CN101216449A - 识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为了克服现有方法中存在的繁琐、费时或误差较大，难于区别死细胞和活细胞，且不能在线监测等问题，提供了一种识别死－活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，该方法是按下述步骤实现的：以自制的石墨粉－环氧树脂固态碳糊为基础电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝为对极的三电极系统下，在－0.45～1.0V电位范围内置于含有苯胺的硫酸溶液中，以50mV.s－1进行循环伏安扫描，在石墨粉－环氧树脂固态碳糊电极上，电化学聚合苯胺，获得聚苯胺修饰电极；再对获得的聚苯胺修饰电极做电化学处理获得识别死－活细胞的聚苯胺修饰电极。优点：制备方法简单易得，操作方便，实验条件温和；获得的修饰电极可用于死－活细胞的识别和筛选分离；可用于活细胞的计数；由于电极对活细胞的可逆吸附，可用于细胞生长或使用过程的实时监测。
Description
技术领域：
本发明涉及与细胞相关的生物材料领域以及生物电化学领域，特别涉及一种用于识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，该方法制得的电极可应用于细胞的电化学计数、细胞生长过程的电化学监测，细胞的电化学研究以及细胞的电化学识别等领域。
背景技术：
贴壁生长在电极上的细胞形状和运动状态的变化都会引起贴壁界面阻抗的变化，Giaever等人根据细胞这一贴壁界面电特性设计了能实时、连续、定量跟踪哺乳动物细胞形状变化的细胞形状分析传感器。鉴于对有关哺乳动物胚胎细胞计数方法的专门报道很少，且在实验室应用的细胞计数方法都存在一定缺点，如①空气晾干制片，缺点是不适合于大的囊胚(如嵌合囊胚)的计数，因为这时的卵裂球不易扩散。②荧光染色法，操作较为复杂，但是准确、应用范围广，而且可以随时镜检，减少胚胎的丢失。但须用荧光显微镜。③压片法，这种方法先压片后固定染色，易造成胚胎丢失，而且盖玻片压得过紧，胚胎不易染色。④放射性元素标记法，此法对胚胎卵裂球数目的增加有妨碍，比正常胚胎至少降低一半。所以此方法应用较少。而在食品发酵和制药发酵工业中，细菌总数是控制发酵程度的重要参数之一.在环境监测和食品分析中，细菌总数也是一个很重要的微生物学监测指标.微生物及动物活细胞的检测，通常采用菌落法、比浊法、镜检法、阻抗法等，这些方法大都繁琐、费时或误差较大，难于区别死细胞和活细胞，且不能在线监测。识别微生物通常是基于菌落法(使用选择性培养基)或镜检法，也同样需要非常麻烦和长时间的操作。由于水中的病毒含量很低，加之环境水体中成份复杂，因而常规的方法检出率很低。
发明内容：
本发明为了克服上述方法中存在的大都繁琐、费时或误差较大，难于区别死细胞和活细胞，且不能在线监测等问题，提供了一种识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，该方法是按下述步骤实现的：以自制的石墨粉-环氧树脂固态碳糊为基础电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝为对极的三电极系统下，在-0.45～1.0V电位范围内置于含有苯胺的硫酸溶液中，以50mV.s-1进行循环伏安扫描，在石墨粉-环氧树脂固态碳糊电极上，电化学聚合苯胺，获得聚苯胺修饰电极；再对获得的聚苯胺修饰电极做电化学处理获得识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极。
本发明具有的优点：
(1)制备方法简单易得，操作方便，实验条件温和；
(2)获得的聚苯胺薄膜修饰电极可逆吸附活细胞，而死细胞无响应，可用于死-活细胞的识别和筛选分离；
(3)电极的电化学信号与细胞数量呈正比，可用于活细胞的计数；
(4)由于电极对活细胞的可逆吸附，可用于细胞生长或使用过程的实时监测.
附图说明
图1在修饰后的电极上加不同电位电解陈化所得循环伏安图；
图2细胞在电极上的可逆吸附的循环伏安图
其中：实线为基底曲线；虚线为吸附活细胞后曲线；
图3电极对死细胞和活细胞的不同循环伏安响应
其中：实线为基底曲线；虚线为吸附活细胞后曲线；
图4氧化峰电流与细胞浓度的线性关系。
具体实施方式：
识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，是按下述步骤实现的：以自制的石墨粉-环氧树脂固态碳糊为基础电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝为对极的三电极系统下，在-0.45～1.0V电位范围内置于含有苯胺的硫酸溶液中，以50mV.s-1进行循环伏安扫描，在石墨粉-环氧树脂固态碳糊电极上，电化学聚合苯胺，获得聚苯胺修饰电极；再对获得的聚苯胺修饰电极做电化学处理获得识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极。
所述以石墨粉-环氧树脂固态碳糊基础电极，是按石墨粉∶环氧树脂∶聚酰胺树脂＝8∶3∶1.5的比例混合后调匀；将铜线装入磨好的玻璃管内，使铜线端头距管底端4-5mm，从管底部向管内压入调好的石墨糊，压实，置于玻璃板上晾干，分别用240目、800目、1000目砂纸及硫酸纸磨电极，用环氧树脂固定电极引线，使用前超声洗涤2-5次，每次1-3min，保证电极表面清洁。
所述含有苯胺的硫酸溶液采用10mL的1.0mol.L-1硫酸水溶液与10mL0.5mol.L-1苯胺混合。
所述对获得的聚苯胺修饰电极做电化学处理，即在0.70恒电位下电解100秒后，取出电极，用超纯水清洗电极.置于0.1mol.L-1的磷酸缓冲溶液中做基底实验，连续两次扫描，获得重合的循环伏安曲线.
