CN101232900B - IdeS蛋白酶(来自于酿脓链球菌)在自身免疫性疾病和移植排斥的治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了IdeS多肽或者编码IdeS多肽的多核苷酸在制备用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症的药物中的用途。

Description

IdeS蛋白酶(来自于酿脓链球菌)在自身免疫性疾病和移植排斥的治疗中的用途

技术领域

本发明涉及一种治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症的方法，所述疾病或病症例如自身免疫性疾病、移植排斥、手术后治疗和后天性血友病。

背景技术

IdeS(酿脓链球菌(S.pyogenes)免疫球蛋白G降解酶)是人类病原菌酿脓链球菌产生的胞外半胱氨酸蛋白酶。IdeS最初是从血清型为M1的A组链球菌菌株中被分离得到，但是现在已经在所有的A组链球菌菌株中都识别到了ides基因。IdeS具有极高水平的底物特异性，并且确定的底物仅有IgG一种。IdeS催化人IgG的低绞链区中的单溶蛋白性裂解。所述蛋白水解性降解可以启动调理吞噬的抑制并且干扰A组链球菌的杀灭。IdeS也可以切割多种动物的IgG的某些亚类，并且可以有效地将IgG变成Fc和Fab片段。所述ides基因已经被克隆并且作为GST融合蛋白在E.coli中表达。

发明内容

本发明人证实了IdeS对于由IgG抗体介导的疾病的治疗和预防是有效的。具体地，本发明人证实了IdeS可以被用于治疗类风湿性关节炎(RA)。对被诱发类风湿关节炎的小鼠给予IdeS没有观察到毒性作用，并且该给药完全阻断了类风湿性关节炎的发生。而且，本发明人证实IdeS的效力很强，并且IdeS具有局部效应。

因此根据本发明，可以提供IdeS多肽或者编码IdeS多肽的多核苷酸在制备用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了：

-一种对需要治疗或预防的受试者受试者进行的治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症的方法，所述方法包括对所述受试者给予治疗有效量的IdeS多肽或者编码IdeS多肽的多核苷酸；和

-一种处理离体血液的方法，所述血液取自患有由IgG抗体介导的疾病或病症的患者，所述方法包括使所述血液与IdeS多肽相接触。

附图说明

图1显示接受IdeS处理的小鼠和对照小鼠的关节炎的发病率(a)和严重度(b)。在时间0时注射抗-CII抗体。在所述抗体转移的3小时前(n＝5)或者3小时之后(n＝5)用IdeS(0.950mg/每只小鼠/i.v.)的PBS溶液对小鼠静脉注射，或者不经过任何处理(n＝6)。在第5天，用LPS(25μg/每只小鼠/i.p.)注射所有小鼠。在15天内每天检测小鼠关节炎的发生。所有小鼠都被用于计算。n表示在实验中使用的小鼠的数量。从所述动物取血清和爪样本。

图2显示爪的组织病理学切片，所述爪取自如图1所述的对照小鼠(a和c)和接受IdeS处理的小鼠(b和d)。在实验的第15天收集小鼠的爪。在4℃下，后爪用4％的磷酸盐缓冲的多聚甲醛溶液(pH7.4)固定24小时，之后在乙二胺四乙酸溶液中脱钙4周，所述乙二胺四乙酸溶液含聚乙烯吡咯烷酮和0.1M的Tris(pH6.95)，之后进行脱水并用石蜡包埋。用苏木精和伊红染色6μm厚的切片。显示的结果代表从每组中的三只小鼠获得的样品。原始放大倍数是20倍。

图3显示接受各种不同剂量IdeS处理的小鼠和对照小鼠中的关节炎的发病率(a)和严重度(b)。在第0天的0小时，四个月的雄性B10.RIII小鼠组经静脉注射9mg的CII特异性单克隆抗体M2139和CIIC1。在同一天的3个小时后，用含有0μg(n＝7)、10μg(n＝5)、100μg(n＝5)和1000μg(n＝5)的IdeS的PBS溶液进行静脉注射。在第5天，所有的小鼠接受LPS(25μg/i.p.)处理。n表示每组中小鼠的数量。误差条表示平均值±SEM。所有的小鼠都被用于计算。

图4显示全身地和局部地接受IdeS处理的小鼠和对照小鼠中的关节炎的发病率(a)和严重度(b)。在第0天的0小时，B10.RIII小鼠组经静脉注射9mg的关节炎源抗-CIIIgG2a单克隆抗体混合物。用100μg的IdeS全身性地(i.v.)(n＝4)或局部地(对左爪或者右爪)处理小鼠。所述接受局部处理的小鼠或者在抗-CII抗体转移(n＝6)后的3小时后或者在抗-CII抗体转移后(n-6)的3小时和24小时被给予IdeS。

序列表说明

SEQIDNO：1为从酿脓链球菌AP1分离的编码IdeS的氨基酸序列。

SEQIDNO：2为从酿脓链球菌AP1分离的编码IdeS的氨基酸序列，包括一个推定的信号序列。

SEQIDNO：3为从酿脓链球菌AP1分离的编码IdeS的核酸序列(包括一个信号序列)。

SEQIDNO：4为PCR引物Ide1。

SEQIDNO：5为PCR引物Ide2。

SEQIDNO：6为PCR引物Ide5x。

SEQIDNO：7为PCR引物Ide3x。

SEQIDNO：8为IdeS对人IgG进行切割的产物的N端氨基酸序列。

具体实施方式

本发明提供一种治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症的方法，所述方法包括给予受试者受试者IdeS多肽或者编码IdeS多肽的多核苷酸。

