CN101219240B - 一种带通道的活体组织的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种带通道的活体组织的制备方法，属于组织和器官的人工制造技术领域。该方法首先将弹性高分子材料溶于有机溶剂，将细胞基质材料中加入细胞冻存液；把选定的细胞与含冻存液的细胞基质材料溶液混合均匀；用计算机设计带管道的活体组织模型，根据离散-堆积原理，利用快速成形设备按照计算机模型结构所规划的路径，将上述弹性高分子材料溶液、细胞-基质材料溶液的混合物通过不同的喷头挤压或喷射出来，形成带管道的弹性高分子材料、细胞基质材料的杂合体。然后在低温下泠藏或在液氮中长期冻存，复苏后可直接用于组织或器官的修复，有效避免了细胞在组装后若不及时使用就会出现的坏死现象。

Description

一种带通道的活体组织的制备方法

技术领域

本发明涉及一种活体组织的制备方法，特别涉及一种由弹性高分子材料、细胞-基质材料三维受控堆积成形制造活体组织器官前体的制备方法，属于组织和器官的人工制造技术领域。

背景技术

细胞组装技术是指将细胞、外基质材料和生长因子通过计算机辅助层层堆积，直接形成特定三维结构的技术，是当今生命科学、信息科学和制造科学相融合的新研究热点，其诞生的背景为组织工程，目前已朝着更系统、更深入的方向发展。

基于喷射和挤压的细胞组装技术，在实现高精度的复杂图案或三维结构，并保持细胞的生理活性上，将组织工程大大向前推进了一步，已引起国内外许多研究者的兴趣。最早进行激光直写研究的Odde D J[Odde DJ and Renn MJ.Laser-guided direct writing forthree-dimensional tissue engineering.Biotechnology And Bioengineering 2005；92(2)：129-136]，已把注意力投向开发基于雾化喷射的cell patterning技术，该技术能实现25um尺度的线宽，但细胞密度比较低，雾化时在喷嘴处较高的剪应力对细胞又会造成较大的损伤，同时也无法成形三维结构。基于喷墨打印的技术有Boland R的Cell Printing[Mironov V etal.Organ printing：computer aided jet-based 3D tissue engineering.TRENDS inBiotechnology 2003；21(4)：157161]，Hutmacher DW的3D printing[Hutmacher DW et al.Scaffold development using 3D printing with a starch-based polymer，Materials Science&Engineering C-Biomimetic And Supramolecular Systems，2002；20(1-2)：49-56]，Nakazawa K的microcontact printing等。基于微流连续挤出，有Landers R的Bio-Plotting，Sun W的Multi-nozzle deposition[Sun W et al.Multi-nozzle deposition forconstruction of 3D biopolymer tissue scaffolds，Rapid Prototyping Journal，2005；11(1)：9-17]，Geng L的A desktop rapid prototyping robot dispensing(RPBOD)system等，这些技术也有或多或少的缺陷，以Sun W的Multi-nozzle deposition为例，由于采用高频振动，在喷嘴处高频交变剪应力会对细胞产生较大杀伤，新加坡国立大学Geng L的RPBOD，也由于采用NaOH溶液作为chitosan的胶联剂，无法在成形过程中直接复合细胞，而且在支架成形后要经过多道工序去除支架残留的NaOH。

以上技术，者工艺过程对细胞有较大的损伤，细胞存活密度低，不能直接复合细胞成形，或者成形效率低，成形精度低，无法成形三难复杂的结构，实现细胞、外基质材料和生长因子的精确可控的空间定位。

中国发明专利“一种细胞-材料单元的三维受控堆积成形方法”(申请日：2004.11.12，公开号：CN1609210)，则克服了以上缺点，利用自制的Cell assembly组装机将软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、脂肪干细胞等多种细胞与细胞外基质成分等直接堆积成具有贯通管道的三维结构体，肝细胞在基质中可以存活一段时间并表达一定的生理功能，细胞与细胞之间已建立起连接，此技术的缺点是所组装的细胞-材料三维结构力学性能很差，细胞在组装后若不及时使用就会出现坏死状态、三维结构不能长期保存，与临床应用差距很大。

