CN101573375A - 涉及昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性而调节害虫的生理状况的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种调节害虫的生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫囊泡－融合腺苷三磷酸酶活性的能力；用于检测测试物质的杀虫活性的方法，所述方法包括在囊泡－融合腺苷三磷酸酶与测试物质接触的反应系统中测量囊泡－融合腺苷三磷酸酶活性的步骤，等等。

Description

涉及昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性而调节害虫的生理状况的试剂

技术领域

本发明涉及一种调节害虫生理状况的试剂，所述试剂涉及昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性，等等。

背景技术

囊泡-融合腺苷三磷酸酶(vesicle-fusing ATPase)称为NSF(N-乙基马来酰亚胺敏感因子)，属于P-环腺苷三磷酸酶AAA(与多种细胞活性相关的腺苷三磷酸酶)亚组(Chene，自然药物开发综述(Nature Reviews DrugDiscovery)，1：665-673，2002)，并且在细胞囊泡运输中起着重要作用。另外，至少在脊椎动物中，囊泡-融合腺苷三磷酸酶结合并调节AMPA类谷氨酸受体的功能和亚细胞分布(Hanley等，神经元(Neuron)，34：53-67，2002)。

对于脊椎动物和无脊椎动物相同的是，囊泡-融合腺苷三磷酸酶的最典型的功能是参与囊泡转运(May等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，276：21991-21994，2001)。在囊泡转运过程中，囊泡与目标膜(例如，突触膜)融合并释放囊泡的内容物(例如，神经递质)穿过所述目标膜。囊泡融合由紧密结合的SNARE(可溶NSF附着蛋白受体)蛋白复合物的形成而推动。在囊泡融合后，囊泡-融合腺苷三磷酸酶六聚体与SNARE复合物结合，并且利用来自ATP水解的自由能催化其分解，由此允许SNARE蛋白循环进入下一轮膜融合。囊泡-融合腺苷三磷酸酶仅在存在连接蛋白α-SNAP(可溶NSF附着蛋白)时能够结合所述SNARE复合物。

与秀丽隐杆线虫(C.elegans)和人相反，在黑腹果蝇(D.melanogaster)中存在两种囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因(nsf1[comt，昏睡]和nsf2)。Nsf1编码745个氨基酸残基，而nsf2编码752个氨基酸残基，它们彼此表现出84％的氨基酸同一性。已经提出nsf1具有突触前作用(即，SNARE复合物分解)，并且nsf2具有突触后作用(即，谷氨酸受体调节作用)(Golby等，遗传学(Genetics)，158：265-278，2001)。在另一方面，在黑腹果蝇中的异位表达实验表明nsf1和nsf2基因产物可以是彼此的功能替代物(Golby等，遗传学(Genetics)，158：265-278，2001)。在昆虫中，NSF还与两种关键的神经激素，即促前胸腺激素和滞育激素共同定位，两种激素均调节昆虫的发育。这些发现表明NSF可能参与调节昆虫神经激素的释放(Cui和Xu，肽(Peptides)，27(6)：1226-1234，2006，和Cui等，昆虫生物化学和分子生物学(Insect Biochem Mol Biol.)，36(7)：603-9，2006)。

在秀丽隐杆线虫中通过RNAi损失nsf-1导致胚胎致死、幼虫致死、幼虫停滞、不育和膜细胞器官缺陷性表型(WormBase，http://www.wormbase.org/)。

在黑腹果蝇中的nsf1和nsf2遗传突变分析表明nsf1是在发育的胚胎、幼虫和成虫阶段的存活能力所必需的(WormBase，http://www.wormbase.org/)，而nsf2是在发育的第一龄幼虫阶段的存活能力必需的(Golby等，遗传学(Genetics)，158：265-278，2001)。Nsf1可能主要在调节神经递质释放的突触前能力中起作用，并且nsf2可能在突触能力中起作用。

在黑腹果蝇中对X-连锁的昏睡基因(nsf1)的16种隐性等位基因的研究表明，nsf1的亚效等位基因突变在成虫中引起温度敏感性麻痹，而无效突变导致胚胎和幼虫的致死性(Littleton等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98：12233-12238，2001)。9种温度敏感性麻痹突变体中除了一种之外全部改变了NSF-D1结构域内的高度保守氨基酸，所述NSF-D1结构域是行使腺苷三磷酸酶活性的结构域，所述腺苷三磷酸酶活性为α-SNAP-SNARE复合物分解提供驱动力。在38℃，这些突变体中大部分在几分钟内麻痹，并且在热激后表现出显著的SNARE复合物累积并且阻断囊泡运输。可以通过热激驱动的nsf1转基因挽救无效突变体。与已知阻断囊泡运输的特定阶段的其它基因突变结合，进一步分析一种条件性麻痹等位基因表明，在胞吐和胞吞之间的时间间隔期间，NSF-1正常解离并且循环SNARE蛋白。

染色体-3连锁的nsf2基因的nsf2隐性致死性等位基因似乎正常发育成胚胎，能够从卵的阶段孵化，并且作为与nsf2-缺陷染色体的半合子表现出正常的幼虫运动(Golby等，遗传学(Genetics)，158：265-278，2001)。然而，最严重的nsf2突变体在发育的第一龄幼虫阶段中期期间停止运动并且死亡。所有的表型均可能由在热激控制下的野生型nsf2表达挽救(在发育期间中，每天在38℃加热1小时)。令人感兴趣的是，在神经组织-特异性启动子控制下的野生型nsf2的异位表达不能挽救不同的等位基因突变体。相反，野生型nsf2在中胚层的异位表达足以产生存活的成虫，所述中胚层产生体肌和内脏肌肉。在神经系统和中胚层二者中均表达nsf2的果蝇中，挽救的程度更高。这些结果表明，NSF2主要在中胚层起作用，但是也在神经系统中具有次要的作用。

农业化学品的发现在传统上是基于随机筛选过程，通常直接检测具体的化学品对整个生物体诸如昆虫、真菌和/或植物的作用，并且确定生物活性。一旦发现具有适当生物学活性的化学化合物，需要更深入的研究来专门确定这些化合物在分子水平上的作用模式或作用位点，以预测这些化合物的安全性和环境负荷。

发明内容

本发明描述一种更加基于目标的筛选农业化学品的方法，其中针对特定的目标筛选化合物，所述目标已经鉴定为与化学干扰目标部位以控制昆虫或其它害虫生物体的目的在生物学和/或生理学上相关。

具体地，本发明描述调节害虫的生理状况并且具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的试剂有效用于控制害虫。

即，本发明提供：

1.一种调节害虫生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力；

2.按照第1项的试剂，其中所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶是棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶；

3.按照第1项的试剂，其中所述试剂是杀虫剂；

4.按照第1项的试剂，其中所述调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力是抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力；

5.一种杀虫剂，其包含具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的物质或所述物质的农业上可接受的盐作为活性成分；

6.按照第5项的杀虫剂，其中所述物质具有抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力；

7.按照第6项的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力，其中在存在10μM或更多的所述物质时所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性低于不存在所述物质时的活性；

8.按照第6项的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力，具有100μM或更低的IC50；

9.一种测定测试物质的杀虫活性的方法，其包括：

(1)第一步，在选自下组A的囊泡-融合腺苷三磷酸酶与测试物质接触的反应系统中，检测所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性；和

(2)第二步，基于通过比较在第一步中测量的活性和对照的活性而获得的差别来评估所述测试物质的杀虫活性；

<组A>

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；

(b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中缺失、添加或替代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有75％或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；

(e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2具有75％或更高的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(f)包含由多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(g)包含昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的蛋白；和

(h)包含棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的蛋白；

10.筛选杀虫物质的方法，其包括选择具有通过第9项的方法评估的杀虫活性的物质；

11.一种杀虫剂，其包括通过第10项的方法选择的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分；

12.控制害虫的方法，其包括将有效量的第5、6、7、8或11项的杀虫剂施用于害虫、害虫栖息地或要防治害虫的植物；

13.一种控制害虫的方法，其包括：

鉴定具有通过第9项的方法评估的杀虫活性的物质，并且

使害虫与所鉴定的杀虫物质接触；

14.一种昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶，其包含选自下组B的氨基酸序列：

<组B>

(a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；

(b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中缺失、添加或替代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有75％或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；

(e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2具有75％或更高的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(f)由多核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；和

(g)棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列；

15.昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用；

16.第14项的昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用；

17.一种多核苷酸，其包含编码第14项的囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的核苷酸序列；

18.按照第17项的多核苷酸，其包括核苷酸序列SEQ ID NO：2；

19.一种多核苷酸，其包含与第17或18项的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

20.一种多核苷酸，其包含：

第17或18项的多核苷酸的部分核苷酸序列；或

与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；

21.按照第20项的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：3或4；

22.获得包含编码囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，其包括：

使用第20或21项的多核苷酸作为引物，通过聚合酶链式反应扩增所需的多核苷酸；

鉴定所扩增的所需的多核苷酸；和

回收所鉴定的多核苷酸；

23.获得包含编码囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，其包括：

通过使用第19、20或21项的多核苷酸作为探针进行杂交，检测所需的多核苷酸；

鉴定所检测的所需的多核苷酸；和

回收所鉴定的多核苷酸；

24.一种包含第17或18项的多核苷酸的核苷酸序列的环状多核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地与噬菌体启动子连接；

25.按照第24项的环状多核苷酸，其中所述启动子是T7RNA聚合酶基因启动子；

26.按照第24或25项的环状多核苷酸，其中所述多核苷酸包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起点；

27.制备环状多核苷酸的方法，其包括将第17或18项的多核苷酸连接到载体中；

28.一种转化体，其中引入第17或18项的多核苷酸；

29.按照第28项的转化体，其中所述转化体是转化的大肠杆菌(E.coli)；

30.制备转化体的方法，其包括将第17或18项的多核苷酸引入到宿主细胞中；

31.生产囊泡-融合腺苷三磷酸酶的方法，其包括培养第28或29项的转化体并且回收所生产的囊泡-融合腺苷三磷酸酶的步骤；

32.第14项的囊泡-融合腺苷三磷酸酶或第17-21项中任一项的多核苷酸作为研究工具的应用；

33.按照第32项的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工具；和

34.一种系统，其包括：

输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的设备，其中所述能力是调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力；

基于所需的标准查询并且检索所述数据信息的设备；和

显示并且输出查询和检索的结果的设备。

实现本发明的方式

本发明将在下文中详细地阐释。

在本发明中，“害虫”是指通过直接伤害人和动物或者通过损害农作物而给人的生活带来伤害或不适的小动物。它的实例包括节肢动物诸如昆虫、螨类和虱类以及线虫类(Nematoda)，并且其典型的实例如下：

半翅目(Hemiptera)：

飞虱科(Delphacidae)如灰飞虱(Laodelphax striatellus)、褐飞虱(Nilaparvata lugens)和白背稻飞虱(Sogatella furcifera)，角顶叶蝉科(Deltocephalidae)如黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)和Empoasca onukii，蚜科(Aphididae)如棉蚜(Aphis gossypii)和桃蚜(Myzus persicae)，蝽科(Pentatomidae)，粉虱科(Aleyrodidae)如温室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)和Bemisia argentifolli，蚧科(Coccidae)，网蝽科(Tingidae)，木虱科(Psyllidae)，等；

鳞翅目(Lepidoptera)：

螟蛾科(Pyralidae)如二化螟(Chilo suppressalis)、稻纵卷叶野螟(Cnaphalocrocis medinalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nuhilalis)和Parapediasiateterrella，夜蛾科(Noctuidae)如斜蚊贪夜蛾(Spodoptera litura)、贪夜蛾(Spodoptera exigua)、粘虫(Pseudaletia separata)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉夜蛾属(Trichoplusia spp.)、实夜蛾属(Heliothis spp.)、Helicoverpa spp.和山卷蛾(Earias spp.)，粉蝶科(Pieridae)如菜粉蝶日本亚种(Pieris rapae crucivora)，卷蛾科(Tortricidae)如棉褐带卷蛾(Adoxophyes orana fasciata)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)和苹果皮小卷蛾(Cydia pomonella)，蛀果蛾科(Carposinidae)如桃蛀果蛾(Carposina niponensis)，Bucculatricidae如桃潜夜蛾(Lyonetiaclerkella)，细蛾科(Gracillariidae)如金纹小潜细蛾(Phyllonorycterringoniella)，夜潜蛾科(Phyllocnistidae)如柑橘夜潜蛾(Phyllocnistiscitrella)，巢蛾科(Yponomeutidae)如小菜蛾(Plutella xylostella)，麦蛾科(Gelechiidae)如红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)，灯蛾科(Arctiidae)，谷蛾科(Tineidae)，等；

双翅目(Diptera)：

库蚊属(Culex)如淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、三带喙库蚊(Culestritaeniorhynchus)和致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)，伊蚊属(Aedes)如埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)，按蚊属(Anopheles)如中华按蚊(Anophelinae sinensis)，摇蚊科(Chironomidae)，蝇科(Muscidae)如家蝇(Musca domestica)和厩腐蝇(Muscina stabulans)，丽蝇科(Calliphoridae)，麻蝇科(Sarcophagidae)，夏厕蝇(Fannia canicularis)，花蝇科(Anthomyiidae)如灰地种蝇(Delia Platura)和葱地种蝇(Deliaantigua)，实蝇科(Trypetidae)，果蝇科(Drosophilidae)，毛蠓科(Psychodidae)，蚋科(Simuliidae)，虻科(Tabanidae)，螫蝇科(Stomoxyidae)，潜蝇科(Agromyzidae)，等；

