CN101209349A - 碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用。本发明中合成的氧化碳纳米管可以键合上不同的抗癌药物，键合后的药物分子可以透过细胞膜并在细胞中分布而不会被排出。实验结果表明，没有键合碳纳米管的药物分子在多药耐药细胞系和其母细胞系中的分布差异很大，而在键合之后其分布差异显著减小，这说明多药耐药细胞系上高表达的渗透性糖蛋白没有将键合在碳纳米管上的药物分子大量泵出细胞外，碳纳米管有效地抑制了渗透性糖蛋白外排的作用，从而证明碳纳米管可以作为载体并应用于抗癌药物转运中，这为研制新型的抗癌药物提供了新的思路，同是将促进纳米材料在药物转运和多药耐药机理方面的研究。
Description
技术领域
本发明涉及碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，特别是在新型抗癌药物研究中有着广泛的应用前景。
背景技术
碳纳米管是圆柱状大分子，半径甚至小至几个纳米，它们包括单层或者多层的曲面。碳纳米管的显著特点是具有高比表面，这使其具备了作为分子转运载体的条件(文献1.Bianco A，Prato M.(2003)Adv.Mater.15：1765-1768.)碳纳米管自身的转运能力再加上适当的化学修饰和其固有的光学特性极有可能衍生出一系列在药物转运和癌症治疗方面的新材料(文献2.Kam N，O’Connell M，Wisdom JA，Dai HJ.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：11600-11605.文献3.Wu W，Wieckowski S，PastorinG，Benincasa M，Klumpp C，Briand JP，Gennaro R，Prato M，Bianco A.(2005)Angew.Chem.-Int.Edit.44：6358-6362.)。
化疗是目前最有效的治疗恶性肿瘤的方法。然而，癌细胞能同时对各种药物产生抵抗性的能力(称为多药耐药性)已经成为化疗成功的一个重要障碍。30多年的多药耐药研究已经发现了一些癌细胞逃脱化疗的途径和机理(文献4.Gottesman MM，Fojo T，Bates SE.(2002)Nat.Rev.Cancer2：48-58.)。一些能量依赖的多药耐药究基因已经在癌组织得到确认，在人体中，三种主要的多药耐药泵分别是：渗透性糖蛋白(Pgp)，多药耐药相关蛋白质和在囊泡中的肺癌耐药相关蛋白。Pgp是一个众所周知的药物外排泵，表达并分布于癌细胞的细胞膜中。它也是被研究得最清楚的多药耐药泵，是一个170kDa的蛋白质，包括两个结构相似的区域，每个区域包含六个疏水的跨膜区域和一个高度保守的ATP结合位点。这两个ATP结合位点决定了Pgp是转运蛋白ABC(ATP-binding cassette)家族成员。Pgp与ATP结合后，利用ATP水解产生的能量进行跨膜转运，对疏水性抗肿瘤药有较强的外排作用。实验表明它能将大量的结构不相似的化合物泵出细胞膜。诸如蒽环类化合物，蒽醌类化合物，紫杉醇，长春碱以及荧光试剂Rhodamine123(Rho123)等都是Pgp的底物。当Pgp与抗肿瘤药物结合后，通过ATP提供的能量，将药物从细胞内泵出细胞外，导致细胞内药物浓度不断下降，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，最终出现耐药现象(文献5.Hamilton KO，Backstrom G，Yazdanian MA，Audus KL.(2001)J.Pharm.Sci.90：647-658.文献6.Swerts K，De Moerloose B，Dhooge C，LaureysG，Benoit Y，Philippe J.(2006)Eur.J.Cancer 42：295-309)。