发明内容

本发明的目的是提供一种带通道的活体组织的制备方法，以克服所组装的细胞-材料三维结构力学性能较差，以及细胞在组装后若不及时使用就会出现坏死、不能长期保存的缺陷。

本发明的技术方案如下：

一种带通道的活体组织的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

1)将弹性高分子材料溶于有机溶剂中制成浓度为1～30％(w/v)的溶液；将一种或多种基质材料溶解于水、生理盐水、PBS溶液或细胞培养液中，制成基质材料溶液；所述的基质材料采用明胶、胶原、纤维蛋白原、层粘连蛋白、透明质酸、壳聚糖、琼酯糖、卡拉胶、蛋白多糖和海藻酸钠中的一种或几种；

2)在基质材料溶液中加入体积百分比为5％～50％的细胞冻存液，制备成室温条件下含有细胞冻存液的基质材料溶液，灭菌备用；

3)把选定的细胞加入到步骤2)中的含有细胞冻存液的基质材料溶液中，所述细胞与含有细胞冻存液的基质材料溶液按体积比为1～50％(v/v)的比例，制备成细胞基质材料的混合物；

4)将弹性高分子材料溶液和细胞冻存液的基质材料溶液分别装入两个喷头或针头中，根据离散-堆积原理和快速成形技术，根据预先设计的带通道的三维结构和计算机定义规划的路径，在温度为20℃～-20℃的无菌环境下，喷出离散的微滴、微片、微段或连续的微流，层层堆积形成弹性高分子材料与细胞基质材料的三维杂合体；

5)将形成的三维杂合体浸入预冷的凝血酶PBS溶液、戊二醛溶液或氯化钙溶液中，使细胞基质材料结构稳定后，再利用细胞冻存技术进行冷却，然后放入液氮中长期保存、备用。

本发明的上述方法中，所述的弹性高分子材料采用聚氨酯或聚酯。所述的基质材料中复合氨基酸、多肽、多糖、生长因子和基因片段中的一种或几种。所述的有机溶剂采用二甲基亚砜、1，4-二氧六环、甘油、乙二醇、乙酰胺、丙二醇或异丙醇中的一种或几种。细胞冻存液可采用二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺中的一种或几种。

本发明在已有的细胞组装技术的基础上，利用具有一定力学强度的弹性高分子材料、细胞基质材料和活体细胞的弹性高分子与细胞/基质材料以及细胞冻存液，构建成带通道的三维结构的活体组织，该活体组织既能跟体内血管或生物反应器相连接，又可以长期低温保存，在需要的时候可直接复苏后再应用，从而为组织器官的制备提供了一条有效的途径，具有十分广泛的应用前景。

具体实施方式

本发明提供的一种带通道的活体组织的制备方法，该制备方法可按如下步骤进行：

1)将弹性高分子材料溶于有机溶剂中制成浓度为1％～30％的溶液；将一种或多种基质材料溶解于水、生理盐水、PBS溶液或细胞培养液中，制成基质材料溶液；所述的基质材料采用明胶、胶原、纤维蛋白原、层粘连蛋白、透明质酸、壳聚糖、琼酯糖、卡拉胶、蛋白多糖和海藻酸钠中的一种或几种；在这些基质材料中还可复合氨基酸、多肽、多糖、生长因子、基因片段；弹性高分子材料可采用聚氨酯、聚酯，有机溶剂采用二甲基亚砜、1，4-二氧六环或异丙醇；

2)在基质材料溶液中加入体积百分比为5％～50％的细胞冻存液，制备成室温条件下含有细胞冻存液的基质材料溶液，灭菌备用；细胞冻存液可采用二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺中的一种或几种；

3)把选定的细胞加入到步骤2)中的含有细胞冻存液的基质材料溶液中，所述细胞与含有细胞冻存液的基质材料溶液按体积比为1～50％(v/v)的比例，制备成细胞基质材料的混合物；

4)将弹性高分子材料溶液和细胞冻存液的基质材料溶液分别装入两个喷头或针头中，根据离散-堆积原理和快速成形技术，根据预先设计的带管道的三维结构和计算机定义规划的路径，在温度为20℃～-20℃的无菌环境下，喷出离散的微滴、微片、微段或连续的微流，层层堆积形成弹性高分子材料与细胞基质材料的三维杂合体；

