中。
纯化的c-Jun NH2-端激酶的磷酸化在10ml的终体积通过下述步骤进行。
首先，混和所有的1ml Milli Q水，1ml 500mM Hepes缓冲液，2mlMKK4/SKK1，活性分子(375nM)和MKK7β1，活性分子(375nM)的混合物，和2ml MgCl2(75mM)与ATP(570μM)的混合物，并且将4ml的c-JunNH2-端激酶(1mg/ml)添加到所述混合物中。然后，将所述混合物在室温温育1小时。将用不同批次激活的全部的c-Jun NH2-端激酶收集在一起，并且向其中加入甘油至终浓度10％。然后，将这分成每份1ml，并且保存在-80℃。
应该理解，其它激活方法也是可能的，例如：Ian N.Foltz，等(TheJournal of Biological Chemistry(生物的化学杂志)(1998)卷273，9344-9351)所述的体内刺激。
包含组B中所示的氨基酸序列的昆虫c-Jun NH2-端激酶可以用作研究工具。例如，它可以用作进行诸如检测杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等的研究的研究工具。另外，例如，在分析作用c-Jun NH2-端激酶的试剂的作用和机制的研究中，c-Jun NH2-端激酶也可以用作研究工具。
另外，编码在组B中所示的氨基酸序列的多聚核苷酸和具有与它们有互补性的核苷酸序列的多聚核苷酸，以及编码在组B中所示的氨基酸序列的多聚核苷酸的部分核苷酸序列，或具有与所述部分核苷酸序列有互补性的核苷酸序列的多聚核苷酸，和包含(complying)由SEQ ID NO：3或4代表的核苷酸序列的多聚核苷酸，可以用作研究工具。例如，它们中的一部分作用为用于上文所述的制备c-Jun NH2-端激酶的方法的多聚核苷酸。另外，部分可以用作重要的研究工具，用于进行使用PCR获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸，或者使用杂交获得在多聚核苷酸组B中所示的多聚核苷酸，如上文所述。
特别地，当进行杀虫剂的筛选时，它们可以用作对于筛选所进行的实验的实验工具。具体地，它们可以用作在进行检测杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等时进行的实验的实验工具。
此外，本发明还包括这样的系统，所述系统包括输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的方式，其中所述能力是调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力(以下，在一些情形中，叫作方式a)，基于需要的标准查询并且回传数据信息的方式(以下，在一些情形中，叫作方式b)，和显示并且输出查询和回传的结果的方式(以下，在一些情形中，叫作方式c)(以下，在一些情形中叫作本系统)。
首先，将阐释方式a。方式a意指，当输入关于测试物质具有的调控来源于昆虫的c-Jun NH2-端激酶活性的能力的数据信息之后，存储并且管理所输入的信息，如上文所述。信息通过输入方式1输入，并且通常以记忆方式2记忆。输入方式的实例包括可以输入信息的方式诸如键盘和鼠标。当完成信息输入和存储、管理时，步骤进展到下一种方式b。对于存储、管理所述信息，可以通过使用硬件如计算机和软件如OS和数据库管理而输入具有数据结构的信息，并且将所述信息存储到适当的记忆装置中，例如计算机可读的记录媒体如软盘、光磁盘、CD-ROM、DVD-ROM和硬盘，而有效地存储和管理大量的信息。
将阐释方式b。方式b是一种通过基于获得需要的结果的标准的方式查询并且回传所存储和管理的数据信息的方式，如上文所述。对于所述信息，当将关于查询和回传的标准通过输入方式1输入，并且在通常记忆在记忆方式2中的信息中选择符合所述标准的信息时，步骤进展到下一方式c。选择的结果通常记忆在记忆方式2中，并且可以进一步通过显示输出方式3显示。
将阐释方式c。方式c是显示并且输出查询和回传的结果的方式，如上文所述。显示输出方式3的实例包括显示器、打印机等，并且所述结果可以在计算机的显示装置上显示，或者可以通过打印在纸上输出。
实施例
下面将通过实施例的方式更详细地阐释本发明，但是本发明不限于这些具体的实例。
实施例1(从棉蚜和德国蟑螂提取总RNA)
(1)从棉蚜提取总RNA
将在盆栽黄瓜的叶片上培养的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和卵用小刷子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)分离RNA如下。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨10分钟，同时保持在冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸收计算)为6.9mg/ml。
(2)从德国蟑螂提取总RNA
提供人工培养的德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))的成虫、幼虫和卵囊作为样品。10只雄性成虫和10只雌性成虫(来自每一只已经去除卵囊的个体)用作1.1g的成虫样品，将10只雄性幼虫和10只雌性幼虫用作1.0g的幼虫样品，并且将26只卵囊用作1.0g的卵囊样品。将这三种样品使用独立的研钵和研棒独立地在液氮中压成粉末。从每一份得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因制备)如下分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末碾磨10分钟，同时保持在冰上。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制备)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每5ml水相层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每10ml水相层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制备)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸收计算)在来源于成虫的总RNA的情形中为1.1mg/ml，在来源于幼虫的总RNA的情形中为2.5mg/ml，并且在来源于卵囊的总RNA的情形中为1.4mg/ml。
实施例2(分离棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因)
使用来自棉蚜的总RNA，用于RT-PCR的随机引物(Invitrogen)和Superscript III(Invitrogen)按照Superscript III的生产商的方法而制备第一链cDNA。
通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸，其为对所述基因特异的引物，和Pfu Turbo(由Stratagene制备)按照生产商的方法进行PCR而扩增棉蚜c-Jun NH2-端激酶的全长cDNA。将如上述制备的第一链cDNA用作模板。应用的PCR条件如下：起始变性在94℃10分钟；然后30个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃30秒和72℃2分钟；接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得1260bp的目的DNA。将获得的DNA克隆到pCR-blunt载体(Invitrogen)中。得到的质粒命名为在pCRblunt中的oGAO58-59。测序所克隆的DNA，以验证包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多聚核苷酸包含在所克隆的DNA中。从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列为氨基酸序列SEQ ID NO：1。
实施例3(分离德国蟑螂c-Jun NH2-端激酶基因)
为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离c-Jun NH2-端激酶的同系物，应用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein AnalysisServer)的网址http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html公共可用)，并且基于前文提及的来源于棉蚜的c-Jun NH2-端激酶基因序列和先前已知的Ancylostoma caninum(NCBI登记号AAF00539)，Xenopus laevis(BAB91438，BAB85483)，智人(NP_620448，NP_002744)，Mus musculus(BAC31240)，Rattus norvegicus(S43969)，Gallus gallus(BAA19188)，果蝇(AAF52883，AAC47325)，刚比亚按蚊(EAA05905)和白纹伊蚊(AAO31950)的核苷酸序列，设计简并引物。
