CN103614382B - 菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT8及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及农药学领域，主要是一种在菜青虫中表达的新型5-羟色胺受体基因及其编码蛋白；本发明还涉及该蛋白和受体基因的用途：用来筛选和/或评价调控5-羟色胺受体活性的物质的检测。该检测方法为依次包括以下步骤：1）、将包含菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈的重组载体转染宿主细胞系；2）、用候选物质处理步骤1）所得的细胞；3）、检测步骤2）所得的细胞内钙离子浓度的变化；当细胞内钙离子浓度升高，说明候选物质能够激活表达的目标受体Pr5-HT8。

Description

菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT8及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、细胞生物学以及农药学领域，主要是一种在菜青虫中表达的新型5-羟色胺受体基因及其编码蛋白；本发明还涉及该蛋白和受体基因的用途。

背景技术

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是很多动物体内一种重要生物胺，它能够作为神经递质、神经调质或者神经激素控制和调节很多重要的生理和行为过程，如鳗鱼lampreys的运动行为(Harris-WarrickandCohen1985)，龙虾Homarusamericanus的进攻行为(Kravitz2000)，昆虫的繁殖(Lange2004)、聚集(Ansteyetal.2009)、学习和记忆等(Sitaramanetal.2008)。5-HT发挥不同的生理功能，很多都是通过其受体实现的。对昆虫体内5-HT的研究的一个潜在意义在于开发高效杀虫剂。目前化学农药是防治害虫的主要手段，但是传统的杀虫剂带来了一些不可避免的问题，如害虫的抗药性以及对非靶标生物的毒害性。因此，开发新型作用模式的杀虫剂非常必要。虽然目前还没有报道针对5-羟色胺受体开发的农药，但是以生物胺受体为靶标开发新型农药在上世纪已经实现，如甲脒类杀虫剂的靶标就是章鱼胺受体（octopaminereceptor）(Hollingworth1976)。而5-HT受体在农药开发中的应用也引起了越来越多的人的关注。1-[(4-Aminophenyl)ethyl]-4-[3-(trifluoromethyl)phenyl]piperazine(PAPP)是一种5-HT_1A受体激动剂，特别是对寄生性线虫Haemonchuscontortus的5-HT受体亲和力很高。针对PAPP合成的一些衍生物能够抑制粘虫Pseudaletiaseparate的生长和幼虫的活性，所以这些PAPP的衍生化合物有可能成为新型农药（Caietal.,2010)。

5-HT通过不同的受体调控不同的生理功能，而这些受体主要是G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptors，GPCRs）。在脊椎动物中有14种5-HT受体克隆出来，除5-HT₃是离子通道类型受体外，其它的都是G蛋白偶联受体。根据序列相似度，偶联的第二信使以及药理学特性等又将脊椎动物中13种GPCR型的5-HT受体分为6大类即5-HT₁(包括5-HT_1A/B/D/E/F)、5-HT₂（包括5-HT_2A/B/C)、5-HT₄、5-HT₅（包括5-HT_5A/B)、5-HT₆和5-HT₇。其中5-HT₁和5-HT₅偶联G_i/o，从而抑制cAMP的合成；5-HT₄、5-HT₆和5-HT₇偶联G_s，能够促进cAMP的合成；5-HT₂偶联G_q/11，它能够增加胞内Ca²⁺浓度（综述BlenauandBaumann,2001;HannonandHoyer,2008;NicholsandNichols,2008）。细胞内游离Ca²⁺浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础，它的变化是Ca²⁺跨膜转运和细胞内钙库释放、摄取Ca²⁺等动态平衡的结果。跟无脊椎动物相比，目前在昆虫体内只鉴定出来了5种类型的受体，即5-HT_1A/B,5-HT_2A/B和5-HT₇((BlenauandThamm,2011)(Gasqueetal.,2013)。

目前昆虫5-HT受体的研究主要集中在模式昆虫果蝇Drosophilamelanogaster和蜜蜂Apismellifera，其他昆虫研究相对较少。对农业害虫中5-HT受体的研究，并分析其与有益昆虫5-HT受体的差异，更有利于将成果应用于生产中。