翘翅目(Coleoptera)：

谷物食虫(Diabrotica)如西方谷物食虫(Diabrotica virgifera virgifera)和南方谷物食虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)，金龟科(Scarabaeidae)如古铜异丽金龟(Anomala cuprea)和多色异丽金龟(Anomala rufocuprea)，象虫科(Curculionidae)如玉米象(Sitophiluszeamais)、稻水象(Lissorphoptrus oryzophilus)和绿豆象(Calosobruchyschinensis)，拟步甲科(Tenebrionidae)如黄粉甲(Tenebrio molitor)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)，叶甲科(Chrysomelidae)如水稻负泥虫(Oulema oryzae)、黄守瓜(Aulacophora femoralis)、黄曲条菜跳甲(Phyllotreta striolata)和马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)，窃蠹科(Anobiidae)，瓢虫(Epilachna spp.)如二十八斑瓢虫(Epilachnavigintioctopunctata)，粉蠹科(Lyctidae)，长蠹科(Bostrychidae)，天牛科(Cerambycidae)，毒隐翅虫(Paederus fuiscipes)，等；

缨翅目(Thysanoptera)：

蓟马科(Thripidae)，如包括棕榈蓟马(Thrips palmi)的蓟马属(Thripsspp.)，包括西方花蓟马(Flankliniella occidentalis)的花蓟马属(Frankliniellaspp.)，包括Sciltothrips dorsalis的Sciltothrips，管蓟马科(Phlaeothripidae)，等；

膜翅目(Hymenoptera)：

叶蜂科(Tenthredinidae)，蚁科(Formicidae)，胡蜂科(Vespidae)，等；

网翅目(Dictyoptera)：

蜚蠊科(Blattidae)，Blattellidae，等；

直翅目(Orthoptera)：

剑角蝗科(Acrididae)，蝼蛄科(Gryllotalpidae)，等；

蚤目(Siphonaptera)：

人蚤(Pulex irritans)，等；

虱目(Anoplura)：

体虱(Pediculus humanus capitis)，等；

等翅目(Isoptera)：

白蚁科(Termitidae)，等；

蜱螨目(Acarina)：

叶螨科(Tetranychidae)如二斑叶螨(Tetranychus urticae)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)和小爪螨属(Oligonychus spp.)，瘿螨科(Eriophyidae)如橘刺皮瘿螨(Aculops pelekassi)和斯氏针刺瘿螨(Aculusschlechtendali)，跗线螨科(Tarsonemidae)如侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)，细须螨科(Tenuipalpidae)，杜克螨科(Tuckerellidae)，硬蜱科(Ixodidae)如长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)、褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)、台湾革蜱(Dermacentortaiwanicus)、卵形硬蜱(Ixodes ovatus)、全沟硬蜱(Ixodes persulcatus)和微小牛蜱(Boophilus microplus)，粉螨科(Acaridae)如腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)，皮刺螨科(Dermanyssidae)，肉食螨科(Cheyletidae)如粉尘螨(Dermatophagoides farinae)和屋尘螨(Dermatophagoides ptrenyssnus)，诸如普通肉食螨(Cheyletus eruditus)、马六甲肉食螨(Cheyletus malaccensis)和Cheyletus moorei、皮刺螨(Dermanyssus spp.)，等；

线虫类(Nematodes)：

咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)，伪短体线虫(Pratylenchus fallax)，大豆异皮线虫(Heterodera glycines)，马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)，北方根结线虫(Meloidogyne hapla)，南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，等。

在本发明中，“调节害虫的生理状况”是指将诸如活体内各种现象或其机制的状况改变成不同于通常状况的状况，所述现象是害虫生存应该维持的，例如，功能如呼吸、消化、分泌、体液循环、新陈代谢、神经传递等。实例包括通过停止呼吸以致不提供害虫内部新陈代谢必需的氧气而改变状况，和通过停止害虫的神经传递功能以致终止害虫的各种运动而改变状况。

在本发明中，“调节害虫的生理状况的试剂”是当施用于害虫时可以调节害虫的生理状况的试剂。

在本发明中，“昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶”是指在昆虫中存在的囊泡-融合腺苷三磷酸酶，是在各种生物体中存在的囊泡-融合腺苷三磷酸酶之一。在本文中，昆虫是在动物界(Animalia)，节肢动物门(Arthropod)，昆虫纲(Insecta)下分类的动物，并且它的实例包括下列各目的节肢动物：原尾目(Protura)，弹尾目(Collembola)，双尾目(Diplura)，缨尾目(Thysanura)，蜉蝣目(Ephemeroptera)，蜻蜒目(Odonata)，织翼夜蛾目(Plecoptera)，蛩蠊目(Grylloblattodea)，直翅目(Orthoptera)，竹节虫目(Phasmatodea)，革翅目(Dermaptera)，螳螂目(Mantodea)，Blattaria，等翅目(Isoptera)，纺足目(Embioptera)，啮虫目(Psocoptera)，食毛目(Mallophaga)，虱目(Anoplura)，缨翅目(Thysanoptera)，半翅目(Hemiptera)，脉翅目(Neuroptera)，长翅目(Mecoptera)，毛翅目(Trichoptera)，鳞翅目(Lepidoptera)，鞘翅目(Coleoptera)，双翅目(Diptera)，膜翅目(Hymenoptera)，蚤目(Siphonaptera)，捻翅目(Strepsiptera)，等。

囊泡-融合腺苷三磷酸酶(囊泡-融合腺苷三磷酸酶，EC.3.6.4.6，同义词：N-乙基马来酰亚胺敏感因子；NSF)是称为AAA(与多种细胞活性相关的腺苷三磷酸酶)的腺苷三磷酸酶之一，其具有利用来自ATP水解的自由能分解与囊泡转运相关的SNARE复合物的功能。

囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性可以通过体外测定法的方式测量。存在可以利用放射标记的和未放射标记的ATP作为酶底物来确定囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的多种测定法。例如，可以利用放射标记的ATP放射性测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性，例如，如在Tagaya等，生物化学杂志(J BiolChem)268，1993，2662-2666中所述，其中利用[α-32P]ATP。至于其余的测定法，如在Mueller等，自然细胞生物学(Nature Cell Biol)1，1999，335-340；Peters等，胚胎学杂志(EMBO J)9，1990，1757-1767中所述，存在通过利用[γ-32P]ATP作为底物，基于检测释放的[32Pi]而测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的实例。

类似地，作为用于测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的方法，存在利用非放射标记的ATP的测定法。在这样的方法中，包括，但不限于，在作为底物的ATP裂解后测量产物，和对裂解的底物的比色定量分析。上述测量方法记述在Lanzetta等，分析生物化学(Analytical Biochemistry)100，95-97(1979)；Lill等，细胞(Cell)60，271-280(1990)中。另外，可以利用与囊泡-融合腺苷三磷酸酶的酶促反应偶联的另一种酶促反应来测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性。例如，在进行囊泡-融合腺苷三磷酸酶与作为底物的ATP的酶促反应后，可以通过使用激酶-Glo^TM发光激酶测定法(由普洛麦格(Promega)供应)，以萤光酶的发光量来测量未被消耗的ATP的量。发光量的增加和囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性成反比。

对于其余测定法，例如，通过标准方法如生物学方法(体内测量方法)检测囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性也是可能的，在所述生物学方法中，测量腺苷三磷酸酶的活性。

在所述测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的各种方法中，机械地且有效地测量多样品囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的方法理想地使用上述囊泡-融合腺苷三磷酸酶反应，所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶反应与另一种酶促反应偶联。具体的实例包括这样的方法，所述方法包括在使用ATP作为底物的囊泡-融合腺苷三磷酸酶酶促反应之后，使用激酶-Glo^TM发光激酶测定法(由普洛麦格(Promega)供应)，依据在附在所述试剂盒上的说明书中描述的方法，以萤光酶的发光量来测量未被消耗的ATP的量，并且从这一发光量确定囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性。

另外，用于测量昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的方法可以通过与上述方法相似的方法进行。

已经在不同昆虫物种中鉴定了一些囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列，如在黑腹果蝇(NSF1[comt，昏睡]，登记号NP_524877；NSF2，登记号NP_788676)，烟草天蛾(Manduca sexta)(登记号AAF18300)，谷实夜蛾(Helicoverpa zea)(登记号AAO65962)，棉铃虫(Helicoverpa armigera)(登记号AAW58140)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(登记号AAQ83118)，刚比亚按蚊(Anopheles gambiae)(登记号XP_307148)中，等等，其可以在公共数据库中找到。此外，已经在不同昆虫物种中鉴定了几种囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的核苷酸序列，例如，在黑腹果蝇(nsf1[comt，昏睡]，登记号NM_080138；nsf2，登记号NM_176499)，烟草天蛾(登记号AF118384)，谷实夜蛾(登记号AY220909)，棉铃虫(登记号AY864803)，埃及伊蚊(登记号AY314995)，刚比亚按蚊(登记号XM_307148)，蚕(Bombyx mori)(登记号AY864804)中，等等，其可以在公共数据库中找到。

此处，“公共数据库”包括，例如，由每个数据库如GenBank，DDBL，和EMBL公开的数据库，其中任何人可以没有任何限制地使用记录在所述数据库中的数据。关于在GenBank中记录的碱基序列的信息可以，例如，通过基于GenBank给予每个基因的前述登记号从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(URL；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网页上获得。事实上，官方承认，记录在INSD中的数据应该永久保存，并且作为科学资源材料公开在由国际咨询委员会建立的“DDBL，EMBL和GenBank登记数据的处理”(于2002年5月23-24日)中，所述国际咨询委员会是由上述3个数据库组建的国际核苷酸序列数据库(INSD)的咨询组织。因此，基于登记号，本领域的任何技术人员可以比较(collate)、检索或获得由如GenBank、DDBL和EMBL的每个数据库公开的所有数据。

另外，按照下文所述的方法，可以从棉蚜鉴定囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列和囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的核苷酸序列。所鉴定的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中，并且棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：2中。

在除昆虫之外的动物中已经鉴定了一些囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列，例如，在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中(登记号NP_740892)，在智人(Homo sapiens)中(登记号NP_006169)，等等，这些可以在公共数据库中找到。此外，在除昆虫之外的动物中已经鉴定了一些囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的核苷酸序列，例如，在秀丽隐杆线虫中(登记号NM_170902)，在智人中(登记号NM_006178)，等等，这些可以在公共数据库中找到。

表1显示棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)与在其它动物中发现的囊泡-融合腺苷三磷酸酶及其基因的序列的序列同一性。

表1

序列来源	相对于SEQ IDNO：1的氨基酸序列的同一性(％)	相对于SEQ IDNO：2的核苷酸序列的同一性(％)
			黑腹果蝇(D.melanogaster)NSF1	67	64
黑腹果蝇NSF2	68	64
			埃及伊蚊(Aedes aegypti)	70	67
意大利蜜蜂(Apis mellifera)	69	71
			烟草天蛾(Manduca sexta)	70	65
棉铃虫(Helicoverpa armigera)	71	68
			谷实夜蛾(Helicoverpa zea)	69	68
智人	60	64
			猕猴(Macaca mulata)	60	64
家牛(Bos Taurus)	60	64
			狗(Canis familiaris)	60	64
小鼠(Mus musculus)	60	63
			褐家鼠(Rattus norvegius)	60	63
长尾仓鼠(Cricetulus longicaudatus)	60	63
			黑色仓鼠(Cricetulus griseus)	60	-
红原鸡(Gallus gallus)	60	64
			非洲爪蟾(Xenopus laevis)	59	62
斑马鱼(Danio renio)	59	63
			秀丽隐杆线虫	53	63
紫海胆(Strongylocentrotus purpuratus)	57	64
			环形泰勒虫(Theileria annulata)	42	60
痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)	42	62
			黑曲霉(Aspergillus niger)	46	58

弓形虫(Toxoplasma gondii)	45	57
			巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)	46	62
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)	45	61
			粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)	49	-

调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力是指增加或者减少昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力，即，意指激活囊泡-融合腺苷三磷酸酶的能力，或者抑制囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力。并且，可以向测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的反应系统中加入测试物质，以研究所述测试物质对囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的影响。

已经鉴定了一些腺苷三磷酸酶抑制剂(Chene，自然综述(Naturereviews)，1(2002)665；Beukers等，aunyn-Schmied.Arch.Pharmacol.351：523-528，1995)。这些当中的一些，诸如N-乙基马来酰亚胺，还表现出抗囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性(Steel G.J.等，生物化学(Biochemistry)38，1999，7764-7772和Morgan A.等，JBC 269(7).1994，29347-29350)。

反应中测试物质的IC₅₀值意指不含测试物质的反应活性的50％被抑制时的测试物质的浓度。测试物质的IC₅₀值可以通过这样确定：将不同浓度的测试物质添加到囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性测量反应系统中，测量在添加的测试物质的每一浓度(剂量)下的囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性(反应)，产生剂量-反应曲线，并且计算囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性被抑制50％时所加入的测试物质的浓度。更具体地，剂量-反应曲线可以应用四参数逻辑模型或S形剂量-反应模型生成：

f(x)＝(A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))

$f\left(x\right)=A+\frac{B-A}{1+{(C/x)}^D}$

以计算IC₅₀值。特别地，IC₅₀值可以应用商购计算软件XLfit(由IDBS制作)进行计算。

具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的试剂是一种含有具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的物质作为活性成分的试剂。

在本发明中，“调节害虫的生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力”是一种具有通过前文提及的测量方法指定的调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的试剂，并且意指可以调节害虫的生理状况的试剂。所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶是棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶。另外，所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中调节害虫的生理状况的试剂是杀虫剂。另外，所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力是抑制使用ATP作为底物的反应的能力。