在选择的昆虫物种中的c-Jun NH2-端激酶基因同系物的部分序列通过一系列PCR扩增，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制备)按照附在所述试剂上的生产商的方法而进行。PCR条件为在94℃10分钟；然后是40个PCR循环，一个循环为94℃30秒，45℃1分钟和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
因此，获得包含核苷酸序列SEQ ID NO：15的德国小蠊c-Jun NH2-端激酶基因的部分序列。从所述部分序列推定的氨基酸序列为氨基酸序列SEQID NO：16。
然后，设计对所得到的c-Jun NH2-端激酶基因的昆虫同系物的部分序列特异的引物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3’和5’RACE PCRs这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合成试剂盒(由Clontech制备)按照附在所述试剂盒上的生产商的用法指导而进行。
在3’RACE和5’RACE反应中，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的通用引物混合物(UPM)与对目的序列特异的正向引物或反向引物组合使用。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃每1kb长度的预计扩增产物1分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。关于引物，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物与特异的正向引物或特异的反向引物组合使用，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为在94℃10分钟1个循环；然后40个PCR循环，一个循环为94℃15秒，63℃15秒和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟1个循环。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR-XL-TOPO载体(由Invitrogen制备)中，并且测序。
上述测序结果显示5’-端序列和3’-端序列，其每一端分别编码昆虫c-Jun NH2-端激酶的N-端区域和C-端区域。
实施例4(构建重组杆状病毒穿梭载体)
(1)将c-Jun NH2-端激酶cDNA克隆到基因表达载体pFastBac(注册商标名)HTb中
将通过用EcoRI消化在实施例2中获得的在pCRblunt中的oGAO58-59而得到的1272bp DNA片段分离并且纯化，并且连接到基因表达载体pFastBac(注册商标名)HTb的EcoRI克隆位点。以下，得到的载体命名为在pFastBacHTb中的oGA058-59。
然后，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，并且使用在实施例2中获得在pCRblunt中的oGA058-59作为模板，进行PCR，以获得663bp DNA片段。按照附在试剂上的手册进行PCR，包含核苷酸序列SEQ ID NO：5的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸用作引物，它们为具有高特异性的引物。PCR条件如下：在95℃5分钟1个循环；然后25个PCR循环，一个循环为95℃30秒，50℃30秒和72℃1分30秒；接着在72℃7分钟1个循环。然后，通过对得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化而得到目的DNA片段。此外，将获得的DNA片段克隆到pCR-blunt载体(由Invitrogen制备)中，并且确定DNA片段的核苷酸序列。这样得到的载体命名为在pCRblunt中的oGA060-61。
将通过用BamHI/NdeI消化上述获得的在pCRblunt中的oGA060-61而得到的605bp DNA片段分离并且纯化，并且连接到在pFastBacHTb中oGA058-59的BamHI/NdeI克隆位点。得到的载体叫作pGA01.1。然后，确定核苷酸序列，结果，发现在用来构建的pFastBacHTb中包含一个突变。
将通过用BamHI和EcoRI消化pGA01.1得到的消化产物通过琼脂糖凝胶电泳分析并且纯化，以分离并纯化1241bp的目的DNA片段，并且将所述DNA片段克隆到表达载体pFastBac(注册商标名)HTb的4850bpBamHI/EcoRI片段中。得到的载体叫作pGAO1，并且代替前述pGAO1.1构建体。
(2)产生重组的杆状病毒穿梭载体DNA
使用获得的pGAO1，转化大肠杆菌DH10Bac的感受态细胞。从转化的大肠杆菌DH10Bac分离关于棉蚜c-Jun NH2-端激酶的重组杆状病毒穿梭载体DNA。所有的步骤按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册。
通过PCR分析验证目的基因在重组杆状病毒穿梭载体中的存在或不存在。由于所述杆状病毒穿梭载体包含M13正向(-40)和M13反向引发位点，所以使用M13正向(-40)和M13反向引物。此外，还使用M13正向(-40)或M13反向引物与对目标特异的引物的组合。每一操作按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册而进行。每一PCR条件如下：
(a)在包含核苷酸序列SEQ ID NO：7的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQID NO：8的寡核苷酸的情形中：
(i)94℃5分钟；接着
(ii)40个循环：94℃15秒，60℃15秒，和72℃3分钟；并且接着
(iv)72℃7分钟。
(b)在包含核苷酸序列SEQ ID NO：9的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQID NO：10的寡核苷酸的情形中：
(i)94℃5分钟；接着
(ii)16个循环：94℃15秒，68℃(每+1个循环减小0.5℃)15秒，和72℃3分钟；接着
(iii)20个循环：94℃15秒，60℃15秒，和72℃3分钟；并且接着
(iv)72℃7分钟。
(c)在包含核苷酸序列SEQ ID NO：11的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQID NO：12的寡核苷酸的情形中：
(i)94℃5分钟；接着
(ii)40个循环：94℃15秒，60℃15秒，和72℃3分钟；并且接着
(iv)72℃7分钟。
(d)在包含核苷酸序列SEQ ID NO：8的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQID NO：9的寡核苷酸的情形中：
(i)94℃5分钟；接着
(ii)20个循环：94℃15秒，65℃15秒，和72℃3分钟；接着
(iii)25个循环：94℃15秒，65℃15秒，和72℃3分钟(每+1个循环增加5秒)；并且接着
(iv)72℃7分钟。
基于扩增的DNA片段的大小，选择两种重组杆状病毒穿梭载体pgao1.1和pgao1.8。从两种杆状病毒穿梭载体扩增的DNA片段具有正确的大小。因此，表明pFastBac(注册商标名)表达构建体到杆状病毒穿梭载体DNA的转座已经发生。
实施例5(制备重组杆状病毒穿梭载体储液)
(1)重组的杆状病毒穿梭载体的转染
按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，将重组的杆状病毒穿梭载体pgao1.1转染到Sf9细胞(ATCC：CRL-1711)中，以产生重组的杆状病毒。对于转染，使用下述材料：cellfectin(由Invitrogen制备)，补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，和青霉素/链霉素(由生命技术制备)。使用2μg杆状病毒穿梭载体DNA和7μl cellfectin。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在8天后收集P1重组杆状病毒储液。
<重组杆状病毒的大规模制备>