多肽

所述IdeS多肽优选为酿脓链球菌(S.pyogenes)的IdeS或者为保持有半胱氨酸蛋白酶活性的酿脓链球菌IdeS的变体或片段。所述变体可以是来自其他物种例如另一种细菌的IdeS多肽。所述细菌优选为链球菌(Streptococcus)。所述链球菌优选为A组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。特别地，所述变体可以是来自于例如马链球菌(S.equii)或兽瘟链球菌(S.zooepidemicus)的C组链球菌的IdeS多肽。或者，所述变体可以来自于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。

所述IdeS多肽可以包括：

(a)SEQIDNO：1的氨基酸序列；

(b)SEQIDNO：1序列的变体，所述变体具有与SEQIDNO：1的氨基酸序列至少50％的同一性并且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性；或者

(c)上述任一个序列的片段，所述片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。

优选地，所述多肽包含SEQIDNO：1的序列，或者由SEQIDNO：1的序列组成。所述多肽还可以包含信号序列。因此，所述IdeS多肽可以包含：

(a)SEQIDNO：2的氨基酸序列；

(b)SEQIDNO：2序列的变体，所述变体具有与SEQIDNO：2的氨基酸序列至少50％的同一性并且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性；或者

(c)上述任一个序列的片段，所述片段具有半胱氨酸蛋白酶活性。

所述IdeS多肽可以由SEQIDNO：2中显示的序列组成。

所述变体多肽的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的序列不同，但是保持了与IdeS相同的本质特征或者基本功能。因此所述变体多肽可以表现出IgG半胱氨酸蛋白酶活性。通常，被认为是变体的蛋白与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的氨基酸序列具有大约50％、55％或65％的同一性，优选具有至少70％、至少80％、至少90％的同一性，特别优选具有至少95％、至少97％或至少99％的同一性。这种变体可以包括等位基因变体和所述蛋白质序列的单氨基酸或氨基酸簇的缺失、置换或插入形成的变体，只要所得的肽保持IdeS的基本功能即可。SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的变体的同一性可以在SEQIDNO：1或SEQIDNO：2中显示的序列的长度的至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少250、至少275、至少300个或更长的连续氨基酸上测定，或者更优选在SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的全长上测定。

SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的氨基酸序列的变体优选地包含SEQIDNO：1的Lys-55和/或Cys-65和/或His-233和/或Asp-255和/或Asp-257残基(所述残基分别对应于SEQIDNO：2的Lys-84、Cys-94、His-262、Asp-284和Asp-286)。最优选地，SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的变体包含SEQIDNO：1的Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255和Asp-257残基中的每一个(所述残基分别对应于SEQIDNO：2的Lys-84、Cys-94、His-262、Asp-284和Asp-286)。

可以用任何合适的算法计算氨基酸的同一性。例如UWGCG软件包提供的BESTFIT程序可以被用于计算同源性(例如使用它的默认设置)(Devereuxetal(1984)NucleicAcidsResearch12，387-395)。例如AltschulS.F.(1993)JMolEvol36：290-300；Altschul，S，Fetal(1990)JMolBiol215：403-10中所述，可以使用PILEUP和BLAST算法计算同源性或者对序列进行排队(例如鉴定等价物或相应的序列(通常使用它们的默认设置)。

进行BLAST分析的软件可以从美国NationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。所述算法涉及到首先鉴定高分值序列配对(HSP)，这个步骤是通过在查询序列中鉴定长度为W的短字长，所述短字长当与数据库序列中相同长度的字对齐的时候或者匹配或者满足某个正值的阈值T。T是指邻近字值阈值(Altschuletal，上文)。将这些初始邻近字匹配作为种子启动检索，所述检索是为发现它们中包含的HSP。在每条序列的两个方向的每个方向进行字匹配延伸，到达累积比对分值能够增加的极限。在每个方向上的字匹配的延伸停止的条件是：所述累积比对分值随量X从其达到的最大值回落；由于加上一个或多个负分值的残基比对，所述累积分值为0或小于0；或者达到任何一个序列的端点。所述BLAST算法的参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。所述BLAST算法使用的默认字长(W)为11，BLOSUM62打分矩阵(见HenikoffandHenikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919)比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝4，并且是进行双链比较。

所述BLAST算法进行两个序列之间的相似性的统计分析；参见例如KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787。所述BLAST算法提供的一种相似性的量度是最小和概率(P(N))，所述最小和概率表示两个多核苷酸之间或者两个氨基酸序列之间出现随机匹配的概率。例如，如果一个序列与另一个序列比较中的最小和概率小于大约1，优选小于大约0.1，更优选小于大约0.01，并且最优选小于大约0.001，那么第一序列被认为与第二序列相似。

所述变异序列通常具有至少1、2、5、10、20、30、50个或更多突变的差异，所述突变可以是氨基酸的置换、删除或插入。例如，可以制备1-50、2-30、3-20或5-10个氨基酸的置换、删除或插入。所述被修饰的多肽通常保持了IgG特异性半胱氨酸蛋白酶的活性。所述置换优选是保守置换，例如根据下表的置换。在第二列的同一格内的氨基酸可以置换，优选用在第三列的相同行中的氨基酸相互置换：

也可能提供这样一种IdeS的突变体，其中的催化区域被突变使所述蛋白失去半胱氨酸蛋白酶活性。这类突变体可以包含SEQIDNO：1的第65位(SEQIDNO：2的第94位)的催化性半胱氨酸残基的置换或者缺失。例如，可以用甘氨酸置换半胱氨酸。本发明也涉及这样的突变IdeS的片段的变体，但是所述片段的变体保持IdeS表现的半胱氨酸蛋白酶活性的功能。