在本发明中，“杀虫剂”是指具有控制害虫的能力的试剂。

除本发明中公开的方法之外，用于测量控制害虫的能力的方法的实例还包括，检测关于害虫的杀虫活性的方法。具体地，例如，可以按照下述方法检测杀虫活性。

按照昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版(Elsevier Science Publisers)1985)第35-36页所述的方法，除了制备具有下述组成(表2)的无菌人工饲料之外，并且按人工饲料体积的0.5％加入在DMSO中的测试试剂溶液，并且混合，饲养棉蚜，在6天后研究存活的棉蚜的数目，并且按照下述方程获得控制值。

表2

控制值(％)＝{1-(CbxTai)/(CaixTb)}×100

在所述方程中的字母表示下述意义：

Cb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目

Cai：在未处理部分中在观察时存活的虫子数目

Tb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目

Tai：在处理部分中在观察时存活的虫子数目

可以这样说，表现出显著高的控制值的测试试剂具有杀虫活性。更具体地，可以确定，具有30％或更大的控制值的测试试剂具有实质的杀虫活性，并且可以确定，具有小于30％的控制值的测试试剂没有实质的杀虫活性。

本发明的杀虫剂包含具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的化学物质或其农业上可接受的盐作为活性成分。

在本发明中，农业上可接受的盐是指以这样的形式存在的盐，即，控制试剂的制备及所述制剂的应用是可能的，并且可以是以任何形式存在的盐。具体地，所述盐的实例包括与无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、和磷酸，有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、和乙磺酸，或酸性氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸的酸式加成盐；与无机碱的盐，所述无机碱如钠、钾、镁和铝，与有机碱如甲胺、乙胺和乙醇胺，或碱性氨基酸如赖氨酸和鸟氨酸的盐；以及铵盐。

在本发明中，“包含具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分的杀虫剂”意指以下试剂，其可以通过包含具有在所述测量方法中鉴定的调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分而控制害虫。所述物质的优选实例包括具有抑制囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力的化合物。所述物质的更优选的实例包括具有在无细胞系统中抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力的物质，其中在存在10μM或更多的所述物质下，囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性低于在不存所述物质下的活性。另外，所述物质的其它优选的实例包括具有在无细胞系统中以100μM或更小的IC50抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力的物质。

在本发明中，“测定测试物质的杀虫活性的方法，其包括第一步，在囊泡-融合腺苷三磷酸酶与测试物质接触的反应系统中测量选自组A的囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性，和第二步，基于通过比较在第一步中测量的活性与对照的活性而获得的差别来评估测试物质的杀虫活性”是指特征在于在用于测定测试物质的杀虫能力的各种方法中包括所述第一步和所述第二步的方法。

在本文中，组A是指：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；

(b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中缺失、添加或替代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有75％或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；

(e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2具有75％或更高的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(f)包含由多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(g)包含昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的蛋白；和

(h)包含棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的蛋白。

第一步是在通过将测试物质加入到前文提及的各种囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性测量反应系统中而使得囊泡-融合腺苷三磷酸酶与测试物质接触的状态下测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的步骤。另外，第二步是比较测试物质测量的活性与对照物质的活性并且基于该差异评估杀虫能力的步骤。在本文中，对照意指，例如，在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中的情形中，其中只加入与用来溶解所述测试物质相同的溶剂的检测部分。

在具有第一步和第二步的用于测定测试物质所拥有的杀虫能力的方法中，所用的囊泡-融合腺苷三磷酸酶是在组A中所示的蛋白。在组A的蛋白中，在由(a)表示的蛋白的氨基酸序列和由(b)，(c)，(e)，(f)，(g)和(h)表示的蛋白的氨基酸序列之间可以识别的差别是部分氨基酸的缺失、替代、添加等。这些包括，例如，由于具有由(a)表示的氨基酸序列的蛋白在细胞中进行加工引起的缺失。另外，实例包括由下列各项所产生的氨基酸的缺失、替代、添加等：由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过基因定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。

经受缺失、替代、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现囊泡-融合腺苷三磷酸酶的肽酶活性的范围内的数目。另外，氨基酸替代的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行替代。所述替代的具体实例包括在下列各组中的替代：(1)甘氨酸，丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)丝氨酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。

人工引入氨基酸的缺失、添加或替代(下文，在一些情形中总称为氨基酸的改变)的方法的实例包括将基因定点突变引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中，并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用琥珀突变的方法(缺口双链方法(gappedduplex method)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变随机引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括：使用编码任一种前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列反应条件下进行PCR的方法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常规浓度改变的反应条件下，或在促进聚合酶反应的Mg²⁺的浓度从常规浓度升高的反应条件下。PCR方法的实例包括，例如，在分子生物学方法(Method in Molecular Biology)，(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。

在本文中，“序列同一性”是指两个核苷酸序列或两个氨基酸之间的同一性。“序列同一性”通过比较待比较的序列的所有区域以最适状态排列的两个序列而确定的。在此处，在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中，可以允许添加或缺失(例如，缺口等)。可以通过使用如FASTA[Pearson和Lipman，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，分子生物学杂志(Journal ofMolecular Biology)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，核酸研究(Nucleic Acid Research)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生序列比对的同源性分析而计算序列同一性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上可获得。备选地，序列同一性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN第5版(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，科学(Science)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列同一性。

在(f)中所述的“严格条件”的实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在按照Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratorypress)所述的常规方法进行的杂交中，例如，杂交体在45℃在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬酸三钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤(分子生物学(MolecularBiology)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐浓度可以在从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件下进行选择。洗涤步骤的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件下进行选择。备选地，盐浓度和温度都是可以变化的。

在(h)中描述的蛋白是指在昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶中，存在于棉蚜中的囊泡-融合腺苷三磷酸酶，并且包括含有(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。

另外，组A的蛋白包括含有在(g)中所述的昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的蛋白，并且更优选地包括这样的蛋白，即，其中当与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对以获得最大的序列同一性时，在与氨基酸序列SEQ ID NO：1的(I)位置314，(II)位置341，(III)位置343，(IV)位置421，(V)位置529，(VI)位置547，(VII)位置584，(VIII)位置587，(IX)位置613和(X)位置623相对应的位置的氨基酸残基分别为(I)谷氨酸(在与314对应的位置)，(II)缬氨酸(在与341对应的位置)，(III)天冬酰胺(在与343对应的位置)，(IV)异亮氨酸(在与421对应的位置)，(V)丙氨酸(在与529对应的位置)，(VI)天冬酰胺(在与547对应的位置)，(VII)亮氨酸(在与584对应的位置)，(VIII)精氨酸(在与587对应的位置)，(IX)甘氨酸(在与613对应的位置)，和(X)苏氨酸(在与623对应的位置)。在此处，“与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对以获得最大的序列同一性”意指包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的多个待分析的氨基酸序列的序列同一性通过如上文所述的FASTA，BLAST，CLUSTAL W程序进行分析，并且对它们进行序列比对。通过所述方法比对多个序列，而不管在氨基酸序列中的插入或缺失，可以确定每一氨基酸序列中的保守氨基酸残基的位置。认为保守氨基酸残基存在于目的蛋白的三维结构中的相同位置，并且推测关于目的蛋白的特异性功能具有相似的作用。例如，当将包括在本发明中公开的囊泡-融合腺苷三磷酸酶序列的昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与氨基酸序列SEQ ID NO：1比对以获得氨基酸序列的最大的序列同一性时，显示在与氨基酸序列SEQ ID NO：1的(I)位置314，(II)位置341，(III)位置343，(IV)位置421，(V)位置529，(VI)位置547，(VII)位置584，(VIII)位置587，(IX)位置613，和(X)位置623相对应的位置的氨基酸残基分别为(I)谷氨酸(在与314对应的位置)，(II)缬氨酸(在与341对应的位置)，(III)天冬酰胺(在与343对应的位置)，(IV)异亮氨酸(在与421对应的位置)，(V)缬氨酸(在与529对应的位置)，(VI)天冬酰胺(在与547对应的位置)，(VII)亮氨酸(在与584对应的位置)，(VIII)精氨酸(在与587对应的位置)，(IX)甘氨酸(在与613对应的位置)，和(X)苏氨酸(在与623对应的位置)。

具有杀虫能力的物质可以通过使用测量对上文提及的害虫的杀虫能力或控制作用而测定杀虫能力的方法进行筛选。

备选地，具有杀虫能力的物质还可以通过使用囊泡-融合腺苷三磷酸酶测定杀虫能力的方法进行筛选。具体地，当应用使用囊泡-融合腺苷三磷酸酶测定杀虫能力的方法鉴定测试物质的杀虫能力是特定的值以上，或者特定的值以下时，可以通过选择所述物质而筛选具有杀虫能力的物质。

由于通过所述筛选方法选择的物质具有杀虫能力，所以它可以用作包含所述物质或农业上可接受的盐作为活性成分的杀虫剂。

害虫的控制通常可以通过将有效量的杀虫剂施用于被保护的农作物、害虫或害虫的栖息地而进行。

当将杀虫剂用于农业和林业时，其使用量通常关于每1000m²，杀虫剂的量为0.1到1000g。当将杀虫剂配制成乳剂、水可分散的粉剂、易流动的制剂、微胶囊制剂等时，所述试剂通常通过用水将活性成分稀释至1到10,000ppm的浓度，并且将其喷雾而应用，并且当杀虫剂配制成粒剂、粉剂等时，所述试剂通常按照原样进行应用。

杀虫剂可以通过叶面-处理诸如农作物等需要防治害虫的植物而使用，并且还可以通过在移植农作物的苗之前处理苗床，或者处理在种植时的种植洞或株基而使用。此外，为了控制害虫在耕地的土壤中栖息的目的，可以通过处理所述土壤而应用所述试剂。备选地，所述试剂可以通过将已经加工成薄片或细线的树脂制剂环绕在农作物上，将所述制剂在农作物附近延伸和/或散布在株基的土壤表面而使用。

当将杀虫剂用作害虫控制剂用于防止流行病时，乳剂、水可分散的粉剂、流动物等通常通过用水稀释以致活性成分的浓度为0.01到10,000ppm而应用，并且油剂、气溶胶、薰剂、毒饵等按照原样进行应用。

杀虫剂的一种用途的实例包括控制家畜如牛、绵羊、山羊和鸡或小动物如狗、猫、大鼠和小鼠的外部寄生虫，在这种情形中，所述试剂可以通过兽医学已知的方法施用给动物。作为一种具体的施用方法，当意欲全身控制时，例如，所述试剂通过片剂、混合在饲料中的、栓剂、注射剂(肌内、皮下、静脉内、腹膜内等)等而施用，当意欲非全身控制时，所述试剂通过喷雾油性试剂或水性液体试剂、在治疗时进行倾倒或打点、用洗发精制剂清洗动物或给动物附上已经加工成项圈或耳签的树脂制剂的方法而应用。当施用给动物体时杀虫剂的量通常在0.1到1,000mg范围内，其表示为每1kg动物的化合物A和化合物B的总量。

它们的使用量和使用浓度都取决于这样的情形而不同，所述情形诸如制剂种类、施用时间、施用位置、施用方法、害虫种类、损害程度等，可以增加或减少，而不管前文提及的范围，并且可以适当地进行选择。

前文提及的杀虫剂可以用于上文所述的控制害虫的方法中。

另外，在另一方面，还可以通过使用前文提及的测定测试物质拥有的杀虫能力的方法鉴定具有杀虫能力的物质(所述鉴定方法具有第一步和第二步，使用选自组A的囊泡-融合腺苷三磷酸酶)，并且将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触而控制害虫。在此处，作为将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触的方法，可以应用前文提及的制备方法、施用方法等。

组B中所示的氨基酸序列是昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列，其包含下述(a)到(g)任一种氨基酸序列：

(a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；

(b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中缺失、添加或替代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有75％或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；

(e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2具有75％或更高的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(f)由多核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；和

(g)棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列。

在组B的氨基酸序列中，在由(a)表示的氨基酸序列和由(b)，(c)，(e)，(f)和(g)表示的氨基酸序列之间可以识别的差别是部分氨基酸的缺失、替代、添加等。这些包括，例如，由于具有由(a)表示的氨基酸序列的蛋白在细胞中进行加工引起的缺失。另外，实例包括由下列各项所产生的氨基酸的缺失、替代、添加等：由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过基因定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。

经受缺失、替代、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现囊泡-融合腺苷三磷酸酶的肽酶活性的范围内的数目。另外，氨基酸替代的实例包括用在疏水性、电荷、pH和空间结构上特征相似的氨基酸进行替代。所述替代的具体实例包括在下列各组中的替代：(1)甘氨酸，丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)丝氨酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。

人工引入氨基酸的缺失、添加或替代(下文，在一些情形中总称为氨基酸的改变)的方法的实例包括将基因定点突变引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中，并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，基因定点诱变的实例包括应用琥珀突变的方法(缺口双链方法，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，12，9441-9456(1984))、通过应用引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的方法的实例包括将突变随机引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方法表达这一DNA的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增每种全长DNA的引物对在下列反应条件下进行PCR的方法：即，在用作底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常规浓度改变的反应条件下，或在促进聚合酶反应的Mg²⁺的浓度从常规浓度升高的反应条件下。PCR方法的实例包括，例如，在分子生物学方法(Method in Molecular Biology)，(31)，1994，97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。