通过将0.5ml的P1病毒储液或后来产生的病毒储液(MOI＝0.1)接种在1×106个细胞/ml的300ml Sf9细胞培养物上，而扩增棉蚜c-Jun NH2-端激酶杆状病毒储液。按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册，在培养4天后收集扩增的杆状病毒储液。将Sf9细胞培养物在Erlenmeyer(Elscolab)中在135rpm和27℃悬浮培养。培养基成分如下：补充L-氨基酸的格雷丝昆虫细胞培养基(由Invitrogen，Gibco制备)，10％胎牛血清(由Clontech制备)，青霉素/链霉素(由生命技术制备)，和终浓度0.1％的普卢兰尼克F-68(Pluronic F-68，由Sigma-aldrich制备)。
杆状病毒储液的滴度通过蚀斑检测按照附在Bac-to-Bac杆状病毒(商标名)表达系统(由Invitrogen制备)上的手册确定，但是对于蚀斑检测的培养基，使用2％琼脂糖代替4％琼脂糖。
实施例6(c-Jun NH2-端激酶在昆虫细胞中的表达)
将4×108个Sf9细胞悬浮在30ml引入棉蚜c-Jun NH2-端激酶基因的重组杆状病毒储液中，并且在125ml Erlenmeyer(由Elscolab制造)中在27℃，135rpm旋转培养1小时。然后，将细胞混悬液等分到3个250ml的Erlenmeyer(由Elscolab制造)中，并且加入实施例5中所述的细胞培养基，直到在每个Erlenmeyer中培养溶液的体积达到100ml。将Sf9细胞在135rpm在27℃在制备的培养溶液中旋转培养48小时。将培养的溶液以1200rpm离心以收集感染杆状病毒的Sf9细胞。将收集的Sf9细胞在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃以备将来应用。
实施例7(c-Jun NH2-端激酶的纯化)
(1)制备粗提物
将冷冻的转染杆状病毒的Sf9细胞重悬在30ml缓冲液A(50mMHepes pH 7.5，0.5m NaCl，10mM咪唑)中，并且随后通过弗氏压碎器(由Thermo Spectronic制备)的方式在缓冲液A中裂解。在破碎细胞步骤过程中，压力保持在1300-1500psi。将弗氏加压的溶液在2℃以13,000xg离心20分钟，以获得上层清液。得到的上层清液通过0.45μm过滤器过滤并且保存在冰上。
(2)纯化
将蚜虫c-Jun NH2-端激酶以在6×His标记阅读框内克隆到pFastBacHTb中。重组蛋白使用金属亲和层析纯化，其使用HiTrap鳌合HP(Amersham生物科学)或HisTrap HP(Amersham生物科学)柱，按照制造者(Amersham生物科学)的用法说明进行。纯化步骤在AKTA-FPLC(Amersham生物科学)上进行。
按照制造者的方法(Amersham生物科学)制备HiTrap/HisTrap亲和柱。缓冲液A，结合缓冲液，由50mM Hepes pH 7.5，0.5M NaCl，10mM咪唑制成；和缓冲液B，洗脱缓冲液，由50mM Hepes pH 7.5，0.5M NaCl，500mM咪唑制成。纯化蚜虫c-Jun NH2-端激酶的纯化流程包括下述步骤：
(i)样品注射，
(ii)用10个柱体积(CV)的缓冲液A洗掉未结合的蛋白，
(iii)用15个CV的15％缓冲液B(75mM咪唑)洗涤，以平衡柱，
(iv)用13个CV的50％缓冲液B(250mM咪唑)洗脱纯化的蛋白，和
(v)用10个CV 100％缓冲液B(500mM咪唑)洗涤柱。
分析获得的洗脱级分，以通过SDS-PAGE和蛋白质印迹的标准技术的方式检验重组棉蚜肽基-二肽酶A的存在。由于c-Jun NH2-端激酶蛋白的分子量为46kDa，所以使用8％聚丙烯酰胺凝胶用于c-Jun NH2-端激酶蛋白的最佳凝胶电泳分析(resolution)。对于蛋白质印迹分析，将1∶5000稀释的抗-His(H15)sc-803兔多克隆IgG抗体(由tebubio制备)用作一级抗体。二级抗体是1∶10000稀释的山羊抗-兔-HRP(由Pierce制备)。
在通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对凝胶分析之后，将目的级分收集在一起，并且加入甘油至终浓度10％。蛋白浓度通过使用预先稀释的蛋白测定标准物：牛血清白蛋白级分V系列，按照生产商的方法(Bio-Rad)用Bradford分光光度法确定。然后将收集的级分分成几等份，并且立即在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃。
(3)c-Jun NH2-端激酶的激活
为了提高c-Jun NH2-端激酶的活性，将c-Jun NH2-端激酶用MKK4/SKK1，活性分子(active，由Upstate制备)和MKK7β1，活性分子(active，由Upstate制备)温育。在这一情形中，在附在MKK4/SKK1，活性分子(active，由Upstate制备)和MKK7β1，活性分子(active，由Upstate制备)上的手册中所述的部分激酶检测方法可以进行改进，并且可以激活c-Jun NH2-端激酶。
需要的缓冲液和试剂包括：
(i)Hepes缓冲液，MgCl2，ATP；
(ii)重组的MKK4/SKK1，在大肠杆菌(Upstate)中活性表达，以53.5μM的终浓度保存在50mM Tris/HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.1mM EGTA，0.03％Brij 35，270mM蔗糖，1mM苄脒，0.2mMPMSF，0.1％2-巯基乙醇中；和
(iii)重组的MKK7β1，在大肠杆菌(Upstate)中活性表达，以14.6μM的终浓度保存在50mM Tris/HCl pH 7.5，150mM NaCl，0.1mMEGTA，0.03％Brij 35，270mM蔗糖，1mM苄脒，0.2mM PMSF，0.1％2-巯基乙醇中。
纯化的c-Jun NH2-端激酶的磷酸化在10ml的终体积通过下述步骤进行。
首先，混和所有的1ml Milli Q水，1ml 500mM Hepes缓冲液，2mlMKK4/SKK1，活性分子(375nM)和MKK7β1，活性分子(375nM)的混合物，和2ml MgCl2(75mM)与ATP(570μM)的混合物，并且将4ml的c-JunNH2-端激酶(1mg/ml)添加到所述混合物中。然后，将所述混合物在室温温育1小时。将用不同批次激活的全部的c-Jun NH2-端激酶收集在一起，并且向其中加入甘油至终浓度10％。然后，将这分成每份1ml，并且保存在-80℃。
实施例8(选择调控c-Jun NH2-端激酶活性的化合物)
调控c-Jun NH2-端激酶活性的化合物的选择在这样的系统中进行，即，在所述系统中，检测并且评估c-Jun NH2-端激酶的活性，其通过将测试化合物添加到使用在实施例7中制备的蚜虫c-Jun NH2-端激酶的体外反应系统中而受到调控。
蚜虫c-Jun NH2-端激酶活性的检测这样进行，其使用具有进步的结合系统的IMAP筛选表达试剂盒(由分子装置(Molecular Device)制备)，按照附在所述系统上的手册中所述的方法，并且应用包含在氨基端加上生物素的氨基酸序列SEQ ID NO：13的肽作为底物，和使用包含羧基端被荧光标记的氨基酸序列SEQ ID NO：14的肽作为底物。
对于活性检测，当包含溶解在DMSO中的测试化合物至终浓度10μM时，检测蚜虫c-Jun NH2-端激酶的活性。另外，当包含DMSO代替测试化合物时，检测蚜虫c-Jun NH2-端激酶的活性。然后，计算包含溶解在DMSO中的测试化合物时蚜虫c-Jun NH2-端激酶活性的测定值相对于在包含DMSO代替测试化合物时蚜虫c-Jun NH2-端激酶活性的测定值的比例(％)，并且将通过从100％减去所计算的值而得到的值采用为抑制程度(％)。在每一测试化合物中的结果与实施例9的结果一起显示在实施例9中的表4中。
当包含溶解在DMSO中的测试化合物至每一浓度100μM，30μM，10μM，3μM，1μM，0.3μM，0.1μM或0.03μM的终浓度时，检测蚜虫c-JunNH2-端激酶的活性。使用浓度-依赖性检测分析软件XL fit(由idbs制备)从每一测试化合物每一浓度的结果计算IC50(μM)。结果与实施例9的结果一起显示在实施例10的表5中，
实施例9(杀虫活性检测)
制备具有下述组合物(表3)的无菌人工饲料，然后，按照与在昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版社1985)第35-36页中所述的方法相同的方法，除了将溶解在DMSO中至终浓度640μM的测试化合物以0.5％体积加入到所述人工饲料中，并且混和成分，培养棉蚜。培养后6天，研究存活的棉蚜数目，并且通过用下述方程获得控制值而确定表现出显著控制值(例如，30％或更大的控制值)的实体具有杀虫活性：
控制值(％)＝{1-(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}×100
在所述方程中的字母代表下述意义。
Cb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目
Cai：在未处理部分中在观察时存活的虫子数目
Tb：在处理部分中在处理之前存活的虫子数目
Tai：在处理部分中在观察时存活的虫子数目
