CN101200447A - 双功能化学化合物、其制备方法、其用于核酸检测的用途和含有该化合物的系统 - Google Patents

Abstract

含有插入到核酸的核碱基(B)之间的分子单元(I)、能够发射可检测信号的活性分子单元(AD)和任选的间隔单元的双功能化合物，其中所述活性检测单元(AD)选自这样的化学实体：该化学实体具有的结构能够与插入单元(I)产生下述电子反应：在氧化反应过程中，由插入单元(I)确定的半电对I+/I的还原－氧化电位(EI+/I)低于由核碱基(B)确定的半电对B+/B的还原－氧化电位(EB+/B)，而在还原反应期间，由插入单元(I)确定的半电对I/I的还原－氧化电位(EI/I)高于由核碱基(B)确定的半电对B/B－的还原－氧化电位(EB/B－)。此外，描述了化合物用于检测核酸的用途、其合成方法和含有该化合物的系统。

Description

双功能化学化合物、其制备方法、其用于核酸检测的用途和含有该化合物的系统

[0001]本发明涉及一种双功能的化学化合物、其制备和在核酸检测中的用途以及含该化合物的系统。

发明背景

[0002]通常核酸的检测都是利用所谓的“DNA芯片”进行的，该芯片经得起高通量的检验，而且比传统的DNA印迹或RNA印迹技术更可靠。通常，这种芯片含有数目众多的已知序列的寡核苷酸片段(“探针”)，而且为了提高稳定性，通常优选探针既可以是DNA，也可是被修饰的、对化学和酶降解耐受的寡核苷酸。在分析过程中，将被测试的样品与芯片相接触，使得探针能够与被分析样品的DNA或RNA杂交。接着，通过一些方法，通常是采用插入染料或其它荧光标记的光学方法来检测和定量杂交的核酸。

[0003]但是，该技术需要使用非常昂贵的光学设备和/或荧光标记物。另外，样品中所含的目标DNA的定量检测是很困难的。所以，曾经研究过改进的方法用于在DNA探针上检测DNA链，例如使用双功能化合物的电化学模型。

[0004]目前双功能化合物已被用于DNA的光裂解，它含有两个分子单元-一个被称作“插入”单元(I)，另一个被称作“活性单元”(AD)。通常，单元I经光照射被氧化，从而将一个电子转移到单元AD。然后，氧化的单元I在这个被贡献给了单元AD的电子返回单元I之前被DNA还原。如图1所示，该机制导致了DNA的氧化，并由此将其裂解(J.Joseph，等人，J.Phys.Chem.B(2003)，第107卷，第4444-4450页，以及其参考文献)。

[0005]但是，已经发现一些双功能化合物也可以被用来检测核酸。

[0006]日本专利JP2000-125865描述了一种检测基因的方法，在具电化学特性的插入化合物、即N-N-双[[4-(3-二茂铁酰氨丙基)哌嗪基]丙基]萘-1，4，5，8-四甲酸的存在下，将基因与固定在电极上的DNA探针进行杂交。

[0007]其它的用于电化学检测双链DNA的插入型双功能化合物的例子描述于Makoto Takagi，Pure Appl.Chemistry，2001，第10卷，第1573-1577页，其中插入单元I是萘二酰亚胺，活性单元AD是二茂铁，或者描述于US2002117396中，化合物是N-[3-[4-(3-二茂铁酰氨丙基)哌嗪基]丙基]-1，8-萘酰亚胺。

[0008]在上面提到的双功能化合物中，插入单元I可以吸收环境光。所以，在适当的热力学环境中，这些化合物能够产生光诱导的电子转移过程，而该过程可以导致DNA裂解，如(J.Joseph，N.V. Eldhl，D.Ramaiah，J.Phys.Chem.B(2003)，第107卷，第4444-4450页和其中所含的参考)所描述的DNA裂解方法，导致DNA不能用于接下来的分析或者甚至产生不可靠的分析结果。

[0009]所以，已知的双功能化合物必须是用在保证有适当的光照条件的检测应用中，因此在工业上不适于广泛使用。

发明概述

[0010]因此，本发明的目的在于提供光稳定的适于在核酸分析中使用的双功能化合物。

[0011]根据本发明，提供了一种双功能化合物，其含有可以插入到核酸的核碱基(B)之间的插入单元(I)和能够发出检测信号的活性单元(AD)以及任选的间隔单元，其中活性检测单元(AD)选自这样的化学实体：该化学实体具有的结构能够与插入单元(I)产生下述电子反应：在氧化反应过程中，由插入单元I确定的半电对I+/I的还原-氧化电位(EI+/I)低于由核碱基B确定的半电对B+/B的还原-氧化电位(EB+/B)，而在还原反应中，由插入单元I确定的半电对I/I_的还原-氧化电位(EI/I)高于由核碱基B确定的半电对B/B-的还原-氧化电位(EB/B-)。

