CN101220332B - 利用飞秒激光进行神经损伤与再生修复的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明采用飞秒激光双光子诱发的光刀效应和高光子密度诱导的光镊梯度力作用进行微纳操纵，适用于多种生物细胞的损伤和再生修复的研究。其由激光发生系统、外光路系统、高精度成像系统以及软件控制系统组成。该激光发生系统包括并列的两支，一支由锁模旋钮和飞秒激光器依次组成，另一支由数字延迟/脉冲信号发生器和再生放大器依次组成。外光路系统由双分支光路和半透半反镜、光闸和扩束镜依次组成。双分支光路包括两部分，一部分由可移动凸透镜、固定凸透镜、可旋转全反镜和衰减镜依次组成，另一支为一个衰减镜。该装置可以实现神经细胞纳米损伤及再生研究的全过程，可采用飞秒光镊实现轴突再生过程中超精密的靶位选择。
Description
技术领域
本发明是一种细胞生物学技术，特指一种利用飞秒激光进行神经损伤与再生修复的方法及装置，其采用飞秒激光双光子诱发的光刀效应和高光子密度诱导的光镊梯度力作用进行微纳操纵，适用于多种生物细胞的损伤和再生修复的研究。
背景技术
随着细胞生物学和分子生物学的飞速发展，神经细胞的损伤与再生的研究重点转移到了探讨调节神经再生的局部或整体的生物学因素，神经元的存活、生长、分化、神经再生、突触形成与突触可塑性以及神经退行性疾病的研究已成为目前神经科学领域中的热点之一。
迄今为止，脊椎动物中枢神经损伤后的再生问题还是神经科学领域的一个重大未解难题。越来越多的研究表明，并不是中枢神经元内在的特性使其不能修复再生，若置于合适的微环境中，受损伤神经元轴突是可以再生的。早在上世纪80年代初，Ricbardaom等利用束路追踪技术，令人信服地证明了成年哺乳动物中枢神经元的受损轴突确实能够在移植的外周神经中再生。1998年，Schw ab等从神经细胞轴突的髓鞘中提取出了NI-35、NI-250、bNI220等具有抑制神经再生活性的髓鞘膜蛋白并命名为Nogo基因。2001年，Alyson等在Nature杂志上报道了通过研究发现一种对Nogo具有高度亲合力的轴突受体，这一发现首次为了解Nogo的作用基础提供了线索，破坏Nogo与Nogo-66受体的相互作用，可能会促进轴突的再生。2005年，Yong在Nature系列杂志的Neuroscience刊登了一篇关于基质金属蛋白酶与中枢神经系统神经再生的综述，他认为基质金属蛋白酶是中枢神经系统发育和损伤后神经形成和轴突再生的调控因子，对中枢神经系统损伤后神经功能的恢复起着决定性的作用。
近年来，在神经科学领域，为了提高神经再生速度和进一步优化轴突再生条件，已广泛开展了旨在探求轴突生长的影响因素、轴突寻路和致靶过程中轴突投射的准确性和靶位选择精确性的研究。目前的研究一直都只局限在对复杂的生物有机体的不精确的轴索显微外科术。2004年，斯坦福大学Ginzton实验室的Mehmet Fatih Yanik等人在Nature杂志上报道了使用飞秒激光对线虫的神经细胞轴突进行外科手术，手术后这些轴突实现了功能性再生。飞秒激光轴突显微外科术是一种新型的技术手段，其效率100％、精度达到亚微米级、速度快。激光光镊技术是近年来发展起来的一种非接触的操纵技术，2005年，苏州大学朱天淳等人用激光光镊成功地引导了神经细胞的生长方向。作为一种新的引导神经细胞定向生长的方法，这将可能会对神经回路的构建以及神经的再生起到非常重要的作用。然而，采用飞秒光刀和光镊组合对神经细胞轴突的纳米损伤和再生修复进行的研究还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于突破了传统意义上各种细胞因子对于神经再生、突触形成影响的研究，提供一种飞秒激光三维纳米手术和三维空间纳米操纵的工作装置，该工作装置可以同时实现神经细胞轴突的纳米损伤和飞秒光镊辅助轴突再生的操作。它是一种集超快激光技术、高分辨成像技术、三维高精密扫描技术、软件控制技术于一体的神经损伤与再生技术。