结果与实施例8的结果一起显示在实施例9中的表4中。
表3
Figure A20068002825600551
表4
Figure A20068002825600561
实施例10(杀虫活性检测)
除了加入溶解在DMSO中至终浓度50ppm的测试化合物之外，按照与实施例9的方法相同的方法，进行杀虫活性检测，并且结果与实施例8的结果一起显示在实施例10中的表5中。
表5
Figure A20068002825600571
工业适用性
按照本发明，可以提供筛选农业化学品更基于靶点的途径，其中针对已经鉴定为与化学干扰目标位点以控制昆虫或其它害虫生物体的目的生物学和/或生理学相关的特异的靶点筛选化合物。
序列表中的文本(free text)
SEQ ID NO：3
设计的PCR寡核苷酸引物
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设计的PCR寡核苷酸引物
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设计的PCR寡核苷酸引物
SEQ ID NO：13
设计的JNK底物肽
SEQ ID NO：14
设计的JNK底物肽
序列表
<110>住友化学株式会社
<120>参与昆虫c-JUN氨基端激酶活性调控害虫的生理条件的试剂
<130>S14085WO01
<150>JP 2005/183032
<151>2005-06-23
<160>16
<210>1
<211>397
<212>PRT
<213>棉蚜(Aphis gossypii)
<400>1
Met Leu Gly Thr Gln Ser Arg Phe Val Gln Arg Pro Gln Asn Lys Pro
  1               5                  10                  15
Asp Thr Met Thr Glu Leu Ala Asp Met Phe Tyr Thr Leu Val Phe Gly
             20                  25                  30
Asp Thr Glu Phe Ser Val Pro Arg Arg Tyr Val Asp Leu Val Pro Lys
         35                  40                  45
Gly Leu Gly Ala Gln Gly Met Val Val Ala Ala Met Asp Thr Ile Thr
     50                  55                  60
Gln Gln Ser Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Asn Val
 65                  70                  75                  80
Thr His Al a Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Phe Lys Leu Met Lys Leu Val
                  85                  90                  96
Asn His Lys Asn Ile Ile Gly Leu Leu Asn Ala Phe Thr Pro Gln Arg
            100                 105                 110
Thr Leu Asp Asp Phe Gln Asp Val Tyr Leu Val Met Glu Leu Met Asp
        115                 120                 125
Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Asp Leu Asp His Glu Arg Met
    130                 135                 140
Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly Ile Lys His Leu His Ser
145                 150                 155                 160
Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Val Val Lys
                165                 170                 175
Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ala
            180                 185                 190
Gly Thr Thr Phe Met Met Thr Pro Tyr Val Val Thr Arg Tyr Tyr Arg
        195                 200                 205
Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr Lys Glu Asn Val Asp Ile
    210                 215                 220
Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met Ile Arg Gly Gly Val Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asp Gln Trp Asn Lys Ile Ile Glu Gln
                245                 250                 255
Leu Gly Thr Pro Ser Gln Glu Phe Met Arg Arg Leu Gln Pro Thr Val
            260                 265                 270
Arg Asn Tyr Val Glu Asn Arg Pro Arg Tyr Pro Gly Tyr Ser Phe Asp
        275                 280                 285
Arg Leu Phe Pro Asp Val Leu Phe Pro Ser Asp Ser Ser Glu His Asn
    290                 295                 300
Lys Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu Ser Arg Met Leu Val
305                 310                 315                 320
Ile Asp Pro Glu Lys Arg Ile Ser Val Asp Asp Ala Leu Leu His Pro
                325                 330                 335
Tyr  Ile Asn Val Trp Tyr Asp Glu Ser Glu Val Asn Ala Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Gly Pro Trp Asp His Ser Val Asp Glu Arg Glu His Thr Val Asp Gln
        355                 360                 365
Trp Lys Glu Leu Ile Tyr Gln Glu Val Met Glu Tyr Asp Pro Thr Thr
    370                  375                 380
Ala Ala Ala Ala Ser Ala Asn Glu Pro Gln Pro Ile Arg
385                 390                 395
<210>2
<211>1194
<212>DNA
<213>棉蚜(Aphis gossypii)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1194)
<400>2
atg ctc gga aca caa tca agg ttt gtt caa aga cct caa aat aaa cca  48
Met Leu Gly Thr Gln Ser Arg Phe Val Gln Arg Pro Gln Asn Lys Pro