在本文中，“序列同一性”是指两个核苷酸或两个氨基酸之间的同一性。“序列同一性”通过比较待比较的序列的所有区域以最适状态排列的两个序列而确定的。在此处，在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最适比对中，可以允许添加或缺失(例如，缺口等)。可以通过使用如FASTA[Pearson和Lipman，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，4，2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul等，分子生物学杂志(Journal ofMolecular Biology)，215，403-410(1990)]、CLUSTAL W[Thompson，Higgins和Gibson，核酸研究(Nucleic Acid Research)，22，4673-4680(1994a)]等的程序进行产生比对的同源性分析而计算序列同一性。所述程序一般在日本DNA数据库【日本信息生物学和DNA数据库中心国家遗传所(Genetics，Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan)管理的国际DNA数据库；CIB/DDBJ】的网址(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上可用。备选地，序列同一性还可以应用商购序列分析软件而获得。具体地，例如，可以应用GENETYX-WIN第5版(由软件开发有限公司(SoftwareDevelopment Co.Ltd.)制造)通过Lipman-Pearson方法【Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，科学(Science)，227，1435-1441，(1985)】进行同源性分析并且生成序列比对而计算序列同一性。

在(f)中所述的“严格条件”的实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在按照Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratorypress)所述的常规方法进行的杂交中，例如，杂交体在45℃在含有6×SSC(含有1.5m NaCl和0.15m柠檬酸三钠的溶液是10×SSC)的溶液中形成，并且然后，将这一杂交体在50℃用2×SSC洗涤(分子生物学(MolecularBiology)，John Wiley和Sons，纽约(1989)，6.3.1-6.3.6)。洗涤步骤的盐浓度可以在从2×SSC(低严格条件)到0.2×SSC(高严格条件)的条件下进行选择。洗涤步骤的温度，例如，可以在从室温(低严格条件)到65℃(高严格条件)的条件下进行选择。备选地，盐浓度和温度都是可以变化的。

具有在(g)中所述的氨基酸序列的蛋白是指在昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶中，存在于棉蚜中的囊泡-融合腺苷三磷酸酶，并且包括包含(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。

例如，具有在组B中所示的氨基酸序列的蛋白可以按照下文所述的方法、使用编码在组B中所示的氨基酸序列的多核苷酸进行制备。

昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶可以用作提供评估杀虫活性的指示剂的试剂。具体地，例如，昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶可以通过用作囊泡-融合腺苷三磷酸酶、用于使用囊泡-融合腺苷三磷酸酶测定杀虫能力的方法中而提供评估杀虫活性的指示剂的试剂。另外，更具体的方法可以按照前文所述的测量囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的方法而进行。

另外，当昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶用作提供评估杀虫活性的指示剂的试剂时，更优选地，需要昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶是具有在组B中所示的氨基酸序列的囊泡-融合腺苷三磷酸酶。

具有编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下，在一些情形中叫作多核苷酸组B)具有可以在生物体的细胞中或体外翻译系统中产生具有组B中所示的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。多核苷酸组B可以是从天然克隆的DNA，例如通过基因定点诱变或随机诱变向从天然克隆的DNA中引入核苷酸的缺失、替代或添加的DNA，或人工合成的DNA。具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列的多核苷酸。

<第一种获得方法>

例如，将在下文中显示获得包括在多核苷酸组B中的、包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多核苷酸的方法。作为一个步骤，从棉蚜获得总RNA，合成cDNA文库，并且进行PCR扩增，由此可以获得目的多核苷酸。

将在盆栽黄瓜的叶片上培养的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和幼虫用小刷子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本(Nippon)基因供应)按下述分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末保持在冰上碾磨10分钟。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)供应)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每个5ml水层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到每一管中后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每个10ml水层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司供应)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque公司)中。在260nm测量制备的总RNA的吸光度，以按照常规方法计算浓度。

应用通过上述方法获得的棉蚜总RNA作为模板，并且按照附在试剂上的手册使用随机引物(由Invitrogen供应)和superscript III(由Invitrogen供应)进行RT-PCR，以合成第一链cDNA。

应用通过上述方法获得的棉蚜cDNA文库作为模板，并且按照附在试剂上的手册使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸引物和包含核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸引物以及La-Taq聚合酶(由Takara Bio供应)进行PCR。PCR的条件如下：在94℃起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94℃20秒，60℃20秒，每个循环降低1℃，和72℃2分钟；然后是25个PCR循环，一个循环为94℃20秒，50℃20秒和72℃3分钟；并且接着在72℃温育7分钟。

如上文所述，可以获得包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多核苷酸。

<第二种获得方法>

备选地，在多核苷酸组B中所示的多核苷酸还可以通过制备具有由应用琥珀突变的方法引入的突变的多核苷酸而获得，所述方法为上文提及的基因定点诱变，为一种使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多核苷酸作为模板通过使用引入突变等的引物的PCR方法。

<第三种获得方法>

备选地，还可以通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的多核苷酸作为探针的杂交方法而获得在多核苷酸组B中所示的多核苷酸。更具体地，第三种获得方法可以按照在前文提及的由冷泉港实验出版社出版的Sambrook J.，Frisch E.F.，Maniatis T.，分子克隆第二版中所述的常规杂交而进行。

<第四种获得方法>

备选地，在多核苷酸组B中所示的多核苷酸还可以通过基于已知的昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列制备引物并且进行PCR而获得。为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离囊泡-融合腺苷三磷酸酶的同系物，应用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein Analysis Server)的网址http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html公共可获得)，并且基于前文提及的来源于棉蚜的囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因序列和先前已知的黑腹果蝇(NCBI登记号NM_080138)，烟草天蛾(NCBI登记号AF118384)，谷实夜蛾(NCBI登记号AY220909)，刚比亚按蚊(NCBI登记号XM_307148)等的核苷酸序列，设计简并引物。

选择的昆虫物种的囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因同系物的部分序列通过一系列PCR扩增，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一链cDNA通过前文提及的方法使用Superscript III制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)供应)按照附在所述试剂上的供应商的方法而进行。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下：在94℃起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94℃30秒，60℃1分钟，每个循环降低1℃，和72℃1分30秒；接着是25个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃1分钟和72℃1分30秒；并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen供应)中，并且测序。

然后，设计对所得到的囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的昆虫同系物的部分序列特异的引物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3’和5’RACE PCRs这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合成试剂盒(由Clontech供应)或第二代5’/3’RACE试剂盒(由罗氏(Roche)供应)按照附在所述试剂盒上的供应商的用法指导而进行。

当使用SMART PCR cDNA合成试剂盒时，在3’RACE和5’RACE反应中，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的通用引物混合物(UPM)与对目的序列特异的正向引物或反向引物组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下：在94℃起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94℃30秒，60℃1分钟，每个循环降低1℃，和72℃2分钟；接着是25个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃1分钟和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen供应)中，并且测序。

当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物与特异的正向引物或特异的反向引物组合用作引物，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下：在94℃起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94℃30秒，60℃30秒，每个循环降低1℃，和72℃2分钟；接着是25个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃1分钟，和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen供应)中，并且测序。

上述测序结果显示5’-端序列和3’-端序列，其每一端分别编码昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的N-端区域和C-端区域。

因此，在多核苷酸组B中所示的多核苷酸可以通过基于已知的昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列制备引物、通过PCR而获得。

包括与多核苷酸组B的多核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来应用杂交方法获得在多核苷酸组B中所示的多核苷酸。

本发明中的获得方法包括通过杂交检测所需的多核苷酸的步骤，鉴定所检测的所需的多核苷酸的步骤，和回收所鉴定的所需的多核苷酸的步骤。每一步骤将在下文中具体阐释。

通过杂交检测所需的多核苷酸的步骤和鉴定所检测的所需的多核苷酸的步骤可以这样进行，即，通过使用具有与多核苷酸组B的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸作为探针，按照例如记述在“分子克隆：实验室手册第二版(Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd edition)”(1989)，冷泉港实验室出版社，“当代分子生物学方法(Current Protocols InMolecular Biology)”(1987)，John Wiley和Sons公司ISBN0-471-50338-X等中的方法进行。

具体地，例如，将包括与SEQ ID NO：2的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA通过已知的方法用放射性同位素标记标记或荧光标记，其使用随机引发的DNA标记试剂盒(Random Primed DNA Labelling Kit，由Boehringer供应)、随机引物DNA标记试剂盒第2版(由TAKARA SHUZO有限公司供应)、ECL直接核酸标记和检测系统(ECL Direct Nucleic AcidLabelling and Ditection System，由安玛西亚生物科学供应(AmershamBiosciences)，或Megaprime DNA-标记系统(由Amersham生物科学供应)进行标记，并且这可以用作探针。

用于杂交的条件的实例包括严格条件，并且具体地，实例包括这样的条件，即，在所述条件下，在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠)、5×Denhart’s杂交溶液(0.1％(w/v)菲克(Ficoll)400，0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)、0.5％(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的条件下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution，Boehringer Mamnnheim)中进行温育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDS的条件下进行温育两次，持续15分钟，并且此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和0.5％SDS的条件下进行温育持续30分钟。

更具体地，例如，可以通过应用包括与多核苷酸组B的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸作为模板，使用Megaprime DNA-标记系统(由安玛西亚法玛西亚生物技术(Amersham Pharmacia Biotech)供应)并且使用在试剂盒中指定的反应溶液，而制备用³²P标记的探针。使用这一探针按照常规方法进行菌落杂交，在65℃在存在6×SSC(0.9M NaCl，0.09M柠檬酸钠)、5×Denhart’s杂交溶液(0.1％(w/v)菲克400，0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA)、0.5％(w/v)SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的条件下，或者在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIGEASY Hby solution，Boehringer Mamnnheim)中进行温育，然后，在室温在存在1×SSC(0.15m NaCl，0.015m柠檬酸钠)和0.5％SDS的条件下进行温育两次持续15分钟，并且此外，在68℃在存在0.1×SSC(0.015m NaCl，0.0015m柠檬酸钠)和0.5％SDS的条件下进行温育持续30分钟，由此可以检测(包含)杂交的多核苷酸(的菌落)。因此，可以通过杂交检测所需的多核苷酸，并且可以鉴定所检测的所需的多核苷酸。

对于回收所鉴定的所需的多核苷酸，可以通过前文提及的方法，例如，按照如在冷泉港实验室出版社的“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)中所述的碱法的方法，从含有所检测并且鉴定的多核苷酸的菌落回收质粒DNA。所回收的所需的多核苷酸(质粒DNA)的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam，A.M和W.Gilbert，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74，560，1977等中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74，5463，1977等中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由安玛西亚生物科学(AmershamBiosciences)供应)、染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(Applied Biosystems)制备)等。

包括多核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或包括与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来使用PCR获得在多核苷酸组B中所示的多核苷酸。更具体地，实例包括包含SEQ IDNO：3或4的核苷酸序列的多核苷酸。本发明中的获得方法包括通过PCR扩增所需的多核苷酸的步骤，鉴定所扩增的所需的多核苷酸的步骤，和回收所鉴定的所需的多核苷酸的步骤。每一步骤将在下文中具体阐释。

在通过PCR扩增所需的多核苷酸的步骤中，具体地，基于约20bp-约40bp的核苷酸序列，例如，选自SEQ ID NO：2的核苷酸序列和与SEQ IDNO：2的核苷酸序列互补的序列的核苷酸序列，从多核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列或与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列设计并且合成的DNA，可以用作引物对。引物对的实例包括一套包含由SEQ IDNO：3表示的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列的多核苷酸。例如，通过将商购的PCR试剂盒指定的反应溶液添加到通过前文提及的方法制备的cDNA文库中而制备PCR反应溶液。反应条件可以变化，这取决于要用的引物对，并且例如，可以应用下列条件：这样的条件，即在所述条件下，在94℃温育10秒后，重复大约40个循环，1个循环为94℃15秒，60℃15秒，和72℃3分钟，并且继续在72℃进行温育3分钟；这样的条件，即在所述条件下，在94℃进行温育2分钟，然后在约8℃进行温育3分钟，并且然后重复大约40个循环，1个循环为94℃30秒，55℃30秒，和72℃4分钟；或者这样的条件，即在所述条件下，进行5-10个循环，1个循环为94℃温育5秒，然后72℃4分钟，并且继续进行约20-40个循环，1个循环为在94℃温育5秒，然后在70℃4分钟。在PCR中，例如，可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene供应)，Amplitaq Gold(由应用生物系统供应)，Takara Heraculase(商标名)(由TAKARA SHUZO有限公司供应)，包含在优势cDNA PCR试剂盒(Advantage cDNA PCR Kit)中的DNA聚合酶(由Clonetech供应)，TaKaRa Ex Taq(由TAKARA SHUZO有限公司制备)，PLATINUMTM PCR超级混合物(PLATINUMTM PCR SUPER Mix，由东方生命技术(Lifetech Oriental)供应)。

通过PCR扩增的所需的多核苷酸的鉴定可以通过琼脂糖凝胶电泳，按照冷泉港实验室出版社的“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)中所述的方法测量分子量而进行。另外，关于所扩增的所需的多核苷酸，使用商购的DNA测序反应试剂盒，例如，染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统供应)，按照附在试剂盒上的手册进行测序反应，并且使用DNA测序仪3100(由应用生物系统供应)分析核苷酸，由此，可以读取扩增片段的核苷酸序列。