优选地，所述多肽包含一个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基，它们之间的间隔距离是通常存在于半胱氨酸蛋白酶中的典型间隔距离。例如，在SEQIDNO：1中，这两个残基的间隔距离约为130个氨基酸，这也是半胱氨酸蛋白酶中的典型间隔距离。

在本发明中使用的IdeS的片段的长度通常至少为10个氨基酸，例如所述长度至少15、20、25、30、40、50或更多个氨基酸，所述长度可以多至100、150、200、250或300个氨基酸，只要所述片段保持IdeS的IgG半胱氨酸蛋白酶活性即可。优选地，在本发明中使用的IdeS多肽片段包含SEQIDNO：1的Lys-55和/或Cys-65和/或His-233和/或Asp-255和/或Asp-257残基(所述残基分别对应于SEQIDNO：2的Lys-84、Cys-94、His-262、Asp-284和Asp-286)。最优选地，SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的变体包含SEQIDNO：1的Lys-55、Cys-65、His-233、Asp-255和Asp-257残基中的每个残基(所述残基分别对应于SEQIDNO：2的Lys-84、Cys-94、His-262、Asp-284和Asp-286)。

本发明中使用的多肽可以被化学修饰，例如转录后修饰。例如，它们可以被糖基化、磷酸化或包含经修饰的氨基酸残基。它们的修饰可以是加入另外的组氨酸残基以协助其纯化，或者加入另外的信号序列以促进其对细胞膜的插入。这些修饰的多肽也落入本文使用的术语“多肽”的范围之内。

通常，根据本发明的多肽表现免疫球蛋白半胱氨酸蛋白酶活性，并且特别是IgG半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，所述多肽在铰链区切割IgG，并且更特别地在重链的铰链区切割。优选地，切割的结果是产生IgG的Fc和Fab片段。优选地，所述活性是特异针对IgG。所述半胱氨酸蛋白酶活性可以通过合适的测定方法确定。例如，可以在合适的温度(如37℃)下将待测多肽与IgG一起孵育。然后可以对起始物质和反应产物进行SDSPAGE分析，以确定是否存在期望的IgG的切割产物。通常，这种切割产物是一个31kDa的片段。通常，在这个第一步切割之后没有IgG的进一步降解。可以对所述切割产物进行N-末端的测序，以验证切割是否发生在IgG的铰链区。优选地，所述N-末端序列包含SEQIDNO：8的序列。

可以通过抑制研究进一步地表征所述多肽的半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，所述活性被肽衍生物Z-LVG-CHN₂和/或碘乙酸抑制，这两种物质都是蛋白酶抑制剂。然而，所述活性通常不被E64抑制。

所述多肽的半胱氨酸蛋白酶活性通常是IgG特异性的，也就是说所述多肽在能够切割IgG的条件下与其他类型的免疫球蛋白一起培养时并不降解这些Ig，所述其它类型的Ig为IgM、IgA、IgD和IgE。所述IdeS多肽可以切割受试者待治疗的受试者体内存在的IgG分子。因此，如果所述受试者受试者是人，则所述IdeS多肽可以切割人IgG。在优选的实施方案中，所述多肽能够切割人、兔、小鼠或山羊的IgG。

在本发明中使用的多肽可以基本上为分离的形式。可以理解的是，所述多肽可以与载体或稀释剂混合，所述载体和稀释剂并不干扰所述多肽的预期目的，并且所述多肽仍然可以被认为基本上是分离的。在本发明中使用的多肽可以基本上为纯化的形式，在这种情况下本发明的多肽可以构成一种制剂中包含的多肽，所述制剂中包含多肽重量的多于50％(如多于80％、90％、95％或99％)为本发明的多肽。

在本发明中使用的多肽可以从任何表达IdeS多肽的合适物种中分离。典型地，所述IdeS多肽是从合适的酿脓链球菌的IdeS表达株中分离。大量的技术可以被应用于鉴定合适的物种和菌株。例如，可以首先检测酿脓链球菌菌株是否存在ides基因。多核苷酸引物或探针的设计可以基于例如SEQIDNO：1、2或3。合适的引物的实例示于SEQIDNO：4、5、6和7。然后可以通过使用所述引物的PCR进行所述ides基因的存在的验证，或者通过使所述探针与酿脓链球菌菌株的基因组DNA杂交进行验证。

酿脓链球菌菌株表达的活性IdeS可以通过测定培养上清液中的IgG半胱氨酸蛋白酶活性进行识别。优选地，将抑制剂E64加入到上清液中以抑制任何的SpeB半胱氨酸蛋白酶活性。至少有五个菌株表达活性IdeS：AP1、AP12、AP55、KTL3和SF370。优选地，所述表达菌株选自AP1、AP12和AP55。

从表达IdeS的酿脓链球菌菌株的培养物或者从表达IdeS的其他细胞的培养物分离和纯化IdeS的过程通常基于IgG半胱氨酸蛋白酶活性。优选地，所述纯化方法包括硫酸铵沉淀步骤和离子交换层析步骤。根据一种方法，通过逐渐加入增加量的硫酸铵使所述培养基分级沉淀。所述硫酸铵的量可以为10-80％。优选地，所述培养基用50％的硫酸铵分级，并将所得的上清液进一步用70％的硫酸铵沉淀。然后可对沉淀的多肽进行离子交换层析，例如通过使用MonoQ柱的FPLC进行层析。可以对被洗脱的级分进行IgG半胱氨酸蛋白酶活性检测，并且可以合并具有峰值活性的级分。所述级分可以通过SDSPAGE被分析。例如，可以从所述SDSPAGE蛋白带获得一个N-末端序列。所述级分可以存储于-20℃。