上文中涉及的参考文献具体如下：

AnsteyML,RogersSM,OttSR,BurrowsM,SimpsonSJ.2009.Serotoninmediatesbehavioralgregarizationunderlyingswarmformationindesertlocusts.Science323:627-630（AnsteyML,RogersSM,OttSR,BurrowsM,SimpsonSJ.2009.5-羟色胺调节沙漠蝗虫聚集行为.《科学》323:627-630）；

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BlenauW,ThammM.2011.Distributionofserotonin(5-HT)anditsreceptorsintheinsectbrainwithfocusonthemushroombodies.LessonsfromDrosophilamelanogasterandApismellifera.ArthropodStruct.Dev.40:381-394（BlenauW,ThammM.2011.从黑腹果蝇和意大利蜜蜂讲述5羟色胺受体在昆虫脑部（主要集中在蘑菇体）的分布。《节肢动物结构与发育》40:381-394）；

CaiM,LiZ,FanF,HuangQ,ShaoX,SongG.2010.Designandsynthesisofnovelinsecticidesbasedontheserotonergicligand1-[(4-Aminophenyl)ethyl]-4-[3-(trifluoromethyl)phenyl]piperazine(PAPP)+.J.Agr.FoodChem.58:2624-2629（CaiM,LiZ,FanF,HuangQ,ShaoX,SongG.2010.基于5-羟色胺激活的配体1-[（4-氨基苯基)乙基]-4-[3-（三氟甲基)苯基]哌嗪（PAPP）设计和合成的新型杀虫剂。《农业和食品化学杂志》58:2624-2629）；

GasqueG,ConwayS,HuangJ,RaoY,VosshallLB.2013.SmallmoleculedrugscreeninginDrosophilaidentifiesthe5HT_2Areceptorasafeedingmodulationtarget.Scientificreports3:1-8（GasqueG,ConwayS,HuangJ,RaoY,VosshallLB.2013.通过对果蝇小分子药物的筛选确定了5HT_2A受体是调控取食的靶标。《科学报告》3:1-8）；

Harris-WarrickRM,CohenAH.1985.Serotoninmodulatesthecentralpatterngeneratorforlocomotionintheisolatedlampreyspinalcord.J.Exp.Biol.116:27-46（Harris-WarrickRM,CohenAH.1985.5-羟色胺调节分离的七鳃鳗脊髓中运动需要的中枢模式发生器。《实验生物学杂志》116:27-46）；

HollingworthR.1976.Chemistry,biologicalactivity,andusesofformamidinepesticides.Environ.healthpersp.14:57（HollingworthR.1976.甲脒类杀虫剂的化学性质，生物学活性以及应用。《环境健康展望》14:57）；

HannonJ,HoyerD.2008.Molecularbiologyof5-HTreceptors.Behav.Brain.Res.195,198-213（HannonJ,HoyerD.2008.5-HT受体的分子生物学。《大脑行为研究》195,198-213）；

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NicholsDE,NicholsCD.2008.Serotoninreceptors.Chem.Rev.108:1614-1641（NicholsDE,NicholsCD.2008.5-羟色胺受体。《化学综述》108:1614-1641）；

LangeAB.2004.Aneurohormonalroleforserotonininthecontroloflocustoviducts.Arch.InsectBiochem.Physiol.56:179-190（LangeAB.2004.5-羟色胺作为神经激素在调控蝗虫输卵管中的作用。《昆虫生理生化存档》56:179-190）；

SitaramanD,ZarsM,LaFerriereH,ChenYC,Sable-SmithA,KitamotoT,RottinghausGE,ZarsT.2008.SerotoninisnecessaryforplacememoryinDrosophila.Pro.Natl.Acad.Sci.USA105,5579-5584（SitaramanD,ZarsM,LaFerriereH,ChenYC,Sable-SmithA,KitamotoT,RottinghausGE,ZarsT.2008.5-羟色胺对于果蝇记忆是必需的。《美国国家科学院院刊》105,5579-5584）。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈及其编码的基因，以及利用该受体表达细胞系进行杀虫活性物质筛选的技术。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈，编码具有菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO：1中的核苷酸序列有至少70％的同源性。

作为本发明的菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈的改进：菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

本发明还同时提供了上述菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈编码的蛋白质，该蛋白质为SEQIDNo：2所示的氨基酸序列。

本发明还同时提供了一种重组载体，该重组载体包含上述菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈。

本发明还同时提供了上述重组载体的用途，用于转染宿主细胞，宿主细胞为HEK-293，CHO，COS，Sf9，S2或Sf21。

本发明还同时提供了上述菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈的用途，用来筛选和/或评价调控5-羟色胺受体活性的物质的检测。