回收所鉴定的所需的多核苷酸的方法的实例包括按照冷泉港实验室出版社的“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)中所述的方法从琼脂糖凝胶纯化，并且回收通过琼脂糖凝胶电泳鉴定的前文提及的多核苷酸的方法。另外，这样回收的多核苷酸或通过PCR扩增的所需的多核苷酸可以按照冷泉港实验室出版社的“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)中所述的常规方法、和“当代分子生物学方法”(1987)，John Wiley和Sons公司ISBN0-471-50338-X中所述的常规方法克隆到载体中。要用的载体实例包括pUCA119(由TAKARA SHUZO有限公司供应)，pTVA118N(由TAKARASHUZO有限公司供应)，pBluescriptII(由Toyobo有限公司供应)，pCR2.1-TOPO(由Invitrogen供应)等。另外，克隆的多核苷酸的核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam，A.M和W.Gilbert，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74，560，1977中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger，F.和A.R.Coulson，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，94，441，1975，Sanger，F.和Nicklen和A.R.Coulson.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，74，5463，1977中所述)进行验证。因此，例如，可以使用商购的Termo测序酶II染色终止子循环测序试剂盒(由安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)供应)、染色终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(Applied Biosystems)供应)等。

另外，具有多核苷酸组B的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或具有与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来获得多核苷酸组B中所示的多核苷酸，其不但使用PCR方法还使用前文提及的杂交方法。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO：3或4表示的核苷酸序列的多核苷酸。

制备包括在组B中所示的氨基酸序列的蛋白的方法的实例包括培养其中引入选自多核苷酸组B的多核苷酸的转化体并且回收所生产的蛋白的方法。另外，为了制备本文所用的转化体，其为这样的工作，诸如制备包含这样的多核苷酸的环状多核苷酸，即，在所述多核苷酸中，选自多核苷酸组B的多核苷酸可操作地与噬菌体启动子连接。所述方法将在下文详细阐述。

另外，通过使用包括编码所用的囊泡-融合腺苷三磷酸酶的核苷酸序列的多核苷酸的类似的方法，可以制备并且获得在组A中所示的囊泡-融合腺苷三磷酸酶，所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶用于使用囊泡-融合腺苷三磷酸酶来测定杀虫活性的方法中。

噬菌体启动子意指包含在噬菌体基因组中的基因的启动子。在它们中，有效用于表达外源基因的噬菌体启动子的实例包括下列各项的启动子：T7RNA聚合酶基因、T3RNA聚合酶基因和SP6RNA聚合酶基因。

在本发明中，“可操作地连接”意指将包含目的基因的多核苷酸连接到包含启动子序列的多核苷酸的下游，以便目的基因可以在所用的转录系统中进行转录。具体地，例如，当使用后来描述的T7RNA聚合酶基因的启动子时，包含目的基因的多核苷酸可以连接到T7RNA聚合酶基因启动子的下游。另外，例如，当使用除T7RNA聚合酶基因启动子之外的启动子时，还可以将包含目的基因的多核苷酸连接到包含除T7RNA聚合酶基因启动子以外的启动子序列的多核苷酸的下游。更具体地，例如，当使用利用T7RNA聚合酶基因启动子的质粒pET41b(+)(Novagen)载体时，可以通过将目的基因连接到位于T7RNA聚合酶基因启动子下游的限制酶位点如NcoI，EcoRV，BamHI，EcoRI，StuI，PstI，SacI，SalI，HindIII，NotI，EagI和Xhol而可操作地连接多核苷酸。

在本发明中，“环状多核苷酸”是通过将多核苷酸链的末端结合而成环状的多核苷酸，并且实例包括除了质粒DNA、杆状病毒穿梭载体DNA等以外的许多细菌的染色体DNAs。

质粒DNA是相对低分子量的环状多核苷酸，并且实例包括pET(由Takara Mirus生物公司供应)和pBluescriptII(由Stratagene供应)，其用于在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达。其它实例包括pFastBacl，pFastBac HT A，pFastBac HT B，pFastBac HT C，pFastBac Dual，pBlueBacII(由Invitrogen供应)，pAcSG2(由Pharmingen供应)等，其包含杆状病毒表达盒。

杆状病毒穿梭载体是由BAC(细菌人工染色体)组成的高分子量DNA，所述BAC包含完整的杆状病毒基因组，例如在DH10Bac^TM大肠杆菌细胞(invitrogen)中存在的bMON14272(136kb)。杆状病毒穿梭载体DNA在大肠杆菌细胞中作为大质粒增殖，并且可以包含用于在杆状病毒启动子控制下表达外源基因的表达盒。

在其中将包含编码在组B中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸可操作地连接到噬菌体启动子上的环状多核苷酸具体地为，例如，包含含有与噬菌体T7RNA聚合酶启动子可操作地连接的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的DNA的环状多核苷酸，并且例如，可以按照下述方法制备并且获得。

使用包含按照前文提及的方法克隆的包含棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的质粒DNA作为模板，使用对所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因特异的引物和对所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶特异的添加了XhoI限制性位点的引物，通过PCR扩增包含所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的DNA片段。将得到的PCR产物用XhoI切割，并且将得到的包含棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的约1.4kbp DNA片段与预先用EcoRV和XhoI消化的质粒载体pET41b(+)(由Novagen供应)连接。以这种方式获得的质粒是包含含有与噬菌体T7RNA聚合酶启动子可操作性连接的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的DNA片段的环状多核苷酸的一个实例。

类似地，可以通过将编码组B所示的氨基酸序列的核苷酸连接到载体中而制备环状多核苷酸。

在本发明中，“复制起点”是对于自身在宿主细胞中复制所必需的特异性DNA序列。复制起点的实例包括用于细菌质粒的colE1和f1。

转化体是真核细胞或原核细胞，所述细胞已经通过向细胞中引入外源多核苷酸而被遗传改变。转化体的实例包括通过将用于基因克隆或基因表达的质粒如pET(Novagen)或pBluescript II(Stratagene)引入到大肠杆菌中而转化的大肠杆菌细胞。另外，将DNA引入到宿主细胞中的技术的实例包括转化、转染、原生质体融合、脂质转染法、电穿孔等。

其中引入编码组B所示的氨基酸序列的多核苷酸的转化体的实例包括转化的大肠杆菌，在其中引入包含与噬菌体T7RNA聚合酶启动子可操作地连接的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的DNA。具体地，所述转化体可以按照下述方法进行制备。

转化体可以这样制备，即通过按照在冷泉港实验室出版社的“分子克隆：实验室手册第二版”(1989)中所述的方法，将在EcoRV位点和Xho I位点之间插入包含棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的DNA的质粒载体pET41b(+)(Novagen)引入到大肠杆菌细胞中而制备。另外，还可以通过按照附在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen)上的手册所述的方法，通过用前文提及的质粒DNA转化大肠杆菌而制备转化体，在所述质粒DNA中插入了包含噬菌体T7RNA聚合酶启动子和棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的片段。

囊泡-融合腺苷三磷酸酶可以通过培养由前文提及的方法制备的转化体并且回收所生产的来源于昆虫的囊泡-融合腺苷三磷酸酶而制备。

囊泡-融合腺苷三磷酸酶可以通过重组大肠杆菌表达系统生产。该系统是最常用的用于高水平生产异源蛋白的原核表达系统。大肠杆菌是已知的遗传和生理学最佳表征的生物体，其易于操作，许多工具是可用的，它能够非常快速地生长，它在廉价的复合物或充分-限定的极限培养基上生长，并且它具有极高的合成异源蛋白的能力。

备选地，例如，囊泡-融合腺苷三磷酸酶蛋白可以通过重组杆状病毒/Sf9细胞表达系统生产。这一系统是最有力和通用的可用真核表达系统之一，并且可以用来表达来自许多不同来源的异源基因，所述来源包括真菌、植物、细菌和病毒。

另外，将通过培养转化体而生产的昆虫来源的囊泡-融合腺苷三磷酸酶通过诸如超声、弗氏压碎器和Dyno碾碎机的方法进行裂解，并且以包含在细胞粗提物中的形式回收，并且通过使用通常在酶纯化中所用的方法诸如离子交换柱层析、反相柱层析、凝胶过滤柱层析等而获得纯化的蛋白。备选地，当设计来源于昆虫的囊泡-融合腺苷三磷酸酶以具有His-标记的形式生产时，可以通过特异性识别并且结合His-标记的亲和柱层析快速从细胞粗提物中获得纯化的蛋白。通过所述方法，可以制备来源于昆虫的囊泡-融合腺苷三磷酸酶。

备选地，例如，囊泡-融合腺苷三磷酸酶蛋白可以通过例如重组杆状病毒/Sf9细胞表达系统而产生。例如，可以通过培养用含有与杆状病毒的多角体蛋白启动子可操作地连接的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的DNA片段转化的昆虫细胞，并且用弗氏压碎器将细胞碾碎，然后用柱层析纯化而制备昆虫来源的囊泡-融合腺苷三磷酸酶。

更具体地，例如，将通过上述方法制备的重组大肠杆菌在37℃以250rpm旋转培养过夜，所述重组大肠杆菌含有包含与噬菌体T7RNA聚合酶启动子可操作地连接的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的DNA片段。第二天早上，将培养物用新鲜培养基1/25稀释，并且在37℃250rpm培养。当培养物在600nm处的OD达到0.8时，向所述培养物中加入IPTG至终浓度为10μM。在25℃，60rpm培养4天后，将培养物以7,000rpm离心10分钟以收集大肠杆菌。向收集的大肠杆菌中加入裂解缓冲液(100mM Hepes/KOHpH 7.5，500mM KCl，5mM MgCl₂，2mM 2-巯基乙醇，5mM ATP，0.5mM，Pefablock，10μg/μl亮抑酶肽(Leupeptin)，1μM胃酶抑制剂A)并且混悬。然后，使用弗氏压碎器(由Thermo Spectronic供应)按照记述在所附使用说明中的方法，将大肠杆菌用1,300psi-1,500psi之间的压力裂解。将弗氏加压的溶液以14,000rpm，2℃离心60分钟，并且将得到的上清通过0.45μm滤器过滤。将样品注射到用His缓冲液A(50mM Hepe pH7.0，200mM KCl，1mM MgCl₂，2mM 2-巯基乙醇，0.5mM ATP，10％甘油)平衡的HiTrap螯合HP(由安玛西亚生物科学供应)柱或HisTrapHP(由安玛西亚生物科学供应)柱上。然后，用这样的缓冲液洗涤柱，在所述缓冲液中，混合85％的His缓冲液A和15％的His缓冲液B(20mM Hepes pH 7.0，200mM KCl，1mMMgCl₂，2mM 2-巯基乙醇，0.5mM ATP，500mM咪唑，10％甘油)，用5个柱体积的该缓冲液洗涤所述柱。接下来，制备15个柱体积的混合60％的His缓冲液A和40％的His缓冲液B的缓冲液并且注射到柱中。然后，制备15个柱体积的混合30％的His缓冲液A和70％的His缓冲液B的缓冲液并且注射到柱中。汇集1ml的洗脱级分等分试样，并且用SDS-PAGE分析等分试样，以鉴定含有86kDa囊泡-融合腺苷三磷酸酶的级分。这些级分是包含大量目标囊泡-融合腺苷三磷酸酶的溶液。将包含囊泡-融合腺苷三磷酸酶的溶液注射到用GST缓冲液A(20mM Hepes pH 7.0，200mM KCl，1mMMgCl₂，2mM 2-巯基乙醇，10％甘油)平衡的柱GSTrap FF(由安玛西亚生物科学供应)上。注射二十(20)个柱体积的GST缓冲液以洗涤柱。最后，注射30个柱体积的GST缓冲液B(50mM Tris-HCl，10mM还原谷胱甘肽，2mM 2-巯基乙醇，10％甘油)，然后收集洗脱的级分。所述级分包含溶解在GST缓冲液B中的目标囊泡-融合腺苷三磷酸酶。该级分的等分试样的SDS-PAGE分析证实包含86kDa的囊泡-融合腺苷三磷酸酶。

包含组B中所示的氨基酸序列的昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶可以用作研究工具。例如，它可以用作进行诸如测定杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等的研究的研究工具。另外，例如，在分析作用于囊泡-融合腺苷三磷酸酶的试剂的作用和机制的研究中，囊泡-融合腺苷三磷酸酶也可以用作研究工具。

另外，编码在组B中所示的氨基酸序列的多核苷酸和具有与它们有互补性的核苷酸序列的多核苷酸，以及编码在组B中所示的氨基酸序列的多核苷酸的部分核苷酸序列，或具有与所述部分核苷酸序列有互补性的核苷酸序列的多核苷酸，和包含(complying)由SEQ ID NO：3或4表示的核苷酸序列的多核苷酸，可以用作研究工具。例如，它们中的一部分作用为用于上文所述的制备囊泡-融合腺苷三磷酸酶的方法的多核苷酸。另外，部分可以用作重要的研究工具，用于进行使用PCR获得在多核苷酸组B中所示的多核苷酸，或者使用杂交获得在多核苷酸组B中所示的多核苷酸，如上文所述。

特别地，当进行杀虫剂的筛选时，它们可以用作对于筛选所进行的实验的实验工具。具体地，它们可以用作在进行测定杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等时进行的实验的实验工具。

此外，本发明还包括这样的系统，所述系统包括输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的设备，其中所述能力是调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力(以下，在一些情形中，叫作设备a)，基于所需的标准查询并且检索所述数据信息的设备(以下，在一些情形中，叫作设备b)，和显示并且输出查询和检索的结果的设备(以下，在一些情形中，叫作设备c)(以下，在一些情形中叫作本系统)。

