CN101195808A - 一种酵母细胞破壁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酵母细胞破壁的方法，步骤包括：酵母泥加水配成活菌悬液；加入半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐和中性蛋白酶，控制pH6－8，在40℃－60℃下保温水解6－48小时，得到酵母水解液；酵母水解液经离心得到酵母沉淀，再加水配制成酵母细胞悬浮液，再经数次冻结和微波解冻，破壁率达到95％以上。本发明将半胱氨酸促溶、梯度降低冰点冻结和微波快速解冻相结合，大大提高了酵母细胞破壁率。本发明细胞破壁工艺操作简便，对设备要求低，很适合于啤酒酵母或面包酵母细胞的破壁。

Description

一种酵母细胞破壁的方法

一、技术领域

本发明涉及真菌细胞破壁的方法，具体是一种啤酒酵母或面包酵母细胞破壁的方法。

二、背景技术

酵母尤其是啤酒酵母和面包酵母是重要的食品工业微生物，其细胞壁从外向内分三层，外层为甘露聚糖，中间层含有丰富的蛋白质，内层为葡聚糖。酵母破壁的水解提取液可以加工调味品、保健品原料、生物制品等多种深加工产品，还可以加工成多糖。目前常用的酵母细胞破壁方法有：机械法，酵母细胞自溶法，酶促水解法和冻融法。机械方法用高压匀浆、珠磨法等，设备条件要求高。常规的冻融法、自溶和酶解方法对酵母细胞的破壁率较低，使用过程中都有一定的局限性。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种酵母细胞破壁的方法，可用于啤酒酵母或面包酵母细胞的破壁、溶解，以弥补现有酵母细胞破壁技术的不足，提高破壁效率。

本发明以半胱氨酸(或其盐类)作为啤酒酵母或面包酵母细胞的促溶剂或破壁剂。其促溶机理可能在于：①半胱氨酸把形成酵母细胞壁的蛋白质链中的双硫键-S-S还原成-SH，在一定程度上松开其紧密结构，有利于蛋白质结构的破坏。②加入半胱氨酸可以消除细胞外Cu²⁺、Hg²⁺、Al³⁺、pb²⁺等重金属离子对酵母细胞胞内酶和胞外酶的毒害作用，提高自溶或加酶水解破壁的活力。③作为还原性物质，半胱氨酸可以减少酵母细胞内外蛋白酶的氧化变性。

本发明提供的一种酵母细胞破壁的方法，包括如下步骤：

1)、将废酵母泥用水稀释，过筛除杂，在3000rpm下离心10-20min，得到的酵母泥加水配成活菌悬液，水的加入量为酵母泥质量的2-3倍；

2)、在活菌悬液中加入半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐，加入量为酵母泥质量的0.1-1.0％，再按每克酵母泥100-1000U加入中性蛋白酶，控制PH6-8，在40℃-60℃下保温水解6-48小时，得到酵母水解液；

3)、酵母水解液经离心得到酵母沉淀，再加入3-20质量倍的水配制成酵母细胞悬浮液，在-25℃～-40℃冻结，微波炉中解冻，在恒温水浴中加热到35℃-45℃，保温0.5-1.5h；然后按每100mL酵母细胞悬浮液加入2.6-3.5g的食盐，进行第二次冻结，冻结温度-25℃～-40℃，冻结的酵母液再次用微波解冻；如此加盐、冻结、解冻重复2-5次。然后用显微镜观察细胞破壁情况，破壁率达到95％以上。

上述步骤中：所述的酵母是啤酒酵母或面包酵母。所述的中性蛋白酶是细菌中性蛋白酶或霉菌中性蛋白酶。所述的在酵母细胞悬浮液加入食盐的步骤可以用50℃-70℃下真空浓缩酵母细胞悬浮液代替。

本发明的优点和效果：

一是，在酵母液中加入中性蛋白酶和半胱氨酸(或其盐酸盐)，进行酶促自溶水解，可以提高酵母细胞溶解和破裂程度。从已有文献发现，半胱氨酸是用于食品、药品及生物制品的常见添加剂。此外，半胱氨酸还用作木瓜蛋白酶的激活剂和肉的品质改良剂，但是尚未见到在酵母细胞破壁中的应用。本发明用半胱氨酸(或其盐酸盐)作为细菌中性蛋白酶或霉菌中性蛋白酶水解酵母细胞的促溶剂，与其它酵母促溶剂相比，优点在于：①添加量少，生产成本低，操作简便；②提高了中性蛋白酶水解酵母的活性和稳定性；③水解液中的氨基氮含量明显提高，测其含量(扣除加入的半胱氨酸)比不加半胱氨酸促溶剂提高了10-50％。

