CN101228921A - 一种饲用复合阿魏酸酯酶添加剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其包含阿魏酸酯酶、纤维素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶四种酶，其中内切纤维素酶活为≥16U/g，木聚糖酶活为≥1024U/g，β－葡聚糖酶酶活为≥2.0U/g，阿魏酸酯酶酶活≥2.0U/g。本发明的饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，可显著提高牧草、农作物秸秆以及糠麸类饲料酶解过程中还原糖释放量、细胞壁降解率以及瘤胃发酵挥发性脂肪酸的产生量，全面提高饲料的生物学转化效率。在饲料工业和反刍动物养殖业中具有很高的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种饲用复合酶制剂，具体地说，涉及一种促进饲料细胞壁降解的饲用复合阿魏酸酯酶添加剂及其使用方法。
背景技术
阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，也被称为肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖之间酯键的一类酶，其催化的主要反应为：多糖-阿魏酸酯+H2O＝阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。阿魏酸酯酶在造纸、食品、制药及饲料工业有很广泛的应用空间。饲草、农作物秸秆、糠麸类饲料干物质中含有高达30～80％为细胞壁成分，然而，由于细胞壁中木质素的存在使得反刍动物对这些饲料的消化能力十分有限。而阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上增加瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测认为是消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。
目前，市场所销售的饲用复合酶制剂多以纤维素酶、木聚糖酶为主要成分，尽管在这些饲用酶制剂在单胃动物上得到了广泛的应用，但其在反刍动物的饲养实践中的应用效果至今未能被普遍认可和应用。究其主要原因，首先是没有结合反刍动物瘤胃发酵特性，来合理选择合适的酶种类和酶活配伍参数；其次，没有发现或忽略了消除饲料细胞壁中木质素的包括阿魏酸酯酶在内的侧链水解酶的功效；再者是没有确定合适的添加比例和使用方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进饲料细胞壁降解的饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，可显著提高牧草、农作物秸秆以及糠麸类饲料酶解过程中还原糖释放量、细胞壁降解率以及瘤胃发酵挥发性性脂肪酸的产生量，全面提高饲料的生物学转化效率。
本发明的另一目的是提供一种饲用复合阿魏酸酯酶添加剂的使用方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其包含阿魏酸酯酶、纤维素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶四种酶，其中内切纤维素酶活为≥16U/g，木聚糖酶活为≥1024U/g，β-葡聚糖酶酶活为≥2.0U/g，阿魏酸酯酶酶活≥2.0U/g。
其中，所述阿魏酸酯酶：固体，粉末状(过200目筛)。酶活要求：以100μM阿魏酸甲酯溶液为底物，所测的阿魏酸酯酶酶活不低于4U/g(酶活单位定义：39℃反应温度，pH为6.0条件下，酶解反应时间30分钟后，每克酶制剂每分钟释放1μmolρ-硝基酚阿魏酸定义为1个酶活单位)。
所述纤维素酶：固体，粉末状(过200目筛)。酶活要求①：以2％(w/v)中性黏度羧甲基纤维素为底物，所测得的内切纤维素酶酶活不低于5000U/g(酶活单位定义：39℃反应温度，pH为6.0条件下，酶解反应时间30分钟后，每克酶制剂每分钟释放1μmol葡萄糖定义为1个酶活单位)；酶活要求②：以2％(w/v)微晶纤维素为底物，所测得的外切纤维素酶酶活不低于10U/g(酶活单位定义：39℃反应温度，pH为6.0条件下，酶解反应时间10分钟后，每克酶制剂每分钟释放1μmol葡萄糖定义为1个酶活单位)。
所述木聚糖酶：固体，粉末状(过200目筛)。酶活要求：以2％(w/v)桦树木聚糖为底物，所测得的木聚糖酶酶活不低于10000U/g(酶活单位定义：39℃反应温度，pH为6.0条件下，酶解反应时间15分钟后，每克酶制剂每分钟释放1μmol木糖定义为1个酶活单位)。