首先，将阐释设备a。设备a意指，当输入关于测试物质具有的调节来源于昆虫的囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的数据信息之后，存储并且管理所输入的信息，如上文所述。信息通过输入设备1输入，并且通常以存储设备2存储。输入设备的实例包括可以输入信息的设备诸如键盘和鼠标。当完成信息输入和存储、管理时，步骤进展到下一种设备b。对于存储、管理所述信息，可以通过使用硬件如计算机、和软件如OS和数据库管理而输入具有数据结构的信息，并且将所述信息存储到适当的存储装置中，例如计算机可读的记录媒体如软盘、光磁盘、CD-ROM、DVD-ROM和硬盘，而有效地存储和管理大量的信息。

将阐释设备b。设备b是一种通过基于获得需要的结果的标准的设备查询并且检索所存储和管理的数据信息的设备，如上文所述。对于所述信息，当将关于查询和检索的标准通过输入设备1输入，并且在通常存储在存储设备2中的信息中选择符合所述标准的信息时，步骤进展到下一设备c。选择的结果通常存储在存储设备2中，并且可以进一步通过显示输出设备3显示。

将阐释设备c。设备c是显示并且输出查询和检索的结果的设备，如上文所述。显示输出设备3的实例包括显示器、打印机等，并且所述结果可以在计算机的显示装置上显示，或者可以通过打印在纸上输出。

实施例

下面将通过实施例的方式更详细地阐释本发明，但是本发明不限于这些具体的实例。

实施例1(从棉蚜和德国蟑螂提取总RNA)

(1)从棉蚜提取总RNA

将在盆栽黄瓜的叶片上培养的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和幼虫用小刷子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本(Nippon)基因供应)按下述分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末保持在冰上碾磨10分钟。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)供应)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每个5ml水层转移到两个新管中。在向每一管中加入5ml ISOGEN后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每个10ml水层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司供应)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸光度计算)为6.9mg/ml。

(2)从德国蟑螂提取总RNA

提供人工培养的德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))的成虫、若虫(nymphs)和卵囊(oothecae)作为样品。10只雄性成虫和10只雌性成虫(个体，每一只已经去除卵囊)用作1.1g的成虫样品，将10只雄性若虫和10只雌性若虫用作1.0g的若虫样品，并且将26只卵囊用作1.0g的卵囊样品。将这三种样品使用独立的研钵和研棒独立地在液氮中压成粉末。从每一份得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由Nippon基因供应)按下述分离RNA。在将10ml ISOGEN加入到在研钵中冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末保持在冰上碾磨10分钟。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)供应)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每5ml水层转移到两个新管中。在向每一管中加入5ml ISOGEN后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4℃以12,000xg离心15分钟，并且将每个10ml水层分别转移到新的50ml管中。随后，将10ml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司供应)加入到每一管中，并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4℃以12,000xg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70％乙醇。将得到的混合物在4℃以10,000xg离心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在1ml商购的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸光度计算)在来源于成虫的总RNA的情形中为1.1mg/ml，在来源于若虫的总RNA的情形中为2.5mg/ml，并且在来源于卵囊的总RNA的情形中为1.4mg/ml。

实施例2(分离棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因)

使用来自棉蚜的总RNA，用于RT-PCR的随机引物(Invitrogen)和Superscript III(Invitrogen)，按照Superscript III的供应商的方法而制备第一链cDNA。

通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO：3的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID NO：4的寡核苷酸，其为对所述基因特异的引物，和La-Taq聚合酶(由Takara Bio供应)按照供应商的方法进行PCR而扩增棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的全长cDNA。将如上述制备的第一链cDNA用作模板。应用的PCR条件如下：起始变性在94℃10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94℃20秒，60℃20秒，每个循环降低1℃，和72℃2分钟；然后25个PCR循环，一个循环为94℃20秒，50℃20秒和72℃3分钟；接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得2421bp的包含核苷酸序列SEQ ID NO：2的DNA。将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(Invitrogen)中。从所述核苷酸序列推定的氨基酸序列为氨基酸序列SEQ ID NO：1。

实施例3(分离德国蟑螂囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因)

为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离囊泡-融合腺苷三磷酸酶的同系物，应用Codehop程序(在由FredHutchinson癌症研究中心管理的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks ProteinAnalysis Server)的网址http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html公共可用)，并且基于前文提及的来源于棉蚜的囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因序列和先前已知的黑腹果蝇(NCBI登记号NM_080138)，烟草天蛾(NCBI登记号AF118384)，谷实夜蛾(NCBI登记号AY220909)，刚比亚按蚊(NCBI登记号XM_307148)等的核苷酸序列，设计简并引物。

所选昆虫物种的囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因同系物的部分序列通过一系列PCR扩增，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一链cDNA通过前文提及的方法使用SuperscriptIII制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向引物的一套简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)供应)，按照附在所述试剂上的供应商的方法而进行。PCR条件为进行递减PCR的那些条件，如下：在94℃起始变性10分钟；然后是10个递减-PCR循环，一个循环为94℃30秒，60℃1分钟，每个循环降低1℃，和72℃1分30秒；然后是25个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃1分钟和72℃1分30秒；并且接着在72℃7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen供应)中，并且测序。

因此，获得德国小蠊囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的部分序列。

然后，设计对所得到的囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的昆虫同系物的部分序列特异的引物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3’和5’RACE PCRs这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合成试剂盒(由Clontech供应)按照附在所述试剂盒上的供应商的用法指导而进行。

在3’RACE和5’RACE反应中，在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的通用引物混合物(UPM)与对目的序列特异的正向引物或反向引物组合使用。PCR条件为进行递减PCR的那些条件，如下：在94℃起始变性10分钟；然后是10个递减-PCR循环，一个循环为为94℃30秒，60℃1分钟，每个循环降低1℃，和72℃2分钟；然后是25个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃1分钟和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen供应)中，并且测序。

当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进行嵌套式PCR。在SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物与特异的正向引物或特异的反向引物组合用作引物，所述特异的正向引物或特异的反向引物设计成与第一轮目的PCR产物的内部序列结合。PCR条件为进行递减PCR的那些条件，如下：在94℃起始变性10分钟；然后是10个递减-PCR循环，一个循环为为94℃30秒，60℃30秒，每个循环降低1℃，和72℃2分钟；然后是25个PCR循环，一个循环为94℃30秒，50℃1分钟和72℃2分钟；并且接着在72℃7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-TOPO载体(由Invitrogen供应)中，并且测序。

上述测序结果显示5’-端序列和3’-端序列，其每一端分别编码昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的N-端区域和C-端区域。

实施例4(构建重组质粒)

使用作为对基因序列特异性的引物的包括核苷酸序列SEQ ID NO：5的寡核苷酸，作为对基因序列特异性的引物并且添加XhoI限制性位点的包含核苷酸序列SEQ ID NO：6的寡核苷酸；和PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene供应)，按照附在所述聚合酶上的用法说明，通过PCR扩增囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因片段，其将克隆到用于在大肠杆菌中表达的载体中。将在实施例2中获得的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的全长cDNA用作模板。所用的PCR条件如下：在94℃起始变性5分钟；然后是40个PCR循环，一个循环为94℃20秒，60℃20秒，和72℃2分钟；然后72℃7分钟。

使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(由Qiagen供应)按照附在试剂盒上的用法说明纯化所得到的PCR产物。将纯化后的DNA片段用XhoI消化。

棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶基因的平端(Blunt)/XhoI DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，纯化并且连接到大肠杆菌表达载体pET41b(+)(由Novagen供应)的EcoRV/XhoI克隆位点。所得到的载体称为pGAY008。

重组囊泡-融合腺苷三磷酸酶与两个His-标记和一个GST-标记一起翻译提供一种769个氨基酸的重组蛋白。

在Qiagen质粒纯化手册中所述的步骤后，使用Qiafliter质粒Maxiprep(Qiagen)制备pGAY008。

实施例5(制备重组大肠杆菌)

按照供应商的用法说明，使用1μl浓度为1ng/μl的pGAY008转化大肠杆菌BL21(DE3)(由Invitrogen供应)感受态细胞。转化的大肠杆菌克隆在含有50mg/L卡那霉素(由西格玛(Sigma)供应)的LB琼脂平板上在37℃生长过夜。

实施例6(在大肠杆菌中表达囊泡-融合腺苷三磷酸酶)

将用pGAY008转化的大肠杆菌BL21(DE3)在含有50mg/L卡那霉素(由西格玛供应)的LB-培养基中在37℃，250rpm旋转培养过夜。第二天早上，将所述培养物以1/25稀释在含有50mg/L卡那霉素的LB-培养基中，并且在37℃，250rpm培养。当培养物在600nm处的OD达到0.8时，向培养物中加入IPTG直至终浓度为10μM。将该培养物在25℃，60rpm培养4天，以在大肠杆菌中生产重组囊泡-融合腺苷三磷酸酶。在诱导和表达后，将所述培养物以7,000rpm离心10分钟，以收获大肠杆菌。弃掉上清，并且将剩余的大肠杆菌在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃备用。

实施例7(纯化囊泡-融合腺苷三磷酸酶)

将棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶克隆在pET41(b+)中，符合N-端GST(谷胱甘肽S-转移酶)-标记和His-标记和C-端His-标记的阅读框。重组的囊泡-融合腺苷三磷酸酶蛋白通过下述两个纯化步骤纯化：第一步使用His-标记，并且第二步使用GST-标记。

(1)制备粗提物

将冷冻的诱导的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的细胞沉淀物重悬在30ml裂解缓冲液(100mM Hepes/KOH pH 7.5，500mM KCl，5mM MgCl₂，2mM2-巯基乙醇，5mM ATP，0.5mM，Pefablock，10μg/μl亮抑酶肽，1μM胃酶抑制剂A)中，并且随后使用弗氏压碎器(由Thermo Spectronic供应)在裂解缓冲液中裂解。在破碎细胞步骤过程中，压力保持在1300-1500psi。将弗氏加压的溶液在2℃以14,000xg离心60分钟，以获得上层清液。将收集的上层清液通过0.45μm过滤器过滤并且保存在冰上。

(2)使用His-标记纯化

已经使用金属亲和层析，使用HiTrap螯合HP(安玛西亚生物科学)或HisTrap HP(安玛西亚生物科学)柱，按照供应商(安玛西亚生物科学)的使用说明，第一次纯化了重组蛋白。对于大规模纯化，使用XK-16/20柱(安玛西亚生物科学)，该柱用螯合快速流动琼脂糖(安玛西亚生物科学)填充。纯化步骤在AEKTA-FPLC(安玛西亚生物科学)上进行。

已经按照供应商的方案(安玛西亚生物科学)制备了Hitrap，HisTrap，AX-16/20亲和柱(安玛西亚生物科学)。缓冲液A，即结合缓冲液，由20mMHepes pH 7.0，200mM KCl，1mM MgCl₂，2mM 2-巯基乙醇，0.5mM ATP，和10％甘油制成。缓冲液B，即洗脱缓冲液，由20mM Hepes pH 7.0，200mMKCl，1mM MgCl₂，2mM 2-巯基乙醇，0.5mM ATP，500mM咪唑，和10％甘油制成。

使用His-标记纯化棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶按照下述步骤进行：

(i)样品注射；

(ii)用5个柱体积(CV)的85％缓冲液A/15％缓冲液B洗掉未结合的样品；

(iii)用15个CV的40％缓冲液B(200mM咪唑)洗涤；

(iv)用15个CV的70％缓冲液B(350mM咪唑)洗脱纯化的蛋白；和

(v)用5个CV 100％缓冲液B(500mM咪唑)洗涤柱。

汇集通过用30％缓冲液A/70％缓冲液B洗脱获得的级分，并且保存在冰上，直到开始使用GST-标记进行纯化。

(3)使用GST-标记纯化

将从第一次纯化汇集的His-纯化的级分在GSTrap FF柱(安玛西亚生物科学)上按照供应商手册进行第二次纯化。纯化步骤在AEKTA-FPLC(安玛西亚生物科学)上进行。

缓冲液A，即结合缓冲液，由20mM Hepes pH 7.0，200mM KCl，1mMMgCl₂，2mM 2-巯基乙醇和10％甘油制成。缓冲液B，即洗脱缓冲液，由50mM Tris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽，2mM 2-巯基乙醇和10％甘油制成。在加入谷胱甘肽后，用KOH将pH调节为pH7.5。

使用GST-标记纯化棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶按下述步骤进行：

(i)样品注射；

(ii)用20个柱体积(CV)的100％缓冲液A洗掉未结合的样品；和

(iii)用30个CV的100％缓冲液B洗涤纯化的蛋白。

分析所得到的洗脱级分，以通过标准考马斯染色的SDS-PAGE和蛋白质印迹技术验证重组的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶。使用8％的聚丙烯酰胺凝胶用于所表达的86kDa囊泡-融合腺苷三磷酸酶蛋白的最优化凝胶电泳分辨。

将下述染色液和脱色液用于聚丙烯酰胺凝胶的考马斯染色。染色液由1g/l考马斯亮蓝R，50(v/v)％甲醇，12(v/v)％乙酸和38(v/v)％蒸馏水制成。混合后，过滤溶液，以去除未溶解的亮蓝R染料。脱色液由25(v/v)％甲醇，10(v/v)％乙酸和65(v/v)％蒸馏水制成。

对于蛋白质印迹分析，将1∶500稀释的抗-His(H15)sc-803兔多克隆IgG抗体(tebubio)用作一抗。二抗是以1∶10000稀释的山羊-抗-兔-HRP(Pierce)。

在通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析聚丙烯酰胺凝胶后，汇集目的级分，并且确定蛋白浓度。蛋白浓度通过Bradford方法确定，使用预先稀释的蛋白测定标准物(Pierce)：牛血清白蛋白级分V系列，用Bradford Bio-Rad蛋白测定法(Bio-Rad)，按照供应商的方案进行。然后，将汇集的级分分成几个等分试样，并且立即在液氮中快速冷冻，并且保存在-80℃。

