CN101186656A - 双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖聚合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用双羧基封端的苯胺五聚体交联壳聚糖得到水溶的电活性聚合物及制备方法。本发明提供了从双羧基封端的苯胺五聚体出发，利用两种合成方法得到的含有电活性苯胺五聚物的系列交联聚合物。一种方法为直接在醋酸水溶液和有机溶剂的混合溶剂中，活化的苯胺五聚体的羧基与壳聚糖的氨基通过缩聚反应得到产物；一种利用保护后的壳聚糖与苯胺五聚体在有机溶剂中通过缩聚反应得到产物。该交联聚合物兼具苯胺五聚体和天然高分子的优点，既有电活性还具有生物活性，可溶解于酸性水溶液，可生物降解，降解产物可排出体外。其主要用作生物医用材料，尤其是用作神经及心脏的组织工程支架材料。

Description

双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖聚合物的制备方法

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，涉及苯胺五聚物及其与天然高分子-壳聚糖的交联聚合物及方法。

背景技术

近几十年来，随着高分子科学的迅速发展和高分子科学与现代药学、生物学以及工程学的日益结合，生物医用高分子材料的研究得到了越来越多的关注。其中可生物降解的高分子材料，由于其良好的生物相容性和可生物降解性，已开始在骨固定、人造组织及药物释放等领域得到广泛的应用。而可生物降解的高分子材料，从其来源来划分又可分为纯天然生物高分子材料与合成的生物高分子材料。合成的生物高分子材料尤以脂肪族聚酯为主，如聚丙交酯(PLA)，聚乙交酯(PGA)，聚ε-己内酯(PCL)等，这些材料都具有良好的生物相容性与生物降解性及机械性能。但合成的生物高分子材料大多属于油溶性高分子，而在生物体内，却是水环境，限制了合成高分子材料在生物体内的真正应用。而天然高分子大多水溶如：淀粉、壳聚糖及蛋白等由于其纯天然性，在生物相容性与降解性方面有着独特的优势，但在其它方面如力学性能、溶解性、加工性及功能化方面还存在着欠缺。

在众多天然生物高分子材料中，壳聚糖的研究尤为火热。壳聚糖((1→4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucan(GlcN)and(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucan(GlcNAc))为部分脱乙酰度的甲壳素，它来源广泛，制备简单，可溶于酸性的水溶液中，具有一定的机械性能与良好的生物相容性和生物降解性能，在食品、化妆、药物释放等领域得到了广泛的应用。同时，壳聚糖的六元环上具有氨基、羟基，这就为壳聚糖的改性提供了条件。目前，通过改性得到各种两亲性聚合物，及各种具有新型功能的壳聚糖聚合物已成为该领域的研究热门课题。

最近，生物可降解高分子和导电高分子两个领域的交叉研究又成为一个热点。众所周知，聚苯胺作为一种导电高分子材料，近几十年来一直是一个研究的热点，由于它具有可控的电导率，良好的热稳定性和氧化还原性质，因此被广泛用做防腐衣、电池、传感器、分离膜及防静电和防电磁干扰保护屏。但是最新研究表明，聚苯胺等导电高分子又可以作为一种新型的智能材料被用作心脏或神经支架材料。基本的观点是，电信号或者电化学信号能够直接或者间接地影响细胞的繁殖、组装和分化，因此具有电活性的支架材料就能够通过被施加适当的电信号以控制组织细胞的生长和繁殖。最近，危岩等(Guterman E.，ChengS.，Palouian K.，Bidez P.，Lelkes P.，and Wei Y.《多肽修饰的用于组织工程的电活性共聚物》，Polym.Prepr.2002，43，766-767)已经采用了H9c2心脏成肌细胞和PC12膀胱嗜铬肿瘤细胞证明，聚苯胺及它的衍生物作为生物相容性的基质材料，可以使细胞在其上良好的粘附、生长和分化。其它的电活性聚合物，例如聚吡咯也被证明有电信号刺激时，能够加强神经生长因子对PC12细胞的分化作用的影响。因而电活性聚合物材料在生物医用方面的应用引起了人们的广泛关注，但是聚苯胺等导电聚合物如果直接应用于体内还存在着很多问题，比如说生物相容性差，不可降解以及溶解性差难以加工等等。围绕着解决以上所说的导电聚合物的缺点，一系列研究工作展开了。