作为本发明的菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈的用途的改进：检测方法为依次包括以下步骤：

1）、将如权利要求3或4所述的重组载体转染宿主细胞系；

2）、用候选物质处理步骤1）所得的细胞；

3）、检测步骤2）所得的细胞内钙离子浓度的变化；

当细胞内钙离子浓度升高，说明候选物质能够激活表达的目标受体Pr5-HT8。

在本发明中，发明人在菜青虫中克隆到一种新型5-羟色胺受体的基因Pr5-HT₈。该基因主要存在于一些害虫中如鳞翅目，赤拟谷盗Triboliumcastaneum和冈比亚按蚊Anophelesgambiae。而在模式生物黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、意大利蜜蜂Apismellifera以及人的基因组中未找到该基因的同源基因。在本发明之前，本发明中提及的菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈序列及其编码的基因（核酸序列）未有被公开或报道过。

本发明的目的在于提供菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈序列及其编码的基因（核酸序列），并可以用该序列来转染构建稳定表达该受体的细胞系，通过该细胞系可以对针对该受体靶标的杀虫活性物质进行筛选。

在本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO：1中从核苷酸第1-1317位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQIDNO：1中从核苷酸第1-1317位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO：1中从核苷酸第1-1317位的核苷酸序列。

本发明分离出的菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈包括：具有SEQIDNO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNO：2序列的多肽。

本发明DNA分子转化的宿主细胞是真核细胞。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈编码的核酸序列指：编码具有菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO：1中第1-1317位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO：1序列编码框第1-1317位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQIDNO：1中第1-1317位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQIDNO：1所述的序列。

还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDNO：中从核苷酸第1-1317位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQIDNO：1中从核苷酸第1-1317位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有天然的菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个）核苷酸的缺失、插入/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个（通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内）核苷酸。

在本发明中菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈指：具有菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈活性的SEQIDNO：2序列的多肽。该术语还包括具有与天然菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈相同功能的、SEQIDNO：2序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个）氨基酸的缺失、插入/或取代，以及在C末端和/或N端添加一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地以5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的活性片段和活性衍生物。

在本发明中菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈保守性变异多肽指：与SEQIDNO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala（A）	Val；Leu；Ile	Val
Arg（R）	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn（N）	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp（D）	Glu	Glu
			Cys（C）	Ser	Ser
Gln（Q）	Asn	Asn
			Glu（E）	Asp	Asp
Gly（G）	Pro；Ala	Ala
			His（H）	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile（I）	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu（L）	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys（K）	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met（M）	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe（F）	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro（P）	Ala	Ala
Ser（S）	Thr	Thr
			Thr（T）	Ser	Ser
Trp（W）	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr（Y）	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val（V）	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈或多肽的类似物。这些类似物与天然5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L－氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如²、³－氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈时，可以将菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈表达载体。

如本发明所用的“可操作地连于”指这样一种情况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽（分泌前导序列）DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能够翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中宿主细胞为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞核哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如HEK-293细胞、COS细胞等。

还可用Northern印迹法技术分析菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈基因产物的表达，即分析菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈核苷酸编码序列的8-66个连续氨基酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的核酸分子。

本发明涉及检测样品中是否存在菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

此外，根据本发明的菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈同源基因或同源蛋白。

为了得到与菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈基因相关的菜青虫cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选菜青虫cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自菜青虫的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clonetech，Stratagene，PaloAlto，这种筛选方法也可以识别与菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的基因家族的核苷酸序列。

本发明的菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所提供的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产（Stewart等人，（1969）Solid-PhasePeptideSynthesis,WHFreemanCo.,SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154）。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪（FosterCity，CA）来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接产生全长的分子。利用本发明的菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈，通过各种常规筛选方法，可筛选出菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或抗拮剂等。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为加四种生物胺，包括章鱼胺（Octopamine，OA）、酪胺（Tyramine，TA）、多巴胺（Dopamine，DA）以及5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）后的钙离子反应对比图。

图2为加5-HT受体激动剂，包括5-methoxytryptamin（5-MT）、Sumatriptansuccinate、8-OH-DPAT和5-carboxamidotryptamine（5-CT）后的钙离子反应对比图。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、菜青虫5-羟色胺受体Pr5-HT₈的克隆