实施例8(选择抑制囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的化合物)

调节囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的化合物的选择在这样的系统中进行，即，在所述系统中，测量并且评估囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性，所述活性通过将测试化合物添加到使用在实施例7中制备的棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的体外反应系统中而受到调节。

至于棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的测量，在使用ATP作为底物的囊泡-融合腺苷三磷酸酶的酶促反应后，使用Kinase-Glo^TM发光激酶测定法(由普洛麦格(Promega)供应)，按照附在试剂盒上的用法说明中描述的方法，以萤光酶的发光量来测量未被水解的ATP的量。从发光量计算囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性。

为了测量该活性，当包含溶解在DMSO中的测试化合物至10μM的终浓度时，测量蚜虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性。另外，当包含DMSO代替测试化合物时，测量蚜虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性。然后，计算包含溶解在DMSO中的测试化合物时蚜虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的测定值相对于在包含DMSO代替所述测试化合物时蚜虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的测定值的比例(％)，并且将通过从100％减去所计算的值而得到的值采用为抑制程度(％)。在每一测试化合物中的结果与实施例9的结果一起显示在实施例9中的表4中。

当包含溶解在DMSO中的测试化合物至100μM，30μM，10μM，3μM，1μM，0.3μM，0.1μM或0.03μM中每个浓度的终浓度时，测量蚜虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性。使用浓度-依赖性检测分析软件XL fit(由idbs供应)，从每一测试化合物在每一浓度的结果计算IC₅₀(μM)。结果与实施例9的结果一起显示在实施例10的表5中。

实施例9(杀虫活性检测)

制备具有下述组成(表3)的无菌人工饲料。然后，按照与在昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版社1985)第35-36页中所述的方法相同的方法，但是将溶解在DMSO中至终浓度50ppM的测试化合物以0.5％体积加入到所述人工饲料中，并且混和各成分，培养棉蚜。培养后6天，研究存活的棉蚜数目，并且通过用下述方程获得控制值而确定表现出显著控制值(例如，30％或更大的控制值)的实体具有杀虫活性：

控制值(％)＝{1-(Cb×Tai)/(Cai×Tb)}×100

在所述方程中的字母表示下述含义：

Cb：在未处理部分中在处理之前存活的虫子数目

Cai：在未处理部分中在观察时存活的虫子数目

Tb：在处理的部分中在处理之前存活的虫子数目

Tai：在处理的部分中在观察时存活的虫子数目

结果与实施例8的结果一起显示在实施例9中的表4中。

表3

表4

化合物名称	实施例8的结果	实施例9的结果
				抑制囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的活性(在10μM添加物下的抑制程度(％))	杀虫活性的测定结果
苏拉明	100	存在杀虫活性
			氯化卡米达佐	80	存在杀虫活性
NPC15437二盐酸盐	35	存在杀虫活性

实施例10(杀虫活性检测)

按照与实施例9的方法相同的方法，进行杀虫活性检测，并且结果与实施例8的结果一起显示在实施例10中的表5中。

表5

化合物名称	实施例8的结果	实施例9的结果
				抑制囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的活性(IC50，μM)	杀虫活性的测定结果
苏拉明	1.9	存在杀虫活性
			氯化卡米达佐	4.7	存在杀虫活性
NPC15437二盐酸盐	19.0	存在杀虫活性
			竹红菌乙素(Hypocrellin B)	＞100	不存在杀虫活性
(±)-Blebbistatin	＞100	不存在杀虫活性

工业适用性

按照本发明，可以提供更基于目标的筛选农业化学品的方法，其中针对特定目标筛选化合物，目的在于化学干扰目标位点以控制昆虫或其它害虫生物体。

序列表中的文本(free text)

SEQ ID NO：3

设计的PCR寡核苷酸引物

SEQ ID NO：4

设计的PCR寡核苷酸引物

SEQ ID NO：5

设计的PCR寡核苷酸引物

SEQ ID NO：6

设计的PCR寡核苷酸引物

序列表

<110>住友化学株式会社

<120>涉及昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性而调节害虫的生理状况的试剂

<130>S16999WO01

<150>JP 2006/311241

<151>2006-11-17

<160>6

<210>1

<211>747

<212>PRT

<213>棉蚜(Aphis gossypii)

<400>1

Met Val Val Tyr Lys Ala Ile Lys Cys Leu Ala Asp Asp Trp Ala Leu

1                 5                  10                  15

Thr Asn Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Asp Phe Arg Ser Asp Thr Lys

             20                  25                  30

Tyr Ile Glu Val Gln His Gln Leu Lys Pro Asp Leu Lys Phe Trp Phe

         35                  40                  45

Thr Ile Leu Phe Val Lys Asn Pro Pro Pro Arg Gly Cys Ile Ala Phe

     50                  55                  60

Ser Val Asn Gln Arg Glu Trp Ala Gln Leu Ser Ile Asn Gln Pro Ile

 65                  70                  75                  80

Ser Ile Thr Ser Tyr Pro Gly Asn Thr Ala Ile Asp Phe Leu Cys Ser

                 85                  90                  95

Val Glu Ala Glu Ile Asp Tyr Phe Gln Lys Asn Lys Ser Lys Ala Asn

            100                 105                 110

Glu Gln Phe Asp Thr Asp Met Met Ala Lys Glu Phe Leu Val Asn Phe

        115                 120                 125

Thr Asn His Val Leu Ser Val Ser Gln Thr Leu Leu Phe Gln Leu Pro

    130                 135                 140

Glu Lys Pro Leu Met Thr Ile Lys Ile Lys Ser Ile Glu Gly Val Asn

145                 150                 155                 160

Ser Gln Glu Ile Asn Ser Gly Ala Lys Pro Arg Ser Ile Gln Tyr Gly

                165                 170                 175

Lys Cys Leu Ser Asn Thr Ala Val Arg Phe Val Val Gly Ser Asn Thr

            180                 185                 190

Ser Leu Met Leu Val Gly Lys Ser Lys Cys Gln Gln Ala Arg Val Ser

        195                 200                 205

Ile Ile Asn Pro Asp Phe Asp Phe Asn Lys Met Gly Ile Gly Gly Leu

    210                 215                 220

Asp Thr Glu Phe Asn Ala Ile Phe Arg Arg Ala Phe Ala Ser Arg Val

225                 230                 235                 240

Phe Pro Gln Glu Ile Ile Glu Gln Leu Gly Cys Lys His Val Lys Gly

                245                 250                 255

Ile Leu Leu Tyr Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Met Ala Arg

            260                 265                 270

Gln Ile Gly Gln Met Leu Asn Ala Arg Glu Pro Lys Ile Val Asn Gly

        275                 280                 285

Pro Gln Ile Leu Asp Lys Tyr Val Gly Glu Ser Glu Ala Asn Ile Arg

    290                 295                 300

Arg Leu Phe Ala Asp Ala Glu Glu Glu Glu Lys Lys Ser Gly Ser Ala

305                 310                 315                 320

Ser Gly Leu His Ile Ile Ile Phe Asp Glu Ile Asp Ala Ile Cys Lys

    325                 330                 335

Ala Arg Gly Ser Val Gly Gly Asn Thr Gly Val His Asp Thr Val Val

            340                 345                 350

Asn Gln Leu Leu Ala Lys Ile Asp Gly Val Glu Gln Leu Asn Asn Ile

        355                 360                 365

Leu Val Ile Gly Met Thr Asn Arg Arg Asp Met Ile Asp Glu Ala Leu

    370                 375                 380

Leu Arg Pro Gly Arg Leu Glu Val Gln Met Glu Ile Ser Leu Pro Asp

385                 390                 395                 400

Glu His Gly Arg His Gln Ile Leu Asn Ile His Thr Thr Arg Met Lys

                405                 410                 415

Glu Phe Lys Lys Ile Ala Asp Asp Val Asp Met Lys Glu Leu Ser Ile

            420                 425                 430

Arg Thr Lys Asn Phe Ser Gly Ala Glu Leu Glu Gly Leu Val Arg Ala

        435                 440                 445

Ala Gln Ser Thr Ala Met Asn Arg Leu Ile Lys Ala Asn Asn Lys Val

    450                 455                 460

Glu Val Asp Pro Asp Ala Ser Glu Lys Leu Gln Val Cys Lys Glu Asp

465                 470                 475                 480

Phe Leu His Ala Leu Glu Tyr Asp Ile Lys Pro Ala Phe Gly Ala Ser

                485                 490                 495

Ala Glu Ala Leu Glu His Phe Leu Ala Arg Gly Ile Ile Thr Trp Gly

            500                 505                 510

Pro Ser Val Ser Gly Ile Leu Glu Asp Gly Thr Leu Leu Thr Gln Gln

        515                 520                 525

Ala Arg Val Ala Asp Thr Phe Gly Leu Val Ser Val Leu Ile Glu Gly

    530                 535                 540

Pro Pro Asn Ser Gly Lys Thr Ala Leu Ala Ala Lys Leu Ala Lys Asp

545                 550                 555                 560

Ser Asp Phe Pro Phe Val Lys Val Cys Ser Pro Glu Asp Met Val Gly

                565                 570                 575

Phe Thr Glu Thr Ala Lys Cys Leu Gln Ile Arg Lys Ile Phe Asp Asp

            580                 585                 590

Ala Tyr Arg Ser Gln Leu Ser Cys Ile Leu Val Asp Asn Ile Glu Arg

        595                 600                 605

Leu Leu Asp Tyr Gly Ser Ile Gly Pro Arg Tyr Ser Asn Leu Thr Leu

    610                 615                 620

Gln Ala Leu Leu Val Leu Leu Lys Lys Gln Pro Pro Lys Gly Lys Lys

625                 630                 635                 640

Leu Leu Val Leu Cys Thr Ser Ser Arg Lys Gln Val Leu Glu Glu Met

                645                 650                 655

Glu Met Leu Ser Ala Phe Thr Ala Val Leu His Val Pro Asn Leu Ser

            660                 665                 670

Gln Pro Glu Glu Leu Ile Thr Val Leu Glu Gln Phe Asp Leu Phe Thr

        675                 680                 685

Lys Gln Asp Ile His Lys Ile Tyr Asn Gln Ile Ser Gly His Asn Val

    690                 695                 700

Phe Ile Gly Ile Lys Lys Leu Leu Ala Leu Ile Asp Met Ala Arg Gln

705                 710                 715                 720

Thr Asp Pro Lys Val Arg Val Ile Lys Phe Leu Thr Lys Met Glu Glu

                725                 730                 735

Glu Gly Cys Leu Asp Leu Gly Thr Met Ile His

            740                 745

<210>2

<211>2241

<212>DNA

<213>棉蚜(Aphis gossypii)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2241)

<400>2

atg gtg gtt tac aag gca atc aaa tgt ttg gca gac gat tgg gct ctt     48

Met Val Val Tyr Lys Ala Ile Lys Cys Leu Ala Asp Asp Trp Ala Leu

  1               5                  10                  15

acg aat tgt gca gtg gtt aat gat gaa gac ttt cga agc gat aca aaa     96

Thr Asn Cys Ala Val Val Asn Asp Glu Asp Phe Arg Ser Asp Thr Lys

             20                  25                  30

tac ata gag gtc caa cat caa ctc aaa cca gat ctt aag ttt tgg ttt    144

Tyr Ile Glu Val Gln His Gln Leu Lys Pro Asp Leu Lys Phe Trp Phe

         35                  40                  45

aca ata ttg ttt gtg aaa aat cct cct cca cga gga tgc ata gct ttt    192

Thr Ile Leu Phe Val Lys Asn Pro Pro Pro Arg Gly Cys Ile Ala Phe

     50                  55                  60

tct gtg aat caa cga gaa tgg gcc caa ctg tct atc aat cag cca atc    240

Ser Val Asn Gln Arg Glu Trp Ala Gln Leu Ser Ile Asn Gln Pro Ile

 65                  70                  75                  80

agt att act tct tat ccg ggc aat aca gct atc gat ttt ttg tgt tca    288

Ser Ile Thr Ser Tyr Pro Gly Asn Thr Ala Ile Asp Phe Leu Cys Ser

                 85                  90                  95

gtt gaa gct gaa att gac tat ttt caa aag aat aag tca aaa gct aat    336

Val Glu Ala Glu Ile Asp Tyr Phe Gln Lys Asn Lys Ser Lys Ala Asn

            100                 105                 110

gaa cag ttt gat act gac atg atg gct aaa gag ttt tta gta aat ttc    384

Glu Gln Phe Asp Thr Asp Met Met Ala Lys Glu Phe Leu Val Asn Phe

        115                 120                 125

aca aat cac gtt tta tct gtc agt cag aca tta tta ttt cag tta cca    432

Thr Asn His Val Leu Ser Val Ser Gln Thr Leu Leu Phe Gln Leu Pro

    130                 135                 140

gaa aaa cca tta atg aca att aag atc aaa agc att gaa ggt gta aat    480

Glu Lys Pro Leu Met Thr Ile Lys Ile Lys Ser Ile Glu Gly Val Asn

145                 150                 155                 160

tct caa gaa att aat tca gga gca aaa ccc cgg tct att caa tat ggg    528

Ser Gln Glu Ile Asn Ser Gly Ala Lys Pro Arg Ser Ile Gln Tyr Gly

                165                 170                 175

aaa tgt ttg agc aat aca gct gta cga ttt gta gtc ggc tcc aat act    576

Lys Cys Leu Ser Asn Thr Ala Val Arg Phe Val  Val Gly Ser Asn Thr

            180                 185                 190

tca tta atg ttg gtc gga aag tca aaa tgc caa caa gca cgt gta tca    624

Ser Leu Met Leu Val Gly Lys Ser Lys Cys Gln Gln Ala Arg Val Ser

        195                 200                 205

att ata aat cca gat ttt gac ttc aat aaa atg gga att ggt ggt ttg    672

Ile Ile Asn Pro Asp Phe Asp Phe Asn Lys Met Gly Ile Gly Gly Leu

    210                 215                 220

gat aca gag ttt aat gct att ttt aga aga gca ttt gca tct aga gta    720

Asp Thr Glu Phe Asn Ala Ile Phe Arg Arg Ala Phe Ala Ser Arg Val

225                 230                 235                 240

ttt cca caa gag ata att gaa caa ctt ggg tgc aaa cac gtc aaa ggt    768

Phe Pro Gln Glu Ile Ile Glu Gln Leu Gly Cys Lys His Val Lys Gly

                245                 250                 255

att ttg ctt tat ggt cca cct gga act ggt aaa aca ttg atg gct aga    816

Ile Leu Leu Tyr Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Leu Met Ala Arg