所述β-葡聚糖酶：固体，粉末状(过200目筛)。酶活要求：以1.0mM ρ-硝基-β-D-葡萄糖溶液为底物，所测的β-葡聚糖酶酶活不低于1000U/g(酶活单位定义：39℃反应温度，pH为6.0条件下，酶解反应时间15分钟后，每克酶制剂每分钟释放1μmol ρ-硝基酚定义为1个酶活单位)。
本发明饲用复合阿魏酸酯酶添加剂的酶制剂原料及其重量百分配比包括5-20％纤维素酶、10-38％木聚糖酶、1-20％葡聚糖酶和22-80％阿魏酸酯酶。
本发明饲用复合阿魏酸酯酶添加剂按照内切纤维素酶活为≥16U/g、木聚糖酶活为≥1024U/g、β-葡聚糖酶酶活为≥2.0U/g、阿魏酸酯酶酶活≥2.0U/g的要求，取各酶制剂原料进行混合均匀而成。
本发明所用的各原料均可以市售获得。
本发明饲用复合阿魏酸酯酶添加剂适用的饲料种类包括牧草类、农作物秸秆类和糠麸类等高纤维性植物来源的饲料或配合饲料。如经过粉碎的羊草、苜蓿干草、玉米秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆、小麦麸皮、米糠、玉米皮、玉米纤维饲料等。
使用方法：对牧草类饲料，可以用水稀释后直接均匀喷洒在饲料表面，复合阿魏酸酯酶的添加比例不低于0.5％；对农作物秸秆类饲料，进行铡短(长度不大于5厘米)处理后，直接喷洒饲料表面或与饲料混合，复合阿魏酸酯酶添加比例不低于1％；对糠麸类饲料，直接混合使用，复合阿魏酸酯酶添加比例不低于0.2％；对混合配合饲料，直接混合使用，复合阿魏酸酯酶添加比例不低于0.1％。
本发明选择合适的酶制剂原料，并将阿魏酸酯酶与纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶按照一定的酶活配伍要求进行混合均匀后，过筛制备形成复合阿魏酸酯酶添加剂，使用时将此添加剂按照本发明要求的比例采用本发明推荐的使用方法添加到动物的饲料中后，即可提高饲料的生物学转化效率。
本发明的促进饲料转化的饲用复合酯酶添加剂通过酶解实验、瘤胃发酵实验获得了满意的应用效果，证明该酶制剂可显著促进饲料降解后还原糖的释放量的增加、瘤胃微生物发酵饲料代谢产物的增加，有利于开发反刍动物专用新型饲用复合阿魏酸酯酶。本发明在饲料工业和反刍动物养殖业中具有较高的实际应用价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 复合阿魏酸酯酶添加剂制备
第一步：选择四种酶制剂原料如表1所列，并对这四种酶制剂(编号分别为E12，E7，E16，E8)原料的各种酶活进行实测后结果见表1。E12为纤维素酶，实测外切纤维素酶酶活＞5000U/g，E7为木聚糖酶，实测木聚糖酶酶活＞10000U/g，E16为β-葡聚糖酶，实测β-葡聚糖酶酶活＞1000U/g，E8为阿魏酸酯酶，实测阿魏酸酯酶酶活＞4U/g。以上原料符合本发明要求的酶制剂酶活要求。
表1.四种商品酶制剂原料的不同酶活实测结果(U/g)
| 编号 | 商品酶名称 | CMCase | SCELL | BX | BG | FAE |
| E12E7E16E8 | 纤维素酶木聚糖酶β-葡聚糖酶阿魏酸酯酶 | 6789.46137.2637.8106.1 | 18.150.916.71.8 | 2588.451959.4786.7744.3 | 702.04296.01303.4603.0 | 0.740.0010.614.14 |
CMCase：内切纤维素酶酶；SCELL：外切纤维素酶；BX：桦树木聚糖酶；BG：β-葡聚糖酶；FAE：阿魏酸酯酶。
第二步：根据酶活配伍要求，内切纤维素酶活为≥16U/g、木聚糖酶活为≥1024U/g、β-葡聚糖酶酶活为≥2.0U/g、阿魏酸酯酶酶活≥2.0U/g时，建立如下的多元线性方程组：
纤维素酶：6789.4X12+6137.2X7+637.8X16+106.1X8≥16 式1
木聚糖酶：2588.4X12+51959.4X7+786.7X16+774.3X8≥1024 式2
β-葡聚糖酶：702.0X12+4296X7+1303.4X16+603X8≥16 式3
阿魏酸酯酶：0.74X12+0.001X7+0.61X16+4.14X8≥16 式4
添加比例合计：X12+X7+X16+X8＝1 式5
对上述多元方程组进行线性规划求解，即可计算获得制备复合阿魏酸酯酶所需要的E12，E7，E16，E8酶的添加比例(X12，X7，X16，X8)分别为：5％，34.9％，14.9％，45.2％(重量百分含量)。
第三步：按照上述比例称取并混合各种原料即制备获得符合本发明酶活配伍要求的复合酯酶添加剂(外切纤维素酶2622U/g，木聚糖酶18697U/g，β-葡聚糖酶2000U/g，阿魏酸酯酶2U/g)。使用内衬薄膜编织袋进行封装，避光室温(不高于20℃)保存。
试验例1.复合阿魏酸酯酶可以促进饲料酶解过程中还原糖的释放量