5)将形成的三维杂合体浸入预冷的凝血酶PBS溶液、戊二醛溶液或氯化钙溶液中，使细胞基质材料结构稳定后，再利用细胞冻存技术进行冷却，然后放入液氮中长期保存、备用。

实施例1：制备聚氨酯、脂肪干细胞/明胶/纤维蛋白原三维结构。具体的工艺步骤为：将聚氨酯溶于二甲基亚砜中，制成1％(w/v)的溶液；将纤维蛋白原和明胶这两种生物相容性很好的天然生物材料分别溶于PBS(phosphate-buffered saline)溶液中制成10％(w/v)和30％(w/v)的基质材料溶液，再按1∶1(v/v)比例混合均匀。然后按体积百分比加入5％(v/v)的二甲基亚砜；将脂肪干细胞与明胶/纤维蛋白原混合液混合均匀，得到脂肪干细胞-明胶-纤维蛋白原混合物；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述聚氨酯溶液与细胞/基质材料分别装入两个喷头或针头中，通过微滴喷射的方法在无菌成形室中(20℃)下逐层堆积，形成聚氨酯、脂肪干细胞-明胶-纤维蛋白原三维结构体。将三维结构体在4℃下放置半小时，然后浸入预冷的凝血酶PBS溶液(100IU/mL)中，直接投入液氮中长期保存。等使用时可将其中细胞复苏，直接与体内的血管系统接合、进行组织或器官替代。

实施例2：制备聚氨酯、骨髓干细胞/明胶/纤维蛋白原/海藻酸钠三维结构。具体的工艺步骤为：将聚氨酯溶于1，4-二氧六环中，制成30％(w/v)溶液；将纤维蛋白原、明胶、海藻酸钠分别溶于PBS溶液中制成2％、20％和30％的基质材料溶液，再按1∶1∶1(v/v)比例混合均匀。然后按体积百分比加入50％(v/v)的甘油和二甲基亚砜(1∶1v/v)的混合液；将骨髓干细胞与含冻存液(甘油和二甲基亚砜)的明胶/纤维蛋白原/海藻酸钠溶液混合均匀，得到骨髓干细胞-明胶-纤维蛋白原混合物；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述聚氨酯溶液与细胞/基质材料分别装入两个喷头或针头中，通过微滴喷射的方法在无菌成形室中利用低温(-20℃)逐层堆积，形成聚氨酯、骨髓干细胞-明胶-纤维蛋白原三维结构体。然后将成形结构体浸入再浸入浓度为3％氯化钙溶液中3分种，再浸入凝血酶PBS溶液(10IU/mL)中5分钟，直接投入液氮中长期保存、备用。

实施例3：制备聚酯(如乳酸与乙醇酸共聚物PLGA)溶于二甲基亚砜与1，4二氧六环混合液中，制成5％(w/v)溶液；将胚胎干细胞与肝细胞与1∶1(v/v)比例混合在一起，然后按体积百分比加入10％的细胞冻存液[如Hanks溶液加入20.5％二甲基亚砜(w/v)，15.5％乙酰胺(w/v)，10％丙二醇(Mr＝8000)，用2mol/L的NaOH溶液调PH值至7.4]的30％(w/v)的明胶PBS溶液混合。根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述PLGA溶液与细胞/基质材料分别装入两个喷头或针头中，通过微滴喷射的方法在无菌成形室中利用低温(-18℃)逐层堆积，形成PLGA、胚胎干细胞-明胶三维结构体。然后将成形结构体浸入预冷的0.5％的戊二醛溶液中30秒钟，取出后直接投入液氮中长期保存、复苏、备用。