为了提高电活性聚合物的生物相容性，很多方法被使用了，目前使用比较多的是：和具有生物活性的物质共混或者在聚合物侧链接枝上生物相容性的物质以及在聚合物主链上接上生物相容性的嵌段。比如说，危岩等把聚苯胺和天然生物高分子如凝胶(Li，M.；Guo，Y.；Wei，Y.；MacDiarmid，A.G.；Lelkes，P.I.《用于组织工程的含有凝胶的聚苯胺电纺丝纤维》，Biomaterials 2006，27，2705-2715.)等共混，或者在聚苯胺侧链接上短肽等生命活性物质，使得聚苯胺的生物相容性得到很大提高。

聚苯胺等导电聚合物溶解性一般都比较差，只能溶解在N，N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜及N-甲基吡咯烷酮等强极性溶剂中。这样为它的加工应用带来了很多问题。提高电活性聚合物的溶解性采用的方法也基本上是在聚合物侧链上引入能增加溶解性的聚合物，如聚乙二醇和聚丙烯酸等。

限制电活性聚合物在体内应用的另外一个非常重要的因素就是它的不可降解性。如果聚苯胺等导电聚合物在体内长期使用可以诱导关节发炎的不良反应，由于它不可降解，使用后就必须二次手术取出，给病人带来再一次的痛苦。为了解决这个问题，需要将材料做成可以生物降解的。如Rivers等(River，T.J,；Hudson，T.W.；Schmidt，C.E.《合成一种新颖的生物可降解的导电聚合物用于生物医药领域》；Adv.Funct.Mater.2002，12，33-37)利用酯键将吡咯齐聚物相互连接起来就实现了材料的降解性能。

发明内容

目前还没有一种材料能够将以上提出的相容性差，不可降解以及溶解性差，难加工等缺点都完整地解决。为了从根本上解决以上提出的问题，发明人利用苯胺五聚物交联天然生物高分子-壳聚糖得到新型电活性生物材料。苯胺五聚物具有和聚苯胺相似的电活性，且具有更好的溶解性，通过和壳聚糖的交联，既可以提高苯胺五聚体的溶解性，生物活性，又可以解决材料的降解问题，是一个比较可行的方法。因而该交联聚物为电活性材料在人体内应用提供了良好的前景，为神经组织工程材料开辟了一条新的道路。

本发明的目的之一是提供双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖的聚合物，其结构式为：

本发明的目的之二是提供双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖聚合物的制备方法。根据缩合反应所选用的溶剂不同，开发了不同的合成方法。当选择醋酸水溶液和有机溶剂的混合液为溶剂时，定义为方法1；当选用纯有机溶剂时，定义为方法2。

方法1步骤和条件如下：

(1)在无水无氧的条件下，加入溶剂N，N-二甲基甲酰胺(以下简称DMF)，活化剂N-羟基琥珀酰亚胺(以下简称NHS)，缩合剂二环己基碳二亚胺(以下简称DCC)，NHS和DCC的摩尔数均为苯胺五聚体摩尔数的两倍，加入浓度为75mg/ml的苯胺五聚体，在室温和搅拌的条件下，聚合时间为24h，产物用乙醇沉降，过滤，洗涤，真空干燥，得到两端羧基活化的苯胺五聚体；

其反应方程式如下：

(2)在室温和搅拌的条件下，将壳聚糖溶解于浓度为10v％的醋酸水溶液中，壳聚糖浓度为15-27mg/ml，壳聚糖的质量为醋酸质量的5-9倍，得到壳聚糖的醋酸水溶液；

(3)将体积为步骤(2)中的壳聚糖的醋酸水溶液体积的2/3的二甲基亚砜(以下简称DMSO)溶剂以1滴/(3-5)秒滴速，滴加到壳聚糖的醋酸水溶液中；

(4)将步骤(1)得到的两端羧基活化的苯胺五聚体溶解于体积为步骤(2)中壳聚糖的醋酸水溶液体积的1/3的DMF溶剂中，在无氧的条件下，在50℃和搅拌的条件下，将该DMF溶液通过恒压滴液漏斗以1滴/(3-5)秒滴速，滴加到步骤(3)得到的溶液中，滴加完成后在50℃和搅拌的条件下再反应24h，过滤，用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，沉降物溶解于浓度为10v％醋酸水溶液中，过滤，再次用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖聚合物。

其反应方程式如下：

方法2步骤和条件如下：

(1)在无水无氧条件下，加入溶剂N，N-二甲基乙酰胺(以下简称DMAC)，加入浓度为0.02-0.06mol/L的苯胺五聚体，加入活化剂N，N-羰基二咪唑(以下简称CDI)，CDI摩尔数为苯胺五聚体摩尔数的两倍，在60℃和搅拌条件下反应24h，得到两端带咪唑基团的苯胺五聚体的DMAC溶液；将6-O-三苯甲基壳聚糖加入到含两端带咪唑基团的苯胺五聚体的DMAC溶液中，通过抽气换气技术，在60℃和搅拌条件下反应24h，过滤，乙醚沉降，过滤，40℃下真空干燥2天，得到苯胺五聚体交联的6-O-三苯甲基壳聚糖；