  1               5                  10                  15
gac act atg act gaa tta gct gat atg ttc tac act tta gta ttt ggt  96
Asp Thr Met Thr Glu Leu Ala Asp Met Phe Tyr Thr Leu Val Phe Gly
             20                  25                  30
gac act gaa ttt tca gtt ccc aga cga tat gtt gat ctt gtg ccc aaa    144
Asp Thr Glu Phe Ser Val Pro Arg Arg Tyr Val Asp Leu Val Pro Lys
         35                  40                  45
ggt tta ggt gct cag ggc atg gtg gtt gct gct atg gac act att act    192
Gly Leu Gly Ala Gln Gly Met Val Val Ala Ala Met Asp Thr Ile Thr
     50                  55                  60
caa caa agc gtt gca att aaa aaa cta tct aga ccc ttt caa aat gta    240
Gln Gln Ser Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Asn Val
 65                  70                  75                  80
aca cat gca aaa aga gca tat aga gag ttc aaa ctt atg aaa tta gta    288
Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Phe Lys Leu Met Lys Leu Val
                 85                  90                  95
aat cat aaa aat att att ggt tta cta aat gcc ttc acg cca caa agg    336
Asn His Lys Asn Ile Ile Gly Leu Leu Asn Ala Phe Thr Pro Gln Arg
            100                 105                 110
aca tta gat gat ttt caa gat gtg tac ttg gta atg gaa ctg atg gat    384
Thr Leu Asp Asp Phe Gln Asp Val Tyr Leu Val Met Glu Leu Met Asp
        115                 120                 125
gct aat cta tgc cag gtg atc caa atg gat ctt gat cat gaa cga atg    432
Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Asp Leu Asp His Glu Arg Met
    130                 135                 140
tca tat ctt tta tat caa atg tta tgt ggt att aaa cat tta cat tca    480
Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly Ile Lys His Leu His Ser
145                 150                 155                 160
gca gga att att cat aga gac ctt aaa cct agt aat att gtt gta aaa    528
Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Val Val Lys
                165                 170                 175
tct gac tgc aca tta aag att ttg gat ttt gga tta gct cga aca gct    576
Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ala
            180                 185                 190
gga acc aca ttt atg atg acg cca tat gtt gtt act aga tac tat cgt    624
Gly Thr Thr Phe Met Met Thr Pro Tyr Val Val Thr Arg Tyr Tyr Arg
        195                 200                 205
gct cca gag gta att tta ggt atg ggt tat aag gaa aat gtt gac att    672
Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr Lys Glu Asn Val Asp Ile
    210                 215                 220
tgg tca gta ggt tgt att atg ggt gag atg ata aga ggt ggc gtt tta    720
Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met Ile Arg Gly Gly Val Leu
225                 230                 235                 240
ttt cct gga act gat cat ata gat caa tgg aat aaa att ata gaa caa    768
Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asp Gln Trp Asn Lys Ile Ile Glu Gln
                245                 250                 255
ctg ggc aca cct tca caa gaa ttt atg aga aga tta caa cca act gtt    816
Leu Gly Thr Pro Ser Gln Glu Phe Met Arg Arg Leu Gln Pro Thr Val
            260                 265                 270
aga aat tat gtt gaa aat aga cct cgt tat cca ggt tat tca ttt gat    864
Arg Asn Tyr Val Glu Asn Arg Pro Arg Tyr Pro Gly Tyr Ser Phe Asp
        275                 280                 285
cga tta ttt cct gac gta cta ttt ccg tca gat tcg tct gaa cat aat    912
Arg Leu Phe Pro Asp Val Leu Phe Pro Ser Asp Ser Ser Glu His Asn
    290                 295                 300
aaa ctt aaa gca agc caa gct cgt gac ctt ttg tct cga atg ctg gtt    960
Lys Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu Ser Arg Met Leu Val
305                 310                 315                 320
atc gat cca gaa aag cgt ata tct gtg gac gat gca ttg cta cat cca    1008
Ile Asp Pro Glu Lys Arg Ile Ser Val Asp Asp Ala Leu Leu His Pro