按照表2中的酶活配伍要求，制备9种不同组合的复合阿魏酸酯酶后，小心称取待测玉米秸秆饲料底物10g，放入1.5ml的EP管中(管盖上扎一小孔)。各种固体酶制剂用柠檬酸-磷酸盐缓冲液(0.05M，pH＝6.0)直接配置成1‰的溶液(稀释1000倍)，然后在各种EP管中加入200μL稀释复合酯酶酶液，每种酶3个重复，同时设三个底物空白。然后向加入200μL缓冲液，酶空白按照酶活性测定中的值相应扣去。然后把所用的EP管放入生化培养箱39℃酶解24h，然后加入0.5mL 3，5-二硝基水杨酸溶液中止酶解，沸水显色5min，然后取200μL加入酶标板中(颜色深则用蒸馏水稀释)，放入酶标仪540nm读板。还原糖的释放量根据葡萄糖的标准曲线计算获得。
表2.不同复合阿魏酸酯酶对玉米秸秆24小时酶解还原糖释放量的影响
| 试验编号 | 酶活配伍水平(U/g) | 还原糖释放(ug) | |||
| 阿魏酸酯酶 | 木聚糖酶 | 纤维素酶 | β-葡聚糖酶 | ||
| 1234567 | 0.0020.0020.0020.1250.1250.1252 | 16256102416256102416 | 216512216512512 | 283232288 | 367.7±9.1849.5±21.2738.5±8.5533.4±66.4563.0±48.8463.3±1.11494.4±15.1 |
| 89 | 22 | 2561024 | 216 | 322 | 1237.6±48.01538.2±38.6 |
由表2结果可知，阿魏酸酯酶最高浓度水平(2U/g)的阿魏酸酯酶组合均明显高于其它低浓度水平组合，与中等浓度水平和低浓度水平组合相比，还原糖释放量分别提高173％和118％。但是其中等浓度水平组合的效果却低于其低浓度组合。最大的还原糖释放组合为：阿魏酸酯酶2U/g，木聚糖酶1024U/g，纤维素酶16U/g，β-葡聚糖酶2U/g。
试验例2.复合阿魏酸酯酶可以促进饲料瘤胃微生物发酵过程中饲料瘤胃降解率和挥发性脂肪酸代谢产物的释放量
选取玉米秸秆、苜蓿干草等为饲料底物，称取100mg待测上述饲料底物放入尼龙袋(4×4cm)中，每种酶制剂3个袋子，经热封后称重。加入400μL稀释后复合酯酶酶液(空白对照加入400μL缓冲液)，酶添加比例为0.1％(按实施例1的配方)，然后将尼龙袋放入试管底部(20mL)，接种前放入39℃培养箱中16h。晨饲前，通过瘤胃瘘管采集肉牛(日饲喂2Kg精料和2Kg羊草/天)的瘤胃液各500mL，倒入已预热并充满CO2的保温瓶中，立即带回实验室处理。接种前四层纱布过滤，弃去残渣。厌氧培养液的配制(1L溶液含NaHCO3 8.75g，NH4HCO3 1.00g，Na2HPO4 1.43g，KH2PO4 1.55g，MgSO4.7H2O 0.15g，Na2S 0.52g，MnCl2.4H2O 0.015g，CoCl3.6H2O0.002g，FeCl3.6H2O 0.012g，CaCl2.2H2O 0.017g，刃天青1.25mg)，配制后高压灭菌代用。使用前冲入CO2至pH＝7.0，并预热39℃。实验时，每个试管中加入12mL接种液(瘤胃液∶厌氧培养液＝1∶2)，充入CO2数秒后，立即用胶塞密封，放入生化培养箱培养。自不同培养时间点取出袋子用清水洗涤至无色为止，然后放入烘箱烘24h(60℃)，干燥皿中平衡后称重。饲料底物表观消化率＝减少的待测饲料重量/初始重。取部分发酵液测定瘤胃微生物挥发性脂肪酸产生量。
表3.复合阿魏酸酯酶对不同瘤胃培养时间的玉米秸秆和苜蓿体外表观降解率(％)的影响
| 饲料种类 | 培养时间(h) | ||||
| 12 | 24 | 48 | 72 | ||
| 玉米秸秆 | 对照组复合阿魏酸酯酶 | 5.7±1.113.4±1.1 | 6.8±0.514.8±0.7 | 9.1±1.016.5±0.5 | 13.6±2.518.6±1.3 |
| 苜蓿干草 | 对照组复合阿魏酸酯酶 | 6.3±0.710.3±0.6 | 7.3±0.711.4±0.6 | 9.2±0.813.9±0.3 | 10.8±1.415.6±0.5 |
复合阿魏酸酯酶添加后，不同培养时间点的饲料降解率见表3。0.1％比例添加复合阿魏酸酯酶可显著提高两种饲料底物的降解率。对玉米秸秆而言，复合酯酶添加可提高饲料瘤胃降解率至少在36％以上，对苜蓿干草，则可提高至少在44％以上。
表4.复合阿魏酸酯酶添加对不同种类饲料瘤胃体外挥发性脂肪酸产生量(mmol/L)的影响
| 培养时间点 | 水稻秸秆 | 玉米秸秆 | 米糠 | 小麦麸 | 玉米皮 | |||||
| +ENZ | -ENZ | +ENZ | -ENZ | +ENZ | -ENZ | +ENZ | -ENZ | +ENZ | -ENZ | |