1.对5龄左右的菜青虫幼虫用Trizol法匀浆提取总RNA并转录为cDNA：

使用TransScriptTMIIReverseTranscriptase进行反转录实验。

反应体系：

TotalRNA（1μg/μl）1ul

dNTPMixture(10mMeach)1ul

Random6mers(20uM)1ul

RNaseFreedH₂O7ul；

备注：Random6mers为随机的6核苷酸引物；

反应条件：65℃，5min立即冰上放置2分钟，然后加入下列组分：

5×PrimeScriptRTBuffer（5倍PrimeScript反转录缓冲液）4ul

RNaseInhibitor(40U/ul)（RNA酶抑制剂）0.5ul

TransScriptTMIIReverseTranscriptase（TransScriptTMII反转录酶）0.5ul

RNaseFreedH₂O5ul

反应条件：30℃，10min42℃，30min95℃，5min。

2.PCR扩增全长基因序列

使用Transgen的TransStartFastPfuDNAPolymerase来PCR扩增；

反应体系：

步骤1所得的反转录反应液2ul

dNTPMixture(2.5mMeach)5ul

FPrimer（20uM）（正向引物）1ul

RPrimer（20uM）（反向引物）1ul

5×TransStartFastPfuBuffer（5倍全式金FastPfu缓冲液）10ul

TransStartFastPfuDNAPolymerase（全式金FastPfu酶）1ul

dH2O30ul

反应条件：95℃，1min

72℃，5min；

最后产物为两端含有EcoR1和Kpn1限制性内切酶的全长序列（SEQIDNO：1，即序列表1所述）。

上述FPrimer的序列为：5’-TTGGTACCACCATGGAAATAAATAAT-3’；

上述RPrimer的序列为：5’-CCCTCGAGTTACCATTTTCCCTT-3’。

实施例2、菜青虫5-羟色胺受体蛋白Pr5-HT₈在HEK-293细胞系中表达

1.将克隆得到的菜青虫Pr5-HT₈基因序列（SEQIDNO：1）克隆到pcDNA3表达载体：

pcDNA3表达载体的准备：EcoR1和Kpn1双酶切反应体系

pCDNA3（200ng/ul）41ul

10×MBuffer5ul

EcoR1(10U/ul)2ul

Kpn1(10U/ul)2ul

反应条件：37℃4hours；

使用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKit切胶回收上述酶切产物。

用连接酶（TaKaRaT4DNALigase）将实施例1中得到的序列连接到上述的酶切载体中，得到表达载体pcDNA3-Pr5-HT₈。

2.转染HEK-293细胞系与单克隆细胞培养

将pcDNA3-Pr5-HT₈用lipofectamine2000脂质体转染试剂转染到HEK-293细胞系中，转染步骤和方法参照产品说明书。24h后加入终浓度为0.8mg/ml的G418进行筛选，一周后形成细胞群落后用克隆圆环挑取细胞簇后进行单克隆培养。得pcDNA3-Pr5-HT₈细胞。

备注说明：上述筛选条件为：以未转染pcDNA3-Pr5-HT8的HEK293细胞为对照，在转染和未转染pcDNA3-Pr5-HT8的细胞里面加0.8mg/ml的G418，一个星期左右未转染成功的细胞开始死亡，两个星期左右未转染pcDNA3-Pr5-HT8的细胞全部死亡。转染了pcDNA3-Pr5-HT8的细胞形成单克隆。

上述单克隆培养条件为：在D-MEM培养基(GibcoBRL,Gaithersburg,MD)中培养，培养基内增补10%热灭火的FBS(GibcoBRL)，细胞置于恒温37℃，5%CO2含量的二氧化碳培养箱中培养。

实施例3、HEK-Pr5-HT₈细胞系对各种生物胺以及5-HT受体激动剂和拮抗剂的钙离子反应

将表达的Pr5-HT₈（即实施例2所得的pcDNA3-Pr5-HT₈）细胞提前48h转到12mm盖玻片上，用DPBS（Dulbeccophosphate-bufferedsaline，杜氏磷酸缓冲液）清洗两遍后再用Fura-2AM（钙荧光探针，终浓度5M）与DMEM（Dulbecco′smodificationofEagle′smediumDulbecco，改良杜氏伊格尔培养基）的混合液负载30min，然后用Ringerbuffer清洗两遍后在PTI公司的ERP钙离子成像系统上测定分别在340nm和380nm激发波长下的510nm发射波长的荧光强度，两者比值可以换算成细胞内钙离子的绝对浓度。