                325                 330                 335
tat ata aat gtt tgg tat gat gaa agt gaa gta aat gca cca gca cca    1056
Tyr Ile Asn Val Trp Tyr Asp Glu Ser Glu Val Asn Ala Pro Ala Pro
            340                 345                 350
gga cca tgg gac cat tca gta gat gaa cgt gaa cat acc gtt gat caa    1104
Gly Pro Trp Asp His Ser Val Asp Glu Arg Glu His Thr Val Asp Gln
        355                 360                 365
tgg aaa gaa ctt atc tat caa gaa gtc atg gag tat gat cca act act  1152
Trp Lys Glu Leu Ile Tyr Gln Glu Val Met Glu Tyr Asp Pro Thr Thr
    370                 375                 380
gca gca gca gct tct gct aat gaa cca caa cca atc cga tag          1194
Ala Ala Ala Ala Ser Ala Asn Glu Pro Gln Pro Ile Arg
385                 390                 395
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>3
gtcagacatt ggacggaggt aaactgtgc                                        29
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>4
gtttgttgaa tttgagattg tccac                                            25
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>5
ggatccatgc tcggaacaca atcaaggttt gttc                                  34
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>6
cttataaccc atacctaaaa ttacctctgg agc                                   33
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>7
gctccagagg taattttagg tatgggttat aag                                   33
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>8
caggaaacag ctatgac                                                     17
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>9
gttttcccag tcacgac                                                     17
<210>10
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>10
cgctttgttg agtaatagtg tccatagcag caaccacc                              38
<210>11
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>11
ggtggttgct gctatggaca ctattactca acaaagcg                              38
<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物
<400>12
gtggttccag ctgttcgagc taatccaaaa tccaaaatc                             39
<210>13
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的JNK底物肽
<400>13
Lys Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn
  1               5                  10                  15
Gln Ala Leu Leu Arg
             20
<210>14
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：设计的JNK底物肽
<400>14
Lys Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn
1             5                  10                  15
Gln Ala Leu Leu Arg Cys
             20
<210>15
<211>732
<212>DNA
<213>德国小蠊(Blatella germanica)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(732)
<400>15
atg ttc tac ama gtg gag ttt gga gac act gag ttc tct gtt ccc aat  48
Met Phe Tyr Xaa Val Glu Phe Gly Asp Thr Glu Phe Ser Val Pro Asn
  1               5                  10                  15
cgc tat tcg gac ttg gca ccc aaa ggg gtg ggt gcg cag ggc atg gtc  96
Arg Tyr Ser Asp Leu Ala Pro Lys Gly Val Gly Ala Gln Gly Met Val
             20                  25                  30
tgt gct gct tat gac aca gtg act cag cag aac gtg gct atc aag aaa  144
Cys Ala Ala Tyr Asp Thr Val Thr Gln Gln Asn Val Ala Ile Lys Lys
         35                  40                  45
ttg agc cgt cca ttc cag aat gtt acg cat gct aag cgy gcc tat cga    192
Leu Ser Arg Pro Phe Gln Asn Val Thr His Ala Lys Xaa Ala Tyr Arg
     50                  55                  60
gaa ttc aag ctc atg aag ctg gtt aat cac aag aat att att ggc ctg    240
Glu Phe Lys Leu Met Lys Leu Val Asn His Lys Asn Ile Ile Gly Leu
 65                  70                  75                  80
cta aat gct ttc aca cca caa aga tca tta gag gag ttt caa gat gtt    288
Leu Asn Ala Phe Thr Pro Gln Arg Ser Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val
                 85                  90                  95
tat cta gta atg gag ctt atg gat gcc aac ctc tgc cag gtc atc caa    336