在本发明中使用的多肽也可以被制备成这类分离的多肽的片段。而且，所述IdeS多肽也可以通过合成或者通过重组的方法制备。例如，重组IdeS多肽的产生可以通过用一种表达载体转染培养的哺乳动物细胞，所述表达载体包含与合适的控制序列有效连接的编码所述多肽的核苷酸序列，然后培养所述细胞，提取并纯化所述细胞产生的IdeS多肽。

在本发明中使用的多肽的氨基酸序列可以被修饰，以使其包含非天然氨基酸或者提高所述化合物的稳定性。如果所述多肽是通过合成的方法制备，那么这些氨基酸可以在制备的过程中被引入。也可以在合成产物或者重组产物形成之后修饰所述多肽。

在本发明中使用的多肽也可以使用D-氨基酸制备。在这种情况下，所述氨基酸将会以从C到N的方向进行反序列的连接。这在制备这类多肽的领域中是常规的技术。

在本领域中已知大量的侧链修饰方式，它们也可以用于对所述IdeS多肽的侧链进行修饰，只要所述多肽保持IgG半胱氨酸蛋白酶活性即可。

多核苷酸

编码IdeS多肽或其变体的多核苷酸可以被用于治疗或预防IgG抗体介导的疾病或病症。具体而言，所述多核苷酸可以包含下述序列或者由下述序列组成：(a)SEQIDNO：3的编码序列；(b)可以简并为(a)中限定的序列的遗传编码的序列；(c)与(a)或(b)中限定的序列有至少60％的同一性、并且编码具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽的序列；或者(d)在(a)、(b)或(c)中限定的任何一个序列的片段，所述片段编码具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。

通常，所述多核苷酸为DNA。然而，所述多核苷酸也可以为RNA多核苷酸。所述多核苷酸可以为单链或者双链，并且可以包含合成的或者修饰的核苷酸。

本发明的多核苷酸可以典型地与SEQIDNO：3的编码序列或者该编码序列的互补序列杂交，所述杂交的水平显著地高于背景的杂交水平。例如由于在DNA文库中存在其他DNA，可能出现背景杂交。与其他多核苷酸和SEQIDNO：3的编码序列之间相互作用的强度相比，本发明的多核苷酸与SEQIDNO：3的编码序列或者SEQIDNO：3的编码序列的互补序列之间的相互作用产生的信号水平通常要高至少10倍，优选地高至少100倍。所述相互作用的强度的检测可以通过例如使用³²P的放射性标记探针进行。通常，使用中等严格度到高严格度的条件可以获得选择性杂交。然而，这种杂交可以在本领域已知的任何合适的条件下进行(见Sambrooketal，MolecularCloning：ALaboratoryManual，1989)。例如，如果需要高严格度，合适的条件包括在60℃-65℃下的0.1-0.2×SSC。如果需要较低的严格度，合适的条件包括在60℃下的2×SSC。

可以通过核苷酸置换对SEQIDNO：3的编码序列进行修饰，例如进行1、2或3-10、25、50或100个核苷酸的置换。替代地或附加地，也可以通过一个或多个插入和/或缺失和/或通过在一端或两端进行延伸，而对SEQIDNO：3的多核苷酸进行修饰。也可以加入例如信号序列的其他序列。所述经修饰的多核苷酸通常编码具有IgG特异的半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。可以进行简并性置换，和/或可以进行当经修饰的序列被翻译的时候产生如上表所示的保守氨基酸替换的置换。

能够与SEQIDNO：3的DNA编码序列的互补序列选择性杂交的核苷酸序列通常在一段区域内与SEQIDNO：3的编码序列有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者至少99％的序列同一性，所述区域至少为20，优选至少30，例如至少40、至少60、更优选至少100个的连续的核苷酸，或者最优选为SEQIDNO：3全长或者为编码具有SEQIDNO：1中显示的序列的多肽的SEQIDNO：3的长度。序列同一性可以通过任何合适的方法确定，例如上文描述的方法。

上述的序列同一性和最小长度的任何组合都可以被用于限定本发明的多核苷酸，优选更加严格的组合(如在更长的序列上具有更高的序列同一性)。因此，例如在20个核苷酸上，优选在30个核苷酸上具有至少90％的序列同一性的多核苷酸可以构成本发明的一个技术方案，在40个核苷酸上具有至少95％的序列同一性的多核苷酸也可以构成本发明的一个技术方案。

多核苷酸片段的长度优选为至少10，优选为至少15或至少20，例如至少25，至少30或至少40个核苷酸。通常，它们的长度达到40、50、60、70、100或者150个核苷酸。片段可以长于150个核苷酸，例如其长度可达到200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸，或者甚至其长度比SEQIDNO：3的编码序列仅少几个核苷酸，例如少五个、十个或十五个核苷酸。

在本发明中使用的多核苷酸可以通过重组、合成或者本领域技术人员可获得的任何方法产生。也可以通过标准技术克隆所述多核苷酸。通常，所述多核苷酸以分离的形式和/或纯化的形式提供。