其反应方程式如下：

(2)将步骤(1)中得到的产物苯胺五聚体交联的6-O-三苯甲基壳聚糖分散在二氯乙酸中，室温搅拌到固体完全溶解，过滤，用乙醚沉降，用乙醇洗涤，过滤得到未提纯的苯胺五聚体交联壳聚糖；

(3)将步骤(2)得到的未提纯的苯胺五聚体交联壳聚糖溶解在浓度为10v％的醋酸水溶液中，过滤，用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖聚合物。

本发明的有益的效果如下：

本发明以苯胺五聚体出发，通过交联天然生物高分子-壳聚糖得到的聚合物具有和聚苯胺及苯胺齐聚物相似的良好电活性，而且同时拥有了生物相容性好，可生物降解，水溶解性等特点，该苯胺五聚体交联壳聚糖得到的聚合物拥有和壳聚糖相似的生物相容性，能够支持大鼠神经胶质瘤细胞的生长和分化。该交联聚合物溶解于酸性水溶液中具有和壳聚糖相似的溶解性能，为材料将来的加工利用提供了方便。

本发明所制备的苯胺五聚体交联壳聚糖得到的聚合物主要用作生物医用材料，尤其是用作神经及心脏的组织工程支架材料。

附图说明

图1：苯胺五聚体交联壳聚糖的产物在醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中不同浓度的紫外吸收谱图(具体为实施例2中得到的产物的紫外吸收)。

图2：苯胺五聚体交联壳聚糖的产物在醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中不同浓度的紫外吸收谱图(具体为实施例4中得到的产物的紫外吸收)。

图3：苯胺五聚体交联壳聚糖的产物溶解在醋酸浓度为10v％醋酸水溶液后得到的薄膜的循环伏安曲线(具体为实施例3中得到的产物的循环伏安谱图)。

图4：苯胺五聚体交联壳聚糖的产物，纯壳聚糖，纯苯胺五聚体的细胞毒性实验结果(具体为实施例4中得到的产物，纯壳聚糖，纯苯胺五聚体的细胞毒性实验)。

具体实施方式

实施例1：活化苯胺五聚体的端羧基

在无水无氧的条件下，将双羧基封端的苯胺五聚体1.5g(0.00223mol)，0.642g(0.00446mol)NHS和0.92g(0.00446mol)DCC溶解于20mlDMF中，室温搅拌24h，过滤，将反应产物用400ml冷乙醇沉出，抽滤，45℃下真空干燥48h，得到1.597g两端羧基活化的苯胺五聚体。产率93％。

实施例2：苯胺五聚体交联壳聚糖的合成，其中苯胺五聚体含量2.4％

取商品壳聚糖(分子量4万，脱乙酰度为75％)0.45g，在搅拌的条件下溶解于30ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，在室温和搅拌的条件下，通过滴液漏斗将20mlDMSO以每3-5秒滴1滴的速度滴加入醋酸水溶液中。取实施例1中得到的两端羧基活化的苯胺五聚体0.05g溶解于10mlDMF中并置于恒压滴液漏斗中。通过抽气换气技术，在氮气保护下，将反应体系升温到50℃后，将DMF溶液以每3-5秒滴1滴的速度滴加到醋酸水溶液和DMSO的混合溶液中，滴加完后在50℃和搅拌的条件下反应24h。滤掉不溶物，用3M NaOH调节溶液的pH到7-9，过滤，将产物在搅拌条件下溶解于20ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，滤掉不溶物，再次用3M NaOH调节溶液的pH到7-9，过滤，用去离子水洗涤，冷冻干燥，得苯胺五聚体交联的壳聚糖0.307g.产率61.4％.苯胺五聚体含量2.4％。

实施例3：苯胺五聚体交联壳聚糖的合成，其中苯胺五聚体含量4.9％

取商品壳聚糖(分子量4万，脱乙酰度为75％)0.8g，在搅拌的条件下溶解于30ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，在室温和搅拌的条件下，通过滴液漏斗将20mlDMSO以每3-5秒滴1滴的速度滴加入醋酸水溶液中。取实例1中得到的两端羧基活化的苯胺五聚体0.2g溶解于10mlDMF中并置于恒压滴液漏斗中。通过抽气换气技术，在氮气保护下，将反应体系升温到50℃后，将DMF溶液以每3-5秒滴1滴的速度滴加到醋酸水溶液和DMSO的混合溶液中，滴加完后在50℃和搅拌的条件下反应24h。滤掉不溶物，用3M NaOH调节溶液的pH到7-9，过滤，将产物在搅拌条件下溶解于40ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，滤掉不溶物，再次用3M NaOH调节溶液的pH到7-9，过滤，用去离子水洗涤，冷冻干燥，得苯胺五聚体交联的壳聚糖0.7g。产率70％.苯胺含量4.9％。