纳米新材料对于导入和转运生物药物分子是极为有效的，它是指在三维结构中有一维的长度在1-100纳米之间或者具有纳米结构的材料。由于具有小尺寸效应，它们可以有效地克服细胞膜的屏障，特别是在多药耐药研究方面(文献7.Kam N，Liu ZA，Dai HJ.(2006)Angew.Chem.-Int.Edit.45：577-581.)。一些药物运载系统已经对医疗技术产生了巨大的影响，大大提高了现有药物的性能，并催生了许多全新的治疗方法(文献8.LaVanDA，McGuire T，Langer R.(2003)Nat.Biotechnol.21：1184-1191)。
发明内容
本发明的目的在于将Pgp的底物分子Rho123等抗癌药物键合到碳纳米管上，键合后的碳纳米管可以均匀地、稳定地分布于溶液中并以内吞的模式进入细胞内，并分布于细胞中，抑制Pgp对Rho123的外排。实验结果表明，键合在碳纳米管上之前的药物分子在白血病多药耐药细胞系(K562A)和其母细胞系(K562S)中的分布差异很大，而键合之后其分布差异显著减小，这说明K562A上高表达的Pgp会将大量的底物分子排出细胞，而并没有将键合在碳纳米管上的底物分子大量泵出细胞，从而证明碳纳米管可以作为载体并应用于抗癌药物转运中，并可用于体外抗肿瘤实验。这为研制新型的抗癌药物提供了新的思路，同是将促进纳米材料在药物转运和多药耐药机理方面的研究。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，所述碳纳米管制备过程为，于120℃下将10-20mg碳纳米管与20-30mL体积比1/3的强酸(质量分数为69％浓HNO3和质量分数为98.3％浓H2SO4)在搅拌回流的条件下反应30min-4h；氧化后的碳纳米管和强酸的混合溶液用水按照1∶20稀释，在8000转下离心以去除未被氧化的碳纳米管，仍溶解在溶液中的即是所需的碳纳米管。
所述碳纳米管作为载体担载抗癌药物过程为，室温下1-2mg碳纳米管与1-5mg EDC在搅拌的条件下与1.5-4.5mg药物分子反应12-24h键合。
所述碳纳米管直径约为10-30纳米，长度约为20-500纳米，所键合的药物须是Pgp的底物，同时分子上有氨基且氨基不是活性位点，如：罗丹明123(Rhodamine123)、阿霉素(Doxorubicin)或盐酸尼莫司汀(Nimustinehydrochloride)，每克碳纳米管可键合0.45-1.6克药物。
本发明具有如下优点：
1.将碳纳米管充分氧化，使其具有优良的水溶性。未经氧化的碳纳米管由于没有亲水基团而水溶性很差。通过强酸氧化的方法可以在碳纳米管端口引入羧基，从而极大提高了碳纳米管的水溶性，使其可以均匀地、稳定地分布于溶液中。
2.碳纳米管作为载体键合Pgp的底物分子(特别是抗癌药物)后作用于多药耐药细胞系时可以有效抑制Pgp的外排作用。作用过程中，碳纳米管作为抗癌药物转运载体时仍可以均匀地、稳定地分布于溶液中，并可以通过内吞的方式进入细胞内而不会被排出。
3.采用共价键合的方式将药物分子固载于碳纳米管上，可以有效避免脱落。由于游离的抗癌药物分子在细胞中会被Pgp大量排出，而当将其以共价键合的方式固载于碳纳米管上后即可有效避免外排。
4.本发明证明碳纳米管可以作为载体并应用于抗癌药物转运中，这为研制新型的抗癌药物提供了新的思路，同是将促进纳米材料在药物转运和多药耐药机理方面的研究。
附图说明
图1碳纳米管的TEM图(A和B放大50,000倍，C放大25,000倍)；
图2药物分子键合到碳纳米管上的示意图；
图3药物分子键合到碳纳米管上前(A)后(B)在K562A和K562S中的分布。
具体实施方式
实施例1
通过催化化学气相沉积法制得的碳纳米管为多壁碳纳米米管，未氧化前是很长很粗的线状结构，见附图1A。于120℃下将10-20mg碳纳米管与20-30mL体积比1/3的强酸(质量分数为69％浓HNO3和质量分数为98.3％浓H2SO4)在搅拌回流的条件反应30min-4h。碳纳米管变短变细，其长度从几微米缩短到几百纳米，直径降到20纳米左右，见附图1B。氧化后的碳纳米管和强酸的混合溶液用水按照1∶20稀释，在8000转下离心以去除未被氧化的碳纳米管，仍溶解在溶液中的即是所需的碳纳米管，直径在10-30纳米，长度在20-500纳米范围内。见附图1C。