通常，短的多核苷酸由合成获得，包括对目标核酸序列进行一次一个核苷酸的分步合成。使用自动化技术完成所述过程的技术在本领域中是容易获得的。

较长的多核苷酸通常使用重组的手段产生，例如使用PCR(多聚酶链式反应)克隆技术。这包括设计针对克隆目标ides基因区域的一对引物(如大约15-30个核苷酸)，将所述引物与从细菌细胞分离得到的DNA接触，在产生目标区域扩增的条件下进行多聚酶链反应，分离被扩增的片段(如通过琼脂糖凝胶纯化反应混合物)和回收扩增的DNA。所述引物可以被设计成包含合适的限制性酶识别位点，籍此扩增的DNA可以被克隆入合适的克隆载体中。合适的引物的实例例如SEQIDNOs：4、5、6或者7的序列。

上述技术可以被应用于获得本文所述的ides基因序列的全长或者部分。虽然本文提及的技术总体上是本领域中所熟知的，但是也可以参考有关文献，特别是参考Sambrooketal.(1989)。

本文所述的IdeS多聚核苷酸可以产生在本发明中使用的多肽，所述产生过程可以发生在体外、体内或离体的情况。所述多核苷酸自身可以被用作治疗剂或者可以被用于重组蛋白的合成。

通常，可将本发明中应用的多核苷酸整合进重组的可复制载体中。所述载体可以在适合的宿主细胞中用于复制所述核酸。因此，本发明中应用的多核苷酸的制备可以通过下述方式进行：将一种IdeS多核苷酸引入一种复制载体、将所述载体导入到一种合适的宿主细胞中，并且在产生所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。

优选地，所述载体为一种表达载体，所述表达载体包含编码IdeS多肽的核酸序列。这种表达载体用分子生物学领域的常规方法构建，并且可以使用例如质粒DNA和合适的起始因子、启动子、增强子和如多腺苷酸信号的其他元件，上述载体元件可能是必需的并且位于正确的方向以使得蛋白可以被表达。其他合适的载体对本领域技术人员是显而易见的。在这方面的其他实例可以参考Sambrooketal.(1989)。

优选地，本发明中使用的载体中的多核苷酸与控制序列有效连接，所述控制序列可以使宿主细胞表达编码序列，也就是说所述载体为一种表达载体。术语“有效连接”指一种并置关系，所述并置描述的组件之间的关系能使他们以预期的方式发挥功能。“有效连接”到编码序列的调控序列(例如启动子)的位置能够使得在与所述调控序列相适应的条件下实现所述编码序列的表达。

例如质粒、病毒和噬菌体的载体可以提供复制起始区，任选地提供所述多核苷酸表达所用的启动子，还任选地提供所述启动子的调控子。所述载体通常适合于体内使用。

可以选择启动子和其他表达调控信号，以使其与被设计用于表达的宿主细胞相适应。例如，可以使用例如β-肌动蛋白启动子的哺乳动物启动子。特别优选组织特异性启动子。也可以使用病毒启动子，所述病毒启动子例如Moloney鼠白血病病毒长末端重复启动子(MMLVLTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞包含体病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(例如HSVIE启动子)或HPV启动子，特别是HPV上游调控区域(URR)。病毒启动子在本领域中是容易获得的。

所述载体可以进一步在所述多核苷酸两侧包含多核苷酸序列，使得所述序列包含与真核生物基因组序列特别是哺乳动物基因组序列同源的序列。这使得可以通过同源重组将本发明的多核苷酸引入到真核细胞的基因组中。具体而言，可以使用在表达盒两侧含有病毒序列的的质粒载体来制备病毒载体，所述病毒载体适于将本发明的多核苷酸送递至哺乳动物细胞。合适的病毒载体的其他实例包括单纯性疱疹病毒载体和逆转录病毒，包括慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和HPV病毒。使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员已知的。例如，可以用逆转录病毒载体多核苷酸稳定地整合进宿主基因组中。与此相反的是复制缺陷腺病毒载体仍然保持游离并因此使得可以瞬时表达。

疾病和病症

IdeS肽或多核苷酸可以被应用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或病症。致病的IgG抗体与许多不同疾病和病症的发生有关是本领域熟知的。本发明的发明人发现可以使用IdeS多肽或多核苷酸抑制致病的IgG抗体在这些疾病中的作用。

所述疾病或病症可以是自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病包括阿狄森氏病(Addison’sdisease)、斑秃、强直性脊椎炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性胃炎、自身免疫性失聪、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺机能减退、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多种内分泌病、贝切特氏病(disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、慢性炎症脱髓鞘性多神经病、丘-施氏综合征(Churg-Strausssyndrome)、腹部疾病、克罗恩病(Crohn′sdisease)、CREST综合征、德戈斯病(Degosdisease)、后天性大疱性表皮松解、原发性混合冷凝球蛋白血栓、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture′ssyndrome)、格雷夫斯病(Graves′disease)、吉-巴氏综合征(Guillan-Barresyndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto′sthyroiditis)、特发性血小板减少性紫癜、炎性肠病、川崎氏病(Kawasaki′sdisease)、美尼尔综合征(Meniere′ssyndrome)、混合性结缔组织病、莫伦溃疡(Mooren′sulcer)、多发性硬化症、重症肌无力、落叶性天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多腺性自身免疫综合征类型1(PAS-1)、多腺性自身免疫综合征类型2(PAS-2)、多腺性自身免疫综合征类型3(PAS-3)、多发性肌炎/皮肌炎、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺综合征(Raynaud′ssyndrome)、莱特尔综合征(Reiter′ssyndrome)、类风湿性关节炎、肉状瘤病、胶原沉着病、干燥综合征(Sjgren′ssyndrome)、亚急性甲状腺炎、交感性眼炎、全身性红斑狼疮、高安氏动脉炎(Takayasu′sarteritis)、1型糖尿病、白癜风、伏格特-小柳-原田三氏综合征(Vogt-Koyanagi-Haradadisease)或韦格纳肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)。优选地，所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎(RA)。