将苯胺五聚体交联的壳聚糖产物溶解在醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，浓度为1mg/ml。将1ml该水溶液滴加在ITO电极上(面积为2cm×5cm)，室温下干燥。以铂电极为对电极，Ag+/Ag电极为参比电极，1M HCl为电解液，得到该产物的循环伏安曲线，谱图见图2。实施例4：苯胺五聚体交联壳聚糖的合成，其中苯胺五聚体含量9.5％

取商品壳聚糖(分子量4万，脱乙酰度为75％)0.5g，在搅拌的条件下溶解于30ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，在室温和搅拌的条件下，通过滴液漏斗将20mlDMSO以每3-5秒滴1滴的速度滴加入醋酸水溶液中。取实例1中得到的两端羧基活化的苯胺五聚体0.5g溶解于10mlDMF中并置于恒压滴液漏斗中。通过抽气换气技术，在氮气保护下，将反应体系升温到50℃后，将DMF溶液以每3-5秒滴1滴的速度滴加到醋酸水溶液和DMSO的混合溶液中，滴加完后在50℃和搅拌的条件下反应24h。滤掉不溶物，用3M NaOH调节溶液的pH到7-9，过滤，将产物在搅拌条件下溶解于40ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，滤掉不溶物，再次用3M NaOH调节溶液的pH到7-9，过滤，用去离子水洗涤，冷冻干燥，得苯胺五聚体交联的壳聚糖0.467g.产率46.7％.苯胺含量9.5％。

实施例5：苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖的制备，其中苯胺五聚体的含量为2.8％

利用无水无氧技术，在氮气保护下，苯胺五聚体0.2g(0.3mmol)和CDI 0.1g(0.6mmol)溶解于15mlDMAC中，将反应溶液升温到60℃后，搅拌24h。将6-O-三苯甲基壳聚糖(分子量10万，脱乙酰度为90％，三苯甲基取代度为94％)1g溶解于15mlDMAC中。利用无水无氧技术，在氮气保护下，将6-O-三苯甲基壳聚糖所在的DMAC溶液加入到苯胺五聚体所在的DMAC溶液中，在60℃下，搅拌24h，冷却，乙醚沉出，乙醇洗涤，室温下真空干燥至恒重，得到产物苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖0.7g。产率58％，苯胺五聚体含量为2.8％。

实施例6：苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖的制备，其中苯胺五聚体的含量为6.8％

利用无水无氧技术，在氮气保护下，苯胺五聚体0.4g(0.6mmol)和CDI 0.2g(1.2mmol)溶解于15mlDMAC中，将反应溶液升温到60℃后，搅拌24h。将6-O-三苯甲基壳聚糖(分子量10万，脱乙酰度为90％，三苯甲基取代度为94％)1g溶解于20mlDMAC中。利用无水无氧技术，在氮气保护下，将6-O-三苯甲基壳聚糖所在的DMAC溶液加入到苯胺五聚体所在的DMAC溶液中，在60℃下，搅拌24h，冷却，乙醚沉出，乙醇洗涤，室温下真空干燥至恒重，得到产物苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖0.96g。产率68.6％，苯胺五聚体含量为6.8％。

实施例7：苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖的制备，其中苯胺五聚体的含量为9.1％

利用无水无氧技术，在氮气保护下，苯胺五聚体0.6g(0.9mol)和CDI 0.3g(1.8mmol)溶解于15mlDMAC中，将反应溶液升温到60℃后，搅拌24h。将6-O-三苯甲基壳聚糖(分子量10万，脱乙酰度为90％，三苯甲基取代度为94％)1g溶解于25mlDMAC中。利用无水无氧技术，在氮气保护下，将6-O-三苯甲基壳聚糖所在的DMAC溶液加入到苯胺五聚体所在的DMAC溶液中，在60℃下，搅拌24h，冷却，乙醚沉出，乙醇洗涤，室温下真空干燥至恒重，得到产物苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖1.07g。产率66.8％，苯胺五聚体含量为9.1％。