[0012]这种具有插入部分(I)和活性检测部分(AD)的双功能化合物的特殊的设置允许双功能分子与核酸碱基(B)结合，吸收能量并将能量传递给活性检测部分，从而产生可检测的信号。但是，不同部分或化合物的氧化还原电位是被设计好的，这样能量不会传递给碱基但却会传递给活性检测部分，由此避免了通常由骨架裂解导致的DNA结构的改变。因此，双功能化合物可以检测核酸而不会破坏核酸的结构。

[0013]检测器可以带有多个包被有或邻近于一个或多个探针的电极。当探针与目标杂交并与双功能化合物结合时，在该位点电流会升高。电流强度取决于样品中目标核酸的浓度，因此可以对其含量进行测定。可以通过任何方法，举例来说，通过循环伏安法、差量脉冲伏安法和恒电位仪来测量电流强度。

[0014]在下文中，术语“化学实体”指的是含有功能基团的分子的一部分，或者是含有功能基团的整个分子。

[0015]双功能化合物的插入单元I具有诸如通过与核碱基B的π轨道重叠而与核酸结合的结构，优选选自萘基、蒽基、芘基、菲基及其功能等价物。

[0016]活性检测单元AD选自能够发射发光信号、磁信号、电信号、热信号、光信号、电子信号和电化学信号等可检测信号的化学实体，而且具有，例如紫罗碱的化学结构。紫罗碱是4，4’-双吡啶的双季铵衍生物。其名称的由来是这类化合物容易被还原成带强烈蓝色的自由基单个阳离子。通常紫罗碱的化学式是1，1’-双-r-4，4’-双吡啶氯化物，其中r＝甲基、乙基、苯基或甜菜碱。在紫罗碱的变体中，带有双吡啶的钌II络合物以及更通常的电致变色金属络合物或双极性络合物也可以被采用。

[0017]在本文中，重要的是能够用不改变DNA结构的技术检测由活性检测单元AD发射的信号。

[0018]当含有间隔单元S时，它防止了在基态下插入单元I和活性检测单元AD之间的直接电子影响，而且它是一个非共轭的体系，例如，可以是一个任选取代的脂族链，特别是用对-二甲苯的衍生物取代的脂族链。

[0019]特别地，本发明的双功能化合物提供了一个活性检测单元AD，其具有诸如通过电子转移使插入单元I的激发态失活的结构，这样就防止了插入单元I的激发态与DNA链的核碱基B之间进一步的相互影响。

[0020]所以，插入单元I被适当的活性检测单元AD所稳定，其具有的氧化-还原电位低于核碱基的氧化-还原电位，这样与被分析的核酸辐射后不会发生电子交换过程，因此就防止了核酸的裂解。

[0021]被要求权利保护的双功能分子结构是很有优势的，由于插入单元I和活性检测单元AD的适当的选择使得核酸检测的灵敏度和特异性都达到了最佳化，而仍能防止其降解。

[0022]特别地，提供了一种双功能化合物，名为1-{4-[2-(9-蒽基甲氧基)乙基]苯基}-1’-甲基-4，4’-双吡啶，具有结构式1：

[0023]式1的化合物是由含有已知具有dsDNA插入活性的蒽的插入单元I和含有已知具有耐受可逆还原反应能力的紫罗碱的活性单元AD构成。

[0024]通过紫罗碱的光致还原作用，利用其产生的电子转移过程可以使光刺激后处于激发态的蒽的功能失活，从而通过还原作用防止任何其它电子向蒽被插入其中的核酸进行转移。

[0025]合成式1的化合物的方法包括了将式2的化合物：

[0026]其中n是0-10，在氢化钠的存在下，与α，α’位置被卤素取代的对-二甲苯反应而得到式3的化合物的步骤；

[0027]其中X是卤素；

[0028]使式3的化合物与4，4’-双吡啶反应而得到式5的化合物；

[0029]最后，使式5的化合物与甲烷的卤化衍生物反应而得到式1的化合物。

[0030]该双功能化合物特别适用于核酸的检测，例如电化学检测。此外，它也可以分析不同性质的核酸，诸如溶液中的或与核酸探针杂交后固定在固体表面上的RNA和单链或双链DNA。