所述疾病或病症可以是哮喘。所述哮喘可以是急性哮喘或慢性哮喘。

IgG可以激活经典的补体系统途径。因此，IdeS多肽和多核苷酸可以被应用于治疗补体激活对患者有害的疾病和病症。例如，所述IdeS多肽和多核苷酸可以被应用于治疗移植派生的紊乱，所述紊乱例如移植排斥(如同种异体移植物和异种移植物排斥)和移植物抗宿主病。对患者进行的组织或器官的移植可能会导致出现所述移植派生的紊乱。

IdeS多肽和多核苷酸也可以被应用于手术后治疗中，例如被应用于治疗经心脏旁路手术的患者。

而且，IdeS多肽和多核苷酸可以被应用于后天性血友病的治疗，即清除血友病患者体内的IgG，所述血友病患者具有抗凝血因子的自身抗体。

受试者通常是哺乳动物受试者，所述哺乳动物受试者例如小鼠、大鼠或灵长类动物(如狨猴或猴子)。所述受试者可以是人或者非人动物。如果所述受试者是如小鼠、大鼠或灵长类的实验动物，所述动物可以被处理以诱发由致病性IgG抗体介导的疾病或病症。例如，可以使用vwesionNandakumaretal.(Am.J.Pathol.163(5)：1827-1837，2003)描述的小鼠抗-CII抗体诱导的关节炎(CAIA)模型或者在实施例中描述的所述模型的改进模型。

治疗和预防

本发明提供了IdeS多肽和多核苷酸用于由致病性IgG抗体介导的疾病或病症的治疗或预防的用途。治疗可以是治疗性的或预防性的。

可以将所述IdeS多肽或多核苷酸给予一个个体以阻止所述疾病或病症的一种或多种症状的发生。在这个实施方案中，所述受试者可以没有症状。所述受试者可能是所述疾病的遗传易感的。将预防有效量的所述多肽或多核苷酸给予这样一个个体。所述预防有效量是可以阻止所述疾病或病症的一种或多种症状的发生的量。

所述IdeS多肽或多核苷酸的一种预防有效量是有效地缓解一种疾病或病症的一种或多种症状发生的量。优选地，所述被治疗的个体是人。

可以通过任何合适的途径将所述IdeS多肽或多核苷酸给予所述受试者。所述多肽或多核苷酸的给药方法可以通过肠内或肠外途径，例如通过口腔的、面颊的、直肠的、肺的、静脉内的、动脉内的、肌内的、腹腔内的、关节内的、局部的或其他合适的给药途径。

可以以对特定的位点进行靶治疗的方式将所述IdeS多肽或多核苷酸给予所述受试者。例如，可以将IdeS多肽直接给予移植器官的位点。可以局部注射所述IdeS多肽，例如在一个或多个关节的关节内注射。在所述关节进行IdeS的局部给药特别优选地被应用于类风湿性关节炎(RA)的预防或治疗。所述IdeS多肽可以与能特异性结合软骨的试剂联合使用。对于IdeS多核苷酸而言，编码所述IdeS多肽的表达载体可以用于在特定的组织中直接表达IdeS，例如通过使用组织特异的启动子或RNAi进行。

本文提及的任何多肽和多核苷酸的制剂将依赖于例如所述多肽或多核苷酸的性质或被治疗的病症的因素。可以以各种剂量形式进行所述多肽或多核苷酸的给药。所述各种给药途径可以通过口服(如为片剂、含片、锭剂、水剂或油悬液、可分散粉末或颗粒)、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、胸骨内、皮肤或通过输注技术。所述多肽或多核苷酸也可以作为栓剂给药。内科医师可以为每个特定的患者确定所需要的给药途径。

通常，所述多肽或多核苷酸与一种可药用的载体或稀释剂配伍使用，并且这可以使用药学领域中常规的方法进行。所述可药用载体或稀释剂可以是例如一种等渗溶液。例如，固体口服形式除所述活性化合物之外还可以包括稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如硅酸酐、云母、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；结合剂；例如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；分解剂，例如淀粉、褐藻酸、藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；沸腾复合剂；染料；增甜剂；湿润剂，例如卵磷脂、多山醇酯、月桂硫酸盐；和通常的药学制剂中使用的无毒和无药理活性的物质。可以以已知的方法进行这些药物制剂的加工，所述已知的方法例如通过混合、碾碎、压片、包糖衣或薄膜包衣等工艺的方式。

用于口服给药的液体分散物可以是糖浆剂、乳剂和悬浮液。所述糖浆剂可以包含例如蔗糖或者与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇联合使用的蔗糖，并作为载体。

悬浮液和乳剂可以包含例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇，并作为载体。用于肌肉注射的所述悬浮液或溶液除了所述活性化合物外还可以包含可药用的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇例如丙二醇，并且如果需要可以包含合适量的盐酸利多卡因。

用于静脉注射或输注的溶液可以包含例如无菌水并作为载体，或者优选地它们可以是无菌水性等渗盐溶液的形式。

对于栓剂，可以包括传统的结合剂和载体，例如聚亚烷基二醇或甘油三酸酯；这种栓剂可以由包含0.5％-10％(优选1％-2％)范围内的活性成分的混合物形成。

口服制剂中包含那些常用的赋形剂，所述赋形剂例如药学级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物形成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式并且包含10％-95％(优选25％-70％)的活性成分。如果所述药物组合物为冻干的形式，则在给药之前可以将所述冻干物质重溶，例如重溶为悬浮液。重溶优选地在缓冲液中进行。