实施例8：苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖的脱保护，其中苯胺五聚体的含量为6.8％

取实例6得到的产物0.3g分散于20ml二氯乙酸中，在室温下搅拌30-40min，过滤，乙醚沉降，乙醇洗涤。产物溶解在15ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，过滤，用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到苯胺五聚体交联壳聚糖产物0.16g。产率75％。

实施例9：苯胺五聚体交联6-O-三苯甲基壳聚糖的脱保护，其中苯胺五聚体的含量为9.1％

取实例7得到的产物0.12g分散于20ml二氯乙酸中，在室温下搅拌30-40min，过滤，乙醚沉降，乙醇洗涤。产物溶解在10ml醋酸浓度为10v％醋酸水溶液中，过滤，用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到苯胺五聚体交联壳聚糖产物0.09g。产率82％。

实施例10：交联产物的细胞毒性实验

取实施例4得到的产物，纯壳聚糖和苯胺五聚体各0.5g，在紫外光照射下消毒后，采用MTT技术分别测得三种材料在不同浓度下的细胞毒性，结果如图3所示。从实验结果可以看出实施例4得到的产物具有和纯壳聚糖相似的细胞毒性，说明该交联产物的毒性得到了保证。

Claims (3)

1.一种苯胺五聚体交联壳聚糖的聚合物，其特征在于结构式为：

2.如权利要求1中所述的苯胺五聚体交联壳聚糖的聚合物的制备方法，其特征在于，步骤和条件如下：

(1)在无水无氧的条件下，加入溶剂N，N-二甲基甲酰胺，活化剂N-羟基琥珀酰亚胺，缩合剂二环己基碳二亚胺，活化剂N-羟基琥珀酰亚胺和缩合剂二环己基碳二亚胺的摩尔数均为苯胺五聚体摩尔数的两倍，加入浓度为75mg/ml的苯胺五聚体，在室温和搅拌的条件下，聚合时间为24h，产物用乙醇沉降，过滤，洗涤，真空干燥，得到两端羧基活化的苯胺五聚体；

(2)在室温和搅拌的条件下，将壳聚糖溶解于浓度为10v％的醋酸水溶液中，壳聚糖浓度为15-27mg/ml，壳聚糖的质量为醋酸质量的5-9倍，得到壳聚糖的醋酸水溶液；

(3)将体积为步骤(2)中的壳聚糖的醋酸水溶液体积的2/3的二甲基亚砜溶剂以1滴/(3-5)秒滴速，滴加到壳聚糖的醋酸水溶液中；

(4)将步骤(1)得到的两端羧基活化的苯胺五聚体溶解于体积为步骤(2)中壳聚糖的醋酸水溶液体积的1/3的N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，在无氧的条件下，在50℃和搅拌的条件下，将该N，N-二甲基甲酰胺溶液通过恒压滴液漏斗以1滴/(3-5)秒滴速，滴加到步骤(3)得到的溶液中，滴加完成后在50℃和搅拌的条件下再反应24h，过滤，用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，沉降物溶解于浓度为10v％醋酸水溶液中，过滤，再次用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖聚合物。

3.如权利要求1中所述的苯胺五聚体交联壳聚糖的聚合物的制备方法，其特征在于，步骤和条件如下：

(1)在无水无氧条件下，加入溶剂N，N-二甲基乙酰胺，加入浓度为0.02-0.06mol/L的苯胺五聚体，加入活化剂N，N-羰基二咪唑，活化剂N，N-羰基二咪唑摩尔数为苯胺五聚体摩尔数的两倍，在60℃和搅拌条件下反应24h，得到两端带咪唑基团的苯胺五聚体的DMAC溶液；将6-O-三苯甲基壳聚糖加入到含两端带咪唑基团的苯胺五聚体的N，N-二甲基乙酰胺溶液中，通过抽气换气技术，在60℃和搅拌条件下反应24h，过滤，乙醚沉降，过滤，40℃下真空干燥2天，得到苯胺五聚体交联的6-O-三苯甲基壳聚糖；

(2)将步骤(1)中得到的产物苯胺五聚体交联的6-O-三苯甲基壳聚糖分散在二氯乙酸中，室温搅拌到固体完全溶解，过滤，用乙醚沉降，用乙醇洗涤，过滤得到未提纯的苯胺五聚体交联壳聚糖；

(3)将步骤(2)得到的未提纯的苯胺五聚体交联壳聚糖溶解在浓度为10v％的醋酸水溶液中，过滤，用3M NaOH调节滤液的pH为7-9，过滤，去离子水洗涤，冷冻干燥，得到双羧基苯胺五聚体交联壳聚糖聚合物。