实施例
将石墨粉与环氧树脂聚和酰胺树脂按照重量比为8∶3∶1.5的比例混合调匀，填入打磨好的玻璃管中，从另一端插入铜线，铜线距管底端4-5mm，放置在阴凉干燥处晾干，分别用240目、800目、1000目砂纸打磨平整，并在硫酸纸上打磨呈镜面。石墨粉-环氧树脂固态电极，使用前经超声洗涤一次，约2min，保证电极表面清洁后备用。
将制好的石墨粉-环氧树脂固态电极置于10mL的0.5mol.L-1硫酸水溶液与10mL 0.5mol.L-1苯胺混合，通入高纯氮气除氧后，在饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对极，自制的石墨粉-环氧树脂固态碳糊电极为工作电极的三电极系统下，在-0.45～1.0V电位范围内，以50mV.s-1进行循环伏安扫描，直至循环伏安曲线上不出现峰为止.此时聚苯胺膜均匀，膜薄而致密，颜色呈淡黄色；将所得电极用去离子水清洗后，置于0.1mol.L-1的磷酸缓冲溶液中，在0.70V电位下氧化电解100秒，后进行循环伏安实验，参看图1，两圈扫描，曲线完全重合。
将制得的聚苯胺修饰电极置于0.1mol.L-1的磷酸缓冲液中作基底实验后，浸入细胞所在培养液中，十分钟后取出，放回到磷酸缓冲液中作循环伏安扫描，所得的循环伏安图，参看图2，吸附细胞后的电极在第一圈扫描中获得的伏安曲线在0.45伏处有一不可逆氧化峰，而在第二圈扫描时，伏安曲线与基底完全一致。此结果表明，氧化峰是吸附细胞的脱附峰，吸附是可逆的，吸附的细胞可以在电位扫描过程中脱附.
将电极置于含有死细胞的溶液中吸附10分钟后，进行循环伏安扫描，获得的循环伏安曲线，0.45伏处的氧化峰没有出现，参看图3，表明该电极具有识别死-活细胞的功能.
将细胞溶液进行稀释后，在相同的吸附时间下的氧化峰电流与细胞的含量呈线性关系，参看图4，表明该电极可以进行细胞的电化学计数.
Claims (4)
1.识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，是按下述步骤实现的：以自制的石墨粉-环氧树脂固态碳糊为基础电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝为对极的三电极系统下，在-0.45～1.0V电位范围内置于含有苯胺的硫酸溶液中，以50mV.s-1进行循环伏安扫描，在石墨粉-环氧树脂固态碳糊电极上，电化学聚合苯胺，获得聚苯胺修饰电极；再对获得的聚苯胺修饰电极做电化学处理获得识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极。
2.根据权利要求1所述的识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，其特征在于：所述以石墨粉-环氧树脂固态碳糊基础电极，是按石墨粉∶环氧树脂∶聚酰胺树脂＝8∶3∶1.5的比例混合后调匀；将铜线装入磨好的玻璃管内，使铜线端头距管底端4-5mm，从管底部向管内压入调好的石墨糊，压实，置于玻璃板上晾干，分别用240目、800目、1000目砂纸及硫酸纸磨电极，用环氧树脂固定电极引线，使用前超声洗涤2～5次，每次1-3min，保证电极表面清洁。
3.根据权利要求1所述的识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，其特征在于：所述含有苯胺的硫酸溶液采用10mL的1.0mol.L-1硫酸水溶液与10mL 0.5mol.L-1苯胺混合。
4.根据权利要求1所述的识别死-活细胞的聚苯胺修饰电极的制备方法，其特征在于：所述对获得的聚苯胺修饰电极做电化学处理，即在0.70恒电位下电解100秒后，取出电极，用超纯水清洗电极.置于0.1mol.L-1的磷酸缓冲溶液中做基底实验，连续两次扫描，获得重合的循环伏安曲线.
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