Tyr Leu Val Met Glu Leu Met Asp Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln
            100                 105                 110
atg gac cta gat cat gag agg atg tct tat ctt ctc tat cag atg cth    384
Met Asp Leu Asp His Glu Arg Met Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Xaa
        115                 120                 125
tgc ggc atc aag cat ctc cac tct gca ggc atc ata cat agr gac ctg    432
Cys Gly Ile Lys His Leu His Ser Ala Gly Ile Ile His Xaa Asp Leu
    130                 135                 140
aaa mct agc aac att gtg gta aaa tca gac tgt acc ctg aaa ata tta    480
Lys Xaa Ser Asn Ile Val Val Lys Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu
145                 150                 155                 160
gac ttt ggt ttg gca aga acg gct ggc aca aca ttc atg atg act cca    528
Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ala Gly Thr Thr Phe Met Met Thr Pro
                165                 170                 175
tat gtt gtt acg cgc tac tat agg gca cca gag gta ata tta ggt atg    576
Tyr Val Val Thr Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met
            180                 185                 190
gga tac aaa gaa aat gtg gac atc tgg tca gta ggg tgc atc atg ggt    624
Gly Tyr Lys Glu Asn Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly
        195                 200                 205
gag atg ata cga ggt gga gtg ttg ttt cca ggg aca gat cac att gat    672
Glu Met Ile Arg Gly Gly Val Leu Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asp
    210                 215                 220
cag tgg aat aaa ata ata gaa caa ctt ggt act cca tca caa gac ttt    720
Gln Trp Asn Lys Ile Ile Glu Gln Leu Gly Thr Pro Ser Gln Asp Phe
225                 230                 235                 240
agg aaa cga ctc                                                    732
Arg Lys Arg Leu
<210>16
<211>244
<212>PRT
<213>德国小蠊(Blatella germanica)
<400>16
Met Phe Tyr Xaa Val Glu Phe Gly Asp Thr Glu Phe Ser Val Pro Asn
  1               5                  10                  15
Arg Tyr Ser Asp Leu Ala Pro Lys Gly Val Gly Ala Gln Gly Met Val
             20                  25                  30
Cys Ala Ala Tyr Asp Thr Val Thr Gln Gln Asn Val Ala Ile Lys Lys
         35                  40                  45
Leu Ser Arg Pro Phe Gln Asn Val Thr His Ala Lys Xaa Ala Tyr Arg
     50                  55                  60
Glu Phe Lys Leu Met Lys Leu Val Asn His Lys Asn Ile Ile Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Asn Ala Phe Thr Pro Gln Arg Ser Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val
                 85                  90                  95
Tyr Leu Val Met Glu Leu Met Asp Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln
            100                 105                 110
Met Asp Leu Asp His Glu Arg Met Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Xaa
        115                 120                 125
Cys Gly Ile Lys His Leu His Ser Ala Gly Ile Ile His Xaa Asp Leu
    130                 135                 140
Lys Xaa Ser Asn Ile Val Val Lys Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu
145                 150                 155                 160
Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ala Gly Thr Thr Phe Met Met Thr Pro
                165                 170                 175
Tyr Val Val Thr Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met
            180                 185                 190
Gly Tyr Lys Glu Asn Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly
        195                 200                 205
Glu Met Ile Arg Gly Gly Val Leu Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asp
    210                 215                 220
Gln Trp Asn Lys Ile Ile Glu Gln Leu Gly Thr Pro Ser Gln Asp Phe
225                 230                 235                 240
Arg Lys Arg Leu

Claims (36)

1.一种调控害虫生理条件的试剂，其中所述试剂具有调控昆虫c-JunNH2-端激酶活性的能力。