本发明的技术解决方案如下：
实现本发明的装置由激光发生系统、外光路系统、高精度成像系统以及软件控制系统组成。该激光发生系统包括并列的两支，一支由锁模旋钮和飞秒激光器依次组成，另一支由数字延迟/脉冲信号发生器和再生放大器依次组成。外光路系统由双分支光路和半透半反镜、光闸和扩束镜依次组成。双分支光路包括两部分，一部分由可移动凸透镜、固定凸透镜、可旋转全反镜和衰减镜依次组成，另一支为一个衰减镜。高精度成像系统由白光源、显微物镜阵列、二向色镜、电子耦合组件和计算机依次组成。软件控制系统由计算机、高精度三维扫描平台和培养盒依次组成。
激光发生系统由两部分构成，一部分完成飞秒光镊和连续光镊的功能，另一部分完成飞秒光刀的功能。对于实现光镊功能的激光器来讲，在实验中需要连续激光时，只要取消锁模旋钮即可以实现连续的红外光镊；当需要飞秒激光时，可以启动锁模旋钮实现飞秒脉冲的红外光镊。对于实现飞秒光刀的激光器来讲，可以通过与激光器相连的数字延迟/脉冲信号发生器来选择输出激光的脉冲个数和重复频率。在飞秒光刀光路中，飞秒激光经过衰减镜实现对激光功率的衰减，以满足飞秒激光光致损伤和光刀的要求。在光镊光路中，飞秒激光经过衰减镜实现对激光功率的连续衰减，以满足飞秒激光光镊捕获的要求，两个凸透镜可以实现光镊和光刀系统的齐焦，可旋转全反镜实现对光镊和光刀系统焦点的重合调节。这两束光经过一个半透半反镜耦合到一个光路中，光闸用于控制激光的通断，选择性的在样品合适的位置曝光。然后经过一个扩束镜实现对光斑面积的扩增，后经过一个二向色镜将耦合的光束传输到的显微物镜阵列中将激光束聚焦到目标细胞上。软件控制系统一方面能够协调三维扫描平台的运动和光闸的开关，以实现激光焦点在目标细胞上的操作，另一方面可灵活地调整扫 描速度，改变曝光时间，以满足不同的要求。整个操作过程由电子耦合组件实时监控。
该装置是飞秒光镊和飞秒光刀的组合系统。飞秒光刀可以实现神经细胞轴突的纳米切割和局部损伤，飞秒光镊可以辅助受损的神经细胞轴突实现再生。因此，该装置可以实现神经细胞纳米损伤及再生研究的全过程，可以用于不同损伤程度对轴突再生的影响，采用飞秒光镊实现轴突再生过程中超精密的靶位选择。
与传统的神经细胞损伤与再生方法相比，本装置可以实现微损甚至是无损的纳米蚀除和光镊操作。飞秒激光脉冲具有极短的脉冲宽度和极高的峰值功率，飞秒激光脉冲与靶标的相互作用，具有极高的时间和空间分辨率，并可以高精度地控制作用能量。当飞秒激光光镊作用于细胞体或是细胞附近区域时，它具有非机械接触的优点，不会机械地损伤细胞膜及细胞器；同时，由于飞秒激光的高峰值功率具有非线性的特点，使其能够实现细胞膜和轴突的精确定位和避免激光传输过程中非焦点处引起的损伤。当飞秒激光光刀进行轴突的切割或局部损伤的时候，由于高强度飞秒激光引起的多光子效应可以在焦点处引起超高精度的损伤区域，实现尺寸小于波长的亚微米级或纳米级损伤，因此可以对神经细胞轴突产生最小的损伤，从而减小对神经细胞的结构和功能的破坏。
附图说明
图1飞秒激光光镊与手术神经细胞损伤与再生系统装置示意图。