| 6122448 | 19.7921.7433.3952.96 | 23.9227.2629.8144.51 | 35.9034.7745.4256.40 | 37.6934.7449.4855.74 | 33.4162.5269.4071.17 | 26.8237.3248.6552.10 | 25.5332.8138.8848.78 | 28.9035.4135.5344.95 | 23.1341.5551.4272.03 | 35.0037.2047.3258.02 |
a-ENZ＝不加酶；+ENZ＝复合阿魏酸酯酶添加组，添加比例为0.1％。
进一步对瘤胃发酵液挥发性脂肪酸产生量进行分析测试结果表明，0.1％比例添加复合阿魏酸酯酶可显著提高各种挥发性脂肪酸和总挥发性脂肪酸的生成量。添加阿魏酸酯酶，在糠麸类饲料细胞壁降解中功效更显著高于秸秆类饲料(8.9％vs 4.8％)。
以上结果综合表明，复合阿魏酸酯酶可以与瘤胃微生物协同，提高饲料瘤胃降解速率36％以上，刺激瘤胃微生物的生长繁殖，提高饲料分解后宿主动物所必需的生糖和脂肪合成前体物质挥发性脂肪酸的产生量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (11)
1.一种饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其特征在于，其包含阿魏酸酯酶、纤维素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶四种酶，其中内切纤维素酶活为≥16U/g，木聚糖酶活为≥1024U/g，β-葡聚糖酶酶活为≥2.0U/g，阿魏酸酯酶酶活≥2.0U/g。
2.根据权利要求1所述的饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的酶活要求：以100μM阿魏酸甲酯溶液为底物，所测的阿魏酸酯酶酶活不低于4U/g。
3.根据权利要求1或2所述的饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其特征在于，所述纤维素酶的酶活要求①：以2％(w/v)中性黏度羧甲基纤维素为底物，所测得的内切纤维素酶酶活不低于5000U/g；酶活要求②：以2％(w/v)微晶纤维素为底物，所测得的外切纤维素酶酶活不低于10U/g。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其特征在于，所述木聚糖酶的酶活要求：以2％(w/v)桦树木聚糖为底物，所测得的木聚糖酶酶活不低于10000U/g。
5.根据权利要求1-4任意一项所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其特征在于，所述β-葡聚糖酶的酶活要求：以1.0mM ρ-硝基-β-D-葡萄糖溶液为底物，所测的β-葡聚糖酶酶活不低于1000U/g。
6.根据权利要求1-5任意一项所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂，其特征在于，所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂包括5-20％纤维素酶、10-38％木聚糖酶、1-20％葡聚糖酶和22-80％阿魏酸酯酶。
7.权利要求1-6任意一项所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂在用于牧草类、农作物秸秆类和糠麸类高纤维性植物来源的饲料或配合饲料中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用于牧草类饲料时，所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂的添加比例不低于0.5％。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用于农作物秸秆类饲料时，所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂的添加比例不低于1％。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用于糠麸类饲料时，所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂的添加比例不低于0.2％。
11.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用于配合饲料时，所述饲用复合阿魏酸酯酶添加剂的添加比例不低于0.1％。
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