[0031]本双功能化合物可以用于区分单链或双链DNA链。

[0032]最后，根据本发明，提供了一个用于检测核酸的含有上面描述的双功能化合物的系统，检测双功能化合物的活性检测单元AD与核酸探针所发射的信号的方法。此外，该系统可以含有用以支撑核酸探针的材料。

附图简要说明

[0033]本发明更进一步的特性和优点将通过下面的对一些具体实施方式的描述来呈现，这些具体实施方式只是非限制性的描述，必要时可以参照附图，其中：

[0034]图1图示了本领域现有技术的双功能化合物的活性机制；

[0035]图2显示的是参照化合物蒽甲醇和本发明的式1的双功能化合物的吸收光谱；

[0036]图3显示的是参照化合物蒽甲醇和式1化合物的荧光图谱；

[0037]图4显示的是在激光脉冲激发后所记录的参照化合物蒽甲醇和式1化合物的瞬时吸收图谱；

[0038]图5显示的是随着连续添加dsDNA，式1化合物的吸收光谱中观察到的光谱变化；

[0039]图6显示的是在裸露的ITO电极(a)上记录的式1化合物(40μM)和用双链DNA修饰的电极(b)上记录的式1化合物(2μM)的循环伏安图；

[0040]图7显示的是在裸露的ITO电极(a)上记录的式1化合物(40μM)和用单链DNA修饰的电极(b)上记录的式1化合物(2μM)的循环伏安图；

[0041]图8显示的是用单链和双链DNA修饰的四种不同的ITO电极的还原电位变化；和

[0042]图9和图10显示的是本发明系统的两个具体实施方式。

发明详述

[0043]具体而言，参照图9和图10，用于检测核酸的系统或装置整体用数字11标明，其含有根据本发明的双功能化合物12(参见下面的实例)；检测工具13，例如电极系统；核酸探针14，例如固定在支撑物15上。分析时，将要分析的核酸样品16加到检测设备11中并使之与探针14接触。在杂交过程中或之后，双功能化合物插入到核酸的双链中并发射出可以被检测工具13检测到的信号。由紫罗碱发射的信号可以是双重的：1)与其还原电位相关的电信号；2)紫罗碱的变色而导致的光信号(假如电极是透明的则很容易检测到)；这种变色会保留到施加电位使还原形式稳定下来。

[0044]根据图9所显示的，加样时双功能化合物12和探针14都包含在一个普通的承载工具，例如一个容器中，当加入样品核酸16时，其可选择比如用可被切断的分离隔膜(用虚线表示)分成单独的隔间，其中设有共有的通道。

[0045]仅仅根据图10所描述的，双功能化合物12和探针14被分别装在各自的承载工具中，例如，称之为适当的分离容器12a、14a，该承载工具构成了同一试剂盒的一部分，其与检测工具13一起被定义为一个整体——系统11。样品核酸16被加入时，双功能化合物12也被加入到探针14的附近，这样可使其在杂交步骤中插入到DNA中，比如只需要打开相应的容器。在图10中，容器12a、14a显示为独立的实体，当需要的时候，容器12a的内容物可被倒入容器14a中。

[0046]另一种情况是，杂交探针14可以被固定在例如由承载工具、举例来说，还含有双功能化合物12的容器的形成固体表面的部分所确定的支撑物15上，或者可以将杂交探针14悬浮在溶液中，例如包含在前面所说的容器中，或者固定在由例如微球体构成的支撑物15上。

[0047]在下面的实施例中，通过双功能化合物12的特性、结构、合成过程和功能进一步描述了本发明，以由式1的化合物组成的具体实施方式进行详细的说明。

实施例1：化合物1的合成

[0048]图解2概述了式1化合物的合成反应。

[0049]将500mg的(蒽-9-基)甲醇(M.W.208.26g/mol，2.4mmol)溶解在乙腈中而得到黄色的溶液。随后回流加热(82℃)，并向其中鼓入氮气。

[0050]加入预先用己烷冲洗过、然后悬浮到乙腈中的70mg氢化钠(M.W.24g/mol，2.9mmol)。大约30分钟后，混合液呈现出红色。

[0051]此时，加入通过将1.3g的α，α’-双吡啶对二甲苯(M.W.263.97，5mmol)溶解在乙腈中而制备的溶液。保持回流16个小时。

[0052]随后让反应物通过二氧化硅TLC(薄层层析)，用环己烷/二氯甲烷(1∶2)混合液洗脱。这样就会观察到一些副产物和在Rf 0.77处非常强的斑点以及与未反应的成分相关的各斑点。

[0053]将Rf0.77处的斑点(图解2中的化合物A)用甲醇提取出来，用UV-VIS测定吸收光谱。该光谱显示了蒽的特征带。

[0054]将50mg的4，4’-双吡啶(M.W.156g/mol，0.32mmol)溶解在20ml的乙腈中。将该溶液回流加热，并少量加入制备好的溶有30mg化合物A的溶液。

[0055]让反应物再次通过二氧化硅TLC，用二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脱。2小时后可观察到化合物A消失(其为缺陷的)。产物(化合物B，根据图解2中说明的反应获得)显示0.18的Rf。

[0056]通过Br-和PF6-之间的阴离子交换进行化合物B的纯化，为此，要浓缩反应混合物，并加入3ml的NH4+PF6-饱和水溶液。可观察到出现粉色的沉淀，随后过滤分离，并用少量的冷水冲洗。

[0057]然后将化合物B(0.07mmol)加热溶解到氯仿/乙腈中，将温度保持在40℃。

[0058]加入100μl的碘甲烷，在40℃与化合物B反应，由于碘甲烷的挥发性，后面的8小时都要加入额外分量的碘甲烷。24小时后，进行二氧化硅TLC，用二氯甲烷/甲醇(1∶1)洗脱，该过程高亮显示了化合物1的Rf＝0。

实施例2：化合物1的表征

[0059]以一种方式设计式1的化合物使得插入单元对于DNA是光化学不活跃的，以防止任何在周围光亮环境下对其的破坏。

[0060]图2显示了被选作模式参照化合物的蒽甲醇和式1的双功能化合物的吸收光谱。光谱的两个相似的轨迹清楚地提示在基态中在蒽单元和紫罗碱之间没有相互作用。

[0061]而在激发态水平上却会发现差异。图3显示了蒽甲醇和式1化合物的荧光图谱。正如可以观察到的，由于紫罗碱基团的存在，在式1化合物中蒽发色团的典型的发射被完全去活化。

[0062]通过闪光镭射的光分解实验证实了在式1化合物中蒽环的三重态钝化。图4显示了在蒽甲醇和式1化合物中，激发激光脉冲后100ns记录的瞬时吸收光谱。在蒽甲醇中，观察到的吸收是蒽的最低激发三重态的典型信号。但是，在式1化合物中三重态信号一直都有，提示激发态数未增加(populated)。在式1化合物中可见的淬灭可以归咎于热力学有利的被激发的蒽和紫罗碱之间的光诱导的电子转移过程。

实施例3：化合物1和DSDNA之间的相互反应

[0063]通过在确保式1化合物100％地与DNA结合的浓度下进行的闪光镭射光学实验显示了在DNA存在时式1化合物的高光稳定性。紫罗碱还原形式在600nm未出现信号，证明从紫罗碱到蒽环的电子回归是一个占优势的过程，它调节来自蒽氧化形式的核碱基的氧化。

[0064]通过吸收性质的分析对式1化合物与DNA相互反应进行了研究。特别是加入DNA后不受其吸收影响，能够观察到更高波长下的吸收的可能改变，在大约300nm终止。

[0065]图5显示了随着连续添加dsDNA，在式1化合物的吸收光谱中观察到的光谱变化。

[0066]该结果高亮显示了DNA的存在是如何导致光谱上的很明显着色不足和向红效果。特别地，在347nm、365nm和384nm处的三个主要条带的强度下降超过50％，同时向红色转变。明显观察到的着色不足是发色团和DNA核碱基的电子状态之间标志反应的一个指数。由于预想这些相互反应的影响会随着发色团和碱基之间分开的距离的立方而减少，所以该效果是蒽发色团和DNA碱基之间亲密缔和的指数。观察到由于多色化合物的插入引起的典型光谱变化，所以证明了式1化合物主要通过π，π轨道重叠的相互作用而与DNA结合。

[0067]通过McGhee和Von Hippel研究的方法(J.D.McGhee，P.H.vonHippel，J.Mol.Biol.(1974)，vol.86，第469-489页)已经计算出的缔和常数值大约是3.3×10⁵。这个值比对蒽和紫罗碱(C.V. Kumar，E.H.Asuncion，Chem.Comm.(1992)，第470页)和单独对紫罗碱(D.W.Pang，H.D.Abruna，Anal.Chem.(2000)，72卷，第4700-4706页)的文献中所报道的值高出一个数量级，证明式1化合物结构中紫罗碱的存在不仅仅改进了蒽的插入特性，也明显提高了结合效果。

实施例4：化合物1与SSDNA和DSDNA的相互反应

[0068]图6显示了用裸露的ITO电极(a)记录的水溶液中式1化合物(40μM)和在用双链DNA修饰的ITO电极(b)上记录的式1化合物(2μM)的伏安图。结果清楚地显示在修饰电极的情况下式1化合物的还原相对于裸露电极情况下所观察到的向负值转变。所以，相信氧化-还原单元与DNA的相互反应是静电型的，正如单独对紫罗碱的文献中所报道的(D.W.Pang，H.D.Abruna，Anal.Chem.，(2000)，72卷，第4700-4706页)。

[0069]图7显示了用裸露的ITO电极(a)记录的水溶液中式1化合物(40μM)和在用单链DNA修饰的ITO电极(b)上记录的式1化合物(2μM)的循环伏安图。

[0070]在这种情况下也清楚地显示在修饰电极的情况下式1化合物的还原相对于无修饰的电极情况下所观察到的向负值转变。所以，这就证明氧化-还原单元与DNA的相互反应是静电型的，正如单独对紫罗碱的文献中所报道的(D.W.Pang，H.D.Abruna，Anal.Chem.，(2000)，72卷，第4700-4706页)。

[0071]但是，以上两种转变都表明：当与单独紫罗碱相比时，式1化合物的被还原和被氧化的型式表现出与DNA更好的亲和性。

[0072]最后，图8显示了4种用单链(虚线)和双链(实线)DNA修饰的ITO电极观察到的还原电位的差异。既使这种差异很小，也是可以复制的，因此表明式1化合物能够将两种不同型式的DNA结构区分开来。

Claims (19)

1.一种双功能化合物，含有能够插入到双链核酸的核碱基(B)之间的插入单元(I)和能够发射可检测信号的活性检测单元(AD)，其特征在于所述活性检测单元(AD)选自这样的化学实体：该化学实体具有的结构能够与插入单元(I)产生下述电子反应：在氧化反应过程中，由插入单元(I)确定的半电对I+/I的还原-氧化电位(EI+/I)低于由核碱基(B)确定的半电对B+/B的还原-氧化电位(EB+/B)，而在还原反应中，由插入单元(I)确定的半电对I/I_的还原-氧化电位(EI/I)高于由核碱基(B)确定的半电对B/B-的还原-氧化电位(EB/B-)。

2.根据权利要求1的双功能化合物，其特征在于所述的可检测的信号选自发光信号、磁信号、电信号、热信号、光学信号、电子信号和电化学信号。

3.权利要求1的双功能化合物，其特征在于所述的插入单元(I)选自萘基、蒽基、芘基和菲基。

4.根据权利要求1的双功能化合物，其特征在于所述的活性检测单元(AD)选自紫罗碱基团、带有双吡啶的钌II络合物、电致变色的金属络合物或双极性络合物。

5.根据权利要求1的双功能化合物，其特征在于它含有置于所述插入单元(I)和所述活性检测单元(AD)之间的间隔单元(S)。

6.根据权利要求5的双功能化合物，其特征在于所述的间隔单元(S)是非共轭体系，优选任选地取代的脂族链。

7.根据权利要求6的双功能化合物，其特征在于所述的间隔单元(S)是被芳香基团取代的脂族链。

8.根据权利要求7的双功能化合物，其特征在于所述的间隔单元(S)是被对-二甲苯取代的脂族链。

9.权利要求1的双功能化合物，具有式1：

10.根据权利要求1的化合物用于检测核酸的用途。

11.根据权利要求9的化合物用于检测核酸的用途。

12.根据权利要求11的用途，其特征在于所述的检测是电化学类型的检测。

13.根据权利要求12的用途，其特征在于所述的核酸选自单链DNA、双链DNA或RNA。

14.根据权利要求10的用途，其特征在于它是与固定在固体表面的杂交探针协力完成的。

15.根据权利要求10的用途，其特征在于它是与悬浮在溶液中的杂交探针协力完成的。

16.一种用于制备双功能化合物的方法，含有下列步骤：

a)将式2化合物：

其中n是0-10，

在氢化钠的存在下与α，α’位用卤素取代的对-二甲苯反应得到式3的化合物：

其中X是卤素；

b)将所述式3化合物与4，4’-双吡啶反应而得到式5的化合物：

c)将所述式5化合物与甲烷的卤化衍生物反应而得到所述的式1化合物：

17.用于检测核酸的系统含有根据权利要求9双功能化合物，和用于检测由所述的分子单元(AD)发射的所述信号的工具。

18.根据权利要求17的系统，其特征在于它含有核酸探针。

19.根据权利要求18的系统，其特征在于它含有用于所述双功能化合物和用于所述核酸探针的承载工具。

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