1锁模旋钮，2飞秒激光器，3可移动凸透镜，4固定凸透镜，5可旋转全反镜，6衰减镜，7数字延迟/脉冲信号发生器，8再生放大器，9衰减镜，10半透半反镜，11光闸，12扩束镜，13二向色镜，14显微物镜阵列，15高精度三维扫描平台，16培养盒，17白光源，18电子耦合组件，19计算机。
具体实施方式
结合图1示例的飞秒激光光镊与手术神经细胞损伤与再生系统装置示意图对本发明的具体装置和神经损伤与再生方法的实施情况作如下说明：
实现超快光子神经损伤与再生的装置主要由激光发生系统、外光路系统、高精度成像系统以及软件控制系统依次组成。其中激光发生系统包括锁模旋钮1、飞秒激光器2、数字延迟/脉冲信号发生器7，再生放大器8。外光路系统包括可移动凸透镜3，固定凸透镜4，可旋转全反镜5，衰减镜6，衰减镜9，半透半反镜10，光闸11，扩束镜12，二向色镜13和显微物镜阵列14。高精度成像系统包括二向色镜13、显微物镜阵列14、白光源17、电子耦合组件18和计算机19。软件控制系统主要由计算机19、高精度三维扫描平台15和培养盒16组成。上述各组成元件依次连接构成飞秒激光光镊与手术神经细胞损伤与再生系统装置。该装置可以同 时实现飞秒光镊和飞秒光刀的功能。飞秒光刀功能由元件7、8、9、10、11、12、13、、14、15、16、17、18和19来实现，飞秒光镊功能由元件1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、、16、17、18和19来实现。飞秒光刀可以实现神经细胞轴突的纳米切割和局部损伤，飞秒光镊可以辅助受损的神经细胞轴突实现再生。
进行神经细胞的损伤和再生之前，首先打开光闸11，手动调节凸透镜3、4之间的距离和可旋转全反镜5的偏转，使得飞秒光镊产生的激光焦点和飞秒光刀产生的焦点在样品内重合。第二步，将盛有神经细胞的培养盒16夹持到高精度三维扫描平台15上，调节飞秒光刀光路中的衰减镜9得到合适的激光功率，设定计算机19的控制程序，使精调三维扫描平台15和光闸11协调运动，从而实现神经细胞轴突的切割或局部损伤。第三步，在培养液中添加聚乙二醇(PEG)和神经营养因子，促进神经细胞损伤轴突的再生。第四步，调节衰减镜6得到合适的激光功率，采用飞秒光镊诱导损伤处轴突的再生方向，激光焦点的位置正好在轴突损伤前方一点点的地方，以引导轴突内微管组成的细胞骨架在光镊驱动力的作用下跟着激光焦点移动生长，最后到达靶细胞位置。第五步，采用电子耦合组件18定时拍摄神经轴突再生修复的过程。
Claims (1)
1.利用飞秒激光进行神经损伤与再生修复的装置，其由激光发生系统、外光路系统、高精度成像系统以及软件控制系统组成，其特征在于该激光发生系统包括并列的两支，一支由锁模旋钮(1)和飞秒激光器(2)依次组成，另一支由数字延迟/脉冲信号发生器(7)和再生放大器(8)依次组成；外光路系统由双分支光路和半透半反镜(10)、光闸(11)和扩束镜(12)依次组成，双分支光路包括两部分，一部分由可移动凸透镜(3)、固定凸透镜(4)、可旋转全反镜(5)和衰减镜(6)依次组成，另一支为一个衰减镜(9)；高精度成像系统由白光源(17)、显微物镜阵列(14)、二向色镜(13)、电子耦合组件(18)和计算机(19)依次组成，软件控制系统由计算机(19)、高精度三维扫描平台(15)和培养盒(16)依次组成。
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