药物分子键合过程简单，先经上述强酸氧化在碳纳米管末端引入羧基，室温下1mg碳纳米管与1mg EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride]在搅拌的条件下与1.5mg药物分子反应24h键合。详细示意图见附图2。所键合的药物须是Pgp的底物，同时分子上有氨基且氨基不是活性位点，例如罗丹明123(Rhodamine123)、阿霉素(Doxorubicin)和盐酸尼莫司汀(Nimustine hydrochloride)。每克碳纳米管可键合1.1克罗丹明123。
温育时间和温度的选择。碳纳米管可以在较短时间内进入细胞，所以温育时间以1h为宜。同时由于是以内吞的模式进入细胞，因而温度影响较大，考虑到细胞的耐受能力，选择37℃为宜。
在K562细胞孵育溶液中加入键合在碳纳米管上的Rho123浓度为25μg/mL，在37℃下温育1h，然后洗净细胞外面的残余，测定细胞中的药物分子。其在K562A和K562S中的分布如图3所示，图3A是药物分子本身和K562A和K562S孵育后的流式细胞仪检测结果，分布在K562S中的Rho123的量是在K562A中的22.69倍。图3B为药物分子键合到碳纳米管上之后和K562A和K562S孵育时的结果，分布在K562S中的键合到碳纳米管上的Rho123仅是在K562A中的2.97倍。通过比较可以看出碳纳米管有效地抑制了Pgp外排底物的作用。
由于碳纳米管作为抗癌药物转运载体时仍可以均匀地、稳定地分布于溶液中，键合药物分子后作用于K562A和K562S时可以起到抑制Pgp外排的作用，这为研制新型的抗癌药物提供了新的思路，同是将促进纳米材料在药物转运和多药耐药机理方面的研究。
实施例2
按照实施例1，氧化后的碳纳米管可以按照同样步骤键合阿霉素，每克碳纳米管可键合0.76-1.60克阿霉素。
实施例3
按照实施例1，氧化后的碳纳米管可以按照同样步骤键合盐酸尼莫司汀，每克碳纳米管可键合0.45-0.90克盐酸尼莫司汀。
Claims (5)
1.碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用。
2.按照权利要求1所述碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，其特征在于：所述碳纳米管制备过程为，于120℃下将10-20mg碳纳米管与20-30mL体积比1/3的强酸(质量分数为69％浓HNO3和质量分数为98.3％浓H2SO4)在搅拌回流的条件下反应30min-4h；氧化后的碳纳米管和强酸的混合溶液用水按照1∶20稀释，在8000转下离心以去除未被氧化的碳纳米管，仍溶解在溶液中的即是所需的碳纳米管。
3.按照权利要求2所述碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，其特征在于：所述碳纳米管作为载体担载抗癌药物过程为，室温下1-2mg碳纳米管与1-5mg EDC在搅拌的条件下与1.5-4.5mg药物分子反应12-24h键合。
4.按照权利要求2所述碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，其特征在于：所述碳纳米管直径约为10-30纳米，长度约为20-500纳米，所键合的药物须是渗透性糖蛋白的底物，同时分子上有氨基且氨基不是活性位点。
5.按照权利要求2所述碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，其特征在于：所键合的药物是罗丹明123、阿霉素或盐酸尼莫司汀，每克碳纳米管可键合0.45-1.6克药物。
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