用于患者口服给药的胶囊、片剂和丸剂可以以肠溶包衣的形式提供，所述肠溶包衣包括例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、乙酸纤维素、醋酞纤维素或羟丙基甲基纤维素。

也可以使用适合例如经皮给药的无针注射的药物组合物。

可以给予治疗有效量的多肽或多核苷酸。可以通过各种参数确定所述剂量，特别是根据所使用的多肽或多核苷酸；待治疗的患者的年龄、体重和状况；给药途径；和所需的治疗方案。而且，内科医师可以针对任何特定患者确定所需的给药途径和剂量。根据特异性抑制剂的活性、待治疗的受试者的年龄、体重和状况、疾病的类型和严重程度和给药的频率和途径，典型的日剂量为按体重约0.1至50mg/kg，优选为约0.1mg/kg至10mg/kg。优选地，日剂量水平为5mg至2g。

上文描述的IdeS核苷酸序列和包含所述序列的表达载体也可以被用作如上所述的药物制剂。优选地，如RNA或DNA的核酸序列(特别是DNA)以表达载体的形式被提供，所述表达载体可以在被治疗的个体的细胞中表达。疫苗(vaccine)可以包含裸露核苷酸序列或者与阳离子脂、聚合物或靶向系统一起使用。可以通过任何可用的技术送递所述疫苗。例如，可以通过针注射送递所述核酸，优选经皮内注射、皮下注射或者肌肉内注射。或者，可以使用例如颗粒介导的基因送递的核酸送递装置将所述核酸直接经皮肤进行送递。可以将所述核酸局部给予皮肤上或者给予粘膜表面，例如通过鼻内、口腔、阴道内或直肠内给药。

几种已知的转染技术可以增强核酸构建体的吸收，所述技术例如包含使用转染剂的技术。这些转染剂的例子包括阳离子试剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖，以及lipofectant，例如lipofectam和transfectam。可以改变被给予的核酸的剂量。通常，给予的核酸的剂量范围是1pg至1mg，优选地，对于颗粒介导的基因送递为1pg至10μg核酸，并且对于其他途径为10μg至1mg。

本发明也提供一种处理离体血液的方法，所述血液来自于患有有致病性IgG抗体介导的疾病或病症的患者，所述方法包括使所述血液与IdeS多肽相接触。因此，IdeS可以被用于血液的体外处理。所述IdeS可以被用于处理血液的一个或多个组分，所述组分例如血浆或血清。本文所述的离体方法可以用于已经脱离患者身体的血液。在与IdeS多肽接触以后，所述血液或血液产物可以任选地被输回所述患者体内。

用下面的实施例举例说明本发明：

实施例1：IdeS对关节炎的诱发和发展的作用

使用针对II型胶原(CII)的小鼠IgG2a抗体特别设计了类风湿性关节炎(RA)的动物模型来诱发RA，该动物模型是从Nandakumaretal.(2003)已知的抗-CII抗体诱导关节炎(CAIA)模型变化而来的动物模型。对几组雄性B10.RIII小鼠经静脉注射9mg的CII特异性IgG2a单克隆抗体混合物，所述混合物包含的M287和CIIC1分别与J1和C1^I表位结合。在抗-CII抗体转移3小时之前(n＝5)或者3小时之后(n＝5)对小鼠注射IdeS(0.950mg/每只小鼠/i.v.)的PBS溶液。对照小鼠不作处理(n＝6)。在第5天，对所有的小鼠注射LPS(25μg/小鼠/i.p.)。在15天中每天观察小鼠的关节炎发病情况。关节炎的发病率(a)和严重程度(b)示于图1。观察所述动物的存活率和总体健康情况。

在实验过程中没有小鼠死亡，并且在接受IdeS处理之后没有显现任何副作用。在所述对照组中除了发生关节炎之外，所有小鼠均保持健康。因此，所述结果表明IdeS处理没有明显的毒性效应，并且可以完全地阻止关节炎的发生。

对所述小鼠的血清进行分析确定抗-CII抗体的水平。对所述小鼠的爪进行组织学分析。所述组织学分析证实了临床评分数据。图2显示关节区域和所述关节周围的浸润组织的组织学情况。在对照组小鼠(a和c)中，有活性的炎性血管翳组织侵蚀骨头和软骨。在所述经处理的小鼠(b和d)中，所述关节是正常的。

实施例2：确定IdeS的有效剂量

为了诱导CAIA，使用9mg的两种单克隆抗体的混合物：(i)检测C1^I表位的CIIC1和CIIC1的IgG2a同种型；(ii)检测J1表位的M2139和M2139的IgG2b同种型。因此，所述实验与实施例1中进行的实验的区别在于使用了不同的J1特异性抗体。所述M2139抗体与实施例1中使用的M287对J1表位有相似的亲和力。在所述抗体混合物被注射到四个月大的雄性B10.RIII小鼠3个小时之后，用三种不同剂量(10,100和1000μg)的IdeS处理所述小鼠。未处理的对照组未接受IdeS(0μg)。同实施例1一样，在注射所述抗体混合物后的第5天，使用LPS以增加关节炎的发病率。