备注说明：HEK-293和HEK-Pr5-HT₈两者的钙离子浓度基本没有差异（一般为10-100nM左右），不会因为表达了受体而产生变化。所不同的是普通HEK-293细胞不会对5-羟色胺受体激动剂（比如5-CT和5-MT）有反应，而HEK-Pr5-HT₈细胞则会对激动剂产生强烈的钙离子反应，所以可以用来进行筛选。

待检验细胞（HEK-Pr5-HT₈细胞）在缓冲液灌流下加入不同浓度的激动剂记录荧光强度比值的变化；具体如下：

1.室温下，用RingerBuffer以1mL/min的速度灌流存放玻片的浴槽，然后用移液器加入40μL的1μM浓度的各种激动剂或杀虫剂，然后记录钙离子信号；

激动剂为5-HT、5-methoxytryptamin（5-MT）、Sumatriptansuccinate、8-OH-DPAT和5-carboxamidotryptamine（5-CT）；

2.对于能够产生钙离子信号的药物，再逐步降低浓度以测定产生信号的最低浓度；对于没能产生信号的药物，则逐步增加浓度到100μM，还不能观察到反应就说明该药物对Pr5-HT₈没有作用。

图1即为加不同的生物胺serotonin（5-HT）、dopamine（DA）,octopamine（OA）和tyramine(TA)后的钙离子反应，可以看到100μM的DA、OA和TA不能引起钙离子反应，而10nM的5-HT可引起一定强度的信号反应，表明该新受体为5-HT受体，并且偶联偶联Gq，它能够增加胞内Ca²⁺浓度。

备注说明：

G蛋白偶联受体（GPCR）根据其偶联的G蛋白的不同，会使细胞内环腺苷酸cAMP或Ca²⁺浓度的改变，从而引起两种不同的信号转导途径。当跟G_i偶联，能够抑制cAMP的上升；跟G_s偶联，能够促进cAMP上升；跟G_q偶联，能够增加胞内Ca²⁺浓度。

对比实验：以转染pc-DNA3空载体的HEK-293细胞替代检验细胞（HEK-Pr5-HT₈细胞），实验内容同上，结果为：无论是5-HT，还是激动剂5-MT、8-OH-DPAT和5-CT，100μM的上述药物都对转染空载体细胞没有任何反应，100μMATP作为钙离子实验的阳性对照。

图2即为加不同的5-HT受体激动剂5-methoxytryptamin（5-MT）,Sumatriptansuccinate（Sumatriptan）、8-OH-DPAT和5-carboxamidotryptamine（5-CT）后的钙离子反应，可以看到10μM的5-MT、8-OH-DPAT和5-CT可引起非常大的信号反应，表明该受体表达细胞系可以用来筛选作用于5-羟色胺受体的活性物质；而Sumatriptan不能。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110>浙江大学

<120>菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈及其应用

<160>2

<210>1

<211>1317

<212>DNA

<213>菜青虫（Pierisrapae）

<400>1

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<211>438

<212>PRT

<213>菜青虫（Pierisrapae）

<400>2

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425430435

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Claims (6)

1.菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈，其特征在于：所述基因编码菜青虫5-羟色胺受体蛋白，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.如权利要求1所述的菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。

3.重组载体，其特征在于：所述重组载体包含权利要求1所述的菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈。

4.如权利要求3所述的重组载体的用途，其特征在于：用于转染宿主细胞，所述宿主细胞为HEK-293，CHO，COS，Sf9，S2或Sf21。

5.如权利要求1所述的菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈的用途，其特征在于：用来筛选和/或评价调控5-羟色胺受体活性的物质的检测。

6.根据权利要求5所述的菜青虫5-羟色胺受体基因Pr5-HT₈的用途，其特征在于：所述检测方法为依次包括以下步骤：

1)、将如权利要求3所述的重组载体转染宿主细胞系；

2)、用候选物质处理步骤1)所得的细胞；

3)、检测步骤2)所得的细胞内钙离子浓度的变化；

当细胞内钙离子浓度升高，说明候选物质能够激活表达的目标受体Pr5-HT8。