实施例4：制备聚氨酯、脂肪干细胞/明胶/纤维蛋白原/内皮细胞生长因子三维结构。具体的工艺步骤为：将聚氨酯溶于乙二醇中，制成10％(w/v)溶液，再加入5％(v/v)的甘油；将纤维蛋白原、明胶分别溶于PBS溶液中制成2％、20％的高分子溶液，再按1∶1(v/v)比例混合均匀，加入1‰(w/v)内皮细胞生长因子。然后按体积比加入10％(v/v)的甘油和10％(v/v)二甲基亚砜；将脂肪干细胞与明胶/纤维蛋白原/内皮细胞生长混合物混合均匀，得到脂肪干细胞-明胶-纤维蛋白原-内皮细胞生长混合物；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述聚氨酯溶液与细胞/基质材料分别装入两个喷头或针头中，通过微滴喷射的方法在无菌成形室中利用低温(-20℃)逐层堆积，形成PU、脂肪干细胞-明胶-纤维蛋白原三维结构体。然后将成形结构体浸入再浸入3％氯化钙溶液中3分种，再浸入凝血酶PBS溶液(10IU/mL)中5分钟，直接投入液氮中长期保存、备用。

实施例5：制备的聚氨酯、脂肪干细胞/明胶/卡拉胶/平滑肌细胞生长因子三维结构。具体的工艺步骤为：将聚氨酯PU溶于乙二醇中，制成20％(w/v)溶液，再加入5％(v/v)的甘油；将卡拉胶、明胶分别溶于PBS溶液中制成2％、20％的高分子溶液，再按1∶1(v/v)比例混合均匀，加入‰(w/v)内皮细胞生长因子。然后按体积百分比加入50％(v/v)的甘油和10％(v/v)二甲基亚砜；将脂肪干细胞与明胶/纤维蛋白原/平滑肌细胞生长混合物混合均匀，得到脂肪干细胞-明胶-纤维蛋白原-平滑肌细胞生长混合物；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述PU溶液与细胞/基质材料分别装入两个喷头或针头中，通过微滴喷射的方法在无菌成形室中利用低温(-20℃)逐层堆积，形成PU、脂肪干细胞-明胶-纤维蛋白原三维结构体。然后将成形结构体浸入预冷的0.5％的戊二醛溶液中50秒钟，直接投入液氮中长期保存、备用。

Claims (4)

1.一种带通道的活体组织的制备方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

1)将弹性高分子材料溶于有机溶剂中制成重量与体积百分比浓度为1～30％的溶液；将一种或多种基质材料溶解于水、生理盐水、PBS溶液或细胞培养液中，制成基质材料溶液；所述的基质材料采用明胶、胶原、纤维蛋白原、层粘连蛋白、透明质酸、壳聚糖、琼酯糖、卡拉胶、蛋白多糖和海藻酸钠中的一种或几种；所述的弹性高分子材料采用聚氨酯或乳酸与乙醇酸共聚物PLGA；

2)在基质材料溶液中加入体积百分比为5％～50％的细胞冻存液，制备成室温条件下含有细胞冻存液的基质材料溶液，灭菌备用；

3)把选定的细胞加入到步骤2)中的含有细胞冻存液的基质材料溶液中，所述细胞与含有细胞冻存液的基质材料溶液按体积百分比为1～50％的比例，制备成细胞基质材料的混合物；

4)将弹性高分子材料溶液和步骤3)中制成的细胞基质材料的混合物分别装入两个喷头或针头中，根据离散-堆积原理和快速成形技术，根据预先设计的带通道的三维结构和计算机定义规划的路径，在温度为20℃～-20℃的无菌环境下，喷出离散的微滴、微片、微段或连续的微流，层层堆积形成弹性高分子材料与细胞基质材料的三维杂合体；

5)将形成的三维杂合体浸入预冷的凝血酶PBS溶液、戊二醛溶液或氯化钙溶液中，使细胞基质材料结构稳定后，再利用细胞冻存技术进行冷却，然后放入液氮中长期保存、备用。

2.按照权利要求1所述的带通道的活体组织的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂采用二甲基亚砜、1，4-二氧六环、甘油、乙二醇、乙酰胺、丙二醇和异丙醇中的一种或几种的混合。

3.按照权利要求1所述的带通道的活体组织的制备方法，其特征在于：所述的细胞冻存液采用二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇和乙酰胺中的一种或几种。

4.按照权利要求1所述的带通道的活体组织的制备方法，其特征在于：所述的基质材料中复合氨基酸、多肽、多糖、生长因子和基因片段中的一种或几种。