关节炎的发病率(a)和严重程度(b)在图3中显示。下面的表显示在第10天关节炎的发病率。

所述实验进行到第19天并且在第19天观察到实质上相同的结果(见图2)。

从这些结果可以得出结论：

a)所述IdeS处理很可能是高效的，因为最低剂量也有很明显的效果。所述有效剂量低于100μg。使用10μg的剂量是有效果的，但是使用100μg可以达到更佳的效果。

b)最高剂量没有效果可能的解释是由于在所述IdeS制备过程中存在的内毒素污染所致。

实施例3：使用IdeS对关节炎的局部治疗

用9mg的产生关节炎的抗-CIIIgG2a单克隆抗体混合物经静脉注射到B10.RIII小鼠组的小鼠。所述小鼠用100μg的IdeS进行全身的(静脉注射)(n＝4)或局部的(左爪或右爪)处理。所述接受局部处理的小鼠在抗-CII抗体转移后的3小时(n＝6)或者在抗-CII抗体转移的3小时和24小时(n-6)被给予IdeS。关节炎的发病率(a)和严重程度(b)在图4中显示。

从这些结果可以得出结论，IdeS具有局部效果并且可能降解已经结合到软骨上的抗体。

序列表

<110>HANSAMEDICALAB

<120>IdeS蛋白酶(来自于酿脓链球菌)在自身免疫性疾病和移植排斥的治疗中的用途

<130>N94829BSER/SJB

<160>8

<170>PatentInversion3.0

<210>1<211>310

<212>PRT

<213>酿脓链球菌(S.Pyogenes)

<400>1

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151015

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202530

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505560

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859095

LysIleAsnPheAsnGlyGluGlnMetPheAspValLysGluAlaIle

100105110

AspThrLysAsnHisGlnLeuAspSerLysLeuPheGluTyrPheLys

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145150155160

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210215220

ThrTyrAlaAsnValArgIleAsnHisValIleAsnLeuTrpGlyAla

225230235240

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245250255

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260265270

SerAlaGlyLysValAlaIleSerAlaLysGluIleLysGluAspAsn

275280285

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SerTrpAsnGlnThrAsn

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<210>2

<211>339

<212>PRT

<213>酿脓链球菌(S.Pyogenes)

<400>2

MetArgLysArgCysTyrSerThrSerAlaAlaValLeuAlaAlaVal

151015

ThrLeuPheValLeuSerValAspArgGlyValIleAlaAspSerPhe

202530

SerAlaAsnGlnGluIleArgTyrSerGluValThrProTyrHisVal

354045

ThrSerValTrpThrLysGlyValThrProProAlaAsnPheThrGln

505560

GlyGluAspValPheHisAlaProTyrValAlaAsnGlnGlyTrpTyr

65707580

AspIleThrLysThrPheAsnGlyLysAspAspLeuLeuCysGlyAla

859095

AlaThrAlaGlyAsnMetLeuHisTrpTrpPheAspGlnAsnLysAsp

100105110

GlnIleLysArgTyrLeuGluGluHisProGluLysGlnLysIleAsn

115120125

PheAsnGlyGluGlnMetPheAspValLysGluAlaIleAspThrLys

130135140

AsnHisGlnLeuAspSerLysLeuPheGluTyrPheLysGluLysAla

145150155160

PheProTyrLeuSerThrLysHisLeuGlyValPheProAspHisVal

165170175

IleAspMetPheIleAsnGlyTyrArgLeuSerLeuThrAsnHisGly

180185190

ProThrProValLysGluGlySerLysAspProArgGlyGlyIlePhe

195200205

AspAlaValPheThrArgGlyAspGlnSerLysLeuLeuThrSerArg

210215220

HisAspPheLysGluLysAsnLeuLysGluIleSerAspLeuIleLys

225230235240

LysGluLeuThrGluGlyLysAlaLeuGlyLeuSerHisThrTyrAla

245250255

AsnValArgIleAsnHisValIleAsnLeuTrpGlyAlaAspPheAsp

260265270

SerAsnGlyAsnLeuLysAlaIleTyrValThrAspSerAspSerAsn

275280285

AlaSerIleGlyMetLysLysTyrPheValGlyValAsnSerAlaGly

290295300

LysValAlaIleSerAlaLysGluIleLysGluAspAsnIleGlyAla

305310315320

GlnValLeuGlyLeuPheThrLeuSerThrGlyGlnAspSerTrpAsn

325330335

GlnThrAsn

<210>3

<211>1020

<212>DNA

<213>酿脓链球菌(S.Pyogenes)

<400>3

atgagaaaaagatgctattcaacttcagctgcagtattggcagcagtgactttatttgtt60

ctatcggtagatcgtggtgttatagcagatagtttttctgctaatcaagagattagatat120

tcggaagtaacaccttatcacgttacttccgtttggaccaaaggagttactcctccagca180

aacttcactcaaggtgaagatgtttttcacgctccttatgttgctaaccaaggatggtat240

gatattaccaaaacattcaatggaaaagacgatcttctttgcggggctgccacagcaggg300

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aattccgctggaaaagtagctatttctgctaaagaaataaaagaagataatattggtgct960

caagtactagggttatttacactttcaacagggcaagatagttggaatcagaccaattaa1020

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgttacttccgtttggatccaagg24

<210>5

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<212>DNA

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

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<210>7

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cggaattcttaattggtctgattccaac28

<210>8

<211>8

<212>PRT<213>人类(Homosapiens)

<400>8

GlyProSerValPheLeuPhePro

15

Claims (3)

1.IdeS多肽在制备用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的用途，所述IdeS多肽包括：SEQIDNO:1的氨基酸序列。

2.根据权利要求1的用途，其中所述多肽由SEQIDNO:1中所示的序列组成。

3.一种处理离体血液的用于非治疗目的的方法，所述血液取自于患有类风湿性关节炎的患者，所述方法包括使所述血液与权利要求1中限定的IdeS多肽接触。