2.按照权利要求1的试剂，其中所述c-Jun NH2-端激酶是棉蚜c-JunNH2-端激酶。
3.按照权利要求1的试剂，其中所述试剂是杀虫剂。
4.按照权利要求1的试剂，其中所述调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力是抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力。
5.一种杀虫剂，其包括具有调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力的物质或所述物质的农业可用的盐作为活性成分。
6.按照权利要求5的杀虫剂，其中所述物质具有抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力。
7.按照权利要求6的杀虫剂，其中所述物质具有在不含细胞的系统中抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力，其中在存在10μM或更多的所述物质时所述c-Jun NH2-端激酶的活性低于不存在所述物质时的活性。
8.按照权利要求6的杀虫剂，其中所述物质具有在不含细胞的系统中抑制昆虫c-Jun NH2-端激酶与SEQ ID NO：14的肽反应的能力，具有100μM或更低的IC50。
9.检测测试物质的杀虫活性的方法，其包括：
(1)第一步，检测选自下组A的c-Jun NH2-端激酶在所述c-Jun NH2-端激酶与测试物质接触的反应系统中的活性；和
(2)第二步，基于通过比较在第一步中测定的活性与对照活性而获得的差别评估所述测试物质的活性；
<组A>
(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；
(b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1有83％或更高的序列相同性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；
(e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有65％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(f)包含由多聚核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述蛋白具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(g)包含昆虫c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的蛋白；和
(h)包含棉蚜c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的蛋白。
10.筛选杀虫物质的方法，其包括选择具有通过按照权利要求9的方法评估的杀虫活性的物质。
11.一种杀虫剂，其包括通过按照权利要求10的方法选择的物质或其农业可用的盐作为活性成分。
12.控制害虫的方法，其包括将有效量的按照权利要求5、6、7、8或11的杀虫剂应用到害虫、害虫栖息地或要防治害虫的植物。
13.一种控制害虫的方法，其包括：
鉴定具有通过按照权利要求9的方法评估的杀虫活性的物质，并且
将害虫与所鉴定的杀虫物质接触。
14.一种昆虫c-Jun NH2-端激酶，其包含选自下组B的氨基酸序列：
<组B>
(a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；
(b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中删除、添加或取代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1有95％或更高的序列相同性的氨基酸序列的蛋白，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；
(e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2有75％或更高的序列相同性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；
(f)由多聚核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多聚核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多聚核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序列具有c-Jun NH2-端激酶活性；和
(g)棉蚜c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列。
15.昆虫c-Jun NH2-端激酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用。
16.按照权利要求14的昆虫c-Jun NH2-端激酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用。
17.一种多聚核苷酸，其包含编码按照权利要求14的c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
18.按照权利要求17的多聚核苷酸，其包括核苷酸序列SEQ ID NO：2。
19.一种多聚核苷酸，其包含与按照权利要求17或18的多聚核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
20.一种多聚核苷酸，其包含：
按照权利要求17或18的多聚核苷酸的部分核苷酸序列；或
与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
21.按照权利要求20的多聚核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：3或4。
22.获得包含编码c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括：
通过聚合酶链式反应扩增需要的多聚核苷酸的步骤，聚合酶链式反应使用按照权利要求20或21的多聚核苷酸作为引物；
鉴定所扩增的需要的多聚核苷酸的步骤；和
回收所鉴定的多聚核苷酸的步骤。
23.获得包含编码c-Jun NH2-端激酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多聚核苷酸的方法，其包括：
通过杂交检测需要的多聚核苷酸的步骤，杂交使用按照权利要求19、20或21的多聚核苷酸作为探针；
鉴定所检测的需要的多聚核苷酸的步骤；和
回收所鉴定的多聚核苷酸的步骤。
24.一种包含按照权利要求17或18的多聚核苷酸的核苷酸序列的环形多聚核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地与杆状病毒启动子连接。
25.按照权利要求24的环形多聚核苷酸，其中所述启动子是多角体蛋白基因启动子。
26.按照权利要求24或25的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含用于在宿主细胞中自动复制的复制起点。
27.按照权利要求24、25或26的环形多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含杆状病毒穿梭载体的核苷酸序列，并且能够作为病毒在昆虫细胞中繁殖。
28.制备环形多聚核苷酸的方法，其包括将按照权利要求17或18的多聚核苷酸连接到载体中。
29.一种转化体，其中引入按照权利要求17或18的多聚核苷酸。
30.按照权利要求29的转化体，其中所述转化体是转化的昆虫细胞；
31.制备转化体的方法，其包括将按照权利要求17或18的多聚核苷酸引入到宿主细胞中。
32.一种重组杆状病毒，在其基因组中包含按照权利要求17或18的多聚核苷酸。
33.生产c-Jun NH2-端激酶的方法，其包括培养按照权利要求29或30的转化体并且回收所生产的c-Jun NH2-端激酶的步骤。
34.按照权利要求14的c-Jun NH2-端激酶或按照权利要求17-21任一项的多聚核苷酸作为研究工具的应用。
35.按照权利要求34的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工具。
36.一种系统，其包括：
输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的方式，其中所述能力是调控昆虫c-Jun NH2-端激酶活性的能力；
基于需要的标准查询并且回传数据信息的方式；和
显示并且输出查询和回传的结果的方式。
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