            260                 265                 270

caa att gga caa atg tta aat gca cgt gaa ccc aaa att gtt aat ggc    864

Gln Ile Gly Gln Met Leu Asn Ala Arg Glu Pro Lys Ile Val Asn Gly

        275                 280                 285

ccg caa att ttg gat aaa tat gtt ggt gaa tct gaa gca aat ata aga    912

Pro Gln Ile Leu Asp Lys Tyr Val Gly Glu Ser Glu Ala Asn Ile Arg

    290                 295                 300

agg tta ttc gca gat gct gaa gaa gaa gaa aag aaa tct ggt tca gct    960

Arg Leu Phe Ala Asp Ala Glu Glu Glu Glu Lys Lys Ser Gly Ser Ala

305                 310                 315                 320

agt ggc tta cat ata att atc ttt gat gaa att gat gct att tgt aaa    1008

Ser Gly Leu His Ile Ile Ile Phe Asp Glu Ile Asp Ala Ile Cys Lys

                325                 330                 335

gca aga ggt tct gtt gga gga aat aca gga gta cac gac act gta gtt    1056

Ala Arg Gly Ser Val Gly Gly Asn Thr Gly Val His Asp Thr Val Val

            340                 345                 350

aat caa ttg tta gct aaa att gat gga gtc gag caa cta aat aac atc    1104

Asn Gln Leu Leu Ala Lys Ile Asp Gly Val Glu Gln Leu Asn Asn Ile

        355                 360                 365

tta gtt ata ggt atg act aat aga aga gac atg att gat gaa gcg tta    1152

Leu Val Ile Gly Met Thr Asn Arg Arg Asp Met Ile Asp Glu Ala Leu

    370                 375                 380

ctg aga cct ggc cga ctt gaa gta caa atg gaa ata agt tta cct gat    1200

Leu Arg Pro Gly Arg Leu Glu Val Gln Met Glu Ile Ser Leu Pro Asp

385                 390                 395                 400

gaa cat ggt cgt cat caa att ttg aat atc cac aca aca cgt atg aaa    1248

Glu His Gly Arg His Gln Ile Leu Asn Ile His Thr Thr Arg Met Lys

                405                 410                 415

gaa ttt aaa aag att gct gat gat gta gac atg aag gaa ctt tca ata    1296

Glu Phe Lys Lys Ile Ala Asp Asp Val Asp Met Lys Glu Leu Ser Ile

            420                 425                 430

cga act aaa aac ttc agt ggt gcc gag ttg gaa ggt tta gtt cgt gct    1344

Arg Thr Lys Asn Phe Ser Gly Ala Glu Leu Glu Gly Leu Val Arg Ala

        435                 440                 445

gct caa tca aca gcc atg aat cgt ttg ata aaa gcc aat aat aag gta    1392

Ala Gln Ser Thr Ala Met Asn Arg Leu Ile Lys Ala Asn Asn Lys Val

    450                 455                 460

gaa gtt gat cct gat gca tct gaa aaa ctt caa gtg tgc aag gaa gat    1440

Glu Val Asp Pro Asp Ala Ser Glu Lys Leu Gln Val Cys Lys Glu Asp

465                 470                 475                 480

ttt cta cat gca ttg gaa tat gat ata aaa ccc gcg ttt ggt gct agt    1488

Phe Leu His Ala Leu Glu Tyr Asp Ile Lys Pro Ala Phe Gly Ala Ser

                485                 490                 495

gct gaa gct ttg gaa cac ttc tta gct cgt ggt att ata act tgg ggt    1536

Ala Glu Ala Leu Glu His Phe Leu Ala Arg Gly Ile Ile Thr Trp Gly

            500                 505                 510

ccg tct gtc agt gga att tta gaa gat gga aca ttg ctt aca cag caa    1584

Pro Ser Val Ser Gly Ile Leu Glu Asp Gly Thr Leu Leu Thr Gln Gln

        515                 520                 525

gct cgt gta gct gat aca ttt ggc ctt gtc tct gta ctc att gaa gga    1632

Ala Arg Val Ala Asp Thr Phe Gly Leu Val Ser Val Leu Ile Glu Gly

    530                 535                 540

ccg cca aat tca gga aaa act gct cta gct gca aag ttg gct aaa gat    1680

Pro Pro Asn Ser Gly Lys Thr Ala Leu Ala Ala Lys Leu Ala Lys Asp

545                 550                 555                 560

tca gat ttc ccc ttt gtc aaa gtg tgt tca cca gaa gat atg gtt gga    1728

Ser Asp Phe Pro Phe Val Lys Val Cys Ser Pro Glu Asp Met Val Gly

                565                 570                 575

ttc act gaa aca gca aaa tgc tta caa atc aga aaa atc ttt gat gat    1776

Phe Thr Glu Thr Ala Lys Cys Leu Gln Ile Arg Lys Ile Phe Asp Asp

            580                 585                 590

gca tac aga tct caa ctt agt tgt att tta gtt gat aat att gaa cgt    1824

Ala Tyr Arg Ser Gln Leu Ser Cys Ile Leu Val Asp Asn Ile Glu Arg

        595                 600                 605

tta tta gac tat ggg tca att gga cca aga tat tct aac tta aca tta    1872

Leu Leu Asp Tyr Gly Ser Ile Gly Pro Arg Tyr Ser Asn Leu Thr Leu

    610                 615                 620

caa gct cta ttg gtt ctg tta aaa aaa caa ccc cct aaa ggt aaa aag    1920

Gln Ala Leu Leu Val Leu Leu Lys Lys Gln Pro Pro Lys Gly Lys Lys

625                 630                 635                 640

ctt tta gta ttg tgt acc agc agt cgt aaa caa gta cta gaa gaa atg    1968

Leu Leu Val Leu Cys Thr Ser Ser Arg Lys Gln Val Leu Glu Glu Met

                645                 650                 655

gag atg tta tct gca ttt act gct gta ctt cat gtc cct aat ctc agt    2016

Glu Met Leu Ser Ala Phe Thr Ala Val Leu His Val Pro Asn Leu Ser

            660                 665                 670

caa cca gaa gaa ctt att acg gtt cta gaa caa ttt gat ttg ttt aca    2064

Gln Pro Glu Glu Leu Ile Thr Val Leu Glu Gln Phe Asp Leu Phe Thr

        675                 680                 685

aaa caa gat atc cac aag ata tac aac caa ata tct gga cac aat gtt    2112

Lys Gln Asp Ile His Lys Ile Tyr Asn Gln Ile Ser Gly His Asn Val

    690                 695                 700

ttt att ggt ata aaa aag ctg ttg gct ttg att gat atg gcc cgt caa    2160

Phe Ile Gly Ile Lys Lys Leu Leu Ala Leu Ile Asp Met Ala Arg Gln

705                 710                 715                 720

aca gat cca aaa gta aga gtg att aaa ttc tta act aag atg gaa gaa    2208

Thr Asp Pro Lys Val Arg Val Ile Lys Phe Leu Thr Lys Met Glu Glu

                725                 730                 735

gaa ggc tgt cta gat tta ggt act atg ata cat                        2241

Glu Gly Cys Leu Asp Leu Gly Thr Met Ile His

            740                 745

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物

PCR

<400>3

cgttcggtag tggtgtccta ctaatgtaat tg    32

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物

<400>4

catccgttga ctcttaacta atttcggaat gt    32

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物

<400>5

atggtggttt acaaggcaat caaatgtt    28

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：设计的PCR寡核苷酸引物

<400>6

ctcgagcttg cacacttgaa gtttttcaga tgc    33

Claims (34)

1.一种调节害虫生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶(EC.3.6.4.6)活性的能力。

2.按照权利要求1的试剂，其中所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶是棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶。

3.按照权利要求1的试剂，其中所述试剂是杀虫剂。

4.按照权利要求1的试剂，其中所述调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力是抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力。

5.一种杀虫剂，其包括具有调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力的物质或所述物质的农业上可接受的盐作为活性成分。

6.按照权利要求5的杀虫剂，其中所述物质具有抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力。

7.按照权利要求6的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力，其中在存在10μM或更多的所述物质时，所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性低于不存在所述物质时的活性。

8.按照权利要求6的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中抑制昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶与ATP反应的能力，IC50为100μM或更低。

9.一种测定测试物质的杀虫活性的方法，该方法包括：

(1)第一步，在选自下组A的囊泡-融合腺苷三磷酸酶与测试物质接触的反应系统中，测量所述囊泡-融合腺苷三磷酸酶的活性；和

(2)第二步，基于通过比较在第一步中测量的活性和对照的活性而获得的差别来评估所述测试物质的杀虫活性；

<组A>

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的蛋白；

(b)包含在氨基酸序列SEQ ID NO：1中缺失、添加或替代一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(c)包含与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有75％或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(d)包含由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的蛋白；

(e)包含由与核苷酸序列SEQ ID NO：2具有75％或更高的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(f)包含由多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述蛋白具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(g)包含昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的蛋白；和

(h)包含棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的蛋白。

10.一种筛选杀虫物质的方法，所述方法包括选择具有通过权利要求9的方法评估的杀虫活性的物质。

11.一种杀虫剂，其包括通过权利要求10的方法选择的物质或其农业上可接受的盐作为活性成分。

12.一种控制害虫的方法，其包括将有效量的权利要求5、6、7、8或11的杀虫剂施用于害虫、害虫栖息地或要防治害虫的植物。

13.一种控制害虫的方法，其包括：

鉴定具有通过权利要求9的方法评估的杀虫活性的物质，并且

使害虫与所鉴定的杀虫物质接触。

14.一种昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶，其包含选自下组B的氨基酸序列：

<组B>

(a)氨基酸序列SEQ ID NO：1；

(b)在氨基酸序列SEQ ID NO：1中缺失、添加或替代一个或多个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(c)与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有75％或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(d)由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列；

(e)由与核苷酸序列SEQ ID NO：2具有75％或更高的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；

(f)由多核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在严格条件下与包含同核苷酸序列SEQ ID NO：2互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸序列具有囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性；和

(g)棉蚜囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列。

15.昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用。

16.权利要求14的昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶作为提供评估杀虫活性的指示剂的试剂的应用。

17.一种多核苷酸，其包含编码权利要求14的囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

18.按照权利要求17的多核苷酸，其包括核苷酸序列SEQ ID NO：2。

19.一种多核苷酸，其包含与权利要求17或18的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

20.一种多核苷酸，其包含：

权利要求17或18的多核苷酸的部分核苷酸序列；或

与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。

21.按照权利要求20的多核苷酸，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：3或4。

22.一种获得多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含编码囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的核苷酸序列，所述方法包括：

使用权利要求20或21的多核苷酸作为引物，通过聚合酶链式反应扩增所需的多核苷酸；

鉴定所扩增的所需的多核苷酸；和

回收所鉴定的多核苷酸。

23.一种获得多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含编码囊泡-融合腺苷三磷酸酶的氨基酸序列的核苷酸序列，所述方法包括：

使用权利要求19、20或21的多核苷酸作为探针，通过杂交检测所需的多核苷酸；

鉴定所检测的所需的多核苷酸；和

回收所鉴定的多核苷酸。

24.一种包含权利要求17或18的多核苷酸的核苷酸序列的环状多核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地与噬菌体启动子连接。

25.按照权利要求24的环状多核苷酸，其中所述启动子是T7 RNA聚合酶基因启动子。

26.按照权利要求24或25的环状多核苷酸，其中所述多核苷酸包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起点。

27.一种制备环状多核苷酸的方法，其包括将权利要求17或18的多核苷酸连接到载体中。

28.一种转化体，其中引入权利要求17或18的多核苷酸。

29.按照权利要求28的转化体，其中所述转化体是转化的大肠杆菌(E.coli)。

30.一种制备转化体的方法，其包括将权利要求17或18的多核苷酸引入到宿主细胞中。

31.一种生产囊泡-融合腺苷三磷酸酶的方法，其包括以下步骤：培养权利要求28或29的转化体并且回收所生产的囊泡-融合腺苷三磷酸酶。

32.权利要求14的囊泡-融合腺苷三磷酸酶或权利要求17至21中任一项的多核苷酸作为研究工具的应用。

33.按照权利要求32的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工具。

34.一种系统，其包括：

输入、存储和管理测试物质的能力的数据信息的设备，其中所述能力是调节昆虫囊泡-融合腺苷三磷酸酶活性的能力；

基于所需的标准查询并且检索所述数据信息的设备；和

显示并且输出查询和检索的结果的设备。