二是，将蛋白酶促溶水解后的酵母液进行冻结-微波解冻融化，第一次解冻液加热到35-45℃保温0.5-1.5h，然后再加入氯化钠或真空浓缩，提高氯化钠的浓度后，进行冻结-微波解冻融化。通过提高氯化钠浓度或不断浓缩，降低酵母液冰点，实现在不同温度段进行酵母的冻融；通过微波快速解冻，提高冻结酵母的融化速度。冻融法已广泛应用于植物(如葛仙米)、动物(如猪血细胞)、藻类(如钝顶螺旋藻)、微生物(如蜜环菌)的细胞破壁。但是常规的冻融方法是将冻结细胞于室温下融化，然后再冻结，从而破坏细胞壁。多次冻融可增加细胞溶胀破碎的比率。试验表明，常规法冻融酵母3次，只有约40-50％的酵母细胞破碎，而用本发明的方法可以使酵母细胞破碎率达到95％以上。

总之，本发明是将半胱氨酸(或其盐酸盐)促进中性蛋白酶水解与梯度降温冻结、微波快速解冻技术相结合，可使酵母细胞破壁率达到95％以上。

四、具体实施方式

实施例1

将啤酒废酵母泥(啤酒厂副产物)用水稀释后，用80目的筛子过筛除杂，在3000rpm下离心15min，倾出上清液，将干净的酵母泥沉淀取出，放入4℃的冰箱中保存、待用；称取酵母泥20g，加40ml水制成悬浮液，加入半胱氨酸盐酸盐0.06g，再加入AS1.398中性蛋白酶0.1g，然后在PH7，温度为45℃保温水解24小时；水解后高温灭酶、冷却，离心去清液，得到沉淀16.5g；加330ml水配制成酵母细胞悬浮液，在-25℃冻结，微波炉中解冻，在恒温水浴中加热到40℃，保温1h，加入11.4g食盐，在-25℃进行第二次冻结，冻结的酵母液再次用微波解冻；如此加盐、冻结、解冻重复2次；显微镜观察，破壁率为96％。

实施例2

将啤酒废酵母泥稀释、过筛除杂，在3000rpm下离心，弃上清液；称取酵母泥20g，加40ml的水制成悬浮液，加入0.1g半胱氨酸，再加入米曲霉中性蛋白酶0.4g，用磷酸盐调悬浮液PH到6.5，于50℃恒温水浴锅中水解10h；高温灭酶、离心后得到沉淀17.2g，加175ml水配制成酵母细胞悬浮液，在-40℃冻结，微波炉中解冻，解冻液在45℃保温0.5小时，加入4.5g的食盐，进行下一次冻结，冻结温度仍在-40℃，冻结的酵母液再次用微波解冻；如此加盐、冻结、解冻重复4次；计算酵母破壁率可以达到97％。

实施例3

取20g面包干酵母，放入40ml2％的蔗糖溶液，在40℃下活化10min，然后于30℃培养2小时，将养分消耗干净；再加入半胱氨酸盐酸盐0.2g和高温中性蛋白酶0.2g，调PH为7.5，于55℃恒温水解40h；灭酶后离心，得到沉淀16.8g，加250ml水配制成酵母细胞悬浮液，在-35℃冻结，微波炉中解冻，在恒温水浴中加热到35℃，保温1.5h，然后在55℃进行真空浓缩，减少水分50％，在-35℃下进行第二次冷冻，微波解冻，计算酵母破壁率可以达到95％。

Claims (5)

1.一种酵母细胞破壁的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)、将废酵母泥用水稀释，过筛除杂，在3000rpm下离心10-20min，得到的酵母泥加水配成活菌悬液，水的加入量为酵母泥质量的2-3倍；

2)、在活菌悬液中加入半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐，加入量为酵母泥质量的0.1-1.0％，再按每克酵母泥100-1000U加入中性蛋白酶，控制PH6-8，在40℃-60℃下保温水解6-48小时，得到酵母水解液；

3)、酵母水解液经离心得到酵母沉淀，再加入3-20质量倍的水配制成酵母细胞悬浮液，在-25℃～-40℃冻结，微波炉中解冻，在恒温水浴中加热到35℃-45℃，保温0.5-1.5h；然后按每100mL酵母细胞悬浮液加入2.6-3.5g的食盐，进行第二次冻结，冻结温度-25℃～-40℃，冻结的酵母液再次用微波解冻；如此加盐、冻结、解冻重复2-5次。

2.如权利要求1所述的酵母细胞破壁的方法，其特征在于，所述的酵母是啤酒酵母。

3.如权利要求1所述的酵母细胞破壁的方法，其特征在于，所述的酵母是面包酵母。

4.如权利要求1、2或3所述的酵母细胞破壁的方法，其特征在于，所述的中性蛋白酶是细菌中性蛋白酶或霉菌中性蛋白酶。

5.如权利要求1、2或3所述的酵母细胞破壁的方法，其特征在于，所述的在酵母细胞悬浮液加入食盐的步骤可以用50℃-70℃下真空浓缩酵母